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Cromatografa por afinidad

La cromatografa de afinidad ocupa un lugar importante en la tecnologa de separacin,


ya que es una tcnica capaz de purificar biomolculas sobre la base de su funcin
biolgica o estructura qumica individual. Esto hace que sea un mtodo de mayor
resolucin precisamente por la extraordinaria selectividad en que se basa su principio de
separacin.

La primera aplicacin de este tipo cromatografa se llev a cabo en 1910 en la


purificacin de amilasa sobre la base de un almidn insoluble. Posteriormente en 1967,
algunos autores reportaron que las molculas que contenan grupos aminos primarios,
podan ser acopladas a matrices de polisacridos activadas con bromuro de ciangeno

Esta cromatografa es un tipo de cromatografa de adsorcin en la que la molcula a ser


purificada es adsorbida de forma reversible y especfica, a una sustancia
complementaria (ligando) inmovilizada en un soporte insoluble (matriz). Tiene un efecto
concentrador, lo que permite procesar grandes volmenes de muestra. La alta
selectividad de las separaciones depende de la especificidad natural de las molculas
interactuantes.

En la cromatografa de afinidad el ligando es un compuesto que presenta una afinidad


reversible y ms o menos especfica, con el producto que se desea separar. En general el
ligando seleccionado para este tipo de cromatografa debe tener las siguientes
caractersticas:

Ser capaz de formar complejos reversibles con la molcula a separar, sino


conllevara a utilizar mtodos drsticos en la separacin.
Evitar una unin extremadamente fuerte con la protena, por lo que la forma de
desorcin traera consigo la desnaturalizacin o la destruccin de la misma.
Evitar una unin dbil con la protena ya que esto pudiera dar lugar a que no se fije
toda la protena o no fijarse absolutamente nada, promoviendo la unin de otras
molculas o contaminantes.
Poseer al menos un grupo qumicamente reactivo que permita su inmovilizacin.
Este grupo no debe estar involucrado en el proceso de interaccin con el producto.
Ser estable durante las reacciones de inmovilizacin.

Tipos de ligando:

Existen diferentes tipos de ligandos:

Monoespecficos de bajo peso molecular (ej. vitaminas y hormonas).


Monoespecficos de alto peso molecular (ej. complejos inmunoenzimticos Ag-Ac).
Grupos especficos de bajo peso molecular (ej. cofactores enzimticos y NADH).
Grupos especficos de alto peso molecular (ej. lecitinas).
Los factores que caracterizan un soporte apropiado en el cual se establece un enlace
covalente con el ligando para cromatografa de afinidad son los siguientes:

Que sea lo ms inerte posible pero con grupos que interacten con el ligando.
Insoluble en agua.
Hidroflico.
Que posea una porosidad que permita la difusin de la partcula al ligando y est
relacionada con la capacidad de adsorcin del soporte, ya que a mayor tamao,
mayor superficie y mayor capacidad.
Rigidez, tamao y forma de la partcula.
Estabilidad qumica, mecnica y biolgica.
Poseer grupos qumicos disponibles para la activacin.
Resistencia al ataque microbiano.
Facilidad de regeneracin.
Bajo costo.

La capacidad de adsorcin de un soporte generalmente depende de la cantidad de


ligando inmovilizado y su accesibilidad. Una inmovilizacin mxima de ligando se
produce o bien cuando la reaccin tiene lugar tanto sobre la superficie como en el
interior de la partcula de gel activada o cuando los grupos funcionales de la matriz estn
altamente concentrados. Sin embargo, debe sealarse que el alto grado de sustitucin,
particularmente en el caso de las macromolculas, da lugar a un gran nmero de sitios
de adsorcin no especficos y que una alta concentracin de polmero en el soporte
produce insuficiente porosidad. Por lo tanto, la seleccin de la matriz es un compromiso
entre un alto grado de sustitucin y una pobre porosidad en la matriz.

En general los soportes cromatogrficos utilizados en cromatografa de afinidad, pueden


ser de origen natural o sinttico. Dentro de los soportes de origen natural, los ms
usados son los polisacridos, como la agarosa, la celulosa y la dextrana. Son utilizados
tambin frecuentemente algunas matrices sintticas como geles de poliacrilamida.

La inmovilizacin de los ligandos de afinidad es un proceso complejo que en cada caso


tiene connotaciones especficas. El general, los ligandos de afinidad se inmovilizan
mediante el establecimiento de enlaces qumicos covalente con el soporte slido
activado y un grupo reactivo del ligando que est lo ms lejos posible de la zona activa
de bioadsorcin.

El objetivo de la inmovilizacin consiste en obtener una capa estable y densa del ligando
bioqumico que conserve su actividad especfica con plenitud.

La cromatografa por afinidad se lleva a cabo en 3 fases:


Algunas aplicaciones de la cromatografa de afinidad.

Aislamiento y fraccionamiento de anticuerpos tipo IgG.


Purificacin de subclases de IgG.
Aislamiento de antgenos.
Eliminacin selectiva de IgG como contaminante.
Debido a su selectividad y efecto concentrador, una tcnica de separacin
indispensable en las investigaciones con cidos nucleicos.
Separar y fraccionar el RNAr y tambin para purificar DNA de doble cadena.
La complejidad del plasma hace que esta cromatografa sea el mtodo ms
conveniente para separar muchos componentes.
Adsorbente eficiente para eliminar la albmina de otros componentes parcialmente
purificados.