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FORMATION BIOLOGIE

MOLECULAIRE
DAKAR Septembre 2006

Philippe Gauthier, CBGP-IRD Montpellier philippe.gauthier@ensam.inra.fr


SOMMAIRE

La naissance de la biologie molculaire


I- L'mergence de la gntique formelle p4

II- Le chromosome, support de l'hrdit p4

III- La convergence de la biochimie et de la gntique p4

IV- L'ADN, support de l'information gntique p4

V- La structure de l'ADN p5

La structure des acides nucliques


I- Les nuclotides p6
1- Les diffrents constituants des nuclotides p6
2- Nomenclature p6

II- Caractristiques gnrales des acides nucliques p7

1- Les liaisons reliant les nuclotides p7


2- Sens de lecture dun acide nuclique p7

III- L'ADN p7

1- Caractristique de l'ADN p7
2- Proprits physico-chimiques de lADN p8
3- Hybridation des acides nucliques et des sondes nucliques p9

IV- Les ARN p9

1- Caractristiques gnrales des ARN p9


2- Les diffrents types d'ARN p9
a- Les ARN ribosomiques (ou ARNr) p9
b- Les ARN de transfert (ou ARNt) p9
c- Les ARN messager (ou ARNm) p10
d- Les petits ARN nuclaires (ou snRNA pour small nuclear RNA) p10

La rplication de l'ADN
I- Caractristiques gnrales de la rplication p12

1
II- Elments ncessaires la rplication de l'ADN p12

III- Les diffrentes tapes de la rplication de l'ADN p12

IV- Discontinuit de la rplication entre les deux brins d'ADN p13

V- Rparation des erreurs p14

La transcription de l'ADN en ARN messager


I- Caractristiques gnrales de la transcription p15

II- Les lments ncessaires la transcription p15

III- Les diffrentes tapes de la transcription p15

1- Linitiation de la transcription p15


2- Llongation de la chane poly-nuclotidique au cours de la transcription p16
3- La terminaison ou fin de la transcription p16

IV- La maturation des produits de transcription p17


1- L'addition de la coiffe lextrmit 5 p17
2- L'addition de poly(A) lextrmit 3 p17
3- L'limination des introns p17

La traduction
I- Caractristiques gnrales de la traduction p18

II- Les lments ncessaires la traduction p18

III- Mcanisme de la traduction p18


1- Initiation de la chane peptidique p19
2- Elongation de la chane peptidique p19
3- Terminaison de la chane peptidique p20

IV- Le code gntique p20

1- Le code gntique est dfini par trois lettres p20


2- Le code gntique est universel p21
3- Le c ode gntique est dgnr p21
4- Code non chevauchant p21
5- Notion de cadre de lecture p21

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Le polymorphisme de l'ADN
I- Types de polymorphisme p22
1- Macrolsions de l'ADN : les remaniements chromosomiques p22
2- Microlsions de l'ADN : les mutations ponctuelles p22
3- Squences rptes en tandem p23

II- Mcanismes mis en uvre dans la gnration du polymorphisme p23

1- Erreurs de rparations p23


2- Recombinaisons ingales p23
3- Conversion gnique p24
4- Insertions de squences mobiles (transposons) ou virales p24
5- Glissement intra-chromatidien p24

Les outils et techniques de la biologie molculaire


I- Les outils de la biologie molculaire p25
1- Les enzymes p25
2- Les amorces et sondes p26
3- Les vecteurs et cellules htes p26

II- Les techniques de la biologie molculaire p26

1- Extraction Purification de l'ADN p27


2- Migration lectrophortique et visualisation des fragments d'ADN p28
3- PCR p29
4- PCR-RFLP p31
5- Purification de produits PCR p31
6- Squenage p31
7- Microsatellites p32
8- AFLP p33
9- SSCP p34
10- Clonage p35

Annexes
Annexe I : Les diffrentes phases de la mitose p38

Annexe II : Glossaire p38

3
La naissance de la biologie molculaire

Le XXe sicle concide avec la naissance gntique : dbutant avec la redcouverte des
travaux de Mendel prcisment en 1900, se poursuivant par l'laboration de la thorie
chromosomique de l'hrdit au dbut du sicle, la dcouverte de l'ADN comme support
biochimique de l'information gntique, l'lucidation de sa structure, et l'explosion de la
biologie molculaire partir des annes 70.

I- L'mergence de la gntique formelle


La gntique classique dbute au milieu du XIXe sicle avec les travaux de Gregor Mendel
(1822-1884), qui tablit ds 1866 les premires lois de l'hrdit en tudiant la transmission
au cours des gnrations d'un certain nombre de caractres simples observer. Ce sont des
caractres versions alternatives tranches : fruits lisses ou rugueux, verts ou jaunes, graines
rondes ou irrgulires, jaunes ou vertes, tige haute ou petite. Ces travaux passent alors
inaperus et seront redcouvert en 1900.

II- Le chromosome, support de l'hrdit


En 1910, les travaux de Thomas Morgan (1866-1945) sur la transmission la descendance
de caractres muts chez la mouche du vinaigre (Drosophila melanogaster), conduisent au
dveloppement de la thorie chromosomique de l'hrdit. Les gnes sont alors localiss
sur les chromosomes, et avec Alfred Sturtevant (1891-1970), ils pourront mme y tre
ordonns, constituant les premires cartes gntiques en 1913.

III- La convergence de la biochimie et de la gntique


Si la prsence des gnes sur les chromosomes est alors tablie, rien n'est connu de la nature
biochimique des gnes ou de leur mode d'action. La premire relation entre un gne et un
enzyme est tablie en 1902 par Archibald Garrod (1857-1936), partir d'une observation
portant sur une maladie gntique humaine (dficience enzymatique transmissible la
descendance). George Wells Beadle (1903-1989) approfondit cette relation sur un systme
accessible l'exprimentation, le champignon Neurospora crassa sur lequel il ralise des
mutations par irradiation. L'ensemble de ces travaux aboutissent finalement la conclusion
que les gnes contrlent la synthse des enzymes, et que chaque protine est code par un
gne diffrent.

IV- L'ADN, support de l'information gntique


Le premier phnomne qui allait permettre de progresser dans l'identification du support de
l'hrdit est celui de la transformation bactrienne, rapport en 1928 par l'anglais Fred
Griffith (1877-1941). Ce phnomne reprsente alors un test d'activit biologique (injection
de bactries virulentes ou non des souris), grce auquel il est possible de dterminer la
nature du matriel gntique. Ce test ne sera pas mis profit par Griffith lui mme, mais par
Oswald Avery (1877-1955) qui l'utilise pour lucider la nature biochimique du matriel
gntique : l'ADN. Cette dcouverte est toutefois accueillie avec beaucoup de scepticisme. Il
faudra de nombreux autres travaux pour que cette ralit soit accepte : en particulier ceux

4
d'Erwin Chargaff (1905-1992) ou de Alfred Hershey (1908-1997). L'acceptation dfinitive
ne viendra qu'avec l'lucidation de la structure de l'ADN par Watson et Crick.

V- La structure de l'ADN
Finalement, c'est avec l'lucidation de la structure en double hlice de l'ADN par James
Dewey Watson (1928-) et Francis Harry Compton Crick (1916-2004) en 1953 que la
biologie molculaire connat son apothose. Ils tablissent en effet un model molculaire
l'aide de l'ensemble des donnes acquises sur l'ADN depuis le dbut du sicle. Cette structure
est aujourd'hui connue de tous, elle est devenue l'emblme de la biologie molculaire (voire la
couverture de ce document!
En outre, Crick a apport d'importantes contributions plusieurs domaines de la biologie
molculaire : c'est lui que l'on doit notamment le dogme central de la biologie, qui stipule
que le flux d'information depuis les acides nucliques vers les protines est sens unique.

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La structure des acides nucliques

Les acides nucliques ont t isols initialement des noyaux des cellules. On peut en
distinguer deux grands types : les acides dsoxyribonucliques (ADN) et les acides
ribonucliques (ARN). Les premiers sont essentiellement localiss dans le noyau des cellules
et les seconds dans le cytoplasme cellulaire. Les acides nucliques (ADN et ARN) sont des
macromolcules et constitus de sous-units appeles nuclotides.

I- Les nuclotides

1- Les diffrents constituants des nuclotides


Un nuclotide comporte trois composants (figure 1) :
- une base : les bases sont classes en pyrimidines et en bases purines. Les principales
bases pyrimidiques sont: luracile, la cytosine et la thymine. Les principales bases
puriques sont ladnine et la guanine.
- un ose (sucre) : il en existe deux types, le ribose et le 2-dsoxyribose. Ces deux
sucres sont des oses cinq atomes de carbone ou pentoses. On les numrote avec des
chiffres accompagns de lindication prime pour viter des confusions avec les
numrotations des bases. Le 2-dsoxyribose est un ribose dans lequel il manque un
OH en 2 (remplac par un H).
- un acide phosphorique (H3PO4) : il possde trois fonctions acide. Deux de ces
fonctions sont estrifies dans les ADN et les ARN. La troisime fonction acide est
libre.

Figure 1 :

2- Nomenclature (tableau 1)
Lassociation ose-base est appele nucloside.
L'association acide phosphorique-ose-base est appele nuclotide.
Les nuclosides et nuclotides base purique (A et G) ont respectivement une terminaison
"ine" et "ylique".
Les nuclosides et nuclotides base pyrimidique (C, T et U) ont respectivement une
terminaison "idine" et "idylique".

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Tableau 1 : Nucloside Nuclotide
Base Code
(ose+base) (ac P+ose+base)
adnine adnosine acide adnylique A
guanine guanosine acide guanylique G
cytosine cytidine acide cytidylique C
thymine thymidine acide thymidylique T
uracile uridine acide uridylique U

II- Caractristiques gnrales des acides nucliques

1- Les liaisons reliant les nuclotides


Dans un acide nuclique (ou polymre de nuclotides), les nuclotides sont assembls entre
eux par des liaisons phosphodiester (figure 2). Une molcule deau est donc limine entre
un OH de lacide phosphorique et lH de la fonction alcool situe en 3 de lose. Quand
lacide phosphorique prsente ses deux fonctions acides bloques dans la formation dester,
on parle de liaison phosphodiester. On peut indiquer les chiffres a et b pour prciser la liaison
phosphodiester concerne. La liaison phosphodiester a correspond la liaison ester entre
lacide phosphorique et lOH en 3 de lose. La liaison phosphodiester b correspond la
liaison ester entre lacide phosphorique et lOH en 5 de lose.

Figure 2 :

2- Sens de lecture dun acide nuclique


Par convention, on lit toujours un acide nuclique dans le sens de lextrmit 5 (comportant
un groupement phosphate) vers lextrmit 3 (comportant un groupement OH libre). La
squence des bases dun ADN par convention sera crite dans le sens horizontal en prcisant
les extrmits 5 et 3 et on indique seulement les bases correspondantes (A, T, G ou C).

III- L'ADN

1- Caractristique de l'ADN
Le ADN prsente plusieurs caractristiques propres et qui l'opposent aux ARN :
- lose : le 2-dsoxyribose (remplac par le ribose dans les ARN);
- les bases : A, C, G et T. Dans les ARN, T est remplac par U;

7
- la molcule dADN est constitue de deux chanes (ou brins) de nuclotides. Les
molcules dARN sont le plus souvent sous forme simple brin.
D'autre part, la double chane dADN possde les caractristiques suivantes :
- elle est antiparallle : les deux brins de la molcule dADN sont disposs dans des
directions opposes. Un brin est orient dans une direction 53, et le second brin
sera parallle au premier et dans la direction inverse 35;
- elle est complmentaire : lappariement des bases des deux brins dune molcule
dADN se fait suivant la rgle de complmentarit: A appari avec T, C appari avec
G. Cette complmentarit repose sur des raisons striques (encombrement dans
lespace) et sur la formation de liaisons hydrogne. Les liaisons hydrogne sont
formes par linteraction entre un atome dhydrogne et deux autres atomes dits
lectrongatifs (oxygne et azote). Les liaisons hydrogne sont au nombre de deux
entre A et T et de trois entre C et G (figure 3);
- elle est hlicodale : dans lespace les deux chanes prsentent une configuration
hlicodale. Elles senroulent autour dun axe imaginaire pour constituer une double
hlice rotation droite.
Figure 3 : Figure 4 :

Les caractristiques de lhlice (figure 4) :


- environ 10 paires de bases par tour de spire;
- l'espacement entre deux bases conscutives est de 0,34 nm;
- le pas de lhlice est de 3,4 nm;
- le diamtre de lhlice est de 2 nm;
- les bases puriques et pyrimidiques sont lintrieur de lhlice, les groupements
phosphates et les dsoxyriboses sont lextrieur.

2- Proprits physico-chimiques de lADN


Si on chauffe une solution dADN, une certaine temprature, les liaisons hydrogne qui
assurent la cohsion des deux brins apparis se rompent, les deux brins se sparent, on parle
de fusion de lADN, caractrise par la temprature de fusion (ou Tm). LADN est dnatur.
Cette dnaturation est cependant rversible dans certaines conditions, les deux brins peuvent
se rassocier suivant les rgles de complmentarit. La temprature de fusion varie selon
lADN tudi. Elle augmente lorsque le pourcentage de bases (G+C) augmente. Ceci est li au
nombre de liaisons hydrogne possibles formes par les bases G et C (3 liaisons hydrogne
entre CG au lieu de 2 entre A=T).
La prsence des bases puriques et pyrimidiques permet aux acides nucliques (ADN et ARN)
dabsorber dans lultra-violet (UV) 260 nm. Les protines absorbent un peu 260 nm, mais

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surtout 280 nm. Cette absorption dans lUV permet de doser les acides nucliques et
destimer la contamination par les protines lors de la purification des acides nucliques.
Dans les cellules, la molcule dADN nuclaire prsente diffrents niveaux d'enroulement et
de compaction (figure 5). Elle est fortement associe des protines pour constituer la
chromatine. Limage la plus classique est celle du collier de perles. La molcule dADN relie
les perles qui sont des complexes protines-ADN appels nuclosomes. Le nuclosome
contient environ 200 paires de bases d'ADN associes des protines appeles histones. Les
histones sont des protines de petit poids molculaire (11-14 kDa), riches en acides amins
basiques. Dans un nuclosome, elles sont au nombre de 8 avec deux exemplaires de chacune
des histones: H2A H2B, H3 et H4. Au niveau d'un nuclosome, l'ADN (200 pb) est donc
associ un octamre d'histone. Lhistone H1 nappartient pas au nuclosome, mais
interviendrait dans le contact entre deux nuclosomes. Ce collier de perles peut subir des
enroulements successifs avec formation de structures de type solnode.
Figure 5 :

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3- Hybridation de l'ADN avec des sondes nucliques
Lhybridation est une proprit fondamentale des acides nucliques qui repose sur les rgles
de complmentarit. Il est possible dapparier des brins dADN (ou dARN) avec des
oligonuclotides ou polynuclotides qui reconnaissent spcifiquement des squences sur les
brins dADN de manire anti-parallle et complmentaire. Ces oligo- ou polynuclotides sont
appels sondes nucliques ou amorces selon leur utilisation.

IV- Les ARN

1- Caractristiques gnrales des ARN


Les ARN prsentent plusieurs caractristiques propres et qui les opposent l'ADN :
- lose : le ribose ( la place du 2-dsoxyribose prsent dans les ADN);
- les bases pyrimidiques et puriques qui sont A, C, G et U. U remplace donc le T
prsent dans l'ADN;
- une seule chane nuclotidique au lieu de deux dans les ADN. On dit que les ARN
sont monocatnaire (ou simple brin). Cette unique chane est plus courte que les
chanes dADN. Cependant, dans une mme chane dARN des portions peuvent tre
sous forme bicatnaire (ou double brin) avec un appariement suivant la rgle : A
appari avec U (deux liaisons hydrogne) et C appari avec G (trois liaisons
hydrogne). Ds lors, au niveau des appariements, on aura la constitution de sortes de
tiges alors dans les rgions non apparies, des boucles apparatront (voir schma des
ARNt).

2- Les diffrents types d'ARN


Les cellules contiennent essentiellement quatre types dARN.

a- Les ARN ribosomiques (ou ARNr)


Les ribosomes sont des organites intra-cellulaires situs dans le cytoplasme et qui sont lusine
de fabrication des protines de la cellule (voir la partie du cours sur la traduction). Les ARNr
jouent un rle essentiel dans la structure et le maintien de lintgrit des ribosomes en
association avec les protines ribosomales.

b- Les ARN de transfert (ou ARNt)


Les ARNt prsentent bien entendu la structure gnrale des ARN, mais ils possdent en plus
quelques particularits propres : certaines portions de la squence nuclotidique s'apparient
entre elles pour former un ARN double brin. En structure spatiale, on prsente souvent les
ARNt sous forme de trfle.
Les sites importants dans les tARN (figure 6) :
- l'extrmit 3-OH est caractrise par trois nuclotides CCA-3-OH. Cest par cette
extrmit que sera fix lacide amin qui sera vhicul par le ARNt.
- lanticodon qui correspond un groupe de trois nuclotides (ou triplet) situ sur une
boucle du ARNt. Ce triplet prsente un rle trs important puisquil doit sapparier
avec le codon correspondant prsent sur lARN messager. Cet appariement entre
lanti-codon et le codon se fait par des liaisons hydrogne et suivant les rgles de
complmentarit. Le codon et lanti-codon sont disposs de manire antiparalllle.
Les ARNt jouent un rle capital dans la biosynthse protique. La fixation de lacide amin
transporter sur le ARNt spcifique sera dcrite en dtail dans la partie du cours concernant la
traduction.

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Figure 6 :

a- Les ARN messager (ou ARNm)


Les ARN messagers constituent le support essentiel de linformation gntique entre lADN
et le ribosome o seffectuera la synthse protique. Les ARNm sont trs rapidement
synthtiss et dgrads, leur dure de vie est trs courte.
Ils sont forms dune seule chane de nuclotides avec les bases communes aux ARN : A, U,
C et G. Cette chane comporte une succession de triplets nuclotidiques. Chaque triplet
nuclotidique constitue un codon spcifique dun acide amin donn (voir la partie du cours
sur la traduction).

b- Les petits ARN nuclaires (ou snRNA pour small nuclear RNA)
Ils sont prsents dans le noyau des cellules et sont impliqus dans certaines tapes de la
transcription (copie de l'ADN en ARN messager).

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La rplication de l'ADN

Lors de la mitose (ou division cellulaire, voire Annexe I), une cellule-mre donne deux
cellules-filles, et il est essentiel que lADN prsent dans les cellules-filles soit la copie
identique de lADN prsent dans la cellule-mre. Cette copie de lADN est indispensable
raliser avant la mitose : c'est la rplication de lADN. Pralablement toute division
cellulaire, la quantit dADN est multiplie par deux (figure 7). Les mcanismes de
rplication conditionnent donc le droulement de la division cellulaire.
Figure 7 :

I- Caractristiques gnrales de la rplication


La rplication est :
- semi-conservatrice. Ceci signifie que sur les deux brins dADN, on a toujours un brin
dADN qui provient dun des deux brins de lADN parental et un brin nouvellement
form. A chaque rplication, les deux brins dADN parental se sparent, chacun de ces
deux brins sert de matrice pour la synthse dun brin complmentaire;
- bidirectionnelle, elle va progresser dans les deux sens partir du point d'ouverture de
la double hlice;
- complmentaire et progresse dans le sens 53;
- discontinue entre les deux brins dADN.

II- Elments ncessaires la rplication de l'ADN


- une matrice dADN constitue par un brin parental;
- des amorces ARN;
- des nuclotides propres lADN, cest--dire contenant du 2-dsoxyribose, des bases
A, T, G et C et sous forme de nuclotides triphosphates (dATP, dTTP, dCTP et
dGTP);
- la prsence de nombreux enzymes, dont l'ADN polymrase;
- la prsence de certains ions (notamment le Mg2+, cation indispensable l'activit de
l'ADN polymrase).

III- Les diffrentes tapes de la rplication de l'ADN (figure 8)


La rplication de l'ADN commence simultanment en de nombreux points prcis appels
origines de rplication.
En ces points, une enzyme, lADN hlicase va catalyser le droulement de la double hlice
dADN, ce qui dfinira la future fourche de rplication.

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Les brins spars de lADN sont stabiliss sous forme simple brin grce la fixation de
protines appeles SSB (pour single strand binding ). Ces protines SSB empchent les
deux brins dADN de se rapparier.
Une enzyme appele primase synthtise une petite amorce dARN (environ 10 nuclotides).
Cette amorce va servir de point de dpart l'ADN polymrase pour la synthse du brin
complmentaire d'ADN dans le sens 5 3. En effet, l'ADN polymrase est incapable de
commencer la synthse dune chane dADN sans amorce.
Les amorces dARN seront ensuite dtruites et hydrolyses par lintervention dune
enzyme, la RNAse H. Elles seront remplaces par des fragments dADN. Les lacunes
engendres par lenzyme RNAse H sont combles par une ADN polymrase. Finalement,
les fragments dADN deviennent contigus et sont souds les uns aux autres par
lintervention dune enzyme qui est une DNA-ligase.

IV- Discontinuit de la rplication entre les deux brins d'ADN (figure 8)


La rplication nest pas identique entre les deux brins dADN. En effet, sur lun des brins la
rplication seffectue de manire continue, on parle de brin avanc, alors que sur lautre brin
elle seffectue de manire discontinue, on parle de brin retard.
Sur le brin avanc, la progression de la rplication se fait dans le sens 53 en utilisant
comme modle le brin dADN orient dans le sens 53. Sur le brin retard, des petits
fragments dADN sont synthtiss, encore appels fragments dOkazaki. Chaque fragment
est synthtis dans le sens 53, le brin modle correspondant de lADN est orient de
manire anti-parallle 35. On voit donc que lallongement discontinu de ce brin retard se
fait dans le sens de la propagation de la rplication.
Il est important de comprendre que le brin qui sert de matrice de lecture pour la constitution
du brin retard doit former une boucle autour dun des deux sites actifs de lADN polymrase.
Dans ces conditions, lintervention de la primase et de lADN polymrase permet la synthse
dun brin nouveau dADN dans le sens 53 par copie au niveau de cette boucle. Aprs la
synthse dADN sur le brin retard, la boucle est dfaite et une nouvelle est reforme au
niveau de louverture de la fourche de rplication. Finalement, des fragments dADN sont
ainsi synthtiss sur le brin retard; de manire discontinue.

Figure 8 :

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V- Rparation des erreurs
Des altrations de l'ADN peuvent provenir d'erreurs commises par la polymrase durant la
rplication. L'ADN polymrase prsente, outre l'activit de synthse 53, une activit
exonuclasique 35 qui lui permet de vrifier si la dernire base introduite correspond bien
aux conditions classiques dappariement. Cette activit ddition diminue considrablement
les erreurs possibles. Au cours de la rplication, il est estim que l'ADN polymrase incorpore
une base incorrecte (erreur d'appariement) tous les 104 105 nuclotides, mais avec les
fonctions d'dition, finalement le taux d'erreur passe 1 pour 109 nuclotides incorpors.

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La transcription de l'ADN en ARN messager

La transcription constitue lensemble des mcanismes par lequel lARN messager (ARNm)
est synthtis. L'ARNm est une copie dune portion de lADN. Seules certaines portions de
lADN sont transcrites, ces squences dADN sont appeles gnes. Enfin, seul lun des deux
brins dADN est copi en ARNm. La transcription constitue ltape prliminaire essentielle
pour la biosynthse protique (ou traduction).

I- Caractristiques gnrales de la transcription


La synthse dun ARNm partir dADN seffectue toujours :
3;
- dans le sens 5
- de manire anti-parallle par rapport la portion dADN copie;
- de faon complmentaire (appariements G/C et A/U).

II- Les lments ncessaires la transcription

- une matrice dADN servant de modle. Ce modle est indispensable lenzyme, on


parle souvent dARN polymrase-ADN dpendante;
- des nuclotides propres au ARNm, les ribonuclotides, contenant du ribose, des bases
A, U, G et C sous forme de ribonuclotides triphosphates (ATP, UTP, CTP et GTP);
- une enzyme : lARN polymrase;
- des ions Mg2+ indispensables au fonctionnement de l'ARN polymrase.

III- Les diffrentes tapes de la transcription (figure 10)


La transcription ne concerne quune portion de lADN, les gnes. La squence d'ADN qui va
tre transcrite (ou unit de transcription) comporte une origine (dpart) et une squence de
terminaison (fin) de la transcription. LARN synthtis qui correspond cette unit de
transcription sappelle le transcrit primaire ou ARN pr-messager (pr-ARNm) (figure 9).

Figure 9 :

La synthse du pr-ARNm comprend trois phases successives : l'initiation (reconnaissance de


la squence du promoteur et du point de dpart de la transcription), llongation (synthse de
lARNm), et la terminaison (reconnaissance de la squence de fin de transcription).

1- Linitiation de la transcription
Cette tape implique la reconnaissance par l'ARN polymrase d'une rgion de l'ADN, le
promoteur, qui se trouve juste avant le dbut de la rgion d'ADN transcrire. Par

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convention, on donne le chiffre +1 au premier nuclotide partir duquel la transcription
commence. L'ARN polymrase se fixe ensuite sur l'ADN et spare localement les deux brins,
crant ainsi une courte rgion simple brin qui servira de matrice pour l'appariement des
premiers ribonuclotides.

2- Llongation de la chane poly-nuclotidique au cours de la transcription


Une fois les premiers ribonuclotides incorpors, l'ARN polymrase va se dplacer le long de
l'ADN en sparant les deux brins. L'incorporation des ribonuclotides continue dans le sens
53, et le pr-ARNm se dtache de la matrice ADN au fur et mesure de sa synthse. Les
liaisons hydrogne se reforment aprs passage de lARN polymrase et les deux brins dADN
reprennent leur forme hlicodale.
Remarque : l'un des brins d'ADN est appel brin codant (ou brin +, ou brin sens, ou brin non
transcrit), l'autre est appel brin non codant (ou brin -, ou brin anti-sens, ou brin transcrit ou
brin matrice). C'est le brin non codant qui va tre parcouru par l'ARN polymrase et qui va
servir de matrice pour la transcription, de telle sorte que, par le jeu de la complmentarit, le
pr-ARNm synthtis sera une copie du brin d'ADN codant :

brin codant 5-AGCTTAACGCGTA-3


ADN
brin non codant 3-TCGAATTGCGCAT-5
pr-ARNm 5-AGCUUAACGCGUA-3
sens de synthse du pr-ARNm

3- La terminaison ou fin de la transcription


Un signal de poly-adnylation (squence 5-AATAAA-3 sur le brin sens) annonce la
terminaison de la transcription dun gne. LARN polymrase reconnat ce signal sur lADN
mais poursuit la transcription. Une enzyme (endonuclase) reconnat la squence
correspondante sur le pr-ARNm (5'-AAUAAA-3') et coupe la squence environ 20 bases en
aval. Le pr-ARNm sera ensuite remodel (modifications post-transcriptionnelles).

Figure 10 :

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IV- La maturation des produits de transcription
La plupart des gnes codant pour des protines prsentent une structure discontinue,
comportant des exons et des introns. Les exons sont les squences dADN qui seront
traduites en protines (on dit aussi quelles seront exprimes). Les introns sont des squences
non codantes dADN intercales entre les exons.
La transcription correspond l'tape de copie dun gne et la formation dun transcrit
primaire (ou pr-ARNm). Ce transcrit primaire correspond une copie intgrale des exons et
des introns dun gne. Pour que ce pr-ARNm devienne un ARNm et puisse servir de matrice
pour la synthse de protines, il doit subir plusieurs phases de maturation : addition d'une
coiffe, addition d'une queue polyA et limination des introns.

1- L'addition de la coiffe lextrmit 5


Cette phase survient ds la formation des premires liaisons nuclotidique et consiste en un
blocage de l'extrmit 5' du pr-ARNm en voie de synthse par fixation d'un ribonuclotide
GTP en position inverse (liaison 5'-5' au lieu de 3'-5'). Ce ribonuclotide particulier est
appel coiffe. L'extrmit 5' du pr-ARNm coiff est ensuite l'objet de plusieurs
mthylations qui protge l'extrmit 5' du pr-ARNm de lattaque par des enzymes de
dgradation (exonuclases).

2- L'addition de poly(A) lextrmit 3


La deuxime phase intervient aprs la terminaison de la transcription du pr-ARNm et
correspond une coupure de l'extrmit 3. Cette coupure est immdiatement suivie par le
transfert de 30 300 ribonuclotides ATP l'extrmit 3'. On parle de polyadnylation de
l'extrmit 3'. La prsence de cette queue polyA aurait une fonction de protection de
lextrmit 3 du pr-ARNm contre l'attaque des exonuclases.

3- L'limination des introns (figure 11)


La troisime phase, appele excision-pissage, permet la maturation du transcrit primaire en
ARNm par limination des introns :

Figure 11 :

1. coupure de l'intron son


extrmit 5';

2. formation d'une boucle ou lasso


par formation d'une liaison entre
l'extrmit 5' libre et un rsidu
adnylique interne de l'intron (site de
branchement);

3. jonction des deux exons et


limination de l'intron.

Gnralement, une cellule peut pisser le transcrit primaire de diffrentes faons, et donner
ainsi plusieurs protines diffrentes partir dun seul gne (ainsi une protine A peut tre
constitue des exons 1, 2 et 3 et une protine B des exons 1 et 3 uniquement). Ce processus
est appel pissage alternatif ou pissage diffrentiel.

17
La traduction

La traduction est le mcanisme de biosynthse des protines. La traduction seffectue dans


le cytoplasme au niveau du ribosome qui traduira l'information contenue sur les ARNm et
synthtisera les protines correspondantes.

I- Caractristiques gnrales de la traduction


- les ribosomes lisent l'ARNm dans le sens 53;
- la synthse protique se droule de lextrmit N-terminale lextrmit C-terminale
de la protine;
- la traduction se ralise au niveau des polysomes (figure 12). Un polysome correspond
un ensemble comprenant un ARNm et plusieurs ribosomes. Chaque ribosome ralise
sa propre synthse protique en dcodant l'ARNm. Chaque ARNm peut donc tre
dcod par plusieurs ribosomes la fois.
Figure 12 :

II- Les lments ncessaires la traduction


- l'ARNm qui indique, par un codage nuclotidique, lordre (ou squence) des acides
amins qui seront incorpors dans la chane polypeptidique par le ribosome.
- les ribosomes qui sont des organites cytoplasmique constitus par l'assemblage de
deux sous-units protiques (une grande et une petite) et d'ARNr;
- les ARNt qui servent d'adaptateurs entre l'ARNm et l'acide amin. Ils possdent un
site d'accrochage des acides amins leur extrmit 3' (squence 5'-CCA-3') et un site
appel anti-codon qui reconnat le codon complmentaire sur l'ARNm ;
- les acides amins qui vont se lis les uns aux autres (liaison peptidique) pour
constituer la protines;
- une enzyme, l'aminoacyl-ARNt synthase, qui lier l'aminoacyl (ou acide amin)
l'ARNt qui lui correspond. C'est ce complexe aminoacyl-ARNt qui participera la
synthse du peptide par le ribosome.

III- Mcanisme de la traduction

La traduction comprend trois tapes successives : linitiation, llongation et la terminaison


(figure 13).

18
Figure 13 :

1- Initiation de la chane peptidique


Il existe sur l'ARNm, prs de lextrmit 5 phosphate, un codon initiateur AUG. Ce codon,
qui code pour la mthionine, est le premier tre reconnu par le ribosome. La mthionine est
donc le premier acide amin tre incorpor dans la chane polypeptidique. Il sera plus tard
supprim de la chane polypeptidique.
Ainsi, au dbut de linitiation de la traduction, les deux sous-units du ribosome sont
dissocies. Puis, la petite sous-unit forme un complexe avec l'ARNm (au niveau du codon
initiateur) et l'ARNt portant la mthionine initiale (ARNt initiateur). La grande sous-unit va
alors se fixer cet ensemble. Le ribosome est alors complet. Les ribosomes possdent deux
sites pour fixer les ARN de transfert :
- un site A (A pour acide amin) sur lequel l'ARNt porteur du nouvel lacide amin
incorporer viendra se fixer;
- un site P (P pour peptide) sur lequel l'ARNt porteur de la chane peptidique en
cours dlongation est fix.
Initialement, la mthionine est fixe par son ARNt dans le site P du ribosome.

2- Elongation de la chane peptidique


Llongation de la chane peptidique se droule en trois tapes:
- premire tape : accrochage du deuxime aminoacyl-ARNt sur le ribosome.
Un deuxime aminoacyl-ARNt (le premier tant la mthionyl-ARNt) se fixe sur le site A de
la grande sous-unit du ribosome. Le codon situ aprs le codon dinitiateur AUG dtermine
lanticodon qui va se fixer, et donc laminoacyl-ARNt;
- deuxime tape : formation dune liaison peptidique.
Il y a tout dabord rupture de la liaison entre la formyl-mthionine et le premier ARNt. Ce
dernier est ject du ribosome. Puis, il y a formation dune liaison peptidique entre le
groupement -COO- (carboxylique) de lacide amin 1 (mthionine) et le groupement -NH3+ du
deuxime de l'acide amin 2. Lenzyme qui catalyse la formation de cette liaison peptidique

19
est une peptidyl-transfrase. Cette activit enzymatique est porte par la grande sous-unit du
ribosome. Finalement la fin de cette phase, on a un dipeptide (peptide constitu de deux
acides amins) qui est log dans le site A de la grande sous-unit du ribosome. Le site P du
ribosome est alors libre;
- troisime tape : la translocation
Aprs la formation de la nouvelle liaison peptidique, le deuxime acide amin (toujours li
son ARNt) se dplace du site A vers le site P. Le ribosome se dplace donc dun cran (d'un
codon) sur l'ARNm dans la direction 53. Un nouveau codon (codon 3) se trouve alors en
face du site A.

3- Terminaison de la chane peptidique


La fin de la traduction se produit quand le ribosome qui se dplace le long de l'ARNm
rencontre codon-stop : UAG, UGA ou UAA qui ne codent pour aucun acide amin (voir
paragraphe III- Le code gntique). Il se produit alors une coupure entre le dernier ARNt et le
dernier acide amin de la chane polypeptidique. La chane polypeptidique est libre et les
deux sous-units du ribosome se dissocient.

IV- Le code gntique

Le code gntique correspond lenchanement ordonn de trois bases nuclotidiques (triplet


ou codon) permettant de dfinir un acide amin. L'enchanement des triplets le long de
l'ARNm dfinit la squence en acides amins de la protine qui est synthtise lors de la
traduction.

1- Le code gntique est dfini par trois lettres (tableau 2)


Le code gntique reprsente un alphabet de quatre lettres (ribonuclotides) permettant
d'crire des mots de trois lettres (codon ou triplet). Le nombre de codons possibles est donc de
4 x 4 x 4 = 64. Sur ces 64 codons disponibles :
- 3 codons (UAA, UAG, UGA) sont des codons qui ne peuvent pas tre traduits en acides
amins. Ces codons sont appels non-sens ou codons-stop et provoque l'arrt de la synthse
peptidique par les ribosomes.
- 61 codons correspondant aux 20 acides amins. Mis part le tryptophane et la mthionine
qui disposent dun seul codon, les 18 autres acides amins sont dfinis individuellement par
plusieurs codons (2 6).

Tableau 2 :

20
2- Le code gntique est universel
Le code gntique est dit universel : il le mme pour tous les organismes aussi bien chez les
eucaryotes que chez les procaryotes.

3- Le c ode gntique est dgnr


Le code gntique est dit dgnr car un mme acide amin peut tre cod par plusieurs
codons diffrents (cf tableau). Dans beaucoup de cas, les triplets nuclotidiques codant pour
un mme acide amin ne diffrent que par la troisime base. C'est l un facteur de stabilit
gntique car une mutation ponctuelle sur la troisime base du codon nentranera le plus
souvent aucun changement dacide amin (on parle alors de mutation silencieuse).
Les deux premires bases dun codon de l'ARNm sont rigoureusement complmentaires de
lanticodon de l'ARNt. En revanche, pour la troisime base du codon lappariement avec la
premire base de lanticodon peut se faire de manire non classique (on parle alors de
flottement). Il n'est donc pas ncessaire qu'il y ait, dans la cellule, autant d'ARNt diffrents
qu'il y a de codons diffrents : un mme ARNt peut reconnatre plusieurs codons
correspondants un mme acide amin.

4- Code non chevauchant


Le code gntique est dit non chevauchant. La partie codante dun ADN est transcrite en
ARNm puis traduite rgulirement triplet par triplet. Les triplets nuclotidiques sont donc lus
dun point de dpart (initiation de la synthse protique) jusqu un point de terminaison et
ceci sans chevauchement.

5- Notion de cadre de lecture


Le cadre de lecture reprsente l'enchanement des triplets le long d'une portion d'ARNm.
Pour une squence ribonuclotidique donne, il existe donc trois cadres de lecture diffrents.
Si on considre par exemple la squence suivante d'un ARNm :
ACG ACG ACG ACG ACG ACG ACG ACG ...
Les trois cadres de lecture possibles (en bleu) sont :
ACG ACG ACG ACG ACG ACG ACG ACG ...
A CGA CGA CGA CGA CGA CGA CGA CGA ...
AC GAC GAC GAC GAC GAC GAC GAC GAC ...
Un cadre de lecture est dit ouvert (ou ORF "Open Reading Frame") si tous les triplets qui le
constituent codent pour des acides anims. Une squence ribonuclotidique qui est traduite en
protine a un cadre de lecture qui commence avec un codon d'initiation (AUG codant pour la
mthionine). Elle comprend ensuite une srie de triplets jusqu' l'un des trois codons de
terminaison possibles (codons-stop).
Un cadre de lecture qui ne peut pas tre lu en protine parce que les codons-stop se prsentent
frquemment est dit bloqu ou ferm. Si cette squence est bloque dans les diffrents cadres
de lecture possibles, elle ne peut pas avoir la fonction de coder pour une protine.
En consquence, une squence qui code pour une protine possde obligatoirement un cadre
de lecture ouvert parmi les trois possibles. Quand la squence d'une rgion d'ADN de fonction
inconnue est obtenue, chaque cadre de lecture doit tre analys pour dterminer s'il est ouvert
ou bloqu.

21
Le polymorphisme de l'ADN

Le polymorphisme peut tre dfini comme l'existence de deux ou plusieurs formes allliques
pour un mme locus entre individus d'une mme espce. Il est possible d'identifier des
polymorphismes de l'ADN diffrentes chelles, allant du niveau chromosomique
(remaniements) au niveau nuclotidique (mutations ponctuelles).

I- Types de polymorphisme
Le polymorphisme provient de modifications de la squence d'ADN, les mutations, qu'on peut
classer selon ltendue de la lsion de lADN : les macrolsions et les microlsions.

1- Macrolsions de l'ADN : les remaniements chromosomiques


Ce type de polymorphisme concerne des altrations de zones plus ou moins importantes des
chromosomes. On peut distinguer :
- les translocations;
- les inversions (changement dorientation tte-bche dun segment variable dADN);
- les fusions de gnes;
- les dltions ou insertions de squences d'ADN (amputations ou additions de matriel
gntique d'amplitude variable).
Toutes insertions ou dltions d'un nombre de base non multiple de trois entrane une
modification du cadre de lecture. Ce type de mutation fait gnralement apparatre en aval un
codon non-sens conduisant la formation d'une protine tronque. Une variation d'un nombre
de bases multiple de trois maintient le cadre de lecture, mais entrane la perte ou l'addition
d'acides amins.

2- Microlsions de l'ADN : les mutations ponctuelles


Ce type de mutation, qui n'intresse qu'une rgion trs limite du gnome (quelques
nuclotides maximum), est la source principale de polymorphisme (une tude chez l'homme
donne une estimation de une base polymorphe tous les 200 1000 nuclotides).
Les modifications peuvent tre de diffrentes natures :
- transitions : substitution d'une base purique par une autre base purique (A/G), ou
d'une base pyrimidique par une autre base pyrimidique (C/T);
- transversions : substitution d'une base purique par une base pyrimidique, ou d'une
base pyrimidique par une base purique (A,G/C,T);
- dltions de base;
- insertions de base.
Il existe 4 transitions et 8 transversions possibles. Dans les rgions codantes, ces substitutions
peuvent modifier la nature de l'acide amin cod, en fonction principalement de la position de
la substitution dans le codon. En effet, compte tenu de la dgnrescence du code gntique,
95% des mutations de la premire base, 100% des mutations de la seconde et 28% des
mutations de la troisime entranent un changement d'acide amin. Dans le cas contraire on
parle de mutation silencieuse (pour la troisime base, 90% des transitions et 30% des
transversions sont silencieuse).
Les dltions ou insertions d'une base conduisent une modification du cadre de lecture.

22
3- Squences rptes en tandem (VNTR : Variable Number of Tandem Repeats)
Les VNTR sont constitues d'un nombre variable de rptitions en tandem d'un motif de taille
variable. En fonction de la taille du motif et de la rptition, on distingue :
- les satellites : le motif comporte 2 plus de 100 nuclotides et le nombre de rptition
peut dpasser les 1000;
- les minisatellites : le motif comporte de 6 24 nuclotides et le nombre de rptition
est de 20 50;
- les microsatellites : le motif comporte 1 4 nuclotides et le nombre de rptition ne
dpasse gnralement pas 25.
La fonction des VNTR reste inconnue, sauf dans le cas des minisatellites de l'ADN
tlomrique o une fonction suppose est de protger l'extrmit des chromosomes de la
dgradation et d'en permettre la rplication.

II- Mcanismes mis en uvre dans la gnration du polymorphisme


1- Erreurs de rparations
Ce mcanisme explique l'apparition de mutations ponctuelles.
LADN subit des modifications de sa composition nuclotidiques principalement dues :
- aux erreurs commises par l'ADN polymrase lors de la rplication. En effet, l'ADN
polymrase commet des erreurs d'appariement lors de la synthse du nouveau brin
d'ADN, et bien qu'un systme de rparation des erreurs existe, celui-ci est imparfait et
on estime le taux d'erreur (aprs correction) environ 1 base tous les 109 nuclotides
incorpors.
A titre d'exemple, au cours d'une vie humaine, on a environ 1017 divisions cellulaires
soit environ 1017 mutations ponctuelles somatiques. En ce qui concerne la ligne
germinale, les mutations ponctuelles sont estimes environ 20 pour un ovule et
environ 250 pour un spermatozode (potentiellement transmises la descendance !!!).
- des agressions chimiques ou physiques. L'ADN gnomique peut tre altr par
exposition de multiples mutagnes (UV, rayons X, agents chimiques) qui peuvent
provoquer des cassures des brins d'ADN, la formation de liaisons entre nuclotides, la
suppression d'une base La plupart de ces altrations sont gnralement reconnues et
corriges par les systmes enzymatiques de rparation de la cellule, mais ceux-ci ne
sont pas infaillibles.

2- Recombinaisons ingales (figure 14)


Les dltions et les duplications peuvent rsulter de recombinaisons entre squences trs
semblables mais non homologues. Ces squences favorisent l'apparition d'erreurs
d'alignement, conduisant des crossing-over ingaux. Ce mcanisme aboutit l'limination
d'une rgion sur l'un des chromosomes et la duplication sur l'autre chromosome. Ces
recombinaisons sont favorises par l'existence de squences semblables contigus.
Figure 14 :

23
3- Conversion gnique
La conversion gnique est un mcanisme de recombinaison permettant un transfert
d'information gntique qui conduit au remplacement d'une squence d'ADN par une autre
apparente. Ce remplacement lieu lors de la rparation d'une lsion de l'ADN par la
polymrase (figure 15 : c'est un fragment apparent "b" qui sert de matrice pour la rparation
de la partie manquant "a")
Figure 15 :

4- Insertions de squences mobiles (transposons) ou virales


Certaines squences d'ADN rptitif possdent une structure de transposon (lments d'ADN
instable) capable de migrer vers diffrentes rgions du gnome par rtro-transposition (les
transcrits ARN peuvent tre convertis dans la cellules en ADN complmentaire par une
enzyme reverse transcriptase, et ces ADN s'insrent au sein de l'ADN gnomique). C'est le
mme phnomne qui se produit avec les virus ARN.

5- Glissement intra-chromatidien
Le glissement intra-chromatidien modifie le nombre de rptition des VNTR. Il se produit par
glissement de l'ADN polymrase conscutif un msappariement lors de la rplication : la
polymrase "drape" et est alors incapable de reproduire fidlement le nombre de rptitions
d'origine.

En conclusion, l'ADN recle donc un important polymorphisme rsultant soit d'accidents


purement alatoires, soit de mcanismes favoriss par certaines structures du gnome
(VNTR). Ce polymorphisme gnre une importante variabilit et est le moteur de l'volution.

24
Les outils et techniques de la biologie molculaire

La biologie molculaire applique la gntique a pour but l'tude d'une rgion du gnome et
la recherche d'un gne, voire d'une mutation. Les techniques de gntique molculaire,
reposant sur un nombre limit d'outils, ont donc pour objectif de cibler le fragment intressant
au sein d'une molcule d'ADN des millions de fois plus grande. Le facteur "quantit" est le
plus souvent limitant : la quantit d'ADN contenue dans une cellule.

I- Les outils de la biologie molculaire

1- Les enzymes
Les principales enzymes utilises en biologie molculaire sont :
- les enzymes de restriction (tableau 3)
Les enzymes de restriction sont issues des bactrie (l'abrviation enzymatique est dtermine
par la source bactrienne). Elles reconnaissent un site spcifique de l'ADN (souvent 4 ou 6
paires de bases palindromiques), et coupent la molcule d'ADN dans ce site. Elles permettent
d'obtenir, partir d'une molcule entire, des fragments d'ADN dont la longueur et le nombre
vont dpendre de la frquence et de la rpartition des sites de restriction sur la molcule
d'ADN d'origine. La coupure peut gnrer des bouts francs ou des bouts cohsifs. Elles sont
utilises dans de nombreuses techniques de biologie molculaire, comme la PCR-RFLP, les
AFLP, le clonage
Tableau 3 :

- les enzymes de digestion autres que les enzymes restriction


Ces enzymes coupent les molcules d'acides nucliques (ADN ou ARN), mais contrairement
aux enzymes de restriction, elles ne ncessitent pas la reconnaissance de sites spcifiques. On
distinguera les exonuclases qui digrent les acides nucliques par les extrmits, et les
endonuclases qui digrent les acides nucliques par l'intrieur. Les endonuclases sont
spcifiques d'un type d'acide nuclique : ARN simple brin, ARN hybrid de l'ADN, ADN
simple brin, ADN double brin.
- les polymrases
les polymrases synthtisent le brin complmentaire d'un brin d'ADN partir de nuclotides
libres prsents dans le milieu ractionnel. Elles sont utilises dans des techniques telles que la
PCR, le marquage de l'ADN (squenage, gnotypage)
- les ligases
Les ligases assemblent des fragments d'ADN linaires entre eux. Elles crent une liaison entre
les extrmits, de squences compatibles, de deux fragments d'ADN. Elles sont utilises

25
notamment dans les techniques de clonage et dans l'addition d'adaptateurs de l'ADN
gnomique digr (AFLP par ex.).
- les phosphatases
Les phosphatases liminent le groupement phosphate l'extrmit 5' d'un acide nuclique.
- les kinases
Les kinases ajoutent un groupement phosphate l'extrmit 5' d'un acide nuclique.

2- Les amorces et sondes


Les amorces sont de courte squence d'environ 20 nuclotides, complmentaires du dbut
dune matrice et servant de point de dpart son recopiage par l'ADN polymrase dans la
technique d'amplification par PCR.
Les sondes sont des squence d'au moins 15 nuclotides, homologue une squence d'ADN
avec laquelle elle s'hybride de faon stable et spcifique par association entre bases
complmentaires. Les sondes sont marques l'aide d'une molcule dtectable (radioactivit,
biotine, enzyme) et permettent ainsi d'identifier les squences d'ADN auxquelles elles
s'hybrident.
Divers facteurs affectent l'hybridation molculaire des sondes et des amorces :
- le temps : plus le temps de raction est long et plus la probabilit d'appariements pour
des squences complmentaires augmente;
- la concentration en acides nucliques (ADN, sondes, amorces) : plus elle augmente et
plus la probabilit de rencontre augmente;
- autres facteurs : longueur des fragments, prsence d'agents chimiques (ex. : DMSO);
- la temprature : basses tempratures favorise hybridation non spcifique;
- la complmentarit.

3- Les vecteurs et cellules htes


Les vecteurs sont des molcules d'ADN circulaire et double brin dans lesquelles un fragment
d'ADN exogne (appel insert) peut tre insr. Ces vecteurs, une fois introduit dans une
cellule hte, ont la capacit de se rpliquer de faon autonome, indpendamment de la
rplication de la cellule elle-mme. Ils possdent galement des proprits permettant de
slectionner les cellules qui l'ont incorpores. Ainsi, le vecteur pourra possder un gne de
rsistance un antibiotique et un gne codant pour une protine facilement dtectable. Ces
deux gnes permettront de slectionner (1) les cellules htes qui ont incorpores un vecteur, et
(2) parmi celles-ci, celles dont le vecteur contient un insert (voir la technique de clonage). Les
vecteurs les plus couramment utiliss sont les plasmides.
Les cellules htes, gnralement des bactries, subissent un traitement chimique de faon
les rendre comptente. La comptence des bactries peut tre dfinie comme leur capacit
incorporer de l'ADN exogne. La technique consistant faire pntrer un fragment d'ADN
exogne dans une bactrie s'appelle la transformation bactrienne.

II- Les techniques de la biologie molculaire


Les techniques de biologie molculaire peuvent tre classes selon leurs objectifs, savoir :
- fragmenter l'ADN (digestion enzymatique, PCR);
- sparer les fragments (lectrophorse, clonage);
- reprer les fragments d'intrt (coloration, marquage l'aide de sondes);
- multiplier le fragment tudier (PCR, clonage);
- lire le fragment (squenage, gnotypage).

26
1- Extraction Purification de l'ADN
Pour pouvoir tudier le polymorphisme de l'ADN, il faut dans un premier temps accder la
molcules d'ADN. Pour ce faire l'ADN doit imprativement tre purifi partir du matriel
biologique dans des conditions optimales de qualit et de quantit.
La premire technique mettre en uvre est donc l'extraction-purification d'ADN. Cette
technique comporte deux tapes.
La premire tape consiste librer l'ADN de la cellule, c'est l'tape d'extraction
Pour cela on va traiter l'chantillon dont on veut extraire l'ADN avec des procds qui vont
permettrent de :
- dissocier les tissus et individualiser les cellules : la digestion. La digestion des tissus
est ralise l'aide d'enzymes vont dtruire les protines liant les cellules les unes aux
autres (collagnase, trypsine, protinase K);
- dtruire les membranes cytoplasmique et nuclaire : la lyse cellulaire. La lyse des
cellules est ralise l'aide (1) de dtergents anioniques (ex. : SDS) qui vont permettre
de dsorganiser la structure des membranes (de nature lipoprotique) et (2) d'enzymes
protolytiques (ex. : protinase K) qui vont dtruire les protines. On peut galement
faire clater les cellules grce un tampon hypertonique ou par la chaleur.
L'extraction ralise, on aura un mlange d'ADN libre et des autres constituants cellulaires
(protines, lysozymes, organites, dbris membranaires etc.)
L'tape suivante consistera donc sparer l'ADN de ces autres constituants cellulaires, c'est
l'tape de purification. Pour la raliser, diffrentes techniques sont disponibles :
- purification phnol/chloroforme. Cette technique est bas sur le principe de la
solubilit diffrentielle des molcules entre deux phases non miscibles : l'ADN est
soluble dans la phase aqueuse et les contaminants (protines, lipides) dans la phase
organique. Le phnol est un dprotinisant puissant qui va dnaturer et solubiliser les
protines, et dans lequel l'ADN n'est pas soluble. Le chloroforme va quant lui
permettre d'liminer les traces de phnol qui auraient ou tre emportes avec la phase
aqueuse. L'ADN est ensuite rcuprer sous forme solide partir de la phase aqueuse
par prcipitation l'alcool (thanol ou isopropanol). Cette opration permet d'liminer
les molcules qui n'ont pas prcipit en mme temps que l'ADN (notamment les sels).
Le culot ainsi obtenu par prcipitation est resuspendu la concentration voulue dans
un tampon Tris/EDTA ou de l'eau.
- purification par utilisation de kits commerciaux. Les kits prsents ici sont le kit
Puregene de la socit Gentra et DNA easy Tissus kit de la socit Qiagen. Le
principe du kit Puregene est bas sur la prcipitation des protines (qui permet leur
limination), puis la prcipitation de l'ADN (limination des sels et des sucres) et sa
resuspension dans un tampon Tris/EDTA ou de l'eau. Le kit Qiagen quant lui est
bas sur le principe des interactions ioniques : l'ADN est d'adsorb sur une membrane
de silice en prsence de sels chaotropiques (qui dshydrate les molcules d'acides
nucliques). Les protines, les lipides et les polysaccharides ne sont pas retenus par la
membrane. Aprs lavage de la membrane, les acides nucliques sont ensuite lus
avec de l'eau ou avec le tampon d'lution fourni dans le kit (solution aqueuse
contenant trs peu de sel). On obtient un rendement d'lution 15 20% suprieur en
chauffant le tampon d'lution 70C).

27
Tableau 4 : comparatif des 3 mthodes (chaque critre est not sur une chelle de 1 3, 1
tant le moins bon et 3 le meilleur) :
Phnol Kit Puregene Kit Qiagen
chloroforme
Quantit/rendement 2 3 1
Puret de l'extrait 3 1 2
Rapidit 1 2 3
Cot 3 2 1
Scurit du manipulateur 1 3 3
Remarque : la technique phnol/chloroforme en elle-mme a un faible cot, mais celui
augmente considrablement si on intgre les cots d'achat et de maintenance des quipements
de scurit et la gestion des dchets (le phnol et chloroforme sont trs toxiques pour le
manipulateur et l'environnement).
Le dosage de l'ADN extrait peut tre :
- effectu par une mesure au photomtre, l'ADN absorbant fortement dans l'ultra-violet
260 nm. Une unit de densit optique 260 nm (DO260) correspond 50g/l pour
de l'ADN double brin. Une ventuelle contamination protique peut tre mesur 280
nm (DO280), et le rapport DO260/ DO280 est alors calcul. Pour une solution d'ADN
pure, ce rapport doit tre compris entre 1,8 et 2,1. Une contamination par le phnol
peut galement tre recherche par mesure de l'absorbance 270 nm (le phnol inhibe
la PCR);
- estim par migration lectrophortique sur gel d'agarose et comparaison avec un
ADN de concentration connue.

2- Migration lectrophortique et visualisation des fragments d'ADN


L'lectrophorse consiste sparer des fragments d'ADN, qui migre dans un gel soumis
un champ lectrique, en fonction de leur taille (plus la taille est leve et moins le fragment
migrera loin dans le gel et inversement, les plus petits fragments auront la distance de
migration la plus importante). Ceci est possible car la molcule d'ADN est charge
ngativement, elle se dplacera donc vers le ple positif (anode) de la cuve de migration. La
dtection de l'ADN est ensuite ralise par coloration au bromure d'thydium (BET, agent
chimique qui s'intercale entre les brins de l'ADN), puis par exposition aux UV. Les UV
excitent le colorant qui met alors une fluorescence rose/orange.
La migration et la sparation des fragments d'ADN vont tre raliss dans un gel d'agarose ou
d'acrylamide selon la rsolution souhaite (tableau 5) :
- gel d'agarose : en fonction du pourcentage d'agarose dans le gel, des fragments d'ADN
de quelques dizaines quelques milliers de paires de bases peuvent tre discrimins. Il
est utilis pour la visualisation de produits PCR;
- gel d'acrylamide : il est plus rsolutifs que le gel d'agarose et permet de sparer, en
fonction du pourcentage d'acrylamide dans le gel, des fragments des quelques dizaines
quelques centaines de paires de bases, la base prs. Il est utilis pour la sparation
fine de fragments d'ADN de taille voisines : squenage, analyses de polymorphismes
de longueur (microsatellites, AFLP).

28
Tableau 5 : rsolution des gels d'agarose et d'acrylamide en fonction du % respectivement
d'agarose et d'acrylamide :

Aprs coloration, cette technique permet de vrifier quantit, qualit et la taille de l'ADN.
C'est une technique de contrle qui peut tre mise en uvre diverses tapes des diffrents
protocoles de biologie molculaire. Ainsi, elle va permettre de visualiser l'ADN :
- aprs extraction-purification : valuation de la quantit et de la qualit;
- aprs amplification par PCR : valuation de la taille, de la quantit et de la spcificit
de l'amplification;
- obtenus aprs digestion par des enzymes de restriction : nombre de fragments,
valuation de leur taille.
La dtermination de la taille se fait l'aide d'un marqueur de poids molculaire qui est
compos de plusieurs fragments d'ADN de taille connue. Il dpos dans le gel et migre en
mme temps que les chantillons (figure 16)
Figure 16 :

L'valuation de la quantit d'un ADN est ralise par comparaison entre l'intensit du
fragment doser et les intensits d'une gamme de concentration connues d'un fragment
tmoin.
L'valuation de la qualit d'un d'ADN est ralise en observant le profil de migration. Un
extrait d'ADN gnomique non dgrad (coup) doit prsent, sur gel, une seule bande de haut
poids molculaire. Si l'ADN est dgrad, on observera des bandes supplmentaires de plus
petit poids molculaire.

3- PCR (Polymerase Chain Reaction ou raction de polymrisation en chane)


La PCR est l'amplification in vitro d'une squence d'ADN double-brin (ADN matrice) par
extension de deux amorces, situes de part et d'autre de la rgion considre, grce une

29
ADN polymrase, en prsence de nuclotides et d'ions Mg2+. L'amplification est effectue
par la rptition de cycles qui assure une duplication exponentielle de chaque brin.
Cette technique permet d'augmenter considrablement la quantit d'ADN cibl. Elle ncessite
de connatre les squences en nuclotides qui dlimitent la rgion d'ADN amplifier. Ces
squences serviront dfinir des amorces complmentaires de celles-ci, et qui seront les
points de dpart de l'amplification par la polymrase
La PCR comporte des cycles successifs. Chaque cycle comprend une succession 3 phases
(figure 17) :
- (1) une phase de dnaturation par la chaleur qui spare les deux brins d'ADN;
- (2) une phase d'hybridation des amorces:
- (3) une phase d'longation au cours de laquelle la polymrase synthtise, partir
d'une amorce, le brin complmentaire.
Figure 17 :

Cette technique pris un essor considrable avec la dcouverte d'une polymrase


thermorsistante issue d'une bactrie thermophile Thermus aquaticus, d'o son nom de Taq
polymrase. Elle a permis une automatisation des diffrents cycles (thermocycleur). Cette
polymrase n'a pas d'activit exonuclase 3'-5', elle n'est donc pas capable de corriger les
erreurs d'incorporation de nuclotides (un A au lieu d'un G en face d'un C par exemple). On
estime le taux d'erreur 1 mauvaise incorporation toutes les 10 000 ou 100 000 bases.
De nombreux paramtres peuvent influencer le rsultat de l'amplification :
- la temprature d'hybridation et la spcificit des amorces;
- la concentration en ions Mg2+;
- le nombre de cycle;
- la prsence d'inhibiteur;
- l'ajout d'adjuvants.
Pour plus d'information, se reporter au protocole " CBGP-BM0009_Polymerase Chain
Reaction".
Les utilisations des produits PCR sont trs varies. En voici quelques unes qui vont tre
dtailles par la suite :
- analyse de restriction : PCR-RFLP
- introduction dans un vecteur pour isoler les diffrentes formes allliques d'un gne :
clonage de produits PCR
- squenage
- gnotypage microsatellite
- gnotypage AFLP
- gnotypage SSCP

30
4- PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restricted Fragment Lenght
Polymorphism ou polymorphisme de longueur des fragments de restriction de produit
PCR)
Le produit PCR est soumis une digestion enzymatique par une enzyme de restriction. Si une
mutation ponctuelle modifie le site de restriction initialement prsent, la taille des fragments
d'ADN obtenus aprs digestion sera modifie et observable aprs migration des fragments
d'ADN sur gel (figure 18).
Figure 18 :

5- Purification de produits PCR


La purification des produits PCR consiste liminer les ractifs ayant servi raliser la PCR
(amorces, nuclotides, sels, polymrase) et qui risquent d'interfrer lors de l'utilisation de ces
produits PCR dans d'autres techniques (ex. : squenage, clonage).
Cette purification peut tre ralise :
- sur amplification PCR mono-bande par colonne (kit PCR Purification Qiagen) ou
raction enzymatique (ExoSap-IT USB Corporation);
- sur amplification multi-bande par colonne (kit PCR Gel Extraction kit de chez Qiagen
ou de chez Millipore) aprs migration et dcoupe sur gel des fragments d'intrt dans
le cas d'une amplification PCR multi-bande.
Le principe des kits colonne (Qiagen et Millipore) est le mme que pour l'extraction-
purification d'ADN : une membrane de silice retient spcifiquement l'ADN mais pas les
nuclotides, la polymrase, les sels et les amorces (qui sont trop petites pour tre adsorbes).
Une rcupration des fragments d'intrt sur gel peut tre ncessaires si l'amplification par
PCR a gnre de nombreuses bandes (problme de spcificit, duplication de gne,
contamination).
La purification enzymatique est ralise l'aide de deux enzymes : l'exonuclase I et une
phosphatase alcaline. La premire dgrade l'ADN simple brin et la seconde hydrolyse les
dNTP. Seul l'ADN double brin reste intact.

6- Squenage
Cette technique enzymatique est base sur la copie d'un fragment d'ADN simple-brin, que l'on
dsire squencer, par une ADN polymrase. On utilise des didesoxynuclotides (ddNTP)
coupls des fluorochrome (4 couleurs diffrentes, une par ddNTP). Ces drivs de
dsoxynuclotides ne possdent pas de OH l'extrmit 3' du dsoxyribose. L'incorporation
de ce ddNTP par la polymrase bloque l'allongement de la molcule d'ADN en cours de
copie. En effet, l'allongement d'une chane polynuclotidique par une polymrase ncessite
qu'un groupement OH soit disponible en 3' (voir les liaisons phosphodiesters entre les
nuclotides).
Lors de la raction de squence, les fragments d'extension sont marqus en 3' par
lincorporation des didoxynuclotides (ddNTPs) fluorescents (4 couleurs de marquages

31
diffrents pour les 4 ddNTPs). Ces ddNTPs bloquent galement la raction d'longation. Les
fragments de diffrentes tailles ainsi synthtiss sont ensuite spars par lectrophorse. La
fluorescence de chaque fragment est lue laide dun laser, la succession des couleurs permet
alors de dterminer la squence nuclotidique.
Les fragments de diffrentes tailles ainsi synthtiss vont ensuite migrer dans un gel
d'acrylamide en fonction de leur taille (figure 19).
Figure 19 :

La lecture du gel est ralise par le balayage automatique d'un laser qui permet de discriminer
les 4 bases qui sont couples 4 fluorochromes diffrents (A-Hex vert; T-Rox rouge; C-Fam
bleu; G-Ned jaune). Le rsultat de ce balayage se prsente sous la forme d'un
lectrophorgramme reprsentant la succession des bases composant le fragment d'ADN
squenc (figure 20).
Figure 20 :

7- Microsatellites
Les microsatellites sont des segments d'ADN contenant des rptitions en tandem de courts
motifs di, tri ou ttra-nuclotidiques (le plus typique tant CA/GT). Le polymorphisme des
microsatellites rside dans le nombre de rptitions du motif.
La technique consiste amplifier par PCR une rgion d'ADN contenant un motif
microsatellite. L'une des deux amorces utilises pour raliser la PCR est marque avec un
fluorochrome. Le fragment fluorescent obtenu migre ensuite dans un gel d'acrylamide et,
comme pour la squence, la fluorescence est dtecte l'aide d'un laser. On pourra alors
observer des diffrences de taille d'allle (en fonction du nombre de rptitions du
microsatellite) d'un individu l'autre et dterminer l'tat homo ou htrozygote de ces
individus. Les microsatellites sont donc des marqueurs co-dominants. Un marqueur co-
dominant est un marqueur qui permet de dtecter simultanment les diffrentes versions
allliques d'un gne chez un individu htrozygote (ex. : PCR-RFLP, microsatellites). Un
marqueur dominant ne permet pas de distinguer un individu htrozygote d'un individu

32
homozygote car les diffrentes versions allliques ne sont pas simultanment dtectables (ex.
: AFLP).
Dans l'exemple (figure 21) suivant, pour un mme locus, deux individus prsentent des profils
microsatellites diffrents : l'individu 1 est htrozygote (un allle 90 et allle 150), l'individu 2
est homozygotes (2 allles 100) :
Figure 21 :

8- AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorphism ou polymorphisme de longueur


de fragments amplifis) (figure 22)
La technique AFLP permet de gnrer des marqueurs gntiques sans dveloppement
pralable (pas besoin de savoir sur quelles portions d'ADN on travaille, donc pas d'obligation
de dfinir des amorces spcifiques pour l'amplification). Son principe est bas sur la dtection
de bandes polymorphes entre individus dans un profil multi-bandes obtenu par digestion de
restriction et puis amplification PCR.
Cette technique consiste donc digrer l'ADN gnomique l'aide de deux enzymes de
restriction reconnaissant des sites de restriction diffrents. Les fragments obtenus, de
longueurs diffrentes, sont ensuite lis chacune de leurs extrmits des adaptateurs de
squences nuclotidiques connues. Ces adaptateurs sont spcifiques : ils ne sont compatibles
qu'avec les extrmits gnres par la digestion d'une enzyme de restriction donne (par
exemple, l'adaptateur EcoRI ne peut se fixer qu' l'extrmit d'un fragment d'ADN qui a t
coup par l'enzyme de restriction EcoRI). Ces adaptateurs permettent ensuite l'hybridation
d'amorces spcifiques (la squence de l'amorce est complmentaire celle de l'adaptateur) et
l'amplification par une srie de PCR. La premire PCR est dite pr-slective : on ajoute 1
base d'ancrage aux l'amorces en plus de la squence de l'adaptateur, ce qui va permettre de
n'amplifier qu'un sous-ensemble des fragments d'ADN prsents dans le mlange (la premire
base du fragment d'ADN, juste aprs l'adaptateur, est soit un A, un T, un C ou un G, et si on
ajoute un C l'amorce, seuls les fragments commenant par G pourront tre amplifis). La
deuxime PCR est dite slective : on ajoute 3 bases d'ancrage aux amorces (dont la premire
est la mme que celle ajoute pour la PCR slective) et l'une des amorces est marque l'aide
d'un fluorochrome. On diminue ainsi la complexit du mlange de fragments, de manire
obtenir un profil constitu de seulement quelques dizaines de bandes distinctes. Les fragments
fluorescents obtenus migrent ensuite dans un gel d'acrylamide et leur fluorescence est dtecte
l'aide d'un laser. On pourra alors observer des profils multi-bandes caractristiques des
individus (ces profils sont fonction de la prsence ou de l'absence des sites de restriction)
(figure 23). La technique AFLP gnre des marqueurs dominants.

33
Figure 22 : Figure 23 :

Dans l'lectrophorgramme ci-dessus, 2 bandes sont


prsentent chez l'individu 1 et pas chez l'individu 2
(flches noires) et inversement 3 bandes sont
prsentent chez l'individu 2 et pas chez l'individu 1
(flches rouges).

9- SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism ou polymorphisme de


conformation simple brin)
La technique SSCP repose sur le fait que la conformation tridimensionnelle d'une molcule
d'ADN simple brin est fonction de sa squence nuclotidique : deux allles d'un mme
marqueur ne se comporteront pas de la mme manire dans l'espace, l'tat simple brin. Ils
auront donc des vitesses de migration diffrentes dans un gel d'lectrophorse non dnaturant
(respectant donc la conformation des molcules). Cette proprit est mise profit pour
dtecter les mutations ponctuelles.
Cette technique consiste amplifier par PCR une rgion d'ADN contenant une ou plusieurs
mutations ponctuelles. Les deux amorces utilises pour raliser la PCR sont marques avec
deux fluorochromes diffrents. Les fragments fluorescents obtenus migrent ensuite dans un
gel d'acrylamide et leur fluorescence est dtecte l'aide d'un laser. On pourra alors observer
des diffrences de vitesse de migration (figure 24). Comme les microsatellites, les SSCP sont
des marqueurs co-dominants.
Figure 24 :

34
10- Clonage
La technique de clonage est base sur la fragmentation de l'ADN gnomique par des
enzymes de restriction, puis l'insertion de ces fragments (inserts) dans un vecteur. Ce vecteur
permet alors l'introduction et la multiplication de la squence dans un microorganisme hte
(gnralement des bactries). Chaque cellule hte intgrera un fragment d'ADN diffrent et
l'ensemble de ces clones constituera une banque d'ADN gnomique. Le clonage permet
donc disoler des fragments dADN et de les amplifier en quantits illimites.
Les diffrentes tapes du clonage sont :
- la prparation du vecteur (digestion) (figure 25). Le vecteur doit tre linaris par
coupure l'aide d'une enzyme de restriction l'endroit o l'on dsire insrer le
fragment d'ADN. Les extrmits ainsi libres doivent tre traites par la phosphatase
alcaline de telle sorte que celui-ci ne puisse pas se refermer sur lui-mme, seul l'ADN
insrer permettant le raboutage;
- la prparation de l'ADN insrer (digestion) (figure 25). L'ADN est dcoup en
fragments par une enzyme de restriction crant des extrmits compatibles avec celles
du vecteur:
- la ralisation du recombinant (ligation) (figure 25). Le vecteur et l'ADN insrer
sont mlangs en prsence d'une ligase qui permet la ligation entre les extrmits du
vecteur et celles de l'ADN insrer;
- l'incorporation l'hte (transformation) (figure 25). Pour se rpliquer, le vecteur
doit tre incorpor dans une cellule hte;
- l'isolement des diffrent clones cellulaires (figure 25), contenant des inserts
diffrents, par talement sur un milieu nutritif dans des botes de Ptri;
- la slection des clones ayant incorpors un fragment d'ADN gnomique (figure
25). Cette slection est rendue possible par la prsence de deux gnes de slection
dans le vecteur : (1) un gne qui confre la cellule hte une rsistance un
antibiotique : les cellules n'ayant pas incorpor un vecteur meurent en prsence de
l'antibiotique, (2) un gne codant pour une protine facilement dtectable (gne lacZ
en gnrale) : si un insert est prsent dans le vecteur, il se trouve au milieu du gne de
slection et la protine n'est pas synthtise.
Figure 25 :

35
- la recherche du fragment d'intrt (hybridation) (figure 26). Parmi tous les clones
cellulaires ayant reu un vecteur contenant un insert, il faut trouver le clone qui
contient le fragment d'ADN que l'on veut tudier. Pour ce faire, les clones cellulaires
sont transfrs sur une membrane et lyss de faon librer l'ADN. Un traitement fixe
l'ADN vecteur sur la membrane, puis on hybride une sonde marque (radioactivit,
biotine, enzyme) et complmentaire du fragment recherch. Seuls les clones qui ont
incorpor le fragment recherch, et sur lequel la sonde s'est fixe, seront visibles aprs
rvlation (clones positifs).

Figure 26 :

L'tude du polymorphisme de l'ADN repose sur une srie d'outils en nombre limit, mais qui
combins entre eux permettent d'imaginer et de crer un nombre sans cesse croissant de
techniques de biologie molculaire. Nous n'avons vu ici qu'un certain nombre d'entre elles :
cette discipline est en perptuelle volution et un grand nombre de nouvelles techniques ont
fait leur apparition ces dernires annes.

36
Annexes

Annexe I : Les diffrentes phases de la mitose


La mitose, ou division cellulaire, est le mcanisme par lequel se transmet l'information
gntique de la cellule mre aux cellules filles. Elle comprend quatre phases :
- Prophase;
- Mtaphase;
- Anaphase;
- Tlophase.

Durant l'interphase qui prcde la mitose, chaque molcule d'ADN est rplique mais les deux
copies ne se sparent pas totalement; elles restent unies au niveau du centromre.
Au dbut de la mitose, en prophase, on assiste une extraordinaire condensation des
molcules d'ADN. Chaque molcule d'ADN forme alors un btonnet trs colorable appel
chromatide. Les deux chromatides correspondant aux deux copies d'une mme molcule
d'ADN demeurent unies au niveau du centromre et forment le chromosome mitotique (ou
chromosome fissur). En mtaphase, tous les chromosomes se rangent au milieu du noyau
puis en anaphase, les deux chromatides de chaque chromosome se sparent et s'loignent
l'une de l'autre pour se retrouver aux deux ples opposs de la cellule. Durant la tlophase, le
cytoplasme se divise entre les deux lots de chromatides ce qui aboutit la formation de deux
cellules filles ayant reu chacune une chromatide de chaque chromosome, c'est--dire une
copie de chacune des molcules d'ADN de la cellule mre, c'est--dire encore la totalit de
l'information gntique de la cellule mre.

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Annexe II : Glossaire
AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorphism) : polymorphisme de la longueur des
fragments d'ADN obtenus aprs digestion par des enzymes de restriction et amplification par
PCR.
Allles : versions alternatives dun mme gne qui diffrent par leur squence nuclotidique.
Amorce : courte squence de nuclotides complmentaire du dbut dune matrice et servant
de point de dpart son recopiage par une polymrase.
Anti-parallle : se dit de lorientation inverse des brins complmentaires de lADN. Il en
rsulte que lextrmit 5 dun brin est en regard de lextrmit 3 de lautre brin.
Autosome : chromosome non sexuel.
Bactrie comptente : se dit dune bactrie ayant subi un traitement lui permettant
dincorporer de lADN exogne (transformation).
Banque : collection de clones cellulaires (bactrie par exemple) o chaque cellule renferme
un exemplaire diffrent dADN recombin un vecteur.
Carte de restriction : ordre de la disposition des sites de restriction prsents sur un segment
dtermin d'ADN.
Chromatide : copie conforme de chaque chromosome se matrialisant au cours de la
mtaphase et se sparant de sa copie parentale lors de lanaphase.
Chromatine : structure associant lADN des protines (histone) dans le noyau pendant
linterphase.
Clonage molculaire : recombinaison in vitro dun fragment dADN avec un vecteur se
rpliquant de manire autonome lintrieur dune cellule hte (bactrie par ex). La culture
de cette cellule contenant le vecteur recombin permet disolement de lADN insr ltat
pur et en quantits illimites.
Code gntique ou codon : triplet de nuclotides codant pour un acide amin donn.
Codominance : dsigne les caractres hrditaires dont les diffrentes versions sont
simultanment dtectables chez un htrozygote.
Complmentarit : rgle universelle dappariement des bases des acides nucliques, selon
laquelle A sassocie avec T et G avec C.
Crossing-over : change rciproque de matriel gntique entre chromosomes homologues,
survenant en gnral au moment de la miose.
Dltion : perte dune ou plusieurs paires de bases conscutives par rupture de continuit de
la molcule dADN.
Dnaturation de lADN : passage de la forme double-brin la forme simple brin. Elle est
obtenue le plus souvent par la chaleur. Se dit galement pour labolition de la structure
secondo-tertiaire de lADN simple brin.
Dsquilibre de liaison : situation dans laquelle deux allles correspondant deux loci
distincts d'un mme chromosome sont plus frquemment associs dans une population que ne
le voudrait le hasard (voir Equilibre de liaison). Une telle association alllique prfrentielle
est favorise par : (1) la proximit physique des loci sur le chromosome; (2) le caractre
rcent de la mutation ayant produit l'un des allles; (3) l'existence d'un avantage slectif.
Diplode : jeu de chromosome o chaque autosome est en double exemplaire et comportant
deux chromosomes sexuels.

38
Distance gntique : (1) sur une carte gntique dsigne un intervalle entre deux loci,
calcul d'aprs la frquence des recombinaisons observes; (2) sur un arbre phylogntique
dsigne l'intervalle de temps coul pour permettre d'accumuler les diffrences observes
entre deux squences homologues dans deux espces diffrentes.
Divergence : pourcentage de diffrences de squence nuclotidique entre deux ADN
apparents.
Dominant : se dit dun allle ou dune mutation qui, ltat htrozygote, conditionne le
phnotype.
Empreinte gntique (DNA finger printing) : assortiment d'allles mis en vidence dans
l'ADN gnomique grce des sondes explorant simultanment plusieurs loci hautement
polymorphes (ex. : microsatellites). Permet de caractriser le gnotype de chaque individu
des fins d'identification ou de filiation. Encore appele carte d'identit gntique.
Endonuclases : enzymes coupant la liaison entre deux nuclotides (liaison phosphodiester)
l'intrieur d'un acide nuclique. Ces enzymes sont spcifiques d'un type d'acide nuclique :
ARN simple brin, ARN hybrid de l'ADN, ADN simple brin, ADN double brin.
Enzyme de restriction : endonuclase bactrienne coupant spcifiquement les deux brins
d'ADN au niveau d'une squence, en gnrale palindromique, parfaitement dfinie (de 4 8
nuclotides).
Elongation d'amorce : extension dans le sens 5' vers 3' par une polymrase d'une amorce
d'ADN permettant la copie d'un brin matrice.
Epissage : se dit du mcanisme d'excision des introns et de raboutage des exons lors de la
maturation des transcrit.
Equilibre de liaison : se dit de l'absence d'association alllique prfrentielle pour deux loci
d'un mme chromosome, atteste par une distribution conforme aux lois statistiques.
Exon : squence de gne dont le transcrit persiste dans l'ARN messager aprs pissage.
Chaque exon reprsente une squence codante.
Exonuclases : enzymes dtruisant les acides nucliques de proche en proche partir d'une
ou des deux extrmits.
Gne : squence de nuclotides contenant l'information pour la production d'une protine
particulire.
Gnotype : constitution gntique d'un individu.
Haplode : jeu de chromosome o il n'existe qu'un seul exemplaire de chaque autosome et un
seul chromosome sexuel.
Htrozygotie : situation gnotypique o deux loci homologues d'une mme paire de
chromosome portent chacun un allle diffrent.
Homozygotie : prsence du mme allle sur les deux chromosomes d'une mme paire.
Hybridation : appariement par complmentarit des bases (A-T et G-C) de deux squences
nuclotidiques complmentaires.
Insert : fragment d'ADN exogne insr dans un vecteur.
Intron : squence d'ADN transcrite puis limine par pissage lors de la maturation d'un
ARN.
Ligation : union par une liaison 3'OH-5'phosphate de deux fragment d'ADN au niveau de
deux nuclotides adjacents.
Locus (pluriel : loci) : emplacement d'un segment d'ADN sur un chromosome.
39
Marqueur gntique : trait gnotypique ou phnotypique permettant de distinguer des
individus diffrents.
Miose : dsigne les deux divisions cellulaires particulires (division rductionnelle et
division quationnelle) qui constituent le stade ultime de la gamtogense.
Microsatellites : segments d'ADN contenant des rptitions en tandem de courts motifs di, tri
ou ttra-nuclotidiques (le plus typique tant CA/GT). Le polymorphisme des microsatellites
rside dans le nombre de rptitions du motif.
Mutation : dsigne n'importe quel changement intervenu dans la squence d'ADN. S'il ne
concerne qu'une seule base, on parle de mutation ponctuelle.
Palindrome : brins d'ADN complmentaire dont la squence est identique quand elle est lue
de gauche droite sur un brin et de droite gauche sur l'autre (donc dans les deux cas de 5'
vers 3'), ex. : 5' CCATGG 3'
3' GGTACC 5'
PCR (Polymerase Chain Reaction) : amplification in vitro d'une squence d'ADN double-
brin par extension de deux amorces, situes de part et d'autre de la rgion considre, grce
une ADN polymrase. L'amplification est effectue par la rptition de cycles de
dnaturation/hybridation/longation qui assure une duplication exponentielle de chaque brin.
Phnotype : manifestation apparente de la constitution du gnome sous la forme d'un trait
morphologique.
Plasmide : ADN circulaire prsent dans les bactries et qui se rplique de faon autonome. Il
peux porter des gnes de rsistance aux antibiotiques, et est utilis comme vecteur dans la
technique de transformation bactrienne.
Polymorphisme gntique : prsence dans une population d'au moins deux variantes
allliques d'un mme gne.
Polymorphisme de restriction : variation individuelle de la squence en bases du gnome
modifiant un ou plusieurs sites de restriction. Elle donne lieu des versions alternatives de la
taille des fragments d'ADN obtenus avec une enzyme de restriction donne (techniques PCR-
RFLP, AFLP).
Polymorphisme de squence : toute variation individuelle de la squence nuclotidique en
un site donn du gnome.
Recombinaison gntique in vitro : assemblage exprimental de squence d'ADN (ex. :
insertion d'un ADN exogne dans un vecteur).
Renaturation (ou rassociation) de l'ADN : appariement des brins complmentaires d'un
ADN pralablement dnatur.
Rcessif : se dit d'un allle ou d'une mutation n'influanant pas le phnotype l'tat
htrozygote.
Rplication : processus de duplication l'identique d'une molcule d'ADN en deux molcules
filles.
Semi-conservative : dsigne le fait qu'au cours de la rplication, chaque brin d'un ADN
double-brin sert de matrice pour former une copie complmentaire.
Site de restriction : squence d'ADN double-brin reconnue et coupe par une enzyme de
restriction donne.
Sonde : squence d'acide nuclique, d'au moins 15 nuclotides, homologue une squence
d'ADN avec laquelle elle s'hybride de faon stable et spcifique par association entre bases
complmentaires.

40
SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) : variation de conformation tri-
dimentionnelle d'un brin d'ADN induite par une variation de squence nuclotidique. Cette
proprit est mise profit pour dtecter les mutations ponctuelles.
SSR (Simple Sequence Repeat) : voir Microsatellite.
STR (Short Tandem Repeat) : voir Microsatellites.
Taq polymrase : ADN polymrase thermorsistante extraite de la bactrie Thermus
aquaticus et utilise pour l'amplification in vitro de l'ADN (PCR) temprature leve
(environ 70C).
Temprature de fusion (Tm) : point d'inflexion de la courbe de fusion d'un segment d'ADN,
correspondant virtuellement une dnaturation de la moiti de la squence.
Temprature d'hybridation (Ta) : point d'inflexion de la courbe d'hybridation d'une sonde
ou d'une amorce sur un segment d'ADN, correspondant virtuellement une hybridation de la
moiti des sondes/amorces.
Traduction : synthse d'une protine par les ribosomes partir d'un ARN messager matur.
Transcription : synthse d'ARN par une ARN polymrase partir d'une matrice d'ADN.
Transcrit : ARN produit par la transcription d'un gne.
Transformation bactrienne : technique exprimentale consistant faire pntrer un
fragment d'ADN exogne dans une bactrie.
Transversion : mutation ponctuelle entranant la substitution d'une base par purique par une
base pyrimidique ou vice versa.
Vecteur : squence nuclotidique capable de s'autorpliquer, utilise pour la recombinaison in
vitro de l'ADN et son amplification extra-chromosomique (clonage) (ex. : plasmide,
bactriophage).
Zygote : cellule diplode rsultant de la fusion de deux gamtes parentaux (cellules
haplodes).

41