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MOLECULAIRE
DAKAR Septembre 2006
V- La structure de l'ADN p5
III- L'ADN p7
1- Caractristique de l'ADN p7
2- Proprits physico-chimiques de lADN p8
3- Hybridation des acides nucliques et des sondes nucliques p9
La rplication de l'ADN
I- Caractristiques gnrales de la rplication p12
1
II- Elments ncessaires la rplication de l'ADN p12
La traduction
I- Caractristiques gnrales de la traduction p18
2
Le polymorphisme de l'ADN
I- Types de polymorphisme p22
1- Macrolsions de l'ADN : les remaniements chromosomiques p22
2- Microlsions de l'ADN : les mutations ponctuelles p22
3- Squences rptes en tandem p23
Annexes
Annexe I : Les diffrentes phases de la mitose p38
3
La naissance de la biologie molculaire
Le XXe sicle concide avec la naissance gntique : dbutant avec la redcouverte des
travaux de Mendel prcisment en 1900, se poursuivant par l'laboration de la thorie
chromosomique de l'hrdit au dbut du sicle, la dcouverte de l'ADN comme support
biochimique de l'information gntique, l'lucidation de sa structure, et l'explosion de la
biologie molculaire partir des annes 70.
4
d'Erwin Chargaff (1905-1992) ou de Alfred Hershey (1908-1997). L'acceptation dfinitive
ne viendra qu'avec l'lucidation de la structure de l'ADN par Watson et Crick.
V- La structure de l'ADN
Finalement, c'est avec l'lucidation de la structure en double hlice de l'ADN par James
Dewey Watson (1928-) et Francis Harry Compton Crick (1916-2004) en 1953 que la
biologie molculaire connat son apothose. Ils tablissent en effet un model molculaire
l'aide de l'ensemble des donnes acquises sur l'ADN depuis le dbut du sicle. Cette structure
est aujourd'hui connue de tous, elle est devenue l'emblme de la biologie molculaire (voire la
couverture de ce document!
En outre, Crick a apport d'importantes contributions plusieurs domaines de la biologie
molculaire : c'est lui que l'on doit notamment le dogme central de la biologie, qui stipule
que le flux d'information depuis les acides nucliques vers les protines est sens unique.
5
La structure des acides nucliques
Les acides nucliques ont t isols initialement des noyaux des cellules. On peut en
distinguer deux grands types : les acides dsoxyribonucliques (ADN) et les acides
ribonucliques (ARN). Les premiers sont essentiellement localiss dans le noyau des cellules
et les seconds dans le cytoplasme cellulaire. Les acides nucliques (ADN et ARN) sont des
macromolcules et constitus de sous-units appeles nuclotides.
I- Les nuclotides
Figure 1 :
2- Nomenclature (tableau 1)
Lassociation ose-base est appele nucloside.
L'association acide phosphorique-ose-base est appele nuclotide.
Les nuclosides et nuclotides base purique (A et G) ont respectivement une terminaison
"ine" et "ylique".
Les nuclosides et nuclotides base pyrimidique (C, T et U) ont respectivement une
terminaison "idine" et "idylique".
6
Tableau 1 : Nucloside Nuclotide
Base Code
(ose+base) (ac P+ose+base)
adnine adnosine acide adnylique A
guanine guanosine acide guanylique G
cytosine cytidine acide cytidylique C
thymine thymidine acide thymidylique T
uracile uridine acide uridylique U
Figure 2 :
III- L'ADN
1- Caractristique de l'ADN
Le ADN prsente plusieurs caractristiques propres et qui l'opposent aux ARN :
- lose : le 2-dsoxyribose (remplac par le ribose dans les ARN);
- les bases : A, C, G et T. Dans les ARN, T est remplac par U;
7
- la molcule dADN est constitue de deux chanes (ou brins) de nuclotides. Les
molcules dARN sont le plus souvent sous forme simple brin.
D'autre part, la double chane dADN possde les caractristiques suivantes :
- elle est antiparallle : les deux brins de la molcule dADN sont disposs dans des
directions opposes. Un brin est orient dans une direction 53, et le second brin
sera parallle au premier et dans la direction inverse 35;
- elle est complmentaire : lappariement des bases des deux brins dune molcule
dADN se fait suivant la rgle de complmentarit: A appari avec T, C appari avec
G. Cette complmentarit repose sur des raisons striques (encombrement dans
lespace) et sur la formation de liaisons hydrogne. Les liaisons hydrogne sont
formes par linteraction entre un atome dhydrogne et deux autres atomes dits
lectrongatifs (oxygne et azote). Les liaisons hydrogne sont au nombre de deux
entre A et T et de trois entre C et G (figure 3);
- elle est hlicodale : dans lespace les deux chanes prsentent une configuration
hlicodale. Elles senroulent autour dun axe imaginaire pour constituer une double
hlice rotation droite.
Figure 3 : Figure 4 :
8
surtout 280 nm. Cette absorption dans lUV permet de doser les acides nucliques et
destimer la contamination par les protines lors de la purification des acides nucliques.
Dans les cellules, la molcule dADN nuclaire prsente diffrents niveaux d'enroulement et
de compaction (figure 5). Elle est fortement associe des protines pour constituer la
chromatine. Limage la plus classique est celle du collier de perles. La molcule dADN relie
les perles qui sont des complexes protines-ADN appels nuclosomes. Le nuclosome
contient environ 200 paires de bases d'ADN associes des protines appeles histones. Les
histones sont des protines de petit poids molculaire (11-14 kDa), riches en acides amins
basiques. Dans un nuclosome, elles sont au nombre de 8 avec deux exemplaires de chacune
des histones: H2A H2B, H3 et H4. Au niveau d'un nuclosome, l'ADN (200 pb) est donc
associ un octamre d'histone. Lhistone H1 nappartient pas au nuclosome, mais
interviendrait dans le contact entre deux nuclosomes. Ce collier de perles peut subir des
enroulements successifs avec formation de structures de type solnode.
Figure 5 :
9
3- Hybridation de l'ADN avec des sondes nucliques
Lhybridation est une proprit fondamentale des acides nucliques qui repose sur les rgles
de complmentarit. Il est possible dapparier des brins dADN (ou dARN) avec des
oligonuclotides ou polynuclotides qui reconnaissent spcifiquement des squences sur les
brins dADN de manire anti-parallle et complmentaire. Ces oligo- ou polynuclotides sont
appels sondes nucliques ou amorces selon leur utilisation.
10
Figure 6 :
b- Les petits ARN nuclaires (ou snRNA pour small nuclear RNA)
Ils sont prsents dans le noyau des cellules et sont impliqus dans certaines tapes de la
transcription (copie de l'ADN en ARN messager).
11
La rplication de l'ADN
Lors de la mitose (ou division cellulaire, voire Annexe I), une cellule-mre donne deux
cellules-filles, et il est essentiel que lADN prsent dans les cellules-filles soit la copie
identique de lADN prsent dans la cellule-mre. Cette copie de lADN est indispensable
raliser avant la mitose : c'est la rplication de lADN. Pralablement toute division
cellulaire, la quantit dADN est multiplie par deux (figure 7). Les mcanismes de
rplication conditionnent donc le droulement de la division cellulaire.
Figure 7 :
12
Les brins spars de lADN sont stabiliss sous forme simple brin grce la fixation de
protines appeles SSB (pour single strand binding ). Ces protines SSB empchent les
deux brins dADN de se rapparier.
Une enzyme appele primase synthtise une petite amorce dARN (environ 10 nuclotides).
Cette amorce va servir de point de dpart l'ADN polymrase pour la synthse du brin
complmentaire d'ADN dans le sens 5 3. En effet, l'ADN polymrase est incapable de
commencer la synthse dune chane dADN sans amorce.
Les amorces dARN seront ensuite dtruites et hydrolyses par lintervention dune
enzyme, la RNAse H. Elles seront remplaces par des fragments dADN. Les lacunes
engendres par lenzyme RNAse H sont combles par une ADN polymrase. Finalement,
les fragments dADN deviennent contigus et sont souds les uns aux autres par
lintervention dune enzyme qui est une DNA-ligase.
Figure 8 :
13
V- Rparation des erreurs
Des altrations de l'ADN peuvent provenir d'erreurs commises par la polymrase durant la
rplication. L'ADN polymrase prsente, outre l'activit de synthse 53, une activit
exonuclasique 35 qui lui permet de vrifier si la dernire base introduite correspond bien
aux conditions classiques dappariement. Cette activit ddition diminue considrablement
les erreurs possibles. Au cours de la rplication, il est estim que l'ADN polymrase incorpore
une base incorrecte (erreur d'appariement) tous les 104 105 nuclotides, mais avec les
fonctions d'dition, finalement le taux d'erreur passe 1 pour 109 nuclotides incorpors.
14
La transcription de l'ADN en ARN messager
La transcription constitue lensemble des mcanismes par lequel lARN messager (ARNm)
est synthtis. L'ARNm est une copie dune portion de lADN. Seules certaines portions de
lADN sont transcrites, ces squences dADN sont appeles gnes. Enfin, seul lun des deux
brins dADN est copi en ARNm. La transcription constitue ltape prliminaire essentielle
pour la biosynthse protique (ou traduction).
Figure 9 :
1- Linitiation de la transcription
Cette tape implique la reconnaissance par l'ARN polymrase d'une rgion de l'ADN, le
promoteur, qui se trouve juste avant le dbut de la rgion d'ADN transcrire. Par
15
convention, on donne le chiffre +1 au premier nuclotide partir duquel la transcription
commence. L'ARN polymrase se fixe ensuite sur l'ADN et spare localement les deux brins,
crant ainsi une courte rgion simple brin qui servira de matrice pour l'appariement des
premiers ribonuclotides.
Figure 10 :
16
IV- La maturation des produits de transcription
La plupart des gnes codant pour des protines prsentent une structure discontinue,
comportant des exons et des introns. Les exons sont les squences dADN qui seront
traduites en protines (on dit aussi quelles seront exprimes). Les introns sont des squences
non codantes dADN intercales entre les exons.
La transcription correspond l'tape de copie dun gne et la formation dun transcrit
primaire (ou pr-ARNm). Ce transcrit primaire correspond une copie intgrale des exons et
des introns dun gne. Pour que ce pr-ARNm devienne un ARNm et puisse servir de matrice
pour la synthse de protines, il doit subir plusieurs phases de maturation : addition d'une
coiffe, addition d'une queue polyA et limination des introns.
Figure 11 :
Gnralement, une cellule peut pisser le transcrit primaire de diffrentes faons, et donner
ainsi plusieurs protines diffrentes partir dun seul gne (ainsi une protine A peut tre
constitue des exons 1, 2 et 3 et une protine B des exons 1 et 3 uniquement). Ce processus
est appel pissage alternatif ou pissage diffrentiel.
17
La traduction
18
Figure 13 :
19
est une peptidyl-transfrase. Cette activit enzymatique est porte par la grande sous-unit du
ribosome. Finalement la fin de cette phase, on a un dipeptide (peptide constitu de deux
acides amins) qui est log dans le site A de la grande sous-unit du ribosome. Le site P du
ribosome est alors libre;
- troisime tape : la translocation
Aprs la formation de la nouvelle liaison peptidique, le deuxime acide amin (toujours li
son ARNt) se dplace du site A vers le site P. Le ribosome se dplace donc dun cran (d'un
codon) sur l'ARNm dans la direction 53. Un nouveau codon (codon 3) se trouve alors en
face du site A.
Tableau 2 :
20
2- Le code gntique est universel
Le code gntique est dit universel : il le mme pour tous les organismes aussi bien chez les
eucaryotes que chez les procaryotes.
21
Le polymorphisme de l'ADN
Le polymorphisme peut tre dfini comme l'existence de deux ou plusieurs formes allliques
pour un mme locus entre individus d'une mme espce. Il est possible d'identifier des
polymorphismes de l'ADN diffrentes chelles, allant du niveau chromosomique
(remaniements) au niveau nuclotidique (mutations ponctuelles).
I- Types de polymorphisme
Le polymorphisme provient de modifications de la squence d'ADN, les mutations, qu'on peut
classer selon ltendue de la lsion de lADN : les macrolsions et les microlsions.
22
3- Squences rptes en tandem (VNTR : Variable Number of Tandem Repeats)
Les VNTR sont constitues d'un nombre variable de rptitions en tandem d'un motif de taille
variable. En fonction de la taille du motif et de la rptition, on distingue :
- les satellites : le motif comporte 2 plus de 100 nuclotides et le nombre de rptition
peut dpasser les 1000;
- les minisatellites : le motif comporte de 6 24 nuclotides et le nombre de rptition
est de 20 50;
- les microsatellites : le motif comporte 1 4 nuclotides et le nombre de rptition ne
dpasse gnralement pas 25.
La fonction des VNTR reste inconnue, sauf dans le cas des minisatellites de l'ADN
tlomrique o une fonction suppose est de protger l'extrmit des chromosomes de la
dgradation et d'en permettre la rplication.
23
3- Conversion gnique
La conversion gnique est un mcanisme de recombinaison permettant un transfert
d'information gntique qui conduit au remplacement d'une squence d'ADN par une autre
apparente. Ce remplacement lieu lors de la rparation d'une lsion de l'ADN par la
polymrase (figure 15 : c'est un fragment apparent "b" qui sert de matrice pour la rparation
de la partie manquant "a")
Figure 15 :
5- Glissement intra-chromatidien
Le glissement intra-chromatidien modifie le nombre de rptition des VNTR. Il se produit par
glissement de l'ADN polymrase conscutif un msappariement lors de la rplication : la
polymrase "drape" et est alors incapable de reproduire fidlement le nombre de rptitions
d'origine.
24
Les outils et techniques de la biologie molculaire
La biologie molculaire applique la gntique a pour but l'tude d'une rgion du gnome et
la recherche d'un gne, voire d'une mutation. Les techniques de gntique molculaire,
reposant sur un nombre limit d'outils, ont donc pour objectif de cibler le fragment intressant
au sein d'une molcule d'ADN des millions de fois plus grande. Le facteur "quantit" est le
plus souvent limitant : la quantit d'ADN contenue dans une cellule.
1- Les enzymes
Les principales enzymes utilises en biologie molculaire sont :
- les enzymes de restriction (tableau 3)
Les enzymes de restriction sont issues des bactrie (l'abrviation enzymatique est dtermine
par la source bactrienne). Elles reconnaissent un site spcifique de l'ADN (souvent 4 ou 6
paires de bases palindromiques), et coupent la molcule d'ADN dans ce site. Elles permettent
d'obtenir, partir d'une molcule entire, des fragments d'ADN dont la longueur et le nombre
vont dpendre de la frquence et de la rpartition des sites de restriction sur la molcule
d'ADN d'origine. La coupure peut gnrer des bouts francs ou des bouts cohsifs. Elles sont
utilises dans de nombreuses techniques de biologie molculaire, comme la PCR-RFLP, les
AFLP, le clonage
Tableau 3 :
25
notamment dans les techniques de clonage et dans l'addition d'adaptateurs de l'ADN
gnomique digr (AFLP par ex.).
- les phosphatases
Les phosphatases liminent le groupement phosphate l'extrmit 5' d'un acide nuclique.
- les kinases
Les kinases ajoutent un groupement phosphate l'extrmit 5' d'un acide nuclique.
26
1- Extraction Purification de l'ADN
Pour pouvoir tudier le polymorphisme de l'ADN, il faut dans un premier temps accder la
molcules d'ADN. Pour ce faire l'ADN doit imprativement tre purifi partir du matriel
biologique dans des conditions optimales de qualit et de quantit.
La premire technique mettre en uvre est donc l'extraction-purification d'ADN. Cette
technique comporte deux tapes.
La premire tape consiste librer l'ADN de la cellule, c'est l'tape d'extraction
Pour cela on va traiter l'chantillon dont on veut extraire l'ADN avec des procds qui vont
permettrent de :
- dissocier les tissus et individualiser les cellules : la digestion. La digestion des tissus
est ralise l'aide d'enzymes vont dtruire les protines liant les cellules les unes aux
autres (collagnase, trypsine, protinase K);
- dtruire les membranes cytoplasmique et nuclaire : la lyse cellulaire. La lyse des
cellules est ralise l'aide (1) de dtergents anioniques (ex. : SDS) qui vont permettre
de dsorganiser la structure des membranes (de nature lipoprotique) et (2) d'enzymes
protolytiques (ex. : protinase K) qui vont dtruire les protines. On peut galement
faire clater les cellules grce un tampon hypertonique ou par la chaleur.
L'extraction ralise, on aura un mlange d'ADN libre et des autres constituants cellulaires
(protines, lysozymes, organites, dbris membranaires etc.)
L'tape suivante consistera donc sparer l'ADN de ces autres constituants cellulaires, c'est
l'tape de purification. Pour la raliser, diffrentes techniques sont disponibles :
- purification phnol/chloroforme. Cette technique est bas sur le principe de la
solubilit diffrentielle des molcules entre deux phases non miscibles : l'ADN est
soluble dans la phase aqueuse et les contaminants (protines, lipides) dans la phase
organique. Le phnol est un dprotinisant puissant qui va dnaturer et solubiliser les
protines, et dans lequel l'ADN n'est pas soluble. Le chloroforme va quant lui
permettre d'liminer les traces de phnol qui auraient ou tre emportes avec la phase
aqueuse. L'ADN est ensuite rcuprer sous forme solide partir de la phase aqueuse
par prcipitation l'alcool (thanol ou isopropanol). Cette opration permet d'liminer
les molcules qui n'ont pas prcipit en mme temps que l'ADN (notamment les sels).
Le culot ainsi obtenu par prcipitation est resuspendu la concentration voulue dans
un tampon Tris/EDTA ou de l'eau.
- purification par utilisation de kits commerciaux. Les kits prsents ici sont le kit
Puregene de la socit Gentra et DNA easy Tissus kit de la socit Qiagen. Le
principe du kit Puregene est bas sur la prcipitation des protines (qui permet leur
limination), puis la prcipitation de l'ADN (limination des sels et des sucres) et sa
resuspension dans un tampon Tris/EDTA ou de l'eau. Le kit Qiagen quant lui est
bas sur le principe des interactions ioniques : l'ADN est d'adsorb sur une membrane
de silice en prsence de sels chaotropiques (qui dshydrate les molcules d'acides
nucliques). Les protines, les lipides et les polysaccharides ne sont pas retenus par la
membrane. Aprs lavage de la membrane, les acides nucliques sont ensuite lus
avec de l'eau ou avec le tampon d'lution fourni dans le kit (solution aqueuse
contenant trs peu de sel). On obtient un rendement d'lution 15 20% suprieur en
chauffant le tampon d'lution 70C).
27
Tableau 4 : comparatif des 3 mthodes (chaque critre est not sur une chelle de 1 3, 1
tant le moins bon et 3 le meilleur) :
Phnol Kit Puregene Kit Qiagen
chloroforme
Quantit/rendement 2 3 1
Puret de l'extrait 3 1 2
Rapidit 1 2 3
Cot 3 2 1
Scurit du manipulateur 1 3 3
Remarque : la technique phnol/chloroforme en elle-mme a un faible cot, mais celui
augmente considrablement si on intgre les cots d'achat et de maintenance des quipements
de scurit et la gestion des dchets (le phnol et chloroforme sont trs toxiques pour le
manipulateur et l'environnement).
Le dosage de l'ADN extrait peut tre :
- effectu par une mesure au photomtre, l'ADN absorbant fortement dans l'ultra-violet
260 nm. Une unit de densit optique 260 nm (DO260) correspond 50g/l pour
de l'ADN double brin. Une ventuelle contamination protique peut tre mesur 280
nm (DO280), et le rapport DO260/ DO280 est alors calcul. Pour une solution d'ADN
pure, ce rapport doit tre compris entre 1,8 et 2,1. Une contamination par le phnol
peut galement tre recherche par mesure de l'absorbance 270 nm (le phnol inhibe
la PCR);
- estim par migration lectrophortique sur gel d'agarose et comparaison avec un
ADN de concentration connue.
28
Tableau 5 : rsolution des gels d'agarose et d'acrylamide en fonction du % respectivement
d'agarose et d'acrylamide :
Aprs coloration, cette technique permet de vrifier quantit, qualit et la taille de l'ADN.
C'est une technique de contrle qui peut tre mise en uvre diverses tapes des diffrents
protocoles de biologie molculaire. Ainsi, elle va permettre de visualiser l'ADN :
- aprs extraction-purification : valuation de la quantit et de la qualit;
- aprs amplification par PCR : valuation de la taille, de la quantit et de la spcificit
de l'amplification;
- obtenus aprs digestion par des enzymes de restriction : nombre de fragments,
valuation de leur taille.
La dtermination de la taille se fait l'aide d'un marqueur de poids molculaire qui est
compos de plusieurs fragments d'ADN de taille connue. Il dpos dans le gel et migre en
mme temps que les chantillons (figure 16)
Figure 16 :
L'valuation de la quantit d'un ADN est ralise par comparaison entre l'intensit du
fragment doser et les intensits d'une gamme de concentration connues d'un fragment
tmoin.
L'valuation de la qualit d'un d'ADN est ralise en observant le profil de migration. Un
extrait d'ADN gnomique non dgrad (coup) doit prsent, sur gel, une seule bande de haut
poids molculaire. Si l'ADN est dgrad, on observera des bandes supplmentaires de plus
petit poids molculaire.
29
ADN polymrase, en prsence de nuclotides et d'ions Mg2+. L'amplification est effectue
par la rptition de cycles qui assure une duplication exponentielle de chaque brin.
Cette technique permet d'augmenter considrablement la quantit d'ADN cibl. Elle ncessite
de connatre les squences en nuclotides qui dlimitent la rgion d'ADN amplifier. Ces
squences serviront dfinir des amorces complmentaires de celles-ci, et qui seront les
points de dpart de l'amplification par la polymrase
La PCR comporte des cycles successifs. Chaque cycle comprend une succession 3 phases
(figure 17) :
- (1) une phase de dnaturation par la chaleur qui spare les deux brins d'ADN;
- (2) une phase d'hybridation des amorces:
- (3) une phase d'longation au cours de laquelle la polymrase synthtise, partir
d'une amorce, le brin complmentaire.
Figure 17 :
30
4- PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restricted Fragment Lenght
Polymorphism ou polymorphisme de longueur des fragments de restriction de produit
PCR)
Le produit PCR est soumis une digestion enzymatique par une enzyme de restriction. Si une
mutation ponctuelle modifie le site de restriction initialement prsent, la taille des fragments
d'ADN obtenus aprs digestion sera modifie et observable aprs migration des fragments
d'ADN sur gel (figure 18).
Figure 18 :
6- Squenage
Cette technique enzymatique est base sur la copie d'un fragment d'ADN simple-brin, que l'on
dsire squencer, par une ADN polymrase. On utilise des didesoxynuclotides (ddNTP)
coupls des fluorochrome (4 couleurs diffrentes, une par ddNTP). Ces drivs de
dsoxynuclotides ne possdent pas de OH l'extrmit 3' du dsoxyribose. L'incorporation
de ce ddNTP par la polymrase bloque l'allongement de la molcule d'ADN en cours de
copie. En effet, l'allongement d'une chane polynuclotidique par une polymrase ncessite
qu'un groupement OH soit disponible en 3' (voir les liaisons phosphodiesters entre les
nuclotides).
Lors de la raction de squence, les fragments d'extension sont marqus en 3' par
lincorporation des didoxynuclotides (ddNTPs) fluorescents (4 couleurs de marquages
31
diffrents pour les 4 ddNTPs). Ces ddNTPs bloquent galement la raction d'longation. Les
fragments de diffrentes tailles ainsi synthtiss sont ensuite spars par lectrophorse. La
fluorescence de chaque fragment est lue laide dun laser, la succession des couleurs permet
alors de dterminer la squence nuclotidique.
Les fragments de diffrentes tailles ainsi synthtiss vont ensuite migrer dans un gel
d'acrylamide en fonction de leur taille (figure 19).
Figure 19 :
La lecture du gel est ralise par le balayage automatique d'un laser qui permet de discriminer
les 4 bases qui sont couples 4 fluorochromes diffrents (A-Hex vert; T-Rox rouge; C-Fam
bleu; G-Ned jaune). Le rsultat de ce balayage se prsente sous la forme d'un
lectrophorgramme reprsentant la succession des bases composant le fragment d'ADN
squenc (figure 20).
Figure 20 :
7- Microsatellites
Les microsatellites sont des segments d'ADN contenant des rptitions en tandem de courts
motifs di, tri ou ttra-nuclotidiques (le plus typique tant CA/GT). Le polymorphisme des
microsatellites rside dans le nombre de rptitions du motif.
La technique consiste amplifier par PCR une rgion d'ADN contenant un motif
microsatellite. L'une des deux amorces utilises pour raliser la PCR est marque avec un
fluorochrome. Le fragment fluorescent obtenu migre ensuite dans un gel d'acrylamide et,
comme pour la squence, la fluorescence est dtecte l'aide d'un laser. On pourra alors
observer des diffrences de taille d'allle (en fonction du nombre de rptitions du
microsatellite) d'un individu l'autre et dterminer l'tat homo ou htrozygote de ces
individus. Les microsatellites sont donc des marqueurs co-dominants. Un marqueur co-
dominant est un marqueur qui permet de dtecter simultanment les diffrentes versions
allliques d'un gne chez un individu htrozygote (ex. : PCR-RFLP, microsatellites). Un
marqueur dominant ne permet pas de distinguer un individu htrozygote d'un individu
32
homozygote car les diffrentes versions allliques ne sont pas simultanment dtectables (ex.
: AFLP).
Dans l'exemple (figure 21) suivant, pour un mme locus, deux individus prsentent des profils
microsatellites diffrents : l'individu 1 est htrozygote (un allle 90 et allle 150), l'individu 2
est homozygotes (2 allles 100) :
Figure 21 :
33
Figure 22 : Figure 23 :
34
10- Clonage
La technique de clonage est base sur la fragmentation de l'ADN gnomique par des
enzymes de restriction, puis l'insertion de ces fragments (inserts) dans un vecteur. Ce vecteur
permet alors l'introduction et la multiplication de la squence dans un microorganisme hte
(gnralement des bactries). Chaque cellule hte intgrera un fragment d'ADN diffrent et
l'ensemble de ces clones constituera une banque d'ADN gnomique. Le clonage permet
donc disoler des fragments dADN et de les amplifier en quantits illimites.
Les diffrentes tapes du clonage sont :
- la prparation du vecteur (digestion) (figure 25). Le vecteur doit tre linaris par
coupure l'aide d'une enzyme de restriction l'endroit o l'on dsire insrer le
fragment d'ADN. Les extrmits ainsi libres doivent tre traites par la phosphatase
alcaline de telle sorte que celui-ci ne puisse pas se refermer sur lui-mme, seul l'ADN
insrer permettant le raboutage;
- la prparation de l'ADN insrer (digestion) (figure 25). L'ADN est dcoup en
fragments par une enzyme de restriction crant des extrmits compatibles avec celles
du vecteur:
- la ralisation du recombinant (ligation) (figure 25). Le vecteur et l'ADN insrer
sont mlangs en prsence d'une ligase qui permet la ligation entre les extrmits du
vecteur et celles de l'ADN insrer;
- l'incorporation l'hte (transformation) (figure 25). Pour se rpliquer, le vecteur
doit tre incorpor dans une cellule hte;
- l'isolement des diffrent clones cellulaires (figure 25), contenant des inserts
diffrents, par talement sur un milieu nutritif dans des botes de Ptri;
- la slection des clones ayant incorpors un fragment d'ADN gnomique (figure
25). Cette slection est rendue possible par la prsence de deux gnes de slection
dans le vecteur : (1) un gne qui confre la cellule hte une rsistance un
antibiotique : les cellules n'ayant pas incorpor un vecteur meurent en prsence de
l'antibiotique, (2) un gne codant pour une protine facilement dtectable (gne lacZ
en gnrale) : si un insert est prsent dans le vecteur, il se trouve au milieu du gne de
slection et la protine n'est pas synthtise.
Figure 25 :
35
- la recherche du fragment d'intrt (hybridation) (figure 26). Parmi tous les clones
cellulaires ayant reu un vecteur contenant un insert, il faut trouver le clone qui
contient le fragment d'ADN que l'on veut tudier. Pour ce faire, les clones cellulaires
sont transfrs sur une membrane et lyss de faon librer l'ADN. Un traitement fixe
l'ADN vecteur sur la membrane, puis on hybride une sonde marque (radioactivit,
biotine, enzyme) et complmentaire du fragment recherch. Seuls les clones qui ont
incorpor le fragment recherch, et sur lequel la sonde s'est fixe, seront visibles aprs
rvlation (clones positifs).
Figure 26 :
L'tude du polymorphisme de l'ADN repose sur une srie d'outils en nombre limit, mais qui
combins entre eux permettent d'imaginer et de crer un nombre sans cesse croissant de
techniques de biologie molculaire. Nous n'avons vu ici qu'un certain nombre d'entre elles :
cette discipline est en perptuelle volution et un grand nombre de nouvelles techniques ont
fait leur apparition ces dernires annes.
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Annexes
Durant l'interphase qui prcde la mitose, chaque molcule d'ADN est rplique mais les deux
copies ne se sparent pas totalement; elles restent unies au niveau du centromre.
Au dbut de la mitose, en prophase, on assiste une extraordinaire condensation des
molcules d'ADN. Chaque molcule d'ADN forme alors un btonnet trs colorable appel
chromatide. Les deux chromatides correspondant aux deux copies d'une mme molcule
d'ADN demeurent unies au niveau du centromre et forment le chromosome mitotique (ou
chromosome fissur). En mtaphase, tous les chromosomes se rangent au milieu du noyau
puis en anaphase, les deux chromatides de chaque chromosome se sparent et s'loignent
l'une de l'autre pour se retrouver aux deux ples opposs de la cellule. Durant la tlophase, le
cytoplasme se divise entre les deux lots de chromatides ce qui aboutit la formation de deux
cellules filles ayant reu chacune une chromatide de chaque chromosome, c'est--dire une
copie de chacune des molcules d'ADN de la cellule mre, c'est--dire encore la totalit de
l'information gntique de la cellule mre.
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Annexe II : Glossaire
AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorphism) : polymorphisme de la longueur des
fragments d'ADN obtenus aprs digestion par des enzymes de restriction et amplification par
PCR.
Allles : versions alternatives dun mme gne qui diffrent par leur squence nuclotidique.
Amorce : courte squence de nuclotides complmentaire du dbut dune matrice et servant
de point de dpart son recopiage par une polymrase.
Anti-parallle : se dit de lorientation inverse des brins complmentaires de lADN. Il en
rsulte que lextrmit 5 dun brin est en regard de lextrmit 3 de lautre brin.
Autosome : chromosome non sexuel.
Bactrie comptente : se dit dune bactrie ayant subi un traitement lui permettant
dincorporer de lADN exogne (transformation).
Banque : collection de clones cellulaires (bactrie par exemple) o chaque cellule renferme
un exemplaire diffrent dADN recombin un vecteur.
Carte de restriction : ordre de la disposition des sites de restriction prsents sur un segment
dtermin d'ADN.
Chromatide : copie conforme de chaque chromosome se matrialisant au cours de la
mtaphase et se sparant de sa copie parentale lors de lanaphase.
Chromatine : structure associant lADN des protines (histone) dans le noyau pendant
linterphase.
Clonage molculaire : recombinaison in vitro dun fragment dADN avec un vecteur se
rpliquant de manire autonome lintrieur dune cellule hte (bactrie par ex). La culture
de cette cellule contenant le vecteur recombin permet disolement de lADN insr ltat
pur et en quantits illimites.
Code gntique ou codon : triplet de nuclotides codant pour un acide amin donn.
Codominance : dsigne les caractres hrditaires dont les diffrentes versions sont
simultanment dtectables chez un htrozygote.
Complmentarit : rgle universelle dappariement des bases des acides nucliques, selon
laquelle A sassocie avec T et G avec C.
Crossing-over : change rciproque de matriel gntique entre chromosomes homologues,
survenant en gnral au moment de la miose.
Dltion : perte dune ou plusieurs paires de bases conscutives par rupture de continuit de
la molcule dADN.
Dnaturation de lADN : passage de la forme double-brin la forme simple brin. Elle est
obtenue le plus souvent par la chaleur. Se dit galement pour labolition de la structure
secondo-tertiaire de lADN simple brin.
Dsquilibre de liaison : situation dans laquelle deux allles correspondant deux loci
distincts d'un mme chromosome sont plus frquemment associs dans une population que ne
le voudrait le hasard (voir Equilibre de liaison). Une telle association alllique prfrentielle
est favorise par : (1) la proximit physique des loci sur le chromosome; (2) le caractre
rcent de la mutation ayant produit l'un des allles; (3) l'existence d'un avantage slectif.
Diplode : jeu de chromosome o chaque autosome est en double exemplaire et comportant
deux chromosomes sexuels.
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Distance gntique : (1) sur une carte gntique dsigne un intervalle entre deux loci,
calcul d'aprs la frquence des recombinaisons observes; (2) sur un arbre phylogntique
dsigne l'intervalle de temps coul pour permettre d'accumuler les diffrences observes
entre deux squences homologues dans deux espces diffrentes.
Divergence : pourcentage de diffrences de squence nuclotidique entre deux ADN
apparents.
Dominant : se dit dun allle ou dune mutation qui, ltat htrozygote, conditionne le
phnotype.
Empreinte gntique (DNA finger printing) : assortiment d'allles mis en vidence dans
l'ADN gnomique grce des sondes explorant simultanment plusieurs loci hautement
polymorphes (ex. : microsatellites). Permet de caractriser le gnotype de chaque individu
des fins d'identification ou de filiation. Encore appele carte d'identit gntique.
Endonuclases : enzymes coupant la liaison entre deux nuclotides (liaison phosphodiester)
l'intrieur d'un acide nuclique. Ces enzymes sont spcifiques d'un type d'acide nuclique :
ARN simple brin, ARN hybrid de l'ADN, ADN simple brin, ADN double brin.
Enzyme de restriction : endonuclase bactrienne coupant spcifiquement les deux brins
d'ADN au niveau d'une squence, en gnrale palindromique, parfaitement dfinie (de 4 8
nuclotides).
Elongation d'amorce : extension dans le sens 5' vers 3' par une polymrase d'une amorce
d'ADN permettant la copie d'un brin matrice.
Epissage : se dit du mcanisme d'excision des introns et de raboutage des exons lors de la
maturation des transcrit.
Equilibre de liaison : se dit de l'absence d'association alllique prfrentielle pour deux loci
d'un mme chromosome, atteste par une distribution conforme aux lois statistiques.
Exon : squence de gne dont le transcrit persiste dans l'ARN messager aprs pissage.
Chaque exon reprsente une squence codante.
Exonuclases : enzymes dtruisant les acides nucliques de proche en proche partir d'une
ou des deux extrmits.
Gne : squence de nuclotides contenant l'information pour la production d'une protine
particulire.
Gnotype : constitution gntique d'un individu.
Haplode : jeu de chromosome o il n'existe qu'un seul exemplaire de chaque autosome et un
seul chromosome sexuel.
Htrozygotie : situation gnotypique o deux loci homologues d'une mme paire de
chromosome portent chacun un allle diffrent.
Homozygotie : prsence du mme allle sur les deux chromosomes d'une mme paire.
Hybridation : appariement par complmentarit des bases (A-T et G-C) de deux squences
nuclotidiques complmentaires.
Insert : fragment d'ADN exogne insr dans un vecteur.
Intron : squence d'ADN transcrite puis limine par pissage lors de la maturation d'un
ARN.
Ligation : union par une liaison 3'OH-5'phosphate de deux fragment d'ADN au niveau de
deux nuclotides adjacents.
Locus (pluriel : loci) : emplacement d'un segment d'ADN sur un chromosome.
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Marqueur gntique : trait gnotypique ou phnotypique permettant de distinguer des
individus diffrents.
Miose : dsigne les deux divisions cellulaires particulires (division rductionnelle et
division quationnelle) qui constituent le stade ultime de la gamtogense.
Microsatellites : segments d'ADN contenant des rptitions en tandem de courts motifs di, tri
ou ttra-nuclotidiques (le plus typique tant CA/GT). Le polymorphisme des microsatellites
rside dans le nombre de rptitions du motif.
Mutation : dsigne n'importe quel changement intervenu dans la squence d'ADN. S'il ne
concerne qu'une seule base, on parle de mutation ponctuelle.
Palindrome : brins d'ADN complmentaire dont la squence est identique quand elle est lue
de gauche droite sur un brin et de droite gauche sur l'autre (donc dans les deux cas de 5'
vers 3'), ex. : 5' CCATGG 3'
3' GGTACC 5'
PCR (Polymerase Chain Reaction) : amplification in vitro d'une squence d'ADN double-
brin par extension de deux amorces, situes de part et d'autre de la rgion considre, grce
une ADN polymrase. L'amplification est effectue par la rptition de cycles de
dnaturation/hybridation/longation qui assure une duplication exponentielle de chaque brin.
Phnotype : manifestation apparente de la constitution du gnome sous la forme d'un trait
morphologique.
Plasmide : ADN circulaire prsent dans les bactries et qui se rplique de faon autonome. Il
peux porter des gnes de rsistance aux antibiotiques, et est utilis comme vecteur dans la
technique de transformation bactrienne.
Polymorphisme gntique : prsence dans une population d'au moins deux variantes
allliques d'un mme gne.
Polymorphisme de restriction : variation individuelle de la squence en bases du gnome
modifiant un ou plusieurs sites de restriction. Elle donne lieu des versions alternatives de la
taille des fragments d'ADN obtenus avec une enzyme de restriction donne (techniques PCR-
RFLP, AFLP).
Polymorphisme de squence : toute variation individuelle de la squence nuclotidique en
un site donn du gnome.
Recombinaison gntique in vitro : assemblage exprimental de squence d'ADN (ex. :
insertion d'un ADN exogne dans un vecteur).
Renaturation (ou rassociation) de l'ADN : appariement des brins complmentaires d'un
ADN pralablement dnatur.
Rcessif : se dit d'un allle ou d'une mutation n'influanant pas le phnotype l'tat
htrozygote.
Rplication : processus de duplication l'identique d'une molcule d'ADN en deux molcules
filles.
Semi-conservative : dsigne le fait qu'au cours de la rplication, chaque brin d'un ADN
double-brin sert de matrice pour former une copie complmentaire.
Site de restriction : squence d'ADN double-brin reconnue et coupe par une enzyme de
restriction donne.
Sonde : squence d'acide nuclique, d'au moins 15 nuclotides, homologue une squence
d'ADN avec laquelle elle s'hybride de faon stable et spcifique par association entre bases
complmentaires.
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SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) : variation de conformation tri-
dimentionnelle d'un brin d'ADN induite par une variation de squence nuclotidique. Cette
proprit est mise profit pour dtecter les mutations ponctuelles.
SSR (Simple Sequence Repeat) : voir Microsatellite.
STR (Short Tandem Repeat) : voir Microsatellites.
Taq polymrase : ADN polymrase thermorsistante extraite de la bactrie Thermus
aquaticus et utilise pour l'amplification in vitro de l'ADN (PCR) temprature leve
(environ 70C).
Temprature de fusion (Tm) : point d'inflexion de la courbe de fusion d'un segment d'ADN,
correspondant virtuellement une dnaturation de la moiti de la squence.
Temprature d'hybridation (Ta) : point d'inflexion de la courbe d'hybridation d'une sonde
ou d'une amorce sur un segment d'ADN, correspondant virtuellement une hybridation de la
moiti des sondes/amorces.
Traduction : synthse d'une protine par les ribosomes partir d'un ARN messager matur.
Transcription : synthse d'ARN par une ARN polymrase partir d'une matrice d'ADN.
Transcrit : ARN produit par la transcription d'un gne.
Transformation bactrienne : technique exprimentale consistant faire pntrer un
fragment d'ADN exogne dans une bactrie.
Transversion : mutation ponctuelle entranant la substitution d'une base par purique par une
base pyrimidique ou vice versa.
Vecteur : squence nuclotidique capable de s'autorpliquer, utilise pour la recombinaison in
vitro de l'ADN et son amplification extra-chromosomique (clonage) (ex. : plasmide,
bactriophage).
Zygote : cellule diplode rsultant de la fusion de deux gamtes parentaux (cellules
haplodes).
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