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Cours dintroduction aux spectroscopies optiques :

Analyse spectroscopique

Stephanie Bonneau

Stephanie.bonneau@upmc.fr
http://stephanie.bonneau.free.fr

Plan du cours

1-Interaction lumire matire 5- Spectroscopie de fluorescence =


A- bases physiques de la lumire spectrofluorimtrie
B- Matire et nergie A- principes et lois gnrales
C- conclusions B- construction des deux types de spectre
C- les fluorophores biologiques
2- Les molcules du vivant a- les chromophores intrinsques
b- les chromophores extrinsques
D- Quest-ce quon peut en dduire ?
a- dosage
3- Spectroscopie dabsorbance UV-visible b- environnement local du fluorophore
A- principes et lois gnrales E- Dure de vie de fluorescence
B- construction dun spectre
C- les chromophores
a- les chromophores lmentaires
b- les chromophores biologiques
6- Dichrosme circulaire
D- Quest-ce quon peut en dduire ?
a- dosage = utilisation de la loi de
7- Polarisation de fluorescence
Beer-Lambert
b- environnement local du
chromophore
8- Consquences biologiques de ces mthodes
4- Spectroscopie dabsorbance IR
A- principes Conclusions
B- spectres et interprtations

1
1- interaction lumire matire A- Bases physiques de la lumire


Une forme dnergie
petits paquets discrets : les quanta -> photons
Propage par vagues
Vitesse (c)

Distance entre les pics de deux vagues successives = /c


= longueur donde (nm)
Energie dun photon
Dure de dfilement entre deux vagues successives
= frquence (Hz)
E = h

Radiation lectromagntique
Longueur donde croissante = nergie par quantum dcroissante

E
E 400 500 600 700


1 10 102 103 104 105 106 nm

Rayon X U.V. Visible Infrarouge (IR) micro ondes

1- interaction lumire matire B - Matire et nergie

lectron
E rotation < E vibration < E lectronique chimique < E lectronique atomique
noyau

Lumire = onde lectromagntique

Mouvements dans la molcule Elle peut interagir avec les diples stables ou induits,
Polarisabilit / polarisation et donc avec la matire
Liaison chimique

Quand un photon rencontre une molcule, il peut tre Rflchi Pas deffet
Transmis (il traverse)
tat excit S2 Absorb

tat excit S1

tat fondamental S0

Seuls les photons dont le quantum dnergie correspond un des niveaux dnergie autoriss
de la molcule peuvent tre absorbs. Ce phnomne est discret.

2
1- interaction lumire matire C - Conclusions

1 10 102 103 104 105 106 nm



Rayon X U.V. Visible Infrarouge (IR) micro ondes

E E

Extraction des e- des Saut lectronique sur Saut d'un niveau lectro- saut d'un saut d'un
couches lectroniques orbitale molculaire . nique dans une orbitale niveau de niveau de
de latome Formation de radical libre molculaire dlocalise vibration rotation

Variation dnergie de la matire

Spcificit informationnelle de chaque spectroscopie

couleur Conservation de lnergie : M + hv M*


Dgnrescence de lnergie :
M* M + nergie thermique
M* M + nergie chimique (raction)
M* M + hv

2- Les molcules du vivant


Caractristiques de la matire, mais spcificits : glucide

Plusieurs milliers de molcules diffrentes par cellule


Renouvellement rapide (Hmes)

Complexit
Spcificit biologique due leur conformation et aux mouvements autoriss
E (liaisons etc) ractions, en fonction des paramtres
thermodynamiques et biologiques
Cas particuliers : certaines captent et transforment lE lumineuse (ex. : chlorophylles)
Milieux aqueux

protine

lipide

Acide nuclique

3
3- Sp. absorbance UV-visible A Principe et lois gnrales

Trs utilise
Rpond des problmes simples (dosage concentration)
Rpond des problmes complexes (structure et mouvement des molcules)

l
Fente Enregistrement
Dtecteur
I0 I
C

Source Lentille Monochromateur

Loi de Beer-Lambert
A une longueur donde donne () : Trajet optique (cm)

A = .l.C
Transmission I Concentration
T = x 100 (mol.L-1)
ou transmittance Coefficient dabsorption molculaire
I0 ou dextinction molaire (L.mol-1.cm-1
ou cm2.mol-1)

Absorbance I Milieu I T A
ou Densit optique A = Log10
ou Extinction transparent I0 100% 0
I0
opaque 0 0%

3- Sp. absorbance UV-visible B Le spectre

Construction du spectre dabsorbance


on regarde diffrentes longueurs donde :

Spectre dabsorbance :
S2 Courbe de niveau auquel le
compos absorbe la lumire
en fonction de la longueur
donde
S1 Abs.

S0

400 500 600 700

(Exemple : figure 3)

4
3- Sp. absorbance UV-visible C - Les chromophores a - lmentaires

Il existe des chromophores lmentaires qui, en fonction de leurs proprits


lectroniques, absorbent certaines longueurs dondes UV-visible

Chromophores lmentaires max (nm) max (L.mol-1.cm-1)


> C = C < (alcne) 173* 10000
- C C - (alcyne) 178* 2000
> C = O (ctone) 290 16
- CH = O (aldhyde) 279 15
- COOH (acide) 208 32
- COCl (chlorure d'acide) 220 100
- CONH2 (amide) 220 63
- COOR (ester) 211 57
- NO2 (nitro) 214 17
- N = N - (azomthane) 338 4

* Dans le n-heptane

3- Sp. absorbance UV-visible C - Les chromophores b - biologiques


Plusieurs chromophores lmentaires dans une molcule :

Chromophores indpendants addition des spectres

Chromophores conjugus effets bathochromes (dplacement vers le rouge)


effets hyperchromes (augmentation du )

Il existe des rgles qui permettent de prdire les spectres

Protines :
- liaison peptidique 180 230 nm
- R dans mme rgion spectrale
- sauf Tyr, Phe et Trp abs.

5
3- Sp. absorbance UV-visible C - Les chromophores b biologiques (2)

Chromophores max max Remarques


Acides nucliques
Adnosine 260 15000
Guanosine 255 14000
Thymidine 265 10000
Cytidine 270 9000 sensible au pH
ADN double brin 260 1U.D.O.=50 g/ml
ADN simple brin 260 1U.D.O.= 33 g/ml
ARN 260 1U.D.O.= 40 g/ml
Protines
Liaison peptidique 190 4-8000 conformation
Pont disulfure 250 300
Phnylalanine 257 200
Tyrosine 275 1400 sensible au pH
Tryptophane 280 5600
Hmes, coenzymes...
Flavine (FMN,FAD) 450 12700
NADH, NADPH 338 6400
Hme II bande 550 27700
Hme II bande Soret 400 120000 (couleur rouge)
Cis-rtinal 498 4200 rhodopsine
Chlorophylle A 660-680 10000 (couleur verte)

Quest-ce quon
3- Sp. absorbance UV-visible C - Les
D chromophores
peut en dduire ? b -dosage
a biologiques (2)

La substance doser possde un pic d'absorption caractristique UV-visible


dosage direct
La substance doser ne possde pas de pic d'absorption caractristique
raction colore :

Substance incolore + ractif produit color

Une bonne mthode de dosage : spcificit, solubilit, stabilit,


sensibilit

proportionnalit (loi de Beer-Lambert)

A = .l.C

On se cale une longueur donde donne, caractristique !


! ( Dpend de la longueur donde)

(Exemple : A280/A260 = prot/Ac Nucliques)

6
Quest-ce quon
3- Sp. absorbance UV-visible C - Les
D chromophores
peut en dduire ? b -dosage
a biologiques
(suite)
(2)

proportionnalit (loi de Beer-Lambert)

A = .l.C

A
1- On connat : mesurer A et calculer C A = .l.C C=
.l
2- On ne connat pas :

2.1- Mthode par comparaison avec un talon unique (solution de concentration connue)

(A)e = .l.Ce (A)e A Ce . A


= C=
A = .l.C Ce C (A)e

2.2- Mthode avec une gamme d'talonnage : gamme de dilutions courbe d'talonnage A = f(c)

(A)e1 = .l.Ce A
(A)e2 = .l.Ce/5 A Dtermination graphique

(A)e3 = .l.Ce/10
etc puis mesure de A C
c

permet de vrifier la linarit, et tient compte des ventuelles erreurs de manipulation (trac d'une droite statistique)

Quest-ce quon
3- Sp. absorbance UV-visible C - Les
D chromophores
peut en dduire ? b - environnement
biologiques (2)

NPO : On peut voir tout ce qui implique les lectrons

Interactions avec le solvant


- Balance hydrophile/hydrophobe
- Ionisation (dans leau, sensible au pH)

Interactions entre chromophores

effets bathochromes (vers le rouge) ou hypsochrome (vers le bleu)


effets hyperchromes (augmentation du ) ou hypochrome (diminution du )

Informations sur lenvironnement local


Conformation et mouvement de la molcule
Associations et Interactions

7
3- Sp. absorbance IR
4- UV-visible A - Principes

Une molcule soumise une radiation infrarouge la structure molculaire se met vibrer

Transitions nergtiques :
- entre les niveaux dnergie de rotation (20 250 m i.e. 500 40 cm-1)
- entre leurs niveaux dnergie de vibration (1 20 m i.e. 10000 500 cm-
1)

E rotation < E vibration < E lectronique

Spectroscopie
UV-visible

Spectroscopie IR

3- Sp. absorbance IR
4- UV-visible B - Spectres et informations

T T

Avec appareil classique Avec appareil utra-sensible


Seulement vibrations Rotations superposes vibrations

= 1/ = 1/
!

Diffrentes fonctions chimiques sur une molcule bandes d'absorption caractristiques

1800 1700 1600 cm-1


C-O alcool 1000 cm-1
C-O phnol 1200 cm -1

acides amides
ester
aldhydes et ctones
(aliphatiques puis aromatiques)

Mthode qualitative:
Informations structurales et/ou puret du produit

8
5- Sp. de fluorescence A Principe et lois gnrales

Plus sensible que labsorbance (1000 10 000 fois); Par rapport une base zro
Rapidit : abs (10-15s) et fluo (10-9s) on voit certains mouvements

Une molcule ayant absorb de l


Fente
lnergie doit la remettre :
I10 I1
C
S1
Source Lentille Monochromateur 1

Monochromateur 2
Enregistrement Dtecteur I2

Miroir

S0

A une longueur donde d'excitation (1) et une longueur donde dmission (2)

Rendement quantique Trajet optique (cm)

I2 = k.I10.Q2..l.C
Concentration
(mol.L-1)
Coefficient dabsorption molculaire
ou dextinction molaire (L.mol-1.cm-1
!
ou cm2.mol-1) DO < 0,05

5- Sp. de fluorescence B Les spectres a dmission

Spectre dmission de fluorescence

A une longueur donde d'excitation (1) donne, on fait varier la longueur


donde laquelle on regarde (longueur donde dmission (2))

S2
I.

S1

400 500 600 700


S0

(Exemple : figure 4)

9
5- Sp. de fluorescence B Les spectres b dexcitation

Spectre dexcitation de fluorescence

On fait varier le longueur donde d'excitation (1) et on regarde une


longueur donde (longueur donde dmission (2) donne)

S2
I.

S1

S0 400 500 600 700

5- Sp. de fluorescence C - Les fluorophores a - intrinsques

Toutes les molcules ne fluorescent pas : il existe dautres processus de dsexcitation

Chromophores ex max em max rendement Remarques


Acides
nucliques
A 260 321 3.10-4
G 255 329 3.10-4 Trs peu fluorescents
C 270 313 8.10-4 Monomres fluorescent plus
que chanes.
U/T 260/270 308/320 4.10-44 / 10-

Protines

Trp 280 348 0,2 sensible lhydrophobie et au


pH
Tyr 275 303 0,15 sensible au pH
Phe 257 282 0,02
Hmes,
coenzymes...
NADH, NADPH 340 470 0,019
Hme 400 608 0,5
(protoporphyrine)

10
5- Sp. de fluorescence C - Les fluorophores b - extrinsques

Peu de molcules naturelles sont de bons fluorophores


On marque les molcules avec des fluorophores
additionnels

Fluorophore Cible ex max em max


Acridine orange(1) ADN 500 526
Bodipy sonde 495-582 503-591
DAPI ADN 358 461
DiI membrane 549 565
NBD(2) sonde 483 543
Fluoresceine FITC(3) (-Lys) 496 516

(1)
(2) (3)

Remarque : il existe aussi des marqueurs de la physicochimie (pH)

Quest-ce quon
3- Sp. de
5- absorbance
fluorescence
UV-visible C - Les
D chromophores
peut en dduire ? b -dosage
a biologiques (2)

Les mthodes fluorimtriques sont plus sensibles que celles par absorbance

proportionnalit

I2 = k.I10.Q2..l.C

Comme pour abs. Mais on ne connat jamais k :

2.1- Mthode par comparaison avec un talon unique (solution de concentration connue)

(I2)e = k.I10.Q2..l.Ce (I2)e I2 Ce . I


= C=
I2 = k.I10.Q2..l.C Ce C (I)e

2.2- Mthode avec une gamme d'talonnage : gamme de dilutions courbe d'talonnage I = f(c)

(I2)e1 = k.I10.Q2..l.Ce I
(I2)e2 = k.I10.Q2..l.Ce/5 I2 Dtermination graphique

(I2)e3 = k.I10.Q2..l.Ce/10
etc puis mesure de I2 C
c

permet de vrifier la linarit, et tient compte des ventuelles erreurs de manipulation (trac d'une droite statistique)

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Quest-ce quon
3- Sp. de
5- absorbance
fluorescence
UV-visible C - Les
D chromophores
peut en dduire ? b - environnement
biologiques (2)
em max rendement
Trp dans eau 355 0,15
Interactions avec le solvant
Trp dans dioxane 325 0,3
- Balance hydrophile/hydrophobe
Tyr dans eau 303 0,06
- Ionisation (dans leau, sensible au pH)
Tyr dans dioxane 301 0,21
rendement

Trp
Tyr
pH (Exemple : figure 4 et voir aussi figure 14 et 16)

350

330

340

Informations sur lenvironnement local


Conformation et mouvement de la molcule
Associations et Interactions

Quest-ce quon
3- Sp. de
5- absorbance
fluorescence
UV-visible C - Les
D chromophores
peut en dduire ? b - environnement
biologiques (2)

em max rendement
Trp dans eau 355 0,15
Interactions avec le solvant
Trp dans dioxane 325 0,3
- Balance hydrophile/hydrophobe
Tyr dans eau 303 0,06
- Ionisation (dans leau, sensible au pH)
Tyr dans dioxane 301 0,21
rendement

Trp
Tyr
pH (Exemple : figure 4 et voir aussi figure 14 et 16)

Interactions molculaires
Transfert de fluorescence
ex em A B
A 400 nm 500 nm
B 500 nm 600 nm

Informations sur lenvironnement local


Conformation et mouvement de la molcule
Associations et Interactions

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Quest-ce quon
3- Sp. de
5- absorbance
fluorescence
UV-visible C - Les
D chromophores
peut en dduire ? b - environnement
biologiques (2)
em max rendement
Trp dans eau 355 0,15
Interactions avec le solvant
Trp dans dioxane 325 0,3
- Balance hydrophile/hydrophobe
Tyr dans eau 303 0,06
- Ionisation (dans leau, sensible au pH)
Tyr dans dioxane 301 0,21
rendement

Trp
Tyr
pH (Exemple : figure 4 et voir aussi figure 14 et 16)

Interactions molculaires
Transfert de fluorescence
ex em A
A 400 nm 500 nm B
B 500 nm 600 nm

Informations sur lenvironnement local


Conformation et mouvement de la molcule
Associations et Interactions

5- Sp. de fluorescence E - Dure de vie de fluorescence

NPO : abs (10-15s) et fluo (10-9s)

Irradiation de lchantillon pendant t < 10-9s par un clair extrmement puissant


le plus de molcules ltat excit
Mesure de lintensit de fluorescence au cours du temps

On obtient une intensit dcroissant exponentiellement avec un tf

Insensible la concentration
Trs sensible
Lenvironnement local
Conformation et mouvement

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6- Dichroisme circulaire

Lumire = onde lectromagntique


Elle peut interagir avec les diples stables ou induits,
et donc avec la matire

Repose sur la capacit qu'on les structures optiquement actives d'absorber de faon ingale la
lumire polarise circulairement droite de la lumire polarise circulairement gauche.

6- Dichroisme circulaire

Lumire polarise linaire

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6- Dichroisme circulaire

Lumire polarise circulaire

Maintenant, si nous combinons deux rayons lumineux polariss 90 l'un de l'autre mais se propageant
dans la mme direction. On obtiendra les ondes suivantes:

La rsultante des deux ondes est une autre onde sinusodale situe entre les deux premires.

Chaque pic de l'une correspond au pic de l'autre,


chaque noeud de l'une arrive au mme point que pour l'autre.

6- Dichroisme circulaire

Lumire polarise
circulaire droite

Lumire polarise
circulaire gauche

15
6- Dichroisme circulaire

Deux ondes lumineuses polarises linaires peuvent se combiner.


La rsultante est un onde lumineuse polarise circulaire.

Deux ondes polarises circulaires peuvent se combiner.


La rsultante est une onde polarise linaire.

6- Dichroisme circulaire

Les structures optiquement actives n'absorbent pas de faon gale la lumire polarise circulairement vers la
droite et la lumire polarise circulairement vers la gauche.

L'absorption prfrentielle de l'une de ces deux polarisations rsultera en une dviation de la rsultante (au lieu
d'un cercle, le trac de la rsultante entre la spirale tournant droite et la spirale tournant gauche donnera une
ellipse).

16
6- Dichroisme circulaire

6- Dichroisme circulaire

La dviation mesure permet d'tablir un spectre (appel CD spectra en anglais) de forme caractristique pour
trois structures secondaires retrouves dans les protines: l'hlice, le feuillet et la forme alatoire (ou random
coil), qui chacune prsentent des asymtries structurales.

tude la structure secondaire (hlices, feuillets, etc.) de


polypeptides et de protines en solution

Suivi au fur et mesure qu'il se droule le dploiement


d'une protine au fur et mesure qu'on la soumet un
traitement dnaturant (cintiques).

17
7- Polarisation de fluorescence

LA LUMIERE POLARISEE
Filtre polariseur et filtre analyseur

7- Polarisation de fluorescence
MESURE DE POLARISATION

ex Verticale ex Verticale

P P

em Vertical P em Horizontale P

III I

III I
P=
III + I

18
7- Polarisation de fluorescence

QUELLES INFORMATIONS DONNE LA POLARISATION?

abs
a em

P0
La valeur de P dpend de:
langle entre abs et em (P0)
lorientation des fluorophores dans la solution (P1)
du mouvement des fluorophores pendent le temps de vie de ltat excit (P2)
du transfert ventuel dnergie de fluorescence entre molcules (P3)

7- Polarisation de fluorescence

QUELLES INFORMATIONS DONNE LA POLARISATION?

abs
a em

P1 < P0
P dpend de:
langle entre abs et em (P0)
lorientation des fluorophores dans la solution (P1)
du mouvement des fluorophores pendent le temps de vie de ltat excit (P2)
du transfert ventuel dnergie de fluorescence entre molcules (P3)

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7- Polarisation de fluorescence

QUELLES INFORMATIONS DONNE LA POLARISATION?

abs
a em

P2 < P1 < P0
P dpend de:
langle entre abs et em (P0)
lorientation des fluorophores dans la solution (P1)
du mouvement des fluorophores pendent le temps de vie de ltat excit (P2)
du transfert ventuel dnergie de fluorescence entre molcules (P3)

7- Polarisation de fluorescence

QUELLES INFORMATIONS DONNE LA POLARISATION?

abs
a em

P3 < P2 < P1 < P0


P dpend de:
langle entre abs et em (P0)
lorientation des fluorophores dans la solution (P1)
du mouvement des fluorophores pendent le temps de vie de ltat excit (P2)
du transfert ventuel dnergie de fluorescence entre molcules (P3)

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8- Consquences biologiques possibles

Au niveau molculaire

Altrations directe (radicaux libres)


(A-B)* A + B

Altrations indirecte (par les peroxydes)


H2O2

Sur les acides nucliques > ruptures simples ou doubles


Sur les protines > rupture des ponts S-S, des liaisons de van der Wals,
ventuellement des liaisons peptidiques

Au niveau cellulaire
Retard de mitose (synchronisation)
Mort cellulaire

Conclusion

Complmentarit des mthodes

Entre les diffrentes spectroscopies


Avec dautres mthodes comme chromatographies

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