8- Biotecnologa reproductiva yegua

Transferencia embrionaria
Criopreservacin embrionaria
-Refrigeracin
-Congelamiento/Vitrificacin

Mayor complejidad:

Transferencia de ovocitos
Produccin invitro
ICSI (inyeccin intracitoplasmatica de Z)
Clonacin

Transferencia embrionaria:
Hembra donante + Padrillo: Animales genticamente destacados.

Importante elegir bien la yegua donante.

Obtenemos un embrin por IA y lo transferimos al tero de la receptora, que lo va a gestar, parir, criar y
a destetar.

El objetivo es aumentar la cantidad de potrillos por yegua.

Indicaciones:

Aumentar el nmero potrillo/ao por yegua

Producir cras de yeguas en entrenamiento
Producir cras de yeguas que tienen problemas para G, pero que si pueden concebir, el embrin
se recupera por lavaje uterino al da 7-8.
Producir cras de yeguas con antecedentes de aborto recurrente

*Yeguas viejas que no son buenas donantes (lesiones en endometrio, pobre logro de embriones,
tratamiento previo al tero antes de realizar IA)

Manejo de la yegua donante

Examen exhaustivo: por el riesgo de contaminacin (son yeguas que valen mucho dinero)

Examen reproductivo
Evitar situaciones de stress IA da de ovulacin (contraindicado el servicio natural por la
contaminacin, las condiciones primordiales son folculo mayor a 35 mm, inducir la ovulacin,
edema en el tero y recin hacemos la IA)
 Da del lavaje en yegua ( del da 8 (7,5-8,5) las yeguas viejas en das 8-9-10, el crecimiento
embrionario es ms lento llega ms tarde al tero, si lavo antes no recupero el embrin)

Manejo de la yegua receptora

Seleccin y disponibilidad
Manejo sanitario ( lazareto, AIE, desparasitar, vacunar) repetir AIE que se contagia por IA
Examen reproductivo
Examen fsico general: Conformacin perineal-salud dental-visin-mansedumbre-desarrollo de
glndula mamaria (que haya parido una vez).
Evitar yeguas viejas
Evitar stress (yeguas que llegan nuevas, no pueden comer ni beber agua por dominancia de las
otras, y por stress tienen problemas de ciclicidad)

Receptoras: seleccin por el veterinario

Edad (receptoras jvenes)- Mansedumbre-Sanidad-Tamao tracto reproductivo-biopsia uterina.

El tamao uterino es importante, capacidad del tero (desarrollo de la gesta), del abdomen y la
lactancia (ver tamao de la donante parecido al de la receptora), sino en el potrillo el potencial
gentico de crecimiento se ver afectado.

Sincronizacin Donante-Receptora

Despus que ovul la donante, a los 8 das realizo el lavaje de tero, pero tambin tengo que saber
qu da ovularon las receptoras, para saber cul es el da 0 de la receptora.

Opcin 1: Lo ideal es que la receptora haya ovulado despus de la donante (+1 +2 +3), la
importancia radica en el RMP, lo coloco y tiene unos das de ventaja para que se realice el RMP,
dado que el da 16 no es ms mvil.

Opcin 2: La receptora ovula el da 0 (ambas ovulan el mismo da)

Opcin 3: es cuando la receptora ovul un da antes que la donante.

 Sincronizacin Donante-Receptora

Sincronizacin con anlogos PGF2 y Cloprostenol

Donante: nica dosis > 6 das de posovulacin (IM), porque el CL ya est maduro es receptivo a la
luteolisis.

Receptora: 1 o 2 das despus de inyectada la donante

Manejo en un centro de TE

Recuperacin embrionaria: Manejo simultaneo de donante-receptora. Sanitariamente es mejor tenerlas

separadas.

A la donante se le sigue el celo, se estimula la ovulacin con

inductores, se realiza IA, lavaje uterino de recuperacin + (da 8),
vamos a lograr un embrin, que se implanta intrauterinamente.

Despus del lavaje aplicamos PGF2 para cortar el ciclo,

queremos que entre en estro enseguida, y tambin por si el
lavaje de recuperacin fue -, para que no se quede gestando.

A las receptoras se les sigue el ciclo para ver cuando ovula.

El lavaje (Flushing) es bastante sencillo, se realiza con un catter de silicona que se insufla un baln,
impidiendo que el lquido refluya, el lquido del lavaje entra por gravedad, hay que asegurarse de no
dejar aire, as el lquido entra y sale con facilidad ( se lleva el embrin).

Se utiliza Solucin PBS Ringer lactato, todo el material es estril (xido de etileno), el 1er litro se deja por
arrastre hace flujo turbulento y sale, el 2do litro hacemos una maniobra transrectal tratamos de
masajear el tero y levantarlo, para despegar y que el salga todo el lquido del tero y no quede nada,
por eso medimos el volumen del lquido recuperado, este pasa por el filtro de embriones (70 um).
Flushing:

Recuperacin embrionaria-lavaje uterino

Medio de lavaje: Sc. Ringer lactato 2 lts.

Esterilizacin de todo el material (Ox. De etileno)
Control de la cantidad del lquido de lavaje
(recuperado)
Aplicacin PG post lavaje

Luego aplicamos la PGF2, tambin podemos aplicarla durante el lavado, porque favorece la
contractilidad uterina, se expulsa todo el lquido y asegura que no quede lquido, tambin aunque este
en diestro si se le da oxitocina realiza la misma funcin.

Factores que afectan la tasa de recuperacin embrionaria

Factores del manejo general: SANIDAD-ALIMENTACION-STRESS

Factores del manejo reproductivo de la donante (joven-vieja(
Factores relacionados al lavaje uterino (operario)

Manejo e identificacin del embrin

Hay que tener cuidado con la contaminacin: guantes, flujo laminar horizontal (todo est abocado a
proteger la contaminacin del embrin), aire estril, si se contamina la placa, implantamos la bacteria,
se produce endometritis, se abre el crvix y perdemos el embrin.

Damos vuelta la placa, obtenemos el embrin,

generalmente 1, pero puede haber 2, lo
descontaminamos, le realizamos lavados en
medio con ATB, lo pasamos desde un pocillo a
otro (se realizan 4 lavados), luego lo ponemos en
solucin de Holding hasta ser transferido, se lo
carga en una pajuela.

El blastocisto expandido es lo que se recupera (ya emiti lquido y se form blastocele), con la capsula
glicoproteica, con la pelucida adelgazada.

El embrin equino nunca se elonga, siempre se mantiene esfrico.

La clasificacin: lavamos da 6 podemos recuperar mrula, si lavo da 8 y la encuentra puede ser una
yegua vieja o que no creci. En las yeguas viejas el crecimiento celular es ms lento.
PAJUELA DE 0,5 ML: sino el embrin queda muy apretado su uso la de 0,25 (otras spp).

MEDIO+AIRE+(MEDIO Y EMBRION)+AIRE+MEDIO

Destino del embrin obtenido

Transferencia embrionaria inmediata a receptora sincronizada

Envo al centro de receptoras: refrigeracin por 24 hs
Eventualmente Criopreservacin a largo plazo:
-Congelamiento convencional
- Vitrificacin

Transferencia embrionaria no quirrgica:

Se carga la pajuela, luego se introduce en la pistola de inovulacin, hay descartables o metlicas, por
fuera tiene una cubierta plstica, con una punta de plstico/ metlica de salida lateral/frontal, se
recubre con una cubierta estril (camisa de celofn), porque entramos por la vagina que est
contaminada, eso me asegura que llegue bien al crvix.

Hay 2maniobras posibles:

Va vaginal entra la pistola de inovulacin, llegamos hasta el crvix, lo tocamos para identificarlo, y
dejamos la pistola en ese lugar, sacamos la mano, entramos por va rectal, sostenemos el tero lo
estiramos hacia craneal, para poder enhebrar, as pasamos la pistola sin raspar la mucosa uterina,
porque si raspamos irrito la mucosa y estimulamos la liberacin de PGF2.

Otro mtodo, si no hay mucha experiencia, es utilizando una pinza de traccin cervical, la idea es colocar
un especulo (bivalvo, trivalvo) observamos el crvix, lo tomamos con la pinza y lo tomamos y lo
retraemos, de esa forma alineamos el cuerpo uterino con el cuerno, y es muy sencillo de realizar sin
raspar.

Con pinza de traccion cervical:

Transferencia de embriones de da 10: la maniobra es mas cuidadosa, el embrion es mas sensible a

perder la capsula, se realiza la extraccion previa a la ecografa, sino no se realiza el lavado.

Manejo de la receptora post tranferencia

Evitar la lutelisis por irritacion o contaminacion del utero

Aplicacin de agentes antiluteolticos: M.de Flunixin ( bloquea la cox2, retrasa la sisntesis de PG)
Aplicacin de P4 ( da tono rapido y cierra el cervix)
Control post tranferencia: NO DEBE APARECER Edema endometrial- liquido intrauterino- del
tono uterino.

Factores que afectan la tasa post transferencia

Factores inherentes al embrin (calidad: grado1,2,3)

Condiciones de laboratorio y esterilizacin
Tecnica de transferencia (Operario), si raspamos no depositamos el embrin ah.
Factores relacionados a la receptora: Disponibilidad, manejo, nutricion,repeticin.
(hasta yeguas castradas, suplementadas con P4 y E2)

Eventos claves en TE

DX da de ovulacion-Dia de lavaje
Control de la contaminacion uterina: IA-Tecnica de minima contaminacion
Manejo hormonal de la receptora:mayos disponibilidad
Preservacion de los embriones

RESULTADOS ESPERADOS:Consideramos una donate normal,IA con padrillo fertil y TE a una receptora
normal con un operador experimentado.

Recuperacion embrionaria promedio del 70%

 Preez post TE: 65%-80%
Perdida embrionaria temprana <12%
Intervalo interovulatoria de la donante 17 das
Promedio 4 preeces anuales (donante)
Mayor costo operativo que en otras spp.

Superovulacin
Limitaciones: en Eq no hay drogas efectivas, si bien logran el crecimiento folicular

Alta variabilidad de respuesta

Menor respuesta en yeguas viejas
Particularidad anatomica:mayor tasa de ovulacion, menor tasa de recuperacion
Disponibilidad comercial, precio

Cuando ocurre la primera ovulacion el foliculo ocupa toda la fosa, las siguientes ovulaciones, no
sabemos si van a llegar al oviducto. Lo que deseamos son ovulaciones dobles, ahora esto se logra
utilizando FSH recombinate, porque es muy dificil lograr esto con manejo hormonal.

Criopreservacin
Refrigeracin
Buenos resultados por 24 hs a 5C
Medios comerciales: Holding(Vigro-Encare)
Colocamos el embrin en un criovial(tubo) con medio de Holding, luego se tapa y se sella para
evitar la perdida de liquido, y asu vez se coloca en otro tubo de 50cc lleno de liquido a la misma
temperatura, que puede ser medio de lavaje o Sc Ringer/Fisiologica(para que amortigue el
descenso de T), se coloca en Equitainer.
La tasa de la preez no varia entre embriones fresco y refrigerados ( hasta 24hs)

Criopreservacin (congelamiento y vitrificacin)

Congelamiento:
El problema es el tamao del embrion, todos los crioprotectores que penetran el embrion son
toxicos, y ademas la cantidad de liquido hace que se generen cristales que pueden daar las
membranas, siempre hay efecto toxico, la tecnica no da buenos resultados.

Algunos crioprotectores:
Glicerol-Etilenglicol-DMSO (son los mas penetrantes)
Galactosa-Sucrosa-Albumina
Efecto citotoxico
Tiempo de exposicion vs concentracion vs T
 Vitrificacion: se utilizan crioprotectores que no forman hielo (masa densa), no forma cristales,
son mas toxicos que los utilizados en la congelacion, pueden estar en contacto con el embrin
poco tiempo, y luego son colocados dentro del N2 liquido, no se necesita curva lenta de
descenso pasa de T ambiente, se le agrega crioprotector en segundos, en 2 pasajes y se coloca
en N 2 inmediatamente. La limitante es el tamao del embrin, los mejores resultados son en
embriones de 300 um, si supera esa medida hay que hacer aspiracion del liquido blastocstico,
con una aguja chupamos todo el liquido del embrin, y luego se vitrifica, cuando se desvitrifica
con una solucion de sacarosa a T 37C, las celulas del trofoblasto comienzan a generar liquido
hasta completar el tamao normal (eso quiere decir que est vivo y tiene muchas chances de
sobrevivir).
Para obtener embrin de 300 um, se adelante el da de lavaje, si se trabaja con yeguas viejas no
obtenemos el embrin, se trabaja con yeguas jovenes.

Criopreservacion embrionaria:

Bajos resultados con embriones congelados

Vitrificacion con buenos resultados
Exposicion a concentraciones altas y crecientes de crioprotectores previo a inmersion directa en
nitrogeno liquido. No hay formacion de cristales de agua. Mejores resultados con embriones
<300 um,lavaje uterino da 6,5. Embriones >300 um aspiracion del liquido blastocelico.

TECNICAS DE REPRODUCCION ASISTIDA

Se utilizan generalmente cuando ya la yegua no produce embriones en forma natular, repetida
recuperacion en 0 de embriones, son yeguas de elite de una increible genetica y performance.

Transferencia de ovocitos :OT

Fertilizacion invitro: FIV
ICSI: Inyeccion intracitoplasmatica de Z
Transferencia nuclear (SCNT=Clonacion)

Transferencia de ovocitos

Obtenemos el ovocito del foliculo ovarico, y ese ovocito lo tranferimos quirurgicamente al oviducto de
una receptora sincronizada, a la cual se la insemina, esta gestar y criar ese producto.

Aplicaciones:

Yeguas viejas es donantes de embriones

Yeguas con problemas de tracto reproductivo
Alteraciones en la ovulacion
Rutina- Manejo de TO:

Seguimiento folicular diario durante el celo de la Donante. Sincronizacion EXACTA entre

Donante y Receptora.
Induccion de ovulacion con Deslorelina y hCG (seguimiento una vez por hora)
Aspiracion de la donante y receptora del foliculo (se saca en ambas) 24-35 hs postinduccin con
OPU (transavaginal con guia ecografica)
Inseminacion de la receptora
Tranferencia QX del COC en la receptora

OPU: Aspiracion transvaginal con gua ecografica (TVA)

Foliculo preovulatorio ( en la donante)

Otras variantes:

Foliculos prequeos(diestro): requieren maduracion in vitro

Foliculos ovaricos de yeguas preadas

Se lleva el transductor al fondo de vagina, por via rectal acercamos al fondo de la vagina el ovario que
tiene el foliculo preovulatorio y lo apoyamos sobre el transductor. El modulo lleva una guia que tiene la
aguja de aspiracion, que es una aguja de doble via ( inyecta loquido y aspira simultaneamente).

Punzamos a traves de la pared de la vagina, cuando aspiramos sale el liquido folicular, es necesario lavar
el interior del foliculo con liquido a presion, que genera un flujo turbulento, que raspa todo el interior de
la cavidad folicular, masajeamos el foliculo al mismo tiempo que aspiramos, se repite la maniobra 6-7
veces, sino no podemos despegar el Cumulus Ovocito, ya que est adherido a la pared.

Aguja doble via 12G, 60 cm

Inyeccion de emdio de aspiracion
Bomba de vacio
Recoleccion en medio esteril y atemperado

Realizamos la busqueda del COC y Maduracion in vitro si es necesario

Transferencia QX del ovocito (COC) al oviducto de la receptora

La CX se realiza de pie, con derivados de la morfina, la manipulacion del oviducto se hace fuera de la cavidad
ya que se se saca fuera por va transrectal para evitar la manipulacion de los mesos, y disminuir el dolor
postoperatorio.
Resultados: TASA DE RECUPERACION 70% al 90% - TASA DE PREEZ 32%

Produccion de embriones Invitro

La fecundacion invitro no funciona en el equino, se coloca un ovocito y Zs precapacitados y se produce la
fecundacion.
Para las practicas se obtienen ovocitos de yeguas de matadero.
El problema de que la tcnica no funcione no est delucidado, no se sabe si es la membrana del Zs, o la
membrana pelucida del ovocito.

ICSI: inyeccin intracitoplasmatica de Zs

Indicado cuando el macho es el que tiene problemas, es una tcnica muy difundida en humanos.
Inyectamos micromanipulado un solo Zs dentro del Ovocito.
Vamos a necesitar un microscopio invertido y 2 brazos de micromanupulacin, uno sostiene el ovocito (pipeta
holding) y por el otro lado una aguja de inyeccin que atraviesa la zona pelucida y deposita ese Zs dentro del
ovocito.
Partimos de la aspiracin (OPU en la yegua donante), luego lo ponemos en maduracin, una vez que termina
lo evaluamos si est maduro, evaluamos los Zs que vamos a inyectar, luego hacer la microinyeccin y cultivo
embrionario, para que haga las fases de divisin celular hasta blastocisto, y transferencia en la receptora.
De los Zs mviles, seleccionamos uno solo, lo aplastamos(con la aguja de inyeccin) para romper la membrana
plasmtica, porque en el citoplasma que est en el espermatozoide estn los inhibidores de divisin celular
LPCZ (Fosfolipasa), esto activa la divisin celular, lo cargamos desde la cola, y lo dejamos montado en la aguja
directamente lo acercamos al ovocito denudado (sabemos que est maduro porque vemos el cuerpo polar), lo
inyectamos lejos de esta zona ( sabemos que est en metafase) rompemos con la aguja el ovolema, hacemos
una pequea aspiracin para asegurarnos que estamos dentro de la membrana plasmtica del ovocito, y lo
depositamos y salimos, a las 24-48hs vemos las mrulas tempranas, a los 8-9 das de cultivo invitro tenemos el
blastocisto.
Hacemos la transferencia, si llegamos al blastocisto hacemos la transferencia directa, sino llegamos a ese
estadio de desarrollo, hacemos la transferencia quirrgica en oviducto.

Aplicaciones:
Padrillos subfrtiles
Zs congelados o liofilizados de padrillos que murieron
Zs de epiddimo
Yeguas con fallas de ovulacin
Yeguas muertas
Procedimiento:
Aspiracion folicular (OPU)
Maduracion del ovocitp (IVM)
Preparacion del Zs
Microinyeccion
Cultivo embrionario
Transferencia
Clonacin
Obtencin de una copia idntica del original.

Particin de embriones
Transferencia de clulas somticas a ovocitos enucleados (SCNT)

Aplicaciones:

Preservacion genetica (extinto o muerto)

Rescate genetico (muertos/castrados)
Yeguas que no producen mas crias
Aumentar el N de animales de cierta genetica

Tenemos que preservar tejidos de la donante, hacer el cultivo celular, necesitamos ovocitos de faena, abrir los
foliculos, sacar todos los ovocitos y ponerlos en cultivo, donde van a producir el cuerpo polar (sabemos que
estan en metafase 2), vamos a proceder a la enuclacion, sacamos la metafase 2 y el cuerpo polar, y todo el
ADN nuclear, cuando ya no tiene material de ADN nuclear se transforma en un Ovoplasto solo tenemos ADN
en las mitocondrias, las celulas somaticas que estan en cultivo se le inyecta dentro pasando la membrana
pelucida, y se lo pega bien al nucleo del ovoplasto, por una microdescaga electrica, se despolarizan las
membranas y el nucleo de la celula somatica pasa al nucleo del ovoplasto, y para que se divida hay que si o si
activarlo, hay activadores quimicos, extracto de ZS (LPCZ) una vez recombinado lo podemos transferir, o lo
dejamos en cultivo hasta que llegue a blastocisto y despues lo transferimos.
Para ver la metafase y lo teimos con colorante vital fluorescente.
** La clonacin en PSC no est permitida, en el polo los clones estn permitidos mientras tanto se puedan
identificar genticamente por esta razn los clones hembras pueden jugar y son varios ya que el componente
mitocondrial lo aporta el ovolema, pero en caso de los clones machos, el Zs no aporta mitocondrias y ms de
un clon no se podra identificar, por eso solo se permite un solo clon macho en el registro.

Sexado de embriones
Objetivo obtencin de potrancas de polo

Biopsia de blastocisto
PCR de las clulas - Lquido blastocistico
Transferencia de embriones hembras
80% de eficiencia

Actualmente se transfieren todos los embriones, ecogrficamente se sexan a los 60-70 das y se abortan los machos.