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Electroforesis

Capilar
Medina Romero Amisaddai
Jasubi
Historia
El desplazamiento de
sustancias bajo la accin
de un campo elctrico
fue citado por Reuss en
1809 en las memorias de
la Sociedad Imperial
Natural (Moscow) (1809).
All se observa el
comportamiento
migratorio de pequeas
partculas de arena en un
mbito de agua
transparente contenido
en un recipiente de vidrio
con un lecho de arena
fina en su fondo y dos
tubos conteniendo
electrodos de una
batera.
Historia
El pasaje de la corriente produce un
enturbiamiento en las proximidades del polo
positivo producido por la migracin de
partculas de arena muy pequeas que se
movilizan por su carga elctrica negativa.
Este experimento puede ser considerado
como el primer aporte bibliogrfico que
revela la polarizacin de la slice, pues la
arena es dixido de silicio y fundida permite
obtener los capilares que se emplean en la
electroforesis capilar.
Historia
En 1816, fue observado el transporte
del agua por accin de la corriente
galvnica generada por la
polarizacin negativa del capilar
que une los dos recipientes
electrdicos.
La pared del capilar, sabemos hoy,
adquiere carga negativa (al pasaje
de la corriente elctrica)
producindose la polarizacin del
agua, la que por consiguiente tiende
a desplazarse hacia el polo
negativo.
Esta corriente lquida que se
desplaza en sentido opuesto a la
direccin de la corriente elctrica, se
designa con el nombre de Fuerza
electroendosmtica (FEO)
La electroforesis en solucin en medios libres sin
elementos soportes (agar, almidn, geles de
poliacrilamida), fue desarrollada por Tiselius el que
resolvi mezclas de protenas en un tubo aplicando
un campo elctrico de corriente continua, no
pulsante, estudios que lo hicieron acreedor al Premio
Nobel en Qumica.
El empleo de capilares para la separacin de
sustancias neutras o iones cargados elctricamente,
apareci en 1967 en una experiencia desarrollada
por Hjerten empleando capilares milimtricos, los
que eran rotados a travs de su seccin longitudinal
para evitar los efectos de la conveccin.
Electroforesis
Movimiento o desplazamiento diferencial
de especies cargadas (iones), sustancias
neutras o migracin pasiva, por atraccin
o repulsin en un campo elctrico a
travs de una matriz porosa, la cual,
finalmente las separa por tamaos
moleculares y carga elctrica,
dependiendo de la tcnica que se use.
La tcnica clsica utiliza una tira recubierta de una sustancia
porosa impregnada de un electrolito. Sus extremos se sumergen
en dos depsitos independientes que contienen ambos al
electrolito y estn unidos a los electrodos del generador de
corriente. La muestra se deposita en forma de un pequeo trazo
transversal en la tira. La distancia de migracin se mide en
relacin un marcador interno. Las placas son reveladas con sales
de plata, azul de Coomassie, o reactivos en particular.
Medios de soporte para
realizar la electroforesis
Lamuestra debe situarse en o sobre un
medio soporte, principalmente para
evitar perturbaciones mecnicas y
corrientes de conveccin durante la
separacin. En algunos soportes (papel o
similares) la muestra queda sobre la
superficie y avanza a lo largo de ella, con
escasa friccin, por lo que el mecanismo
principal de separacin es la magnitud
de la carga de cada componente de la
muestra.
Medios de soporte para
realizar la electroforesis
Otrosmedios de soporte (geles, medios
semislidos o gelatinosos) estn formados
por polmeros que forman una malla,
matriz o red tridimensional a travs de la
cual deben avanzar las molculas de la
muestra, que queda embebida en el
medio de soporte electrofortico. Como
consecuencia, la friccin es notable y los
factores de forma y tamao adquieren
una alta relevancia en la separacin.
Medios de soporte para
realizar la electroforesis
Medios de baja friccin Medios de elevada friccin

papel acetato de celulosa


gel de almidn gel de agarosa
gel de poliacrilamida gel de
separacin principalmente agarosa+poliacrilamida
por carga separacin por carga,
tamao y forma
Medios de baja friccin
Papel: sencillo, pero con elevada adsorcin
debido a los grupos hidroxilo de la celulosa.
Almidn: pasta de almidn cuyos granos se
han disgregado en un tampn caliente (se
hinchan). Actualmente se utiliza poco, ha
sido sustituido por la poliacrilamida.
Poliacrilamida: el gel es el resultado de la
polimerizacin qumica de una mezcla de
acrilamida y bisacrilamida. Regulando la
concentracin de ambas y su proporcin se
consiguen distintas porosidades, siempre
menores que la de los geles de agarosa.
Medios de elevada friccin
Acetato de celulosa: los grupos OH estn
acetilados, lo que reduce la adsorcin; baja
tincin de fondo; es posible transparentarla o
disolverla para detectar y recuperar,
respectivamente, los componentes
separados.
Agarosa: polisacrido, producto purificado
de algas (composicin similar al agar-agar).
Se disuelve en caliente (50-60C) y al enfriar
solidifica formando un gel, de alta porosidad.
Azul de Coomassie
El nombre completo es azul brillante de Coomassie R-250. Se
trata de un compuesto coloreado que se une a todo tipo de
protenas. Es poco soluble en agua, por lo que habitualmente
se disuelve en una mezcla de agua, metanol o isopropanol y
cido actico.
Tras realizar la electroforesis, el gel se "tie" sumergindolo
durante unos 30 minutos en la disolucin de Coomassie para
que ste penetre y se fije a las protenas. Dado que todo el gel
se impregna del colorante, es preciso despus realizar una
destincin, lavando varias veces con disolvente libre del
colorante.
Electroforesis capilar
Esuna tcnica de separacin basada en
la diferente velocidad de migracin de
las distintas especies cargadas bajo la
accin de un campo elctrico.
Equipo

Esta tcnica separativa se basa en la migracin de las especies de


la muestra en disolucin, portadoras de una carga elctrica global,
bajo el efecto de un campo elctrico y en contacto con un soporte
(medio de desplazamiento) adecuado.
En electroforesis capilar la tira se reemplaza por un tubo capilar
abierto en sus extremos, fabricado con un dimetro pequeo (15 a
150m).
Equipo
El capilar y los viales se llenan con una
solucin buffer.
La muestra est formada por un conjunto de
aniones y cationes que se introduce dentro
del sistema ocupando una nica zona.
Al someterlo a la influencia de un campo
elctrico, migran hacia el electrodo
correspondiente, establecindose un
movimiento de iones que forman parte del
sistema.
Permite la separacin de molculas
cargadas en funcin de su movilidad
electrofortica, en un buffer a un pH
determinado, segn el punto isoelctrico (pI)
de la molcula y de un flujo electrosmtico
(EOF) ms o menos importante.
El EOF es el flujo del lquido en el interior del
capilar originado por la carga elctrica
negativa existente en la pared interna del
capilar.
En el caso de los capilares de slice
fundida sta superficie de carga es
generado por la ionizacin de los grupos
silanol.
La carga de la superficie interna del
capilar atrae hacia si iones positivos que
forman una capa adyacente fija por
adsorcin ( capa de Stern ), y una capa
difusa y mvil, tambin positiva ( capa de
Gouy Chapman ).
Flujo electroosmtico
Los iones de la capa difusa experimentan
una fuerza paralela a la superficie y
migran hacia el ctodo al aplicarse una
diferencia de potencial entre los
extremos del capilar.
stos iones, al estar sulfatados, generan
un movimiento global del fluido hacia el
ctodo. ste movimiento del fluido
constituye la fuerza electrosmtica (EOF).
Orden de salida de las
especies
Capilares
Capilar de slice fundido de dimetro muy pequeo
( 10-200 m).
a) los capilares son anticonvectivos en s mismos, por
lo tanto, no es necesaria la utilizacin de un gel
soporte como medio
b) el calor generado al pasar la corriente elctrica
(efecto Joule), que dara lugar a problemas de
gradientes de temperatura no uniformes ( cambios
locales de viscosidad ), es fuertemente reducido,ya
que la disipacin de calor es muy efectiva
c) pueden aplicarse altos voltajes consiguindose
una reduccin del tiempo de anlisis y altas
eficiencias.
Capilares
La electroforesis se
efecta en capilares
de slica fundida, de
25 a 75 m de
dimetro interno; los
capilares son
recubiertos
externamente con
una pelcula de
poliaminas, para
protegerlos de los
daos mecnicos.
Inyeccin de muestras
La inyeccin electrocintica, consiste en
introducir el material empleando una
combinacin de la bomba electroendosmtica y
la movilidad electrofortica.
La inyeccin por desplazamiento puede ser
realizada por aplicacin de la muestra con gas
inerte a presin (por ej. nitrgeno) o por vaco en
el extremo del capilar.
Inyeccin por diferencia de altura. Idntico
efecto puede obtenerse por cambio en las alturas
relativas de la muestra o de los viales de salida del
buffer (inyeccin por gravedad).
Voltaje
Lasfuentes estabilizadas de corriente
continua generan 10 a 30 kv y elevados
campos elctricos (100 a 500 v/cm) al
capilar, pueden variar de 25 a 75 m de
dimetro interno, pudiendo llegar a
300m de dimetro externo. Las
longitudes pueden llegar a 1 m, pero
normalmente no exceden los 75 cm
Detectores
El detector ultravioleta visible es uno de los ms
empleados en la CE. La longitud de onda
escogida es de 214 nm, o de 200 nm de acuerdo
al equipo con el que se trabaja. opera a una
nica longitud de onda
Detector de diodos: adquiere al mismo tiempo el
espectro de cada uno de los analitos en un
mismo anlisis.
Deteccin de fluorescencia, que es ampliamente
utilizada en bioqumica clnica.
La electroqumica, los ms utilizados han sido los
conductimtricos y los amperomtricos.
Buffer
Durante las separaciones, los extremos del
capilar estn colocados en dos recipientes
que contienen un buffer, el mismo con el que
se ha llenado la columna.
La composicin del buffer define el mtodo
de
anlisis. Ambos recipientes contienen el
mismo buffer y su nivel debe ser el mismo en
los dos para evitar cualquier tipo
de flujo debido a un desequilibrio
hidrosttico.
Elbuffer que se emplea en EC debe
reunir una serie de propiedades:
1) Buena capacidad de pH en el rango
encontrado.
2) Baja absorbancia en la longitud de
onda empleada en la deteccin.
3) Baja movilidad (para lo cual se
necesita baja concentracin inica).
Ver los videos de los links
http://mediacampus.cuaed.unam.mx/no
de/1319
http://mediacampus.cuaed.unam.mx/no
de/1320
Bibliografa
http://mediacampus.cuaed.unam.mx/node/1319
http://mediacampus.cuaed.unam.mx/node/1320
Osatinsky, Raquel, Que es la electroforesis capilar?, Bioqumica y Patologa Clnica, vol. 71,
nm. 2, 2007, pp. 60-66, Asociacin Bioqumica Argentina Argentina. Redalyc Sistema de
Informacin Cientfica Red de Revistas Cientficas de Amrica Latina, el Caribe, Espaa y
Portugal http://redalyc.uaemex.mx/src/inicio/ArtPdfRed.jsp?iCve=65114270008
Castagnino, Juan Miguel, Electroforesis capilar Bioquimia, vol. 25, nm. 1, enero-marzo,
2000, pp. 13-32, Sociedad Mexicana de Bioqumica A. C. Distrito Federal, Mxico Disponible
en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=57611797003
Pontfica Universidad Javeriana (2008) Electroforesis en http://www.javeriana.edu.co
/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/electroforesis.html
Principios bsicos de electroforesis capilar: tcnica analtica de separacin de analitos
Mario Chopin Doroteo* Vol. 1, Nm. 2 Septiembre-Diciembre 2012 pp 86-89
http://www.medigraphic.com/rid
Electroforesis capilar.
https://books.google.com.mx/books?id=TUSWtthmCc0C&pg=PA137&lpg=PA137&dq=detect
or+de+fluorescencia+para+electroforesis+capilar&source=bl&ots=5trHUkKANJ&sig=mOZDx
m3YOvxQhF7NzCMHP0jBmXE&hl=es-
419&sa=X&ved=0ahUKEwjzl5ano9DMAhWM6CYKHd1tAJwQ6AEIMjAE#v=onepage&q=detect
or%20de%20fluorescencia%20para%20electroforesis%20capilar&f=false
http://es.slideshare.net/adrianasamillanmoya/electroforesis-y-electrocromatografia-capilar