Clonagem Gateway para Análise Funcional

Protocolo completo clonagem Gateway para anlise funcional
Passos
1- Amplicon
2- Ligao em Topo pENTR
3- Tranformao em Top10
4- PCR de colnia de 12 clones
5- Prep de 10 clones
6- PCR de prep de 10 clones
7- Digesto
8- Sequenciamento
9- Recombinao em pEDV6
10- Tranformao em DH5
11- PCR de colnia de 12 clones
12- Prep de 10 clones
13- PCR de prep de 10 clones
14- PCR com primer universal e purificao de PCR para sequenciamento
15- Tranformao por eletroporao em Pseudomonas (1462 e Psg4)
16- PCR de colnia
17- Estoque..
PARA TODOS OS PROCEDIMENTOS USAR LUVAS E JALECO
Passo 1 Amplicon
Para fazer o amplicon, utilizar um cDNA como molde ou uma clonagem anterior j confirmada
por sequenciamento do gene de interesse. Utilizar os primers do vetor de destino verificando a
TM e adaptando pra enzima utilizada (geralmente a TM varia de 1 a 2 C TM). Para comear
usar a temparatura mais utilizada para esse vetor pEDV6 que 56 C.
Materiais necessrios
1- DNA molde
2- Taq de alta fidelidade (Fidely, Dream, Pfx50...)
3- Tampo Taq
4- dNTP
5- H20 mili-Q autoclavada
6- Primer F
7- Primer R
8- Tubo de 1,5ml novo estril para fazer o mix
9- Gelo
10- Placa de PCR ou tubos de 0,2mL
11- Termociclador
12- Agarose
13- TAE 1x para o gel e para corrida
14- Cuba de eletroforese
15- Marcador de peso molecular (1Kb)
16- Marcador de concentrao
17- Blue juice
18- Pipeta
19- Ponteiras
20- GelRed ou Brometo de etdio
21- Transiluminador
Procedimento
Separar os reagentes da PCR, deixar descongelar (exceto a enzima) e mant-los no
gelo;
Identificar as amostras (tubos ou placa);
Ligar o termociclador para ir esquentando;
Pipetar os reagentes nas quantidades adequadas no tubo de 1,5mL para fazer o mix.
Pipetar a enzima (Taq) por ltimo;
Vortexar e dar um spin no mix;
Distribuir as amostras (nos tubos de 0,2mL ou nos poos da placa);
Colocar o DNA;
Ajustar o programa no termociclador e correr a PCR. (Demora cerca de 2 a 2:30h);
Polimerizar o gel de agarose a 1% colocando os pentes necessrios para o tanto de
amostras existentes*;
Preparar as amostras para a corrida**;
Carregar o gel com as amostras e marcador 1kb e de concentrao e correr;
Revelar o gel***;
Analisar se tem o tamanho da banda esperada e se possui uma banda nica.
Reao de PCR de amplicon
Componentes Concentrao final Volume pipetado
H20 Completar 17,77 l
Tampo 10x 1x 2,5l
dNTP 2,5mM 0.2mM de cada 2,0l
Primer F 10 M 0.1-1.0M 0.8l
Primer R 10 M 0.1-1.0M 0.8l
Taq 5u/l 0.025u/l 0,125l
DNA10ng/l Cerca de 0,5ng/l 1,0l
Volume final 25l
Programa de PCR para o termociclador

Temperatura em C Tempo
94 130 **** A temperatura do primer especfica para o primer.
94 30
TM primer (56C)**** 30 Pode variar. A maioria dos primers EDV anelam na
72 1 temperatura de 56C, mas alguns no. Caso no anelem
72 5 40 ciclos
4 especificamente nessa temperatura, fazer um gradiente ou
usar a TM do primer.
*Preparo de gel de agarose 1%
Para at 14 amostras:
Montar a cama do gel colocando as barreiras externas ou fechando com fita crepe. Colocar o
nmero de pentes necessrios para a quantidade de amostras (1 pente=7 amostras).
Pesar 0,3g de agarose ultrapura e colocar em 35ml de TAE 1x em erlenmeyer de 125ml. Deixar
no microondas por cerca de 130. Retirar com luva trmica e verificar se foi totalmente
dissolvido. Resfriar em gua corrente ou deixar em gua fria at conseguir pegar o erlenmeyer
sem se queimar. Virar o lquido de forma constante na cama pr montada. Deixar polimerizar
(verificar se j est frio colocando a ponta do dedo na parte mais inferior do gel ou obervar a
mudana de cor de transparente para translcido fosco).
**Preparo das amostras para corrida
Cortar um pedao de parafilm e retirar sua proteo, deixando a parte protegida virada para
cima na bancada onde ir pipetar. Ou preparar a amostra em placa limpa.
Pipetar:
6l de gua mili-q ou destilada
1 l de Blue juice TAE 10x
3 l de amostra (produto de PCR)
***Revelao de gel
Colocar o gel na bandeja com gua. Adicionar 5 l de brometo de etdio e deixar em shaker em
temperatura ambiente por 10 min. Lavar bem, trocar a gua da bandeja e deixar por mais 10
min. Tomar cuidado com o manuseio, pois brometo cancergeno e h locais contaminados e
locais no contaminados.
Passo 2 Ligao em TOPO pENTR

1- PCR amplicon
2- Kit vetor Topo
3- Tubo de 0,6ml Estril
4- Fluxo laminar
5- Gelo
6- Pipeta
7- Ponteiras
Procedimento
Colocar os reagentes no gelo junto com a PCR e deixar descongelar;

Ajustar a concentrao da PCR para o intervalo de 20-40ng/l;
Pipetar os reagentes no tubo de 0,6ml dentro do fluxo*;
Deixar em temperatura ambiente por 15min;
Armazenar a -20C.
* Volume a pipetar.
Reagentes Volume
Soluo salina 1 l
Vetor Topo 1 l
PCR (20-40ng/l) 1 l
gua estril 3 l
Volume final 6 l
Passo 3 - Transformao em Top 10

1- Reao de ligao;
2- Top 10;
3- Gelo;
4- Banho maria;
5- Meio soc invitrogen;
6- Agitador;
7- BOD;
8- Placa com meio seletivo*;
9- Ala de drigalski;
10- Fluxo laminar;
11- lcool;
12- Papel filme ou parafilm.
Procedimento
Tirar a clula competente do freezer e coloc-la para descongelar no gelo;
Tirar o meio SOC do freezer e deixar descongelando em temperatura ambiente;
Pipetar, dentro do fluxo, 2 l da reao de ligao em 50 l de clula competente Top 10
( ela j vem aliquotada com 50 l);
Manter o tubo com a clula no gelo por 30 min;
Ligar o banho maria e ajustar para 42C;
Ligar o agitador e ajustar para 37C e 200rpm;
Colocar o tubo com a clula no banho maria por 1min.;
Tirar e colocar IMEDIATAMENTE no gelo por 2 min.;
Colocar 250 l de meio SOC no tubo contendo a clula dentro do fluxo;
Transferir o tubo para o agitador e deixar a clula crescendo por cerca de 1h;
Colocar a placa com o meio seletivo na BOD 37C para climatizao;
Pipetar, dentro do fluxo, 100 l da clula crescida no agitador, na placa com LB+Kan50;
Espalhar com a ala de Drigalski**;
Fechar a placa com papel filme ou parafilm;
Colocar para crescer overnight (12-16h) na BOD a 37C.
*Preparo da placa com meio seletivo
O antibitico de seleo para o vetor topo kanamicina 50.
Meio LB
Componente Quantidade
Tryptona 10g
Extrato de levedura 5g
NaCl 10g
gar 15g
gua destilada 1000ml
Para o preparo do meio, colocar a tryptona, o extrato, o NaCl em 800ml de gua em um
bquer. Colocar no agitador com uma bailarina at dissolver todos os ingredientes. Completar o
volume de gua at 1000ml. Colocar em erlenmeyer de 2000ml, adicionar o gar, colocar uma
bailarina, fechar e autoclavar.
Aps sair da autoclave, deixar esfriando um pouco e colocar 1ml de kanamicina
50mg/ml no meio - dentro do fluxo. Fechar e colocar no agitador bem devagar (para evitar
bolinhas). Abrir o pacote de placas no fluxo, distibuir as placas em forma de pirmide e reservar
o pacote. Verter at tampar o fundo da placa ou colocar cerca de 25ml em cada placa. Deixar
as placas secarem abertas no fluxo. Fechar as placas, identific-las, empacot-las e armazen-
las em geladeira.
**Plaqueamento com ala de Drigalski
Para plaquear, pipetar a quantidade desejada na placa com meio seletivo. Flambar a ala com
lcool duas vezes esperar a ala esfriar para colocar no fogo para evitar que ela quebre.
Esperar esfriar. Espalhar o contedo da placa com a ala at secar passando a ala pelo meio.
Para verificar que secou, basta olhar se ficou fosco e/ou ficou mais diccil deslizar a ala pela
placa.
Passo 4 - PCR de colnia de 12 clones

1- Placa com colnias
2- Placa de fundo U
3- Meio lquido seletivo
4- Palitos estreis
5- Taq
6- Tampo Taq
7- dNTP
9- Primer F
10- Primer R
12- Gelo
14- Termociclador
15- Agarose
19- Blue juice
20- Pipeta
21- Ponteiras
23- Transiluminador
24- Fluxo laminar
1
2
Procedimento
Retirar a placa da BOD e selecionar 12 colnias com caneta;
Colocar 50 l de meio seletivo (LB+Kan) em cada 1 de 12 poos da placa de fundo U;
Com um palito estril, picar a colnia e colocar no poo com a mesma numerao da
placa. Deixar o palito l e pegar todas as outras 11 colnias da mesma forma. Mexer
bem os palitos e descart-los;
Tampar a placa de fundo U com adesivo e fech-la com papel filme;
Deixar a placa crescendo em agitador a 37C a 280rpm por 1:30h.
gelo;
Fazer as contas para 13 reaes (12 colnias + 1 para margem de erro);
Distribuir o mix - 18 l para cada (nos tubos de 0,2mL ou nos poos da placa);
Colocar 2 l do DNA da placa de fundo U;
Ajustar o programa no termociclador e correr a PCR. (Demora cerca 2:30h);
amostras existentes;
Preparar as amostras para a corrida*;
Carregar o gel com as amostras e marcador 1kb e correr;
Revelar o gel;
Reao de PCR de colnia com Taq Phoneutria (pht)
Tampo 10x 1x 2l
Primer F 10 M 0.1-1.0M 0.6l
Primer R 10 M 0.1-1.0M 0.6l
Taq 5u/l 0.025u/l 0,1l
Volume final 20l
94 5
94 30
TM primer (56C)** 30 35
72 1 ciclos
72 5
4
**A temperatura do primer ser a mesma utilizada para fazer a PCR de amplicon.
* Preparo das amostras para corrida
Pipetar:
Caso a reao de PCR no tenha nenhuma outra utilidade, pode-se preparar de outra forma.
Adicionar 2 l de Blue juice TAE 10x direto na reao de PCR, homogeinizar bem e pipetar 10
l no gel.
Forma alternativa de fazer a PCR de colnia

A forma alternativa envolve apenas a coleta do DNA para realizar o procedimento. Todo
o restante igual.
Procedimento:
Colocar 20 l de gua Mili-Q estril em cada um dos 12 poos da placa de fundo U.
Com um palito estril, picar a colnia e colocar no poo com a mesma numerao da
placa. Deixar o palito l e pegar todas as outras 11 colnias da mesma forma. Mexer
bem os palitos e descart-los;
No deixar o palito muito tempo, pois ele pode absorver todo o lquido;
Tampar a placa de fundo U com adesivo e fech-la com papel filme;
No precisa deixar crescendo no agitador. Pode ser usada na hora que foi coletada a
colnia com o palito. Ou seja, economiza tempo;
Colocar a placa com as colnias para crescer novamente na BOD de 37C por no
mximo 16h;
Guardar a placa de fundo U em geladeira aps o uso.
Passo 5 Prep de 5 clones
Aps a confirmao do tamanho e especificidade da banda das colnias escolhidas,
escolher 5 dentre as 12 colnias que apresentaram banda mais homognea, especfica e forte.
1- Tubos de vidro
2- Pipeta
3- Ponteiras
4- Placa de fundo U com clulas clonadas
5- Meio seletivo LB+Kan
6- Fluxo laminar
7- Agitador
8- Solues de mini prep
9- Centrifuga
10- Agarose
13- Marcador de concentrao
14- Blue juice
15- Transiluminador
17- Tubos de 1,5ml estreis
18- Glicerol 50%
Procedimento
Crescer 4 ml de cultura por 12-16h em meio especfico (LB+Kan);
o Para crescer os 4 ml de cultura, colocar 4 ml de meio seletivo no tubo de vidro
previamente identificado;
o Colocar 5 l da suspenso celular contida na placa de fundo U, descartando a
ponteira dentro do tubo;
o Deixar crescendo em agitador a 280rpm a 37C overnight (12-16h).
Forma alternativa de fazer o inculo

A forma alternativa envolve uma maneira diferente de coletar o DNA. Caso voc no
tenha o DNA na placa de fundo U crescido em meio seletivo. O restante permanece.
Procedimento:
o Com uma pipeta de qualquer graduao (de preferncia p10 ou p200) raspar a
colnia identificada na placa e descartar a ponteira dentro do tubo de vidro
previamente identificado contendo o meio seletivo.
o Colocar pra crescer em agitador como descrito acima.
Utilizar 500l para fazer o estoque (500l de glicerol 50% + 500l de cultura de clulas
em eppendorf 1,5ml armazenar no estoque provisrio no freezer de -80);
Transferir 1,5 ml para um eppendorf estril;
Centrifugar a 5000rpm por 5min;
Descartar o sobrenadante;
Transferir o restante pra o eppendorf e repetir a centrifugao;
Descartar o sobrenadante, deixar no papel toalha de cabea para baixo para secar;
Dar um spin (curta centrifugao cerca de 5s) e retirar o restante do meio com a
pipeta;
Ressuspender em 300l de soluo I. Se o plasmdeo for pequeno, pode vortexar, caso
contrrio, ressuspender com pipeta
o Soluo I: Tris HCl 50mM pH7,5
EDTA 10mM
RNAse I 100g/ml. Usar 1l por mL
Deixar no gelo por 5min.;
Adicionar 300l de soluo II. Inverter os tubos delicadamente para misturar cerca de 8
vezes e deixar no gelo no mximo 5min.
o Soluo II: 150l de NaOH 0,4N
150l de SDS 2%
Misturar os dois ingredientes na hora.
Adicionar 300l de soluo III e misturar invertendo os tubos cerca de 8vezes
o Soluo III: Acetato de potssio 1,32M pH4,8
Deixar no gelo por 10 min.;
Centrifugar a 12000rpm por 10min;
Transferir o sobrenadante (cerca de 650l) para um eppendorf novo estril;
Adicionar 600l de isopropanolol 100% gelado. Inverter os tubos por cerca de 10vezes
para misturar;
Centrifugar a 12000rpm por 20 min. a 4;
Lavar o pellet com 300l de etanol 70% gelado;
Centrifugar a 12000rpm por 10 min.;
Dar um spin;
Retirar o excesso com pipeta;
Deixar o pellet secar no fluxo (at ficar transparente);
Ressuspender em 30-40l de gua Mili-Q com pipeta;
Deixar na geladeira por 30 min. e estocar no freezer -20;
Carregar o gel com as amostras e com o marcador de concentrao e correr;
Revelar o gel;
Analisar a concentrao da banda, quantificar.

Pipetar:
2 l de amostra (prep)
Usar marcador de 200ng. Aplicar 10 l do marcador.
Passo 6 PCR de prep dos clones

1- Prep
2- Taq
3- Tampo Taq
4- dNTP
6- Primer F
7- Primer R
9- Gelo
11- Termociclador
12- Agarose
16- Blue juice
17- Pipeta
18- Ponteiras
20- Transiluminador
Procedimento
gelo;
Fazer as contas para 5 reaes;
Diluir a prep em tubo separado para 10ng/l
Distribuir o mix - 18 l para cada tubo de 0,2mL ou poo da placa;
Colocar 1 l do DNA diluido prep diluida;
Revelar o gel;
Reao de PCR de colnia com Taq Phoneutria (pht)
Tampo 10x 1x 2l
Primer F 10 M 0.1-1.0M 0.6l
Primer R 10 M 0.1-1.0M 0.6l
Taq 5u/l 0.025u/l 0,1l
Volume final 20l

94 3
94 30
TM primer (56C)** 30 35
72 1
ciclos
72 7
4
**A temperatura do primer ser a mesma utilizada para fazer a PCR de amplicon.
Pipetar:
Caso a reao de PCR no tenha nenhuma outra utilidade, pode-se preparar de outra forma.
Adicionar 2 l de Blue juice TAE 10x direto na reao de PCR, homogeinizar bem e pipetar 10
l no gel.
Passo 7 Digesto
1- Prep dos clones
2- Tubos de 0,6ml
3- Kit de Enzima de restrio Not I
4- gua Mili-Q estril
5- Gelo
6- Banho maria
7- Agarose
11- Blue juice
12- Pipeta
13- Ponteiras
Procedimento
Fazer as contas para ajustar a concentrao da prep;
Reagentes Volume
Not I Jena Bioscience 0.2 l
Prep (1g/l) 1 l
Tampo 10x 2 l
gua estril 16.8l
Volume final 20 l
Pipetar todos os reagentes em tubo de 0,6ml deixando a enzima por ltimo;
Manter sempre no gelo;
Deixar em banho maria a 37C por 1h;
Se precisar armazenar as amostras, deix-las no freezer a -20C;
Revelar o gel;
Verificar se tem 1 ou 2 bandas e conferir o tamanho das bandas:
o Se tiver apenas 1 banda com cerca de 2500pb o vetor est vazio
o Se tiver 2 bandas, uma com cerca de 2600pb e outra com cerca de 100 pb, o
inserto est na orientao correta;
o Se tiver 2 bandas, uma com cerca de 2600 e outra com cerca de 600pb, o
inserto est na orientao oposta.
Colocar 2 l de TAE 10x na digeto. Pipetar os 22 l no gel e usar o marcador 1kb.
Passo 8 Sequenciamento
1- Placa com meio seletivo LB+Kan
2- Taq
3- Tampo Taq
4- dNTP
6- Gelo
7- Termociclador BioRad
8- Agarose
12- Blue juice
13- Pipeta
14- Ponteiras
15- Tubos de 0,2ml para PCR
17- Transiluminador
18- Estoque dos clones
19- BOD
20- Placa de fundo U
21- Ala de platina
22- Fluxo laminar
23- Kit de purificao de PCR
24- Nanodrop
25- Primer universal m13
Procedimento
Estriar a partir dos estoques dos clones placas com os clones que deseja sequenciar*;
Palitar uma colnia isolada de cada clone (fluxo) e colocar em 20 l de gua Mili-Q em
placa de fundo U;
gelo;
Fazer as contas para 6 reaes (3 reaes para cada clone)**;
Diluir a prep em tubo separado para 10ng/l;
Pipetar os reagentes nas quantidades adequadas no tubo de 0,2mL para fazer o mix;
Distribuir as amostras nos tubos de 0,2mL;
Colocar 2 l do DNA da placa de fundo U;
Preparar as amostras para a corrida***;
Revelar o gel;
Analisar se tem o tamanho da banda esperada e se possui uma banda nica;
Juntar as 3 reaes do memso clone num tubo s e realizar a purificao da PCR com
o Kit;
Purificao com o kit da GE:
o Colocar o a reao de PCR em tubo de 1,5ml;
o Adicionar 500 l de tampo tipo 3 da tampa azul;
o Conferir a tonalidade do lquido que deve estar em tom de amarelo, laranja;
o Homogeinizar bem e transferir para uma coluna o volume total;
o E colocar a coluna no tubo coletor;
o Centrifugar a 16000g por 30s;
o Descartar o contedo do tubo coletor;
o Adicionar 500 l de tampo de tampa amarela, centrifugar a 16000g por 30s e
descartar o contedo do tubo coletor;
o Repetir o passo anterior;
o Centrifugar a 16000g por 1 min.;
o Descartar o tubo coletor
o Colocar a coluna em tubo de 1,5ml novo e autoclavado;
o Adicionar 13 l de tampo de eluio tampa cinza;
o Incubar por 1min. em temperatura ambiente;
o Centrifugar por 1min. a 16000g;
o Descartar coluna e armazenar o tubo em freezer -20C.
Correr o gel de agarose 1% da purificao com marcador 1Kb e marcador de
concentrao;
Ler as amostras no nanodrop anotando a concentrao, a relao 280/260 e a relao
230/260;
Diluir a amostra para 85ng/l;
Entregar para sequenciamento.
Reao de PCR de colnia com Taq phoneutria (pht)
Tampo 10x 1x 2l
Primer F 10 M 0.1-1.0M 0.6l
Primer R 10 M 0.1-1.0M 0.6l
Taq 5u/l 0.025u/l 0,05l
Volume final 20l

94 3
94 30
57 30
72 130
30
ciclos
72 7
4
*Estriar os estoques
Para estriar os estoques deve-se usar uma ala de platina. Retira-se os estoques do freezer e
deixa descongelar no fluxo. Flambar a ala no bico de bunsen, deixar esfriar. Colocar a ala
dentro do tubo de estoque e espalhar a suspenso celular na placa com meio seletivo at secar
(esgotar), a partir do esgotamento puxar com a ala uma linha em zig zag. Fechar a placa com
papel filme ou parafilm e colocar para crescer em BOD a 37C overnight (12-16h).
**Fazer as contas para as reaes de PCR

importante que as contas sejam feitas dessa maneira, pois deram muito certo assim. Para
cada gene, fazer 3 reaes de 20 l cada. Mas para a quantidade de taq, necessrio fazer no
mnimo 4 reaes para evitar erro de pipetagem, ento padronizou-se as contas para 6
reaes, assim, cobrimos os parmetros necessrios. 6 reaes so para 2 genes, ento se
tiver mais genes, fazer o mix sempre em dupla e fazer quantos mix forem necessrios. Por
exemplo, se forem 4 genes, fazer 2 mix de 6 reaes, se forem 6 genes, fazer 3 mix de 6
reaes e assim por diante.
Reao com Taq Phoneutria(pht)
Componentes Concentrao final Volume pipetado Mix para 6 reaes
H20 Completar 13,15 l 78,9 l
Tampo 10x 1x 2l 12 l
dNTP 2,5mM 0.2mM de cada 1,6l 9,6 l
Primer F 10 M 0.1-1.0M 0.6l 3,6 l
Primer R 10 M 0.1-1.0M 0.6l 3,6 l
Taq 5u/l 0.025u/l 0,05l 0,3 l
DNA10ng/l Cerca de 0,5ng/l 2,0l --
Volume final 20l 108 l
*** Preparo das amostras para corrida

Pipetar:
Passo 9 Recombinao em pEDV6

1- Prep do clone em topo confirmado pro sequenciamento;
2- Kit clonase II;
3- Vetor pEDV6;
4- Tampo TE pH8,0;
5- Gelo;
6- Tubo de 0,6ml;
7- Banho maria;
8- Pipetas;
9- Ponteiras.
Procedimento
Retirar o kit de clonase do freezer;
Deixar a enzima no gelo por 2min, vortexar e dar um spin;
Verificar a concentrao da prep e adequar a concentrao necessria;
Pipetar as quantidades adequadas dos reagentes no tubo de 0,6ml;
Incubar por 2h em temperatura ambiente;
Reagentes Volume
Clonase Mix II 1 l
Vetor pEDV6 1 l
Prep (100-300ng/l) 1 l
TE 2 l
Volume final 5 l
Aps as 2h, adicionar 0,5 l de proteinase K e incubar no banho maria a 37C por 10
min.;
Armazenar em freezer -20C.
Passo 10 Tranformao em em DH5

13- Reao de recombinao;
14- Clula competente DH5;
15- Gelo;
16- Banho maria;
17- Tubo de 1,5ml;
18- Meio soc ou LB;
19- Agitador;
20- BOD;
21- Placa com meio seletivo*;
22- Ala de drigalski;
23- Fluxo laminar;
24- lcool;
25- Papel filme ou parafilm.
Procedimento
Tirar a clula competente do freezer e coloc-la para descongelar no gelo;
Tirar o meio SOC da geladeira e deixar em temperatura ambiente;
Pipetar, dentro do fluxo, 1 l da reao de recombinao em 50 l de clula competente
DH5 ( ela no vem aliquotada com 50 l, logo deve-se usar um tubo novo estril de
1,5ml para aliquotar os 50 l as clulas esto aliquotadas com 100 l, se no for usar
os 100 l de clula competente, jogar o restante fora);
Manter o tubo com a clula no gelo por 30 min;
Ligar o banho maria e ajustar para 42C;
Ligar o agitador e ajustar para 37C e 160rpm;
Colocar o tubo com a clula no banho maria por 1min.;
Tirar e colocar IMEDIATAMENTE no gelo por 2 min.;
Colocar 250 l de meio SOC ou LB no tubo contendo a clula dentro do fluxo;
Transferir o tubo para o agitador e deixar a clula crescendo por cerca de 1h;
Colocar a placa com o meio seletivo na BOD 37C para climatizao;
Pipetar, dentro do fluxo, 100 l da clula crescida no agitador, na placa com LB+Gent25;
Espalhar com a ala de Drigalski;
Fechar a placa com papel filme ou parafilm;
Colocar para crescer overnight (12-16h) na BOD a 37C.
*Preparo do meio seletivo
O meio LB prepara-se da mesma forma descrita anteriormente. Aps sair da autoclave,
deixar esfriando um pouco e colocar 250l de Gentamicina 100mg/ml no meio - dentro do fluxo.
Fechar e colocar no agitador bem devagar (para evitar bolinhas). Abrir o pacote de placas no
fluxo, distibuir as placas em forma de pirmide e reservar o pacote. Verter at tampar o fundo
da placa ou colocar cerca de 25ml em cada placa. Deixar as placas secarem abertas no fluxo.
Fechar as placas, identific-las, empacot-las e armazen-las em geladeira.
Passo 11 PCR de colnia de 12 clones

Realizar da mesma forma que o passo 4, trocando o LB+Kan por LB+Gent.
Passo 12 Prep de clones

Realizar da mesma forma que o passo 5, trocando o LB+Kan por LB+Gent.
Passo 13 PCR de prep

Realizar da mesma forma que o passo 6.
Passo 14 PCR com primer universal e purificao de PCR para sequenciamento

Realizar da mesma forma que passo 8 trocando o primer m13 pelo primer pEDV6.
Passo 15 Transformao por eletroporao em Pseudomonas (1462 e Psg4)
1- Prep do clone em pEDV;
2- Eletroporador;
3- Gelo;
4- Clula competente;
5- Placa com meio seletivo KB+Rif+Gent*;
6- Meio SOC ou LB;
7- Tubos de 1,5ml;
8- Cuvetas;
9- Ala de Drigalski;
10- Agitador;
11- Fluxo laminar;
12- Pipetas;
13- Ponteiras;
14- BOD;
15- lcool 70%;
16- lcool.
Procedimento
Lavar as cuvetas com jatos de cool 3 vezes e depois lavar as cuvetas dentro do
fluxo com cool 70% 3 vezes e mant-las no fluxo at secarem sempre lavar uma
cuveta a mais, pois a clula pode estourar;
Retirar a clula competente do freezer e deixar descongelando no gelo;
Ajustar a concentrao da prep para 50ng/ l;
Pipetar 2 l da prep diluida em 25 l de clula competente as clulas j vm
aliquotadas com 25 l e misturar vagarosamente circulando a ponteira da pipeta
(no pipetar pra cima e para baixo pois a clula competente muito sensvel);
Transferir a mistura para a cuveta previamente identificada, que se encontra no
gelo, em sua totalidade;
Colocar a cuveta no eletroporador e direcionar o pulso para ela;
Apertar up at ultrapassar 380, direcionar para arm e quando chegar no 380
apertar trigger;
Mover o pulso para a prxima cuveta e continuar at eletroporar todas;
Retirar as cuvetas do eletroporador e colocar no gelo;
Transferir a clula da cuveta para o tubo de 1,5ml contendo 500 l de meio SOC ou
LB e homogeinizar vagarosamente circulando a ponteira;
Deixar crescendo no agitador por 2h a 28C a 200rpm;
Plaquear com ala de Drigalski 200 l da suspenso de clulas em meio seletivo e
deixar crescendo por 3 dias em BOD a 28C.
Passo 16 PCR de colnia
Realizar da mesma forma que o passo 4, trocando o LB+Kan por KB+Rif+Gent e mudando a
temperatura do agitador para 28C.
Passo 17 Estoque
1- Tubos de vidro;
2- Meio seletivo KB+Rif+Gent;
3- Agitador;
4- Fluxo laminar;
5- Placa de fundo U contendo os clones selecionados positivamente;
6- Pipeta;
7- Ponteiras;
8- Tubos de 1,5ml;
9- Glicerol 50%.
Procedimento
Realizado todo no fluxo. Colocar 4ml de meio seletivo no tubo de vidro identificado e
adicionar 20 l do clone selecionado encontrado na placa de fundo U do passo 15. Colocar
para crescer no agitador por 24h a 280rpm e 28C

Clonagem Gateway para Análise Funcional

Transféré par

Informations du document

Description originale:

Titre original

Copyright

Formats disponibles

Partager ce document

Partager ou intégrer le document

Options de partage

Avez-vous trouvé ce document utile ?

Ce contenu est-il inapproprié ?

Droits d'auteur :

Formats disponibles

Clonagem Gateway para Análise Funcional

Transféré par

Droits d'auteur :

Formats disponibles

Protocolo completo clonagem Gateway para anlise funcional

Programa de PCR para o termociclador

Passo 2 Ligao em TOPO pENTR

Colocar os reagentes no gelo junto com a PCR e deixar descongelar;

Passo 3 - Transformao em Top 10

Passo 4 - PCR de colnia de 12 clones

Forma alternativa de fazer a PCR de colnia

Forma alternativa de fazer o inculo

* Preparo das amostras para corrida

Passo 6 PCR de prep dos clones

Programa de PCR para o termociclador

Programa de PCR para o termociclador

**Fazer as contas para as reaes de PCR

*** Preparo das amostras para corrida

Passo 9 Recombinao em pEDV6

Passo 10 Tranformao em em DH5

Passo 11 PCR de colnia de 12 clones

Passo 12 Prep de clones

Passo 13 PCR de prep

Passo 14 PCR com primer universal e purificao de PCR para sequenciamento

Vous aimerez peut-être aussi