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Manual de guiones experimentales para la enseanza y
aprendizaje del laboratorio de Toxicologa (clave 1614)
Segunda Edicin
ISBN: 978-607-02-7279-0
ISBN: 978-607-02-7279-0
Prohibida la reproduccin total o parcial por cualquier medio, sin la
autorizacin escrita del titular de los derechos patrimoniales.
Impreso y hecho en Mxico
Tamao: 3.30 MB
Tipo de impresin: PDF
Publicacin autorizada por el Comit Editorial de la Facultad de Qumica
Laboratorio de Toxicologa
NDICE
PRLOGO 3
PRLOGO
A partir del semestre 2006-I se inici la implementacin gradual del mapa curricular del plan de estudios vigente
de la carrera de Qumica Farmacutico Biolgica (QFB).
En este mapa curricular, se ubic en el sexto semestre la asignatura terico-experimental de Toxicologa, con
clave 1614. El diseo del contenido programtico de la asignatura, consider revisar los conocimientos bsicos
de toxicologa como son citotoxicidad, bioactivacin txica, estrs oxidante, mutagnesis, carcinognesis y
teratognesis, para integrarlos al estudio del riesgo de exposicin, as como a la toxocintica y toxodinamia de
las reacciones adversas ocasionadas por xenobiticosfrmacos, metales pesados y sustancias de abuso.
Acorde a lo antes sealado, se consideraron guiones experimentales que permitieran la aplicacin e integracin
de los conocimientos adquiridos en diversas asignaturas de semestre previos y de manera importante, los
obtenidos en la clase terica de la asignatura. En el ao 2012 se contaba con el Manual de guiones
experimentales para la enseanza y aprendizaje del laboratorio de Toxicologa, constituido por diez guiones
experimentales diseados de acuerdo a la Reforma de la Enseanza Experimental. Dos de estos guiones se
implementaron con el apoyo del proyecto PE202006 a travs del Programa de Apoyo a Proyectos para la
Innovacin y Mejoramiento de la Enseanza (PAPIME), lo que permiti la adquisicin de equipos, materiales y
reactivos para la enseanza experimental de esta asignatura.
Posteriormente, el grupo de profesores de toxicologa, en forma colegiada, decidi continuar con la revisin del
curso prctico, incluyendo temas de inters actual en esta asignatura como toxicologa ambiental y estrs
oxidante; y rediseando dos de los guiones existentes con la finalidad de mejorar el aprendizaje hacindolos ms
completos e integrales. Con esta intencin, se implementaron tres guiones experimentales con apoyo de otro
proyecto (PE201111) del mencionado programa: a) Identificacin y cuantificacin de txicos no voltiles en
una muestra problema, b) Determinacin del mecanismo de accin antioxidante de compuestos de origen
natural y sinttico, ambos resultado del rediseo de prcticas incluidas en el manual del 2012; y c)
Determinacin de mutgenos ambientales a travs de la prueba de Ames para integrar el tema de toxicologa
ambiental.
Es as que los autores de esta segunda edicin presentamos el Manual de guiones experimentales para la
enseanza y aprendizaje del laboratorio de Toxicologa (clave 1614), constituido por once guiones
experimentales tres de los cuales estn incluidos en la seccin de Guiones experimentales complementarios,
mismos que permiten reforzar los conocimientos en toxicologa analtica y en el caso de uno de ellos, evidenciar
efectos txicos. Cabe destacar que todos los guiones del Manual permiten cubrir las unidades temticas del curso
terico (Tabla 1) y propician tambin su aplicacin a la resolucin de problemas en esta rea. Asimismo, la
secuencia de los guiones experimentales est en concordancia con las clases tericas, lo que favorece el proceso
de enseanza-aprendizaje de los alumnos.
Tabla 1. Relacin entre las unidades temticas del curso terico y los guiones experimentales.
Curso laboratorio Curso terico
Guin experimental Unidad temtica
Identificacin y cuantificacin de txicos no voltiles
Introduccin a la toxicologa
en una muestra problema
Cuantificacin de cianuro de hidrgeno, como txico La biotransformacin de xenobiticos y su importancia
voltil, a partir de glucsidos cianognicos toxicolgica
Determinacin del mecanismo de accin antioxidante
El estrs oxidante
de compuestos de origen natural
Determinacin de mutgenos ambientales a travs de Mutagnesis, carcinognesis y teratognesis y
la prueba de Ames toxicologa ambiental
Cuantificacin de microncleos en eritrocitos de
Mutagnesis, carcinognesis y teratognesis
mdula sea como indicador de genotoxicidad
Efecto txico de plomo en ratas Toxicidad de metales pesados
Efecto del pH en la liberacin de plomo por utensilios
Toxicidad de metales pesados
de barro vidriado
Determinacin de etanol en una muestra problema Toxicidad de sustancias de abuso
Guiones complementarios
Extraccin y cuantificacin de txicos no voltiles en
Introduccin a la toxicologa
una muestra problema
La biotransformacin de xenobiticos y su importancia
Determinacin de malatin residual
toxicolgica
Produccin de metahemoglobina por nitritos y efecto La biotransformacin de xenobiticos y su importancia
protector del azul de metileno in vivo toxicolgica
Cabe recordar que los guiones experimentales se elaboraron siguiendo los criterios establecidos por la Reforma
de la Enseanza Experimental,* donde la adquisicin del conocimiento se da a la luz de las evidencias
observables o medibles de los fenmenos que ocurren en el laboratorio. El estudiante es enfrentado a los mismos
a travs de un problema bien definido, el cual debe ser resuelto encontrando las relaciones causa-efecto a travs
del trabajo experimental.
OBJETIVO ACADMICO
Se establece para reforzar y enriquecer los conocimientos adquiridos en el curso terico, as como el desarrollo
de habilidades en el manejo de materiales y empleo de tcnicas analticas usadas comnmente para determinar
y/o identificar la presencia de xenobiticos.
PROBLEMA
Se plantea con la intencin de enfrentar al estudiante a fenmenos de inters en el rea que le permitan adquirir
los conocimientos planteados en el OBJETIVO ACADMICO a travs del trabajo experimental; encontrando
las relaciones causa-efecto y relacionando estos hallazgos con el riesgo de intoxicacin y/o el potencial
toxicolgico.
DESARROLLO EXPERIMENTAL
Describe el procedimiento y tcnicas utilizadas para el desarrollo y obtencin de resultados que permitan
resolver el PROBLEMA.
CUESTIONARIO
Se incluye con la intencin de dirigir al estudiante hacia la resolucin del PROBLEMA, resaltando los aspectos
vivenciales de la experiencia en el laboratorio y, de esta forma, reforzar el proceso cognoscitivo.
Reglamento de Higiene y Seguridad de la Facultad y del Departamento de Farmacia, para concientizar a los
alumnos de la relevancia y carcter obligatorio de ambos, promoviendo de esta forma el desarrollo de
actitudes apropiadas para un profesional en el rea de las ciencias biolgicas y de la salud.
Formato de Reporte de Seguridad e Higiene y la Hoja de Seguridad de Reactivos, para que los alumnos se
familiaricen con el rombo de comunicacin de riesgos y de esta forma, puedan identificar el equipo de
proteccin personal para el manejo de sustancias qumicas y el grado de riesgo de sustancias peligrosas.
Hoja de valoracin para la evaluacin del bienestar de los animales de experimentacin, con base en la
recomendacin emitida por el Comit Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio
(CICUAL), misma que permitir realizar una revisin de la salud animal peridica posterior a la
administracin del xenobitico en los guiones en donde se emplean animales de experimentacin. Con esta
medida se evitar causarles sufrimiento innecesario y, en su caso, se aplicar adecuadamente el punto final
humanitario del experimento.
Finalmente, los autores agradecemos el apoyo brindado a travs del proyecto PAPIME Nm. PE201111 de la
Direccin General de Asuntos del Personal Acadmico (DGAPA) de la UNAM para la implementacin de tres
guiones experimentales y la elaboracin de esta segunda edicin. Asimismo, agradecemos a los becarios de este
proyecto: Carolina Rivera Santiago, Jos Guadalupe Becerril Vega, Valeria Abigail Rosales Zariana, Marcela
Alejandra Lpez Snchez y Rodrigo Hernndez por sus valiosas aportaciones y dedicacin para lograr el
desarrollo e implementacin de los nuevos guiones.
ARTCULO 1. El presente Reglamento es aplicable en todos aquellos espacios de la Facultad de Qumica donde
se realice trabajo experimental, sea de docencia o de investigacin. Estos sitios, para efectos del presente
Reglamento, sern denominados laboratorios. Su cumplimiento es obligatorio para el personal acadmico,
administrativo y alumnos y no excluye otra reglamentacin que resulte aplicable. Deber exhibirse en un lugar
visible en cada laboratorio de la Facultad de Qumica.
ARTCULO 2. Es necesario que el personal que trabaja en cada laboratorio conozca los sistemas de alerta, las
zonas de menor riesgo, las rutas de evacuacin, el equipo para combatir siniestros y las medidas de seguridad en
cada laboratorio, as como los procedimientos establecidos para actuar en caso de presentarse una emergencia.
ARTCULO 3. Los laboratorios debern estar acondicionados, como mnimo, con lo siguiente:
i. Regadera
j. Lavaojos
k. Polvo para derrames
ARTCULO 4. Cada uno de los Departamentos y Unidades Acadmicas de la Facultad debern nombrar al
menos a un responsable de seguridad.
ARTCULO 5. En los laboratorios de enseanza de Licenciatura, al realizar actividades experimentales, nunca
deber estar una persona sola. El nmero mnimo de personas deber ser de dos y al menos una de ellas deber
ser parte del personal acadmico de la Facultad. En el caso de los laboratorios de investigacin el nmero
mnimo de personas que debern permanecer es de dos, sin importar su nombramiento.
ARTCULO 6. Para trabajar en los laboratorios, es obligatorio usar bata, lentes de seguridad y en caso de ser
necesario guantes; es responsabilidad del usuario contar con el equipo mencionado. Queda prohibido el uso de
lentes de contacto, pelo suelto y zapatos abiertos.
ARTCULO 7. Queda prohibido fumar y consumir alimentos o bebidas en los laboratorios.
ARTCULO 8. Todas las reas donde se realice trabajo con material radiactivo debern estar claramente
identificadas. Para poder manipular este material radiactivo, es indispensable aprobar el curso de capacitacin,
as como la obtencin del dosmetro correspondiente.
ARTCULO 9. Para poder realizar trabajo experimental con Organismos Genticamente Modificados (OGMs),
se deber informar a la Comisin Interna de Bioseguridad. El manejo y disposicin adecuada de estos
organismos, se llevar a cabo de acuerdo con el reglamento interno de cada Departamento.
ARTCULO 10. En caso de trabajar con compuestos que contengan azufre, selenio y fsforo o cualquier
sustancia olorosa se deber informar a la Coordinacin de Seguridad Prevencin de Riegos y Proteccin Civil
para su conocimiento. Para el manejo de las mencionadas sustancias debern seguirse las recomendaciones
establecidas en las hojas de seguridad correspondientes que estarn disponibles en cada laboratorio (NOM
018.STPS-2000). http://www.stps.gob.mx/bp/secciones/dgsst/normatividad/normas/Nom-018.pdf
ARTCULO 11. Las puertas de acceso y salidas de emergencia debern estar siempre libres de obstculos y en
posibilidad de ser utilizadas ante cualquier eventualidad. El responsable del rea deber verificar el
cumplimiento de este artculo.
ARTCULO 12. Las regaderas debern funcionar correctamente, contar con el drenaje adecuado, estar lo ms
alejadas posible de instalaciones o controles elctricos y libres de todo obstculo que impida su uso. El
responsable del rea deber verificar el cumplimiento de este artculo.
ARTCULO 13. La localizacin de los controles maestros de energa elctrica y suministros de gas en cada
laboratorio, deber estar sealada adecuadamente, de manera que puedan ser identificados con facilidad.
ARTCULO 14. Las tuberas de cada laboratorio debern estar sealadas de acuerdo con la norma oficial
mexicana correspondiente (Norma Oficial Mexicana NOM-0026 STPS 1998).
http://www.stps.gob.mx/bp/secciones/dgsst/normatividad/normas/Nom-026.pdf
ARTCULO 15. Cada laboratorio deber contar con un botiqun de primeros auxilios. Su contenido ser el
siguiente: apsitos estriles, vendas elsticas, tela adhesiva, abatelenguas, frulas de cartn de 15 x 50 cm,
mascarilla para respiracin artificial (tipo mascarilla nariz-boca con fuelle, sin contacto directo de boca a boca o
un equipo de funcin semejante), algodn, alcohol en gel o alcohol lquido desnaturalizado, termmetro axilar y
tijera recta. El responsable se har cargo de revisarlo peridicamente.
ARTCULO 16. Los extintores de incendios debern ser de CO2 y de polvo qumico seco, segn lo determine el
Departamento de Prevencin y Combate de Siniestros de la UNAM. Debern ser recargados peridicamente de
conformidad con los resultados de la supervisin que se realiza regularmente o despus de haber sido utilizados.
En caso de que un extintor sea utilizado, deber informarse a la Coordinacin de Seguridad, Prevencin de
Riesgos y Proteccin Civil para obtener un extintor de reemplazo temporal. El extintor debe tener la fecha de la
ltima recarga y cuando se le debe de dar mantenimiento.
ARTCULO 17. Todo el personal acadmico, administrativo y estudiantes debern de tener conocimiento de los
procedimientos de seguridad establecidos para emergencias ocasionadas por incendios, derrames o personas
accidentadas. Estos procedimientos se deben de tener a la vista en cada laboratorio.
ARTCULO 18. Los sistemas de extraccin de gases debern mantenerse sin estorbos ni impedimentos para su
correcto funcionamiento. Se les deber proporcionar el mantenimiento preventivo o correctivo que solicite el
responsable de cada rea.
ARTCULO 19. Los sistemas de suministro de agua corriente y de drenaje, debern recibir el mantenimiento
preventivo o correctivo que solicite el responsable de cada rea, tan pronto como sea posible.
ARTCULO 20. Los lugares donde se almacenen reactivos, disolventes, equipos, materiales, medios de cultivo
y todo aquello relacionado o necesario para el funcionamiento correcto de los laboratorios, estarn sujetos a este
Reglamento en su totalidad.
ARTCULO 21. Queda prohibido desechar sustancias o materiales al drenaje, a la basura municipal o al medio
ambiente. Todos los laboratorios debern contar con procedimientos bsicos para la disposicin adecuada de los
residuos y del personal responsable de su tratamiento.
ARTCULO 22. Queda prohibido pipetear directamente con la boca cualquier lquido.
ARTCULO 23. Al finalizar las actividades cotidianas, el responsable o el profesor correspondiente en los
laboratorios de enseanza deber verificar que queden cerradas las llaves de gas, agua, vaco, etc., as como
apagar todos los equipos que se hayan utilizado. En caso de requerir que algn equipo trabaje continuamente,
debern indicarse tanto en el interior como en el exterior del laboratorio correspondiente, en forma claramente
visible y legible, las precauciones que deben seguirse, as como la informacin para localizar al responsable.
ARTCULO 24. Queda prohibido dejar experimentos bajo condiciones de calentamiento a reflujo toda la noche,
fines de semana y en periodo vacacional excepto cuando cuenten con un sistema de recirculacin de agua.
ARTCULO 25. En cada laboratorio de la Facultad debern exhibirse, visible y legiblemente, los telfonos de
emergencia a los cuales llamar en caso de requerirlo.
ARTCULO 26. Los anaqueles, libreros y muebles de oficina que puedan caerse, debern estar sujetos. Los
cilindros vacos o que contengan gases debern estar asegurados individualmente para prevenir accidentes.
ARTCULO 27. Queda prohibido que menores de edad permanezcan en el laboratorio sin la autorizacin por
escrito del responsable del rea.
ARTCULO 28. El personal (acadmicos, administrativos o estudiantes) que labora, o realiza sus actividades en
los laboratorios, debe informar al responsable del rea o a su jefe inmediato si padece alguna enfermedad que
requiera atencin especial y pueda generar incidentes dentro del rea.
ARTCULO 29. A todas las Unidades, Centros o Departamentos que estn certificados se regirn por el
reglamento general y ser complementado por su reglamento interno.
ARTCULO 30. Todas aquellas cuestiones que no estn especficamente sealadas en el presente Reglamento
debern ser resueltas por la Coordinacin de Seguridad, Prevencin de Riesgos y Proteccin Civil, la cual se
apoyar en la Direccin de la Facultad.
ARTCULO 31. Cualquier alteracin de las condiciones de seguridad, o en el cumplimiento del presente
Reglamento, deber ser reportada la Coordinacin de Seguridad, Prevencin de Riesgos y Proteccin Civil.
ARTCULO 32. Las personas que sean sorprendidas haciendo mal uso de equipos, materiales, instalaciones,
etc., propias de los laboratorios, o de las sealizaciones instaladas para proteccin civil, sern sancionadas
conforme a la Legislacin Universitaria, segn la gravedad de la falta cometida.
ARTCULO 33. En el caso de los alumnos, las sanciones aplicables sern las que decida el H. Consejo Tcnico
de la Facultad, conforme a las disposiciones de la Legislacin Universitaria.
ARTCULO 34. Si se trata de personal acadmico o administrativo, se levantarn las actas correspondientes y
se dictarn las sanciones conforme a las disposiciones de la Ley Federal del Trabajo.
ARTCULO 35. Cada rea acadmica deber tener un Reglamento Interno de Higiene y Seguridad que ser
complementario al presente Reglamento, en tanto no lo contravengan.
ARTCULO 36. Se informar de este reglamento, as como de los particulares, a los usuarios de cada rea
acadmica, quienes debern firmar de enterado.
Para realizar las actividades experimentales en los laboratorios del Departamento de Farmacia, se debern
observar las siguientes indicaciones:
1. Es indispensable que el alumno cuente con el Guin o Manual actualizados de los experimentos, el
Calendario de Prcticas y los tiles o materiales adicionales que le hayan sido solicitados por su
profesor(a).
2. Para tal efecto es necesario que los coordinadores de la asignatura enven, en el periodo sealado para
esta actividad, el Calendario de Prcticas que se elabor de manera colegiada y de acuerdo al formato
vigente que les enva la Coordinacin de Laboratorios de Docencia previo al inicio del semestre.
3. Las actividades que se registren en el calendario de prcticas deben estar asociadas a un espacio fsico en
donde se desarrollar la actividad. Si durante el semestre surge alguna modificacin en la ubicacin de
las actividades, se deber comunicar a la Coordinacin de los Laboratorios al menos una sesin antes de
que realice la actividad en la que hay modificaciones al calendario.
4. Al finalizar el curso prctico de cada asignatura los profesores subirn las calificaciones a la pgina de
escolares: escolares.quimica.unam.mx/profesor, en tiempo y forma de acuerdo con el Calendario de
Actividades vigente y con la forma en la que cada asignatura haya definido de manera colegiada la
forma en la que deben aparecer sin que quede duda entre los estudiantes. Los alumnos que adeudan
material ya estarn sealados en el recuadro correspondiente y solamente la Coordinacin de los
Laboratorios de Docencia podr eliminar la seal de adeudo. Se entregar en la Coordinacin una copia
del Acta de Calificaciones del grupo con las firmas de los profesores que impartieron la asignatura.
5. SOLICITUD DE MATERIAL
Al solicitar el material para las sesiones prcticas, y antes de firmar de conformidad la papeleta de
solicitud, el alumno, deber revisar el material cuidadosamente en la presencia del laboratorista y si es el
caso anotar las observaciones pertinentes en la papeleta. Al finalizar las actividades prcticas, el material
se entregar limpio y en el mismo estado en que se recibi. No olvide recoger la papeleta de
SOLICITUD DE MATERIAL que firm. En caso de haber roto material, el alumno deber llenar
correctamente, firmar y entregar al laboratorista un VALE DE ADEUDO DE MATERIAL. El material
roto y que sea irreparable se deber depositar en el contenedor identificado para tal funcin en cada uno
de los laboratorios.
6. REPOSICIN DE MATERIAL
Para la reposicin de material roto o extraviado, el estudiante deber comprarlo de las mismas
especificaciones y entregarlo, con la factura de compra, en la Coordinacin de los Laboratorios de
Docencia de Farmacia, a ms tardar en la siguiente sesin de laboratorio o en su defecto y de acuerdo
con el costo, la semana anterior a la entrega de calificaciones finales de las asignaturas Terico-
UTILIZACIN DE REACTIVOS
Observaciones anormales
Cantidad empleada
Reactivo (contaminado, ms de una fase, coloracin
(por equipo)
anormal, precipitados)
VIGILANCIA DE EQUIPO
Observaciones
Condiciones de uso
1 (Sucio, no funciona
Hora de (Cantidad pesada , longitud de
2 3 4 adecuadamente, sin
inicio de onda , rpm , tiempo ,
Equipo 5 observaciones). Anotar el
uso/ temperatura , disolvente
6 7 nmero de equipo o inventario
trmino utilizado , aumento ,
8 cuando considere que requiere
volumen )
mantenimiento
1
Balanza
2
Espectrofotmetro
3,4
Centrfuga
3,4
Microcentrfuga
4,5
Estufa
5,6
Rotaevaporador
7
Microscopio
2
Lmpara de luz UV
4,5
Incubadora
TRATAMIENTO DE RESIDUOS
Observaciones
+
Residuo (R) (contenido, estado fsico, si hay ms de una fase o tiene CRETIB
precipitado)
CR E T I B
CR E T I B
CR E T I B
CR E T I B
CR E T I B
+
Marque con una X, la(s) letra(s) correspondiente de acuerdo al sistema CRETIB (Corrosivo, Reactivo,
Explosivo, Txico, Inflamable, Biolgico-Infeccioso)
_______________________________________________________________
(Nombre y firma del encargado de seguridad)
Investigue los siguientes datos (MSDS, Merck Index) y complete las siguientes tablas para cada sustancia a
emplear. Posteriormente, en el Rombo de comunicacin de riesgos, indique el valor de 0 a 4, correspondiente a
cada riesgo (Salud, Inflamabilidad, Reactividad y Caractersticas especficas) de acuerdo con la Clasificacin y
grados de riesgo de las sustancias peligrosas (ANEXO 1 DEL REPORTE DE SEGURIDAD E HIGIENE).
Reactivo:
DL50/CL50 (rata):
Punto de ignicin:
Reactividad / Incompatibilidad:
Caractersticas especficas:
Equipo de proteccin personal:
Reactivo:
DL50/CL50 (rata):
Punto de ignicin:
Reactividad / Incompatibilidad:
Caractersticas especficas:
Equipo de proteccin personal:
Reactivo:
DL50/CL50 (rata):
Punto de ignicin:
Reactividad / Incompatibilidad:
Caractersticas especficas:
Equipo de proteccin personal:
Reactivo:
DL50/CL50 (rata):
Punto de ignicin:
Reactividad / Incompatibilidad:
Caractersticas especficas:
Equipo de proteccin personal:
Reactivo:
DL50/CL50 (rata):
Punto de ignicin:
Reactividad / Incompatibilidad:
Caractersticas especficas:
Equipo de proteccin personal:
En Equipo de proteccin personal indique la(s) letra(s) de identificacin correspondiente(s) con base en la
tabla del ANEXO 1.
Fecha
Macroequipo responsable
Hora
2
Actividad
3
Aislado
3
Pelo erizado
4
Frecuencia de respiracin
Acicalamiento en el punto de
3
administracin
Presencia de herida o irritacin
3
en la zona de aplicacin
Inquisitivo o alerta al momento
3
de sujetarlo
3
Orificios sucios (diarrea u orina)
3
Coloracin anormal de los ojos
3
Extremidades azules
Observaciones adicionales:
OBJETIVOS ACADMICOS
Que el alumno emplee mtodos de extraccin cida y bsica para separar txicos no voltiles de naturaleza
cida y bsica en una muestra problema.
Que el alumno emplee reacciones coloridas y cromatografa en capa fina (CCF) para la identificacin de
txicos no voltiles en una muestra problema.
Que el alumno cuantifique un txico no voltil en una muestra problema.
PROBLEMA
Separar e identificar escopolamina, paracetamol, cido 4-hidroxibenzoico y cido barbitrico de una muestra
problema; y cuantificar el cido barbitrico presente.
REACTIVOS
EQUIPO
Rotaevaporador Bomba de aspersin
Lmpara de luz ultravioleta Espectrofotmetro
Parrilla de calentamiento
DESARROLLO EXPERIMENTAL
El profesor proporcionar una muestra problema de 30 mL, la cual contiene los txicos no voltiles
escopolamina, paracetamol, cido 4-hidroxibenzoico y cido barbitrico.
PRIMERA SESIN
A) EXTRACCIN CIDA
1. A 15 mL de la muestra problema se agrega una solucin acuosa de cido tartrico al 10% hasta llegar a
pH = 2. La muestra acidificada se trasvasa a un embudo de separacin y se extrae con dos porciones
de 15 mL de AcOEt; se colectan las fases orgnicas y se renen en un matraz. Guardar y etiquetar la fase
orgnica y la acuosa y tratar segn lo indicado en los incisos 2 y 3 respectivamente.
2. Tratamiento de la fase orgnica:
2.1 La fase orgnica se extrae con dos porciones de 15 mL de una solucin de bicarbonato de sodio
(NaHCO3) al 10%; reunir las fases acuosas en un matraz y tratarlas de acuerdo con lo indicado en el
inciso 2.3.
2.2 A la fase orgnica obtenida en el inciso 2.1 se le adiciona sulfato de sodio anhidro para eliminar el
exceso de agua en la muestra, posteriormente la fase orgnica se filtra a travs de algodn y se
concentra in vacuo; el residuo final se reconstituye con 2 mL de AcOEt. Etiquetar como fraccin A1.
2.3 La fase acuosa que se reuni en el inciso 2.1 se acidifica con HCl concentrado hasta llegar a un pH = 1 y,
posteriormente, se extrae con dos porciones de 15 mL de AcOEt; las fases orgnicas se renen en
un matraz, se elimina el exceso de agua adicionando sulfato de sodio anhidro y filtrando a travs de
algodn, finalmente la fase orgnica se concentra in vacuo y el residuo obtenido se reconstituye con
2 mL de AcOEt. Etiquetar como fraccin A2.
3.2 A la fase acuosa obtenida en el inciso 3.1, se adiciona gota a gota, HCl concentrado hasta llegar a
pH = 2. Etiquetar como fraccin A4.
4. Tomar 2 mL de la fraccin A4 y llevar a sequedad con ayuda de una parrilla de calentamiento; el residuo
obtenido se reconstituye con 2 mL de MeOH y se conserva para su posterior anlisis con las pruebas de
identificacin.
5. El remanente de la fraccin A4 se conserva para la cuantificacin de cido barbitrico de acuerdo al
procedimiento indicado en el apartado C (cuantificacin).
B) EXTRACCION BSICA
1. A 15 mL de la muestra problema se agrega gota a gota una solucin de NaOH al 10% hasta llegar a
un pH = 10 (aproximadamente 10 gotas). La solucin bsica se trasvasa a un embudo de separacin y se
extrae con dos porciones de 15 mL de CH2Cl2; se separan las fases orgnicas y renen en un matraz.
Guardar y etiquetar la fase orgnica y la acuosa y tratar segn lo indicado en los incisos 2 y 3,
respectivamente.
2. Tratamiento de la fase orgnica:
Adicionar sulfato de sodio anhidro para eliminar el exceso de agua, filtrar sobre algodn y concentra in
vacuo. El residuo obtenido se reconstituye en 2 mL de MeOH. Etiquetar como fraccin B3.
3. Tratamiento de la fase acuosa:
3.1 Adicionar gota agota una solucin de HCl 1N hasta pH = 7. La solucin resultante se trasvasa a un
embudo de separacin y se extrae con dos porciones de 15 mL de AcOEt.
3.2 A la fase orgnica obtenida se le adiciona sulfato de sodio anhidro, se filtra a travs de algodn y se
concentra in vacuo, el residuo final se reconstituye en 2 mL de AcOEt. Etiquetar como fraccin B1.
3.3 La fase acuosa neutra del inciso 3 se lleva a pH = 2 adicionando HCl 1N, se trasvasa a un embudo
de separacin y se extrae con dos porciones de 15 mL de AcOEt. A la fase orgnica obtenida se le
agrega sulfato de sodio anhidro, se filtra a travs de algodn, se concentra a presin reducida y el
residuo final se reconstituye en 2 mL de AcOEt. Etiquetar como fraccin B2.
3.4 La fase acuosa remanente de la extraccin anterior, se etiqueta como fraccin B4.
4. Tomar 2 mL de la fraccin B4 y llevar a sequedad con ayuda de una parrilla de calentamiento; el residuo
obtenido se reconstituye en 2 mL de MeOH y se conserva para su posterior anlisis.
5. El remanente de la fraccin B4 se conserva para la cuantificacin de cido barbitrico.
La curva patrn de cido barbitrico se prepara colocando en matraces volumtricos de 10 mL los volmenes de
la solucin patrn de cido barbitrico indicados en la Tabla 1 y llevando al aforo con agua destilada:
1. Colocar en tubos de ensaye 1 mL de cada una de las fracciones que contienen cido barbitrico (muestra
problema, curva patrn y blanco).
2. Adicionar a cada uno de los tubos de ensaye 0.5 mL de la solucin saturada de NaNO2, 0.1 mL de la
solucin de AcOH 2M y 2.4 mL de agua destilada.
3. Determinar la absorbancia de cada una de las muestras en el espectrofotmetro a 530 nm, utilizando como
blanco el tubo nmero 1 de la curva (ver Tabla 1).
4. Despus de haber realizado la lectura de cada una de las muestras colocarlas en un contenedor etiquetado
como R12.
SEGUNDA SESIN
D) IDENTIFICACIN
Solicitar a los profesores 4 placas para cromatografa en capa fina (CCF). Los anlisis por CCF se realizan en
cromatoplaca de 5 cm X 2.5 cm, que consisten en placas de aluminio recubiertas con una capa de gel de slice
(slica Kieselgel 60 F254 Merck).
Rf= d1/d2
d2
d1
2. Para la identificacin de la escopolamina emplear como sistema de elucin una mezcla de CH2Cl2-MeOH-
NH4OH (9:1:0.1).
3. Para la identificacin del cido barbitrico emplear como sistema de elucin una mezcla de
AcOEt-MeOH-AcOH glacial (7:2:1). Agitar vigorosamente la fase mvil antes de eluir la placa.
4. Para la identificacin de paracetamol utilizar como sistema de elucin una mezcla de CH 2 Cl 2 -
MeOH (9:1).
5. Para la identificacin de cido 4-hidroxibenzoico utilizar como sistema de elucin una mezcla de CH2Cl2-
MeOH (9:1) + 10 gotas de AcOH glacial, por cada 10 mL de mezcla.
6. Saturar las cmaras durante 10 minutos antes de eluir las muestras en las cromatoplacas.
7. Eluir hasta la lnea lmite de elucin indicada en el Esquema 1.
8. Visualizar la presencia de las sustancias con una lmpara de luz U.V. a 254 nm y posteriormente, revelar
las cromatoplacas utilizando la solucin etiquetada como solucin reveladora de reactivo de Dragendorff
para el caso del alcaloide (escopolamina), con una cmara de yodo para el cido barbitrico, y con sulfato
crico amoniacal/H2SO4 para el paracetamol y cido 4-hidroxibenzoico.
9. Calcular el factor de retencin (Rf ) para cada sustancia de acuerdo con el Esquema 1 y comparar el valor
obtenido con el de la referencia correspondiente.
10. Una vez identificados las sustancias, desechar los sistemas de elucin de la siguiente forma: depositar la
mezcla CH2Cl2-MeOH-NH4OH (9:1:0.1) en el contenedor etiquetado como R4; depositar la mezcla
AcOEt-MeOH-AcOH glacial (7:2:1) en el contenedor etiquetado como R5; depositar las mezclas que
contengan CH2Cl2-MeOH-AcOH en el contenedor etiquetado como R6. Depositar las cromatoplacas en
una bolsa de plstico etiquetada como R7.
1. Colocar 10 gotas de la fraccin reconstituida correspondiente a barbitricos en un tubo y agregar dos gotas
del reactivo A y una gota del reactivo B (Dille-Koppanyi).
2. Realizar un control positivo con la muestra de referencia y un control negativo con MeOH para esta
reaccin.
3. Una vez identificadas TODAS las fracciones desechar de la siguiente manera: depositar las fracciones A4,
B4 y los residuos de la reaccin de Dille-Koppanyi en el contenedor etiquetado como R8. Depositar las
fracciones A3, B3 y los residuos de la reaccin de Dragendorff en el contenedor etiquetado como R9.
CUESTIONARIO
1. En el caso de emplear una muestra biolgica indique cul es el objetivo de adicionar cido tartrico
adems de ajustar el pH?
________________________________________________________________________________
2. Una vez desarrollado el guin, qu puntos del proceso y propiedades fisicoqumicas considera que son
crticos para la extraccin eficiente de un xenobitico?
________________________________________________________________________________
3. Reporte en la siguiente tabla los resultados que obtuvo en las pruebas de identificacin. Marque con una
cruz si la reaccin fue positiva y un guin si fue negativa.
________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________________
PROGRAMA DE APOYO A PROYECTOS PARA LA INNOVACIN Y MEJORAMIENTO DE LA ENSEANZA 27
Laboratorio de Toxicologa
________________________________________________________________________________________________
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________________________________________________________________________________________________
8. Cules son los puntos que considera crticos para la adecuada identificacin de los componentes en la
muestra problema? Explique su respuesta.
________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________
9. Reporte en la siguiente tabla los valores de absorbancia obtenidos e indique los valores de la regresin
lineal.
10. Interpole los valores de absorbancia en la curva y calcule la concentracin de cido barbitrico en la
muestra. Indique el procedimiento.
___________________________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________________________
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
Clark E.E. Isolation and Identification of Drugs. Vol. I y II. Pharmaceutical Press, London, 1972.
Bowman W.C. y Rand M.J. Farmacologa. Bases Bioqumicas y Patolgicas. (2 ed). Ed. Interamericana,
Mxico, 1984. pp 42.25-42.32.
Blanke R.V. y Decker W.J. Analysis of Toxic substances. En Burtis C.A., Edward R.A. (Eds.) Textbook of
clinical chemistry. Saunders, Philadelphia, 1986. pp 1670-1744.
Benko A. (1985). Toxicological Analysis of Amobarbital and Glutethimide from Bone Tissue. Journal of
Forensic Sciences 30, 708-714,
Cochin, J., Daly, J.W. (1963). The Use of Thin-Layer Chromatography for the Analysis of Drugs. Isolation and
Identification of Barbiturates and Nonbarbiturates Hypnotics from Urine, Blood and Tissues. Journal of
Pharmacology and Experimental Therapeutics 139, 154-159.
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Zaragoza, Espaa, 2001, pp 775-792.
Aydn, A., Ercan ., Tacolu S. (2005). A novel method for the spectrophotometric determination of nitrite in
water. Talanta 66, 1181-1186.
COOH HO OH
CH3
NH-CH3
O
HO OH CH3
OH
cido glico [A, pKa 3.0] cido propanico [B, pKa 4.36] Efedrina [C, pKa 9.36]
Pesar 12 g de sulfato crico amoniacal y adicionarlos lentamente y con agitacin constante sobre 350 g de hielo,
posteriormente, adicionar 12.5 mL de H2SO4 concentrado manteniendo la agitacin. Una vez obtenida la
solucin se filtra a travs de algodn. Guardar la solucin anterior en un frasco mbar.
Solubilizar 2.6 g de carbonato de bismuto y 7.0 g de yoduro de sodio en 25 mL de cido actico glacial, calentar
por 10 minutos a 40 oC para solubilizar el reactivo. Dejar reposar por 12 horas y posteriormente filtrar la
solucin. 20 mL del filtrado (solucin rojo-caf) se mezclan con 8 mL de acetato de etilo, la solucin anterior
guardarla en un frasco mbar (la cual es estable por 6 meses).
Reactivo A (Dille-Koppanyi)
Reactivo B (Dille-Koppanyi)
Pesar 75.0 mg de cido barbitrico y transferir la pasada cuidadosamente a un matraz volumtrico de 25 mL,
llevar al aforo con agua destilada.
Medir 1.14 mL de cido actico glacial (densidad 1.049 g/mL) y agregarlos a 5 mL de agua, vaciar en un matraz
volumtrico de 10 mL y aforar en seguida con agua destilada.
OBJETIVO ACADMICO
Que el alumno determine la cantidad de cianuro de hidrgeno liberado a partir de glucsidos cianognicos
presentes en muestras que forman parte de la dieta de humanos y animales, y relacione la concentracin con su
potencial toxicolgico.
PROBLEMA
Que el alumno cuantifique la concentracin de cianuro de hidrgeno presente en una serie de 2 muestras de
semillas o plantas, y concluya cul de estas muestras presentan riesgo de toxicidad para el humano, con base en
la cantidad de HCN que est presente en el consumo de 100 g de muestra.
REACTIVOS
Reactivo de Guignard * cido clorhdrico * (HCl)
Cianuro de potasio * (KCN) Cloroformo (CHCl3)
Carbonato de sodio (Na2CO3) cido pcrico
* VER APNDICE II
EQUIPO
Espectrofotmetro Termmetro
Estufa
MATERIAL DE ESTUDIO
Traer por equipo aproximadamente 1 g de una de las siguientes semillas: durazno, manzana roja, ciruela pasa,
lima, capuln, cerezas, mamey o pern.
DESARROLLO EXPERIMENTAL
Cada equipo trabajar con 2 muestras problema de semillas segn la lista mencionada, una de las cuales ser
proporcionada por el profesor.
Nota: Antes de comenzar a triturar y pesar su muestra debern tener todos los
reactivos necesarios dentro del matraz, as como lista la tira reactiva, tanto para su
muestra como para la curva patrn.
PAPEL FILTRO
(TIRA REACTIVA)
MUESTRA
La curva patrn de HCN se prepara colocando en matraces volumtricos de 25 mL los volmenes de la solucin
patrn de KCN indicados en la siguiente tabla y llevando al aforo con agua destilada:
1. Colocar con cuidado la tira reactiva en el matraz como se indica en la Figura 1 y agregar a cada
matraz 1 mL de la solucin de HCl 0.5 N y dos gotas de CHCl3, cuidando de no mojar la tira. Tapar
inmediatamente cada uno de los matraces Erlenmeyer con su tapn despus de concluir este
procedimiento.
2. Una vez preparadas las soluciones de la curva patrn, pasarlas inmediatamente a matraces Erlenmeyer de
250 mL, debidamente etiquetados y colocarlos en bao de hielo.
3. Introducir simultneamente en la estufa a 40C los matraces con las muestras problema y los
correspondientes a la curva patrn de HCN durante 1 h.
1. Transcurrido el tiempo de incubacin, los matraces se sacan de la estufa y se dejan enfriar. Decantar el
contenido del matraz y colocar el residuo lquido en un contenedor etiquetado como R1. El material
vegetal se deja secar en la campana sobre papel peridico para ser desechado posteriormente.
2. Introducir en un tubo de ensaye la tira reactiva positiva (procedente de muestra problema, curva estndar o
blanco) adicionar al tubo 20 mL de agua destilada con pipeta volumtrica, tapar el tubo y agitar
vigorosamente. Filtrar la solucin con papel filtro para eliminar residuos de la tira de papel. Colocar las
tiras en una bolsa de plstico etiquetada como R3.
3. Determinar la absorbancia de la muestra y de la curva patrn en el espectrofotmetro a 520 nm, utilizando
como blanco el primer punto de la curva.
4. Despus de haber realizado la lectura y una vez obtenido resultados, la mezcla se coloca en un contenedor
etiquetado como R2.
CUESTIONARIO
1. Reporte en la siguiente tabla los valores de absorbancia obtenidos, e indique los valores de la regresin
lineal.
10
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
Conn, E.E. (1969). Cyanogenic glucosides. Journal of Agricultural and Food Chemistry 17, 519-526.
Conn, E.E.; Cyanogenic glucosides. En: Toxicants ocurring naturally in foods. (2 ed). National Academy of
Sciences, Washington, D.C., 1973, pp 290-308.
Eyjolfsson, R. (1970). Recent Advances in chemistry of cyanogenic glucosides. Fortschritte der Chemie
Organischer Naturstoffe 28, 74-108.
Fabre, R. Y Truhaht, R. Tratado de toxicologa. Vol. I. Paraninfo, S.A., Madrid, 1976, pp 311-332.
Francisco, I.A. y Pimenta-Pinotti M.H. (2000). Cyanogenic Glycosides in Plants. Brazilian Archives of Biology
and Technology 43, 487-492.
Harborne, J.B. Cyanogenic glucosides and their function. En: Phytochemical ecology. Academic Press, London,
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Linder, E. Toxicologa de los alimentos. Ed. Acribia, Zaragoza, 1978, pp 15-19.
Lucas, B. Sotelo, A. (1984). A simplified test for the quantitation of cianogenic glucosides in wild and cultivated
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Montgomery, R.D. Cyanogens. En: Toxic constituent of plant foodstuff, Liener, IE, (Ed.) Academic Press, New
York, 1980, 143-160.
Speijers, G.J. y Egmoad, H.P. Natural Toxins III. Inherent Plant Toxins. En: International Food Safety
Handbook: Science, International Regulation, and Control. Younes, M., Fishbein, L., Miller, S., (Eds.).
Marcel Dekker, Inc, New York, 1999, pp 368-380.
Vetter, J. (2000). Plant cyanogenic glycosides. Toxicon 38, 11-36.
Reactivo de Guignard
Colocar 2.5 g de cido pcrico en un matraz Erlenmeyer de 250 mL y disolver con 200 mL de agua destilada.
Enseguida agregar 12.5 g de carbonato de sodio (Na2CO3) y agitar cuidadosamente para disolverlo. Llevar la
solucin a un volumen de 500 mL con agua destilada.
Nota: Manejar con cuidado el cido pcrico, ya que esta sustancia es cancergena y se
absorbe fcilmente por la piel.
Se pesa exactamente 12.05 mg de KCN transferir la pesada cuidadosamente a un matraz aforado de 50 mL,
disolver y aforar con agua destilada.
Medir 42.5 mL de HCl concentrado (densidad: 36.46g/100 mL) y vaciar a un matraz volumtrico de 1000 mL
que contiene aproximadamente 500 mL de agua destilada, aforar enseguida con agua destilada.
OBJETIVO ACADMICO
Que el alumno sea capaz de determinar el mecanismo de accin mediante el cual un compuesto de origen natural
ejerce efecto antioxidante.
PROBLEMA
Determinar el mecanismo antioxidante de una sustancia qumica a travs de la realizacin de las pruebas
de: 1. Inhibicin de la Xantina oxidasa, 2. Captura del radical superxido, 3. Captura de perxido de
hidrgeno y 4. Captura de radical hidroxilo.
REACTIVOS
Xantina (Xan) Solucin amortiguadora de carbonatos*
Xantina oxidasa (XO) cido etilendiaminotetraactico (EDTA)
Nitroazul de tetrazolio (NAT) Nitrato de cobre (II) (Cu(NO3)2)
Sulfato de amonio y hierro (II) hexahidratado Perxido de hidrgeno (H2O2)
(Fe(NH4)2(SO4)2 6H2O)
cido hexenico cido sulfrico (H2SO4)
Naranja de xilenol (NX) Butil hidroxitolueno (BHT)
Vainillina cido ferlico
Alopurinol
*Ver APNDICE II
EQUIPO
Balanza analtica Bao Mara
Espectrofotmetro
DESARROLLO EXPERIMENTAL
4. Para el antioxidante BHT preparar los tubos de acuerdo a la Tabla 2, siguiendo el orden de adicin
indicado en la columna titulada reactivo.
5. Transcurrido el tiempo de incubacin leer el contenido de los tubos a 295 nm con celda de cuarzo,
empleando el contenido del tubo Control negativo como blanco para medir el Control positivo. Para
mayor comprensin, leer espectrofotomtricamente el contenido de los tubos en el orden numrico que se
indica en la Tabla 3.
6. Interpretar los resultados obtenidos considerando que la absorbancia del control positivo representa el
100% de produccin de cido rico en el sistema Xan-XO de acuerdo a la siguiente frmula.
% inhibicin de la XO = 100 - [(AM) x 100/AC+]
En donde:
AM= absorbancia de la muestra que contiene antioxidante
A C+= absorbancia del control positivo
7. Una vez obtenidos los resultados desechar el contenido de los tubos en un frasco etiquetado como R1.
8. Lavar las puntas de pipeta y tubos Eppendorf empleados con metanol, jabn y agua destilada; secarlos y
entregarlos al profesor. Depositar el agua y metanol empleado para enjuagar en el contenedor R1.
1. Marcar 3 tubos Eppendorf como control negativo (C-), control positivo (C+), y antioxidante.
2. Para los antioxidantes cido ferlico, alopurinol y vainillina preparar los tubos de acuerdo a la Tabla 4,
siguiendo el orden de adicin indicado en la columna titulada reactivo.
Tabla 4. Preparacin de los tubos problema y control para determinacin
de captura de radical superxido (O2-).
Control
Tubo Control Antioxidante
negativo
Reactivo positivo ( L) ( L)
( L)
a. Xantina 1.5Mm 100 100 100
b. EDTA 0.115Mm 100 100 100
c. Solucin amortiguadora de carbonatos 84
600 300 200
mM pH=10.19
d. NAT 0.1 M 300 300 300
e. Solucin acuosa de antioxidante 650M - - 100
f. XO* - 300 300
VOLUMEN TOTAL 1100 1100 1100
g. Agitar e Incubar ** 20 min 20 min 20 min
h. Cu(NO3)2 1.3 mM 200 200 200
VOLUMEN TOTAL FINAL 1300 1300 1300
* Una vez adicionada, se empieza a contar el tiempo. ** Cerrar el tubo, agitar la mezcla por inversin, colocar
los tubos en una gradilla e incubarlos en bao Mara a 27C.
3. Para el antioxidante BHT preparar los tubos de acuerdo a la Tabla 5, siguiendo el orden de adicin
indicado en la columna titulada reactivo.
4. Transcurrido el tiempo de incubacin leer el contenido de los tubos a 560 nm empleando como blanco el
contenido del tubo etiquetado como control negativo.
5. Interpretar los resultados obtenidos considerando que la absorbancia del control positivo representa el
100% de formazn generado en el sistema Xan-XO-NAT de acuerdo a la siguiente frmula.
% de captura del radical superxido= 100 - [(AM) x100/AC+]
En donde:
AM= absorbancia de la muestra que contiene antioxidante
AC+= absorbancia del control positivo
6. Una vez obtenidos los resultados desechar el contenido de los tubos en un frasco etiquetado como R1.
7. Lavar las puntas de pipeta y tubos Eppendorf empleados con metanol, jabn y agua destilada; secarlos y
entregarlos al profesor. Depositar el agua y metanol empleado para enjuagar en el contenedor R1.
3. Transcurrido el tiempo de incubacin leer el contenido de los tubos a 560 nm empleando como blanco el
contenido del tubo etiquetado como blanco.
4. Interpretar los resultados obtenidos considerando que la absorbancia del tubo marcado como control
positivo de H2O2 representa el 100% del perxido de hidrgeno adicionado al sistema y el tubo marcado
como control positivo -OH representa el 100% del radical hidroxilo generado en el sistema.
En donde:
AM= absorbancia del tubo marcado como Captura de H2O2
AC+H2O2 = absorbancia del tubo marcado como control positivo H2O2
5. Una vez obtenidos los resultados desechar el contenido de los tubos en un frasco etiquetado como R2.
6. Lavar las puntas de pipeta y tubos Eppendorf empleados con metanol, jabn y agua destilada; secarlos y
entregarlos al profesor. Depositar el agua y metanol empleado para enjuagar en el contenedor R2.
CUESTIONARIO
1. Reporte sus resultados en la Tabla 1.
Tabla 1. Resultados por equipo.
Prueba Absorbancia Control Absorbancia de la muestra Porcentaje de
positivo (C+) antioxidante: ________________ actividad
antioxidante*
Inhibicin XO
Captura O2-
Captura H2O2
Captura -OH
*Calcular el porcentaje de inhibicin de XO o Captura de O20-, H2O2 o -OH segn sea el caso de acuerdo a las
ecuaciones presentadas en cada una de las secciones.
3. Compare las absorbancias de los controles positivos para cptura de H2O2 y -OH. A qu proceso o
procesos atribuye la diferencia?
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
7. Cul de los antioxidantes muestra mayor capacidad para capturar al radical O2-?
_________________________________________________________________________________
10. Cul de los antioxidantes muestra una mayor capacidad para capturar al radical -OH?
________________________________________________________________________________
11. Considera que el consumo habitual de estos antioxidantes contribuira a disminuir el estrs oxidante?
Justifique su respuesta.
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
Cadenas, E. Packer L. Handbook of Antioxidants. Marcel Dekker, Inc., New York, 2002.
Klaassen, C.D., Watkins, J.B. Manual de Toxicologa de Casarett & Doull: la ciencia bsica de los txicos. (5
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Detection of Lipid Hydroperoxide in Low Density Lipoprotein. Analytical Biochemistry 202, 384-389.
Nourooz-Zadeh, J., Tajaddini-Sarmadi, J., and Wolff S.P. (1994). Measurement of Plasma Hydroperoxide
Concentrations by the Ferrous Oxidation-Xylenol Orange Assay in Conjunction with
Triphenylphosphine. Analytical Biochemistry 220, 403-409.
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y acciones antioxidantes. Nutricin Hospitalaria. XVII, 271-278.
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xylenol orange assay for the measurement of plasma lipid hydroperoxides. J. Biochem. Biophys.
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Tsutomu, K., Susumu, T., Hidetaka, N., et al. (2003). A novel and potent biological antioxidant, kinobeon A,
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Wardman, P., (2007). Fluorescent and luminescent probes for measurement of oxidative and nitrosactive species
in cells and tissues: Progress, pitfalls, and prospects. Free Radical Biology & Medicine 43, 995-1022.
World Health Organization monographs on selected medicinal plants. Volume 1. 1999, Geneva. Pp 16-32.
7a. Completar la longitud de onda a la que absorben las especies qumicas que se determinan
espectrofotomtricamente en las pruebas de inhibicin de la Xantina Oxidasa y de captura del radical
superxido, respectivamente.
7b. Propsito de la adicin secuencial de: xantina, EDTA, solucin amortiguadora de carbonatos pH 10.2,
nitroazul de tetrazolio, XO y Cu(NO3)2 en las pruebas de inhibicin de la Xantina Oxidasa y de captura de
radical superxido.
7c. Identificar las especies reactivas de oxgeno, indicando si son radicales o no.
8. Analice las reacciones planteadas en el siguiente diagrama y describa lo solicitado en los incisos 9a-9c.
+L
(cido hexenico)
LOOH NX
FeII FeIII + OH + OH- FeIII-NX
(l=560 nm)
NX = Naranja de Xilenol
FeIII-NX = Complejo colorido de hierro III y Naranja de Xilenol
L= Lpido = cido hexenico
LOOH = Lpido hidroperxido producto de la peroxidacin de lpidos
en presencia de OH
Xantina 1.5 mM
Pesar 11.3 mg de xantina, agregar Na2CO3 0.4 M hasta solubilizar y aforar a 50 mL con solucin amortiguadora
de carbonatos.
Pesar 970 mg de NaHCO 3 y 1.01 g de Na 2 CO3 , disolverlos con agua destilada. Ajustar pH a 10.2 y
aforar a 250 mL.
Pesar 41 mg de nitroazul de tetrazolio y aforar a 50 mL con agua destilada. Guardar la solucin en un frasco
mbar en el refrigerador.
EDTA 0.1 mM
Xantina oxidasa
Pesar 1.3 mg de cido ferlico y aforar a 10 mL con solucin amortiguadora de carbonatos pH 10.2
Pesar 1.4 mg de butil hidroxitolueno y disolver en 5 mL de metanol; aforar a 10 mL con solucin amortiguadora
de carbonatos pH 10.2
Tomar 0.1 mL de una solucin de perxido de hidrgeno al 50.4% y aforar a 10 mL con agua destilada; de esta
solucin tomar 17 L y aforar a 10 mL con agua destilada.
Reactivo de FOX2
Mezclar 33.6 mg de naranja de xilenol, 50.2 mg de Fe(NH4)2(SO4)26H2O y disolver en H2O destilada, agregar
695 mL de H2SO4 concentrado y aforar a 50 mL con agua destilada.
Solucin FOX-MeOH
Solucin FOX-Antioxidante
Pesar 6.6 mg de cido hexenico y aforar a 50 mL con agua destilada, tomar de esta solucin 5 mL y
aforar a 10 mL con agua destilada.
R1: xantina, xantina oxidasa, EDTA, solucin amortiguadora de carbonatos pH 10.2, nitroazul de tetrazolio,
cido ferlico, vainillina, butil hidroxitolueno, alopurinol, Cu(NO3)2, azul de tetrazolio, formazn, cido rico,
H2O2, metanol.
R2: Naranja de xilenol, sulfato de amonio y hierro (II), H2SO4, cido hexenico, H2O, H2O2, vainillina,
alopurinol, butil hidroxitolueno, cido ferlico metanol.
OBJETIVO ACADMICO
Determinar la presencia de compuestos mutagnicos en muestras de inters o de impacto ambiental empleando
la prueba de Ames.
PROBLEMA
Que el alumno obtenga a partir de muestras de inters ambiental, la fraccin que contiene los compuestos de
naturaleza orgnica y realice la prueba de Ames para determinar si las fracciones contienen compuestos con
potencial mutagnico.
MATERIAL BIOLGICO
Cultivo nutritivo de 16 horas a 37C de Salmonella typhimurium, cepa TA98, cuyos marcadores genticos son:
requerimiento de histidina (His-), sensibilidad al cristal violeta (mutacin en rfa), presencia del plsmido R
(resistencia a ampicilina), sensibilidad a la luz U.V. (mutacin en uvrB) y frecuencia de reversin espontanea.
a) Colillas de cigarro: Recolectar en una bolsa plstica limpia 20 colillas de cigarro a las que debern retirar
el papel envolvente y conservar nicamente el algodoncillo del filtro.
b) Residuos de escape automotriz: Recolectar con un algodn el holln remanente en el escape de un autobs
y guardarlo en una bolsa plstica limpia; si es necesario emplear unas pinzas largas para tener acceso hasta
el lugar en donde el holln se acumula.
REACTIVOS
Extraccin
Prueba de Ames
Hipoclorito de sodio
Solucin L-histidina 0.5 mM / biotina 0.5 mM
Mezcla fraccin S9:
Amortiguador de fosfatos 0.2 M pH 7.4
Solucin de MgCl2 6H2O 0.4 M/ KCl 1.65 M
Glucosa 6-fosfato
NADP+
Medio mnimo de Vogel-Bonner (en cajas Petri)
Agar de superficie (15 mL en tubos de ensayo 16x150 mm)
EQUIPO
Incubadora
Refrigerador
Rotaevaporador
Lmparas
4. Colocar el sobre doble de papel filtro sobre papel peridico en la campana de extraccin. Al finalizar la
sesin los responsables de seguridad e higiene debern colocarlos en una bolsa de plstico, cerrar y
etiquetar como R1.
5. Adicionar al disolvente de extraccin del inciso 3 sulfato de sodio anhidro para eliminar la presencia de
agua en la muestra, posteriormente filtrarlo por gravedad a travs de algodn y concentrar in vacuo.
6. Reconstituir el residuo final con 500 L de DMSO.
PRUEBA DE AMES
4. En la parrilla de calentamiento, fundir con mucha precaucin los 15 mL de agar de superficie contenido en
el tubo de ensayo para evitar proyecciones y prdidas de reactivo.
5. Aadir 1.5 mL de solucin L-Histidina/Biotina.
Nota 4: Los pasos del 7 al 12 deben hacerse lo ms rpido posible para evitar riesgos
de contaminacin.
8. Tomar uno o dos tubos de ensaye de plstico estriles, segn el tratamiento que se est realizando,
quitarles la tapa por presin sin tocar los bordes y aadir a cada tubo 2 mL de agar de superficie
previamente tratado en el paso 4. Mantenerlos a 45C como los muestra la Figura 2.
9. Realizar slo los tratamientos expuestos en la Tabla 1 o 2 segn el equipo correspondiente, comenzando
por el control negativo. CADA REACTIVO DEBE AGREGARSE EN EL ORDEN INDICADO.
10. Desechar las puntas para micropipetas en la bolsa de residuos colocada a un costado del rea de trabajo y
etiquetada como R2.
11. Sacar de la incubadora dos cajas Petri, etiquetar las cajas en la tapa segn el cdigo indicado en las Tablas
1 y 2, para cada tratamiento agregando el nmero de grupo y equipo.
12. Mezclar el contenido de cada tubo en el agitador vortex.
13. Verter el contenido de cada tubo en la caja de Petri con medio mnimo de Vogel-Bonner correspondiente.
14. Desechar los tubos de plstico en la bolsa de residuos colocada en un costado del rea de trabajo y
etiquetada como R2.
15. Distribuir cuidadosa y homogneamente el agar de superficie realizando movimientos circulares.
16. Dejar solidificar las cajas a temperatura ambiente en una superficie plana durante 10 minutos.
17. Repetir los pasos 7 al 15 para los otros dos tratamientos.
Nota 5: Recordar en todo momento que se est trabajando con compuestos con
posible actividad mutagnica y con un cultivo bacteriano que no es incuo.
18. Colocar el sobrante de la muestra ambiental en DMSO en el contenedor etiquetado como R3.
19. Fijar las tapas de las cajas Petri a su contraparte con cinta adhesiva e introducirlas de manera invertida a la
incubadora a 37C por 48 horas.
20. Una vez terminado el tiempo de incubacin, guardar las cajas de Petri invertidas en el refrigerador a 4C.
CUESTIONARIO
1. Anote el nmero de revertantes encontradas en la Tabla 3.
Tabla 3. Resultados con la cepa TA98.
Control Sin Con Slo
Control negativo Reversin fraccin fraccin mutgeno
Equipo Muestra: Repeticin
negativo fraccin S9 espontnea S9 S9
1 1
2
Promedio
2 1
2
Promedio
3 1
2
Promedio
4 1
2
Promedio
5 1
2
Promedio
2. En cul de las muestras evaluadas, el nmero de revertantes inducidas es igual o superior al doble del
nmero de colonias revertantes espontneas?
_________________________________________________________________________________
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
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(1980)173-215.
Cortinas, C. & Ostrosky, P. (Editoras) Manual de mtodos para la identificacin de mutgenos y carcingenos
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effects of seasonal weather on the genotoxicity, cytokinetic properties, cytotoxicity and organochemical
content of extracts of airborne particulates in Mexico City. Mutation Research 558 (2004) 717.
Villalobos-Pietrini, R., Hernndez-Mena, L., Amador-Muoz, O., Munive-Coln, Z., Bravo-Cabrera, J. L.,
Gmez-Arroy, S., Fras-Villegas, A., Waliszewski, S., Ramrez-Pulido, J., Ortiz-Muiz, R. Biodirected
mutagenic chemical assay of PM10 extractable organic matter in Southwest Mexico City. Mutation
Research 634 (2007) 192204.
MgSO47 H2O 10 g
cido ctricoH2O 100 g
K2HPO4 anhdro 500 g
NaHPO44 H2O 175 g
Aforar a 1 litro. Esterilizar en autoclave y almacenar a temperatura ambiente.
b) Bacto-agar
En un matraz de 1 L colocar 15 g de Bacto-agar ms 500 mL de agua destilada. Esterilizar en autoclave el
material a anterior 121C durante 15 minutos.
g) Agar de Superficie
Pesar 0.6 g de Bacto Agar y 0.5 g de NaCl, agregar 100 mL de agua destilada. Alicuotar 15 mL de la mezcla en
tubos de 16x150 mm, cubrirlos con algodn, esterilizar en autoclave y almacenar a temperatura ambiente.
j) Mezcla fraccin S9
Para preparar esta mezcla se requieren dos tubos estriles de 16 x 150 mm y descongelar previamente la fraccin
S9 en bao de agua con hielos (4C). Tomar las alcuotas indicadas en la Tabla 4 y mezclar siguiendo las
instrucciones posteriores. Pesar la glucosa 6P y el NADP+, usando aplicadores de madera para poder pesar los
reactivos, (con una navaja, una de las puntas del aplicador de madera se plana para poder tomar el reactivo y
pesarlo), vaciarlos cada uno a tubos Eppendorf de 1.5 mL.
En un tubo estril de 16x 150mm, aadir el amortiguador de fosfatos y la solucin de cloruros, mezclar en
vortex, tomar una alcuota de 500 L(con micropipeta) y aadirla en el tubo Eppendorf que contiene a la glucosa
6P para disolverla y agregarla al resto del tubo de 16 x 150 mm, mezclar nuevamente en el vortex. Tomar
nuevamente otra alcuota de 0.5 mL y aadirla al tubo Eppendorf que contiene el NADP+ para disolverlo,
agregar al resto del tubo de 16 x 150 mm. Mezclar la fraccin S9 y tomar la alcuota correspondiente para
aadirla al tubo de 16 x 150 mm, mezclar en vortex perfectamente y filtrar utilizando una unidad Swinex
(Millipore, 0.45 m), obteniendo el filtrado en otro tubo de 16x150 mm ESTRIL. Alicuotar 1.3 mL de la
mezcla para cada equipo en tubos Eppendorf.
OBJETIVO ACADMICO
Que el alumno sea capaz de determinar la actividad genotxica de un xenobitico empleando la tcnica de
cuantificacin de microncleos en mdula sea de ratn.
PROBLEMA
Identificar la presencia de microncleos, inducidos por ciclofosfamida, en eritrocitos policromticos de mdula
sea murina.
REACTIVOS
Solucin salina isotnica (SSI) Colorante de Giemsa modificado
Aceite de inmersin Etanol (EtOH)
Solucin amortiguadora de fosfatos pH=6.8*
ANIMALES DE EXPERIMENTACIN
1 ratn ICR por equipo administrado 24 horas antes con ciclofosfamida con una dosis de 40 mg/Kg i.p. o un
ratn ICR control negativo no tratado.
DESARROLLO EXPERIMENTAL
2. Una vez que se haya confirmado la muerte del animal de experimentacin fijarlo a la mesa de trabajo.
3. Dislocar la articulacin del fmur con la cadera, estirando las patas traseras del animal.
4. Diseccionar y extraer el fmur cortando por arriba de la cresta ilaca (en la cadera) y por debajo de la
rodilla.
5. Limpiar cuidadosamente cada fmur con papel hasta eliminar totalmente el tejido muscular. Para facilitar
la eliminacin del tejido muscular, tomar la parte que queda debajo de la rodilla y rotarla al lado contrario
del movimiento natural de la articulacin de la rodilla y el fmur.
6. Una vez limpio, cortar cuidadosamente ambas epfisis y lavar el interior del fmur con 3 mL de SSI
empleando una jeringa de 3 mL con aguja del nmero 21. Recolectar y reunir en un mismo tubo de 13 x
100, la mdula de cada fmur.
7. Envolver los restos del animal de experimentacin en una hoja de papel peridico, colocarlos en la caja de
contencin para su posterior incineracin.
8. Centrifugar a 3000 rpm durante 5 min el tubo que contiene la mdula (tubo del inciso 6), extraer el
sobrenadante cuidadosamente con una pipeta Pasteur y resuspender el botn en una gota de SSI. Depositar
el sobrenadante en una solucin de hipoclorito de sodio.
9. Realizar 4 extendidos de la siguiente manera: colocar en la orilla de un portaobjetos una gota de la
suspensin de mdula sea y un segundo portaobjetos justo atrs de la gota en ngulo de 45. Dejar que la
muestra se distribuya por capilaridad y deslizar suavemente para formar una delgada capa de clulas.
12. A cada laminilla adicionar dos o tres gotas de colorante Giemsa modificado. Dejar reposar un minuto y
adicionar agua en la misma proporcin que el colorante. Dejar reposar un minuto ms.
14. Cubrir la laminilla con solucin amortiguadora de fosfatos pH 6.8 durante 5 minutos.
15. Enjuagar la laminilla una vez ms con agua destilada y secar al aire.
16. Observar al microscopio con aceite de inmersin, y registrar los siguientes datos:
El nmero de eritrocitos policromticos por cada 200 eritrocitos totales.
El nmero de eritrocitos policromticos micronucleados por cada 1000 eritrocitos policromticos.
Eritrocito
Policromtico
Micronucleado
Eritrocito
Normocromtico
Eritrocito
Policromtico
Eritrocito
Normocromtico
Micronucleado
Nota: Debido a que el conteo de los microncleos se debe realizar al ciego, el alumno
no sabr hasta el final de la prctica si el animal de experimentacin proporcionado
ha sido tratado o no con ciclofosfamida.
CUESTIONARIO
1. Con base en la experiencia adquirida, indique dos caractersticas que le permitan identificar un
microncleo y diferenciarlo de un artefacto producto de la tincin.
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________
2. Reporte sus resultados en la siguiente tabla:
Tabla 1. Resultados por equipo.
EPCa/ ETb EPCMNc/ EPC
Laminilla 1
Laminilla 2
Laminilla 3
Laminilla 4
Suma /200 ET /1000 EPC
4. Realice una comparacin estadstica mediante la prueba de t-student, de una cola y con un 90% de
confianza, entre los dos grupos. Concluya si existen diferencias significativas como para considerar un dao
genotxico.
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__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________________________
5. Con el protocolo empleado y los resultados obtenidos Podra establecer si el dao genotxico ocasionado
por la ciclofosfamida fue clastognico o aneuploidgeno? Explique su respuesta.
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________________________
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
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tobacco smoke with the aim of reducing the toxicity of smoke. Toxicology in Vitro 17, 587594.
EPA (US Environmental Protection Agency), Health Effects Test Guidelines OPPTS 870.5395, Mammalian
Erythrocyte Micronucleus Test, Office of Prevention, Pesticides and Toxic Substances (7101) EPA 712-
C-98-226, August 1998. (Ver:
www.epa.gov/opptsfrs/publications/OPPTS_Harmonized/870_Health_Effects_Test_Guidelines/Series/8
70-5395.pdf.)
Hessel, H., Radon K., Pethran A., Maisch, Bettina., Grbmair, S., Sautter, I., Fruhmann, G. (2001). The
genotoxic risk of hospital, pharmacy and medical personnel occupationally exposed to cytostatic drugs
evaluation by the micronucleus assay. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental
Mutagenesis 497, 101-109.
Kirsch-Voldersa M., Elhajoujia A., Cundaria E., Hummelenb P.V. (1997). The in vitro micronucleos test: a
multi-endpoint assay to detect simultaneously mitotic delay, apoptosis, chromosome breakage,
chromosome loss and non-disjunction. Mutation Research 392, 19-30.
Konopacka, M. (1994). Evaluation of frequency of micronuclei in exfoliated cells from bladder of mice treated
with benzo(a)pyrene, 2-acetylaminofluorene and cyclophosphamide. Cell Biology International 18, 669-
672.
Krishna, G., Hayashi, M. (2000). In vivo Rodent Micronucleus Assay: Protocol, Conduct And Data
Interpretation. Mutation Research 455, 155-166.
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lymphocytes and buccal epithelial cells of Polish farmers exposed to pesticides. Mutation
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Proudlock, R.J., Statham J., Howard W. (1997). Evaluation of the rat bone marrow and peripheral blood
micronucleus test using monocrotaline. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental
Mutagenesis 392, 243-249.
1. Definicin de Eritropoyesis.
2. Concepto de microncleo y proceso de formacin.
3. Diferencia entre dao clastognico y aneuploidgeno y como se pueden diferenciar con la tcnica de
microncleos.
4. Fundamento de la tincin de Giemsa.
5. Coloracin que adquieren los eritrocitos maduros, inmaduros y micronucleados con el colorante Giemsa.
6. Mecanismo de accin genotxico de la ciclofosfamida.
7. Usos clnicos de la ciclofosfamida.
8. Propsito de adicionar: EtOH y solucin amortiguadora de fosfatos pH=6.8.
9. Se determin la actividad genotxica de la daunorrubicina y la apigenina en sangre perifrica de ratn,
administrando grupos de 15 animales para cada tratamiento. Los xenobiticos en estudio se administraron
a 2.5 mg/kg, mientras que el grupo control fue administrado con SSI, obteniendo los siguientes resultados:
Realice una comparacin estadstica mediante la prueba t-student, de una cola y con un 90% de confianza, de los
grupos tratados respecto al control. Concluya si existen diferencias significativas que sean indicativas de dao
genotxico.
Tabla 2. t-student.
Grados 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.025 0.01 0.005
de
libertad
1 1.000 1.376 1.963 3.078 6.314 12.706 31.821 63.657
2 0.816 1.061 1.386 1.886 2.920 4.303 6.965 9.925
3 0.765 0.978 1.250 1.638 2.353 3.182 4.541 5.841
4 0.741 0.941 1.190 1.533 2.132 2.776 3.747 4.604
5 0.727 0.920 1.156 1.476 2.015 2.571 3.365 4.032
6 0.718 0.906 1.134 1.440 1.943 2.447 3.143 3.707
7 0.711 0.896 1.119 1.415 1.895 2.365 2.998 3.499
8 0.706 0.889 1.108 1.397 1.860 2.306 2.896 3.355
9 0.703 0.883 1.100 1.383 1.833 2.262 2.821 3.250
10 0.700 0.879 1.093 1.372 1.812 2.228 2.764 3.169
11 0.697 0.876 1.088 1.363 1.796 2.201 2.718 3.106
12 0.695 0.873 1.083 1.356 1.782 2.179 2.681 3.055
13 0.694 0.870 1.079 1.350 1.771 2.160 2.650 3.012
14 0.692 0.868 1.076 1.345 1.761 2.145 2.624 2.977
15 0.691 0.866 1.074 1.341 1.753 2.131 2.602 2.947
16 0.690 0.865 1.071 1.337 1.746 2.120 2.583 2.921
17 0.689 0.863 1.069 1.333 1.740 2.110 2.567 2.898
18 0.688 0.862 1.067 1.330 1.734 2.101 2.552 2.878
19 0.688 0.861 1.066 1.328 1.729 2.093 2.539 2.861
20 0.687 0.860 1.064 1.325 1.725 2.086 2.528 2.845
21 0.686 0.859 1.063 1.323 1.721 2.080 2.518 2.831
22 0.686 0.858 1.061 1.321 1.717 2.074 2.508 2.819
23 0.685 0.858 1.060 1.319 1.714 2.069 2.500 2.807
24 0.685 0.857 1.059 1.318 1.711 2.064 2.492 2.797
25 0.684 0.856 1.058 1.316 1.708 2.060 2.485 2.787
26 0.684 0.856 1.058 1.315 1.706 2.056 2.479 2.779
27 0.684 0.855 1.057 1.314 1.703 2.052 2.473 2.771
28 0.683 0.855 1.056 1.313 1.701 2.048 2.467 2.763
29 0.683 0.854 1.055 1.311 1.699 2.045 2.462 2.756
30 0.683 0.854 1.055 1.310 1.697 2.042 2.457 2.750
40 0.681 0.851 1.050 1.303 1.684 2.021 2.423 2.704
60 0.679 0.848 1.046 1.296 1.671 2.000 2.390 2.660
120 0.677 0.845 1.041 1.289 1.658 1.980 2.358 2.617
h 0.674 0.842 1.036 1.282 1.645 1.960 2.326 2.576
Para preparar 100 mL, se pesan 0.9 g de NaCl y se disuelven en 100 mL de agua destilada; o bien, puede
utilizarse la solucin comercial.
OBJETIVO ACADMICO
Que el alumno visualice el dao macroscpico ocasionado en hgado y bazo de ratas administradas de forma
sub-aguda con diferentes dosis de acetato de plomo por va i.p. Relacionar dicho dao con las alteraciones que se
presentan en la morfologa de los eritrocitos y en los valores del hematocrito (Hto), hemoglobina total (Hbt) y
hemoglobina libre (Hbl).
PROBLEMA
Identificar cul de las dos soluciones de acetato de plomo causa mayor dao en las ratas, al
relacionar los resultados encontrados macroscpicamente en el hgado y bazo, con los encontrados
microscpicamente en los eritrocitos y en la cuantificacin del Hto, Hbt, y Hbl.
REACTIVOS
Acetato de plomo (Pb(CH3COO)2) Etanol (EtOH)
Solucin salina isotnica (SSI) Ketamina
Xilacina
DESARROLLO EXPERIMENTAL
El trabajo experimental se desarrollar por equipos en 4 sesiones de laboratorio.
Nota: El profesor indicar el color con el que se deber marcar las colas de las ratas
en cada equipo y que numeracin se asignar a cada una de las ratas, de acuerdo con
el siguiente cdigo.
1 2 3 4 5
6 7 8 9 10
REACTIVOS
Nuevo azul de metileno Reactivo de Drabkin
Solucin de heparina 1000 UI o EDTA al 10 % Xilacina
Colorante de Wrigth Ketamina
Solucin patrn de cianometahemoglobina (CNMHb) Etanol (EtOH)
Bencidina al 1%* Perxido de hidrgeno al 1% (H2O2)*
Solucin salina isotnica (SSI)*
*Ver APNDICE II
EQUIPO
Centrfuga para microhematocrito Espectrofotmetro
Microscopio de inmersin Centrfuga
Cmara de CO2
DESARROLLO EXPERIMENTAL
1. Preparar 3 jeringas con 0.1 mL de solucin de heparina o EDTA al 10%.
2. Marcar 3 tubos de ensayo de 13 x 100 con el nmero de la rata que corresponda y agregar 0.1 mL de
heparina 0.5 mL de EDTA al 10 % como anticoagulante.
3. Anestesiar a cada rata administrando va i.m. 0.1 mL de Xilacina 20 mg/mL en el muslo izquierdo y 0.1 mL de
Ketamina 100 mg/mL en el muslo derecho. Esperar 10 minutos hasta que el animal se encuentre en
anestesia profunda verificando la ausencia de reflejos antes de proceder con el resto del protocolo.
4. Mediante puncin cardiaca obtener un volumen de 3 mL de sangre de cada una de las ratas.
5. Quitar la aguja de la jeringa y transferir la sangre inmediatamente al tubo de 13 x 100 correspondiente.
Mezclar perfectamente con el anticoagulante por inversin del tubo.
6. Desechar la aguja en el contenedor RPBI y colocar la jeringa en una solucin de hipoclorito de sodio al
10% durante 5 minutos antes de desechar.
7. Sacrificar la rata en cmara de CO2.
8. Llenar dos capilares con la sangre obtenida en el inciso 4 para calcular el hematocrito de acuerdo con lo
indicado en la seccin de tcnicas experimentales.
9. Realizar dos frotis de cada una de las muestras sanguneas con colorante de Wright de acuerdo con la
seccin de tcnicas experimentales.
10. Realizar dos frotis de cada una de las muestras sanguneas con colorante nuevo azul de metileno (NAM)
de acuerdo con la seccin de tcnicas experimentales.
11. Realizar la cuantificacin de hemoglobina total de acuerdo con la seccin de tcnicas experimentales. Una
vez realizadas las determinaciones anteriores, centrifugar cada uno de los tubos con la sangre restante a
2500 rpm x 5 min y separar el plasma del paquete celular. Determinar hemoglobina libre en plasma segn
la seccin de tcnicas experimentales. Colocar el tubo con el paquete celular residual en un contenedor
con hipoclorito de sodio.
12. Hacer una incisin en la parte media del abdomen y extraer el bazo y el hgado de cada rata. Colocar los
rganos en cajas de Petri con SSI, para evitar su deshidratacin. Observar y comparar los rganos con
respecto a la rata control.
13. Envolver los restos de los animales de experimentacin y los rganos extrados en una hoja de papel
peridico y colocarlos en la caja de contencin para su posterior incineracin.
14. Los animales que no fueron empleados debern devolverse a su contenedor de transporte y llevarse al
bioterio.
TCNICAS EXPERIMENTALES
TCNICA DE MICROHEMATOCRITO
1. Llenar con sangre las 2/3 partes de un tubo capilar para cada muestra. Realizar esta operacin por
duplicado.
2. El extremo vaco se cierra con calor.
3. Colocar los capilares con el extremo cerrado hacia fuera en los surcos radiales de la centrfuga para
microhematocrito y centrifugar a 11000 rpm x 10 min.
4. Calcular el hematocrito midiendo la altura del paquete globular (M2) en relacin con la altura total de la
muestra (M1) y expresarla en %.
M
2
M1 _
_
M2 _
_
_
_
_
_
_
5. Una vez obtenidos los resultados, depositar los capilares en el contenedor para residuos peligrosos
biolgico-infecciosos (RPBI). X
TINCIN DE WRIGHT
Muestra de sangre 2
2
1 1 1
1. Preparar 5 tubos de acuerdo a la siguiente tabla, agitando cuidadosamente despus de la adicin de cada
reactivo y dejar reposar 10 min.
4. Una vez ledos colocar el contenido de los tubos en un contenedor etiquetado como R2.
3. Una vez ledos colocar el contenido de los tubos en un contenedor etiquetado como R3.
CUESTIONARIO
1. Reporte sus resultados en la siguiente tabla:
Hematocrito* (cm)
Rata Absorbancia Hbt Absorbancia Hbl M1 M2 M1 M2
SSI
A
B
*M1 = altura total de la muestras, M2 = altura del paquete globular
2. Con los datos de la tabla anterior, calcule segn la seccin de tcnicas experimentales: Hto, Hbt, Hbl y
reporte sus resultados en la siguiente tabla:
3. Cules fueron las diferencias en las alteraciones morfolgicas en hgado y bazo para cada tratamiento?
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
4. Cules fueron las diferencias observadas en las clulas sanguneas con respecto al control utilizando las
tinciones de Wright y NAM?
__________________________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________________________
5. Qu relacin observ entre las alteraciones morfolgicas de las clulas sanguneas y la proporcin de
reticulocitos?
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
6. Qu relacin observ entre las alteraciones morfolgicas de las clulas sanguneas y los valores de
hematocrito encontrados en cada una de las ratas? Qu relacin observ entre la proporcin de
reticulocitos, los valores de Hbl y Hbt?
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
7. Qu relacin observ entre la proporcin de reticulocitos con los valores obtenidos de Hto?Cmo afect
la dosis de la solucin A y B al valor de Hbl y Hbt con respecto al control?
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
8. Qu relacin observ entre los valores de Hbt y Hbl con el Hto en cada una de las ratas?
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
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Puede utilizarse la solucin comercial o preparar una soluci n de cloruro de sodio al 0.9 %. Para preparar
100 mL, se pesan 0.9 g de cloruro de sodio y se disuelven en 100 mL de agua destilada.
Solucin de bencidina al 1%
Perxido de hidrgeno al 1%
Calcular la cantidad adecuada para preparar la solucin de perxido de hidrgeno de acuerdo con la
concentracin de la presentacin comercial.
Calcular la cantidad adecuada para preparar la solucin de cido actico de acuerdo con la concentracin de la
presentacin comercial.
Utilizar colorante de Wright comercial. Agregar alcohol poco a poco, unos cuantos mililitros cada vez, y mezclar
bien con la ayuda de 10 a 20 esferillas de vidrio. Conservar bien tapado para evitar la evaporacin, guardar en un
sitio oscuro durante dos o tres semanas, mezclar con frecuencia. Filtrar antes de usarlo.
R0: Jeringas sin aguja que estuvieron en contacto con acetato de plomo.
R1: Colorante de Wright, sangre de rata, EtOH.
R2: Sangre de rata, NaHCO3, K4[Fe(CN)6], KCN, saponina.
R3: Plasma de rata, bencidina, H2O2, cido actico.
OBJETIVO ACADMICO
Que el alumno determine cualitativamente la presencia de plomo en recipientes de cermica a diferentes valores
de pH.
PROBLEMA
Realizar un anlisis cualitativo comparativo de varios tratamientos de curado para vasijas de barro vidriado y
sugerir cul de ellos presenta mejores resultados para reducir el contenido de plomo en estos recipientes. Discutir
el riesgo de exposicin al plomo liberado por recipientes de barro vidriado en los seres humanos.
REACTIVOS
*Este material debe ser nuevo y del mismo lote, se requiere la cantidad de 6 por cada dos equipos con una
capacidad mxima aproximada de 250 mL.
DESARROLLO EXPERIMENTAL
1. Previo a la sesin, el profesor indicar a los alumnos los tratamientos de curado a realizar a 3 de las 6
vasijas:
Vasija 1 - Ajo: Untar ajo suficiente para cubrir la superficie del interior de la vasija de barro y dejar
reposar por un da antes de lavarla con jabn eliminando cualquier residuo que se haya formado, secar.
Vasija 2 - Vinagre: Llenar partes de la vasija con vinagre blanco y hervir durante 1 hora, reponiendo
el volumen perdido durante esta operacin. Lavar y secar.
Vasija 3 - Cal: Agregar una cucharada sopera de CaCO3 comercial por cada 100 mL de agua y hervir
durante 1 hora, reponiendo el volumen perdido durante esta operacin. Lavar y secar.
2. Marcar las vasijas no curadas como A, B y C y reunirlas con las vasijas curadas 1,2 y 3.
3. Colocar el volumen necesario en cada una segn el diseo de la siguiente tabla.
Tabla 1. Diseo experimental.
A B C 1 2 3
Solucin HCL, pH 2 X X X X
Solucin NaOH, pH 10 X
Agua destilada X
4. Calentar las vasijas a ebullicin y dejarlas hervir 30 minutos. En caso de que el contenido de agua
disminuya considerablemente reponer el volumen perdido con agua.
5. Agitar y raspar ligeramente las paredes de cada vasija con una esptula.
6. Colocar por separado 0.5 mL de solucin de cada vasija en tubos de ensayos.
7. Enfriar los tubos con ayuda del agua de la llave por la parte exterior, y medir el pH.
8. Agregar a cada tubo tres gotas de HNO3 concentrado.
9. Agregar a cada tubo, 1 mL de la solucin de yoduro de potasio procurando que la solucin caiga
directamente en el contenido del tubo. Agitar por unos segundos, dejar reposar en su gradilla y observar.
10. Una solucin o precipitado amarillo indica la presencia de plomo. Emplee un control negativo con agua
destilada y proceda de la misma forma como se indica en los pasos 6 y 7.
11. Una vez obtenidos los resultados vaciar el contenido de los tubos en un contenedor etiquetado como R1.
12. Reunir el contenido de las vasijas con tratamiento cido (A, 1, 2, y 3) en el contenedor etiquetado como
R1.
13. Reunir el contenido de las vasijas con tratamiento neutro (C) y bsico (B) en un contenedor etiquetado
como R2.
CUESTIONARIO
1. Reporte sus resultados en la siguiente tabla, indicando la presencia de plomo con cruces: negativo(-), bajo
(+), medio (++), alto (+++). Utilice el control negativo como referencia.
Tabla 1. Resultados.
Vasija pH inicial pH final Presencia de plomo
A HCl
B NaOH
C agua destilada
1 ajo
2 vinagre
3 cal
2. Compare los resultados obtenidos entre las vasijas A, B, y C. Concluya que mtodo de extraccin fue ms
eficiente.
_________________________________________________________________________________
3. Compare los resultados obtenidos en las vasijas 1, 2 y 3 con la vasija A e indique si hay alguna diferencia.
A qu la atribuye?
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________
4. Compare los resultados obtenidos entre las vasijas 1, 2 y 3. Concluya qu mtodo de curado fue ms
eficiente.
__________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
5. Considera usted que los alimentos contenidos en vasijas de barro podran ser una fuente de exposicin a
plomo?
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________
6. Considera que el proceso de curado es suficiente para evitar la exposicin a plomo? Justifique su
respuesta.
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
Blanke R.V. Decker W.J. Analysis of toxic substances. Textbook of clinical chemistry. Philadelphia, Saunders.
1986, pp 1670-1744.
C.D. Klaassen. PhD. Casarett y Doulls. Toxicology. The basic science of poisons. 6th edition. McGraw Hill.
2001, pp 827-834.
Clark E. E. Isolation and Identification of Drugs. Vol. I y II. Ed. Pharmaceutical Press, London, 1972.
L. Torres-Snchez, L. Lpez-Carrillo y C, Ros. Eliminacin del plomo por curado casero. Salud Pblica,
Mxico. 41:5106 5108 (1999).
NORMA OFICIAL MEXICANA NOM- 009- SSA1- 1993. Salud ambiental. Cermica vidriada. Mtodos de
prueba para la determinacin de plomo y cadmio solubles.
NORMA OFICIAL MEXICANA NOM- 010- SSA1- 1993. Salud Ambiental. Artculos de cermica vidriados.
Lmites de plomo y cadmio solubles.
NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-231-SSA1-2002. Artculos de alfarera vidriada, cermica vidriada y
porcelana. Lmites de plomo y cadmio solubles. Mtodo de ensayo.
Public information office and Bureau of consumer health. Los peligros del plomo www.kdhe.state.ks.us
Calcular la cantidad adecuada para preparar la solucin de pH = 2 con HCl y la solucin de pH 10 con NaOH.
Pesar 16.5 g de KI, colocarlos en un matraz aforado de 100 mL, disolver en aproximadamente 25 mL de agua,
mezclar y aforar. Esta solucin es sensible a la luz.
OBJETIVO ACADMICO
Que el alumno realice la determinacin presuntiva y cuantitativa de etanol en muestras problemas mediante un
mtodo indirecto.
PROBLEMA
Cuantificar al menos el 80% de la concentracin de etanol en mg/dL en dos muestras problema y mediante los
resultados obtenidos indicar el grado de intoxicacin de los sujetos de los cuales provienen las muestras
analizadas.
REACTIVOS
Dicromato de potasio* (K2Cr2O7) Carbonato de potasio* (K2CO3)
cido sulfrico (H2SO4) Etanol (EtOH)
* Ver APNDICE II
EQUIPO
Espectrofotmetro
Estufa
Balanza analtica
MATERIAL
DESARROLLO EXPERIMENTAL
A cada alumno se le proporcionarn 2 muestras problema a las cuales se les realizar la determinacin
presuntiva y cuantitativa de etanol.
Centro de vidrio
CUESTIONARIO
1. Reporte en la siguiente tabla sus resultados de la prueba presuntiva para cada muestra.
Tabla 1. Resultados presuntivos.
Muestra Coloracin Resultado (+/-)
1
2
Control negativo
Control positivo
3. Proponga una modificacin a la tcnica presuntiva que le permita emplearla como prueba cuantitativa.
___________________________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________________________
4. Indique las lecturas de absorbancia obtenidas para cada muestra. Calcular la concentracin de etanol en la
muestra en mg/dL, desglosando los clculos realizados para cada una de las muestras tomando en cuenta
la lectura de absorbancia de la solucin de referencia. Considere todas las diluciones realizadas tanto de su
muestra como de la solucin de referencia.
Tabla 2. Resultados de la prueba cuantitativa.
Muestra Absorbancia Dilucin* Concentracin (mg/dL)
1
2
Solucin de referencia
*En caso de haberse realizado.
5. Con los valores obtenidos en sus muestras relacione la sintomatologa en la siguiente tabla y concluya si
los valores se encuentran por encima del lmite legal establecido.
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________
6. Cul es la concentracin mxima de EtOH que se puede determinar con este protocolo?
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________________________
7. Qu resultados esperara si la concentracin de EtOH en la muestra es mayor a la concentracin mxima
que puede determinar el protocolo?
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________________________
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
Fister, H.J. Ethyl alcohol. Manual of standardized procedures for spectrophotometric chemistry. E-10a.1-E-
10b.3 (1950) U.S.A. Standard scientific supply corporation. U.S.A.
Hobbs, W.H., Rall, T.W., Verdoorn. T.A. Hipnticos y sedantes: etanol. En: Goodman & Gilman. Las bases
farmacolgcas de la teraputica. 1 9a ed. Ed. McGraw-Hill Interamericana, Mxico D.F., 1996, pp 411-
419.
Klassen, C.D. Watkins, J.B. Efectos de los solventes y vapores en Toxicologa Clnica. En: Casarett & Doull,
Manual de Toxicologa, la ciencia bsica de los txicos. (5 ed.) McGraw-Hill Interamericana, Mxico
D.F. 2001, pp 739-744, 934-935.
Pesce, A.J., y Kaplan, L.A. Alcohol por T. J. Schroeder. Methods in clinical chemistry. The C.V. Mosby
Company. U.S.A., 1987, pp 324-329.
Sunshine, I. Ethanol. Methodology for Analitical Toxicology. CRC Press, Inc., 1978, pp 145-154.
Pesar 2.5 g de K2Cr2O7 y solubilizarlo en 20 mL de H2SO4 al 50 %, aforar a 100 mL con H2SO4 al 50%.
Con agitacin, agregar la cantidad necesaria de K2CO3 en el volumen de agua destilada a preparar hasta su
saturacin (se observa que ya no se disuelve). Posteriormente filtrar.
PM del etanol: 46 g/mol
PM del K2Cr2O7: 294.7 g/mol
Densidad del etanol: 0.7893 a 20C
GUIONES COMPLEMENTARIOS
OBJETIVO ACADMICO
Que el alumno emplee mtodos de extraccin cida y bsica para obtener eficientemente txicos no voltiles de
naturaleza cida y bsica en una muestra problema y concluya que mtodo de extraccin es el ms eficiente.
PROBLEMA
Establecer las condiciones ms adecuadas para realizar una extraccin mayor o igual al 90% de los txicos no
voltiles cidos y bsicos (cido acetilsaliclico [AAS] y cafena) presentes en una muestra problema. La muestra
deber trabajarla en medio cido y medio bsico.
REACTIVOS
EQUIPO
MATERIAL
DESARROLLO EXPERIMENTAL
El profesor proporcionar 30 mL de muestra problema la cual deber dividirse en dos porciones de 15 mL para
realizar a una porcin la extraccin en medio cido y a la otra porcin la extraccin en medio bsico. La
cuantificacin de cido acetilsaliclico (AAS) y cafena se determinar siguiendo los apndices correspondientes.
2. La solucin cida se extrae con 2 porciones de 15 mL de CHCl3, separando las fases orgnicas y reunindolas
en un matraz.
4. La fase orgnica se extrae con dos porciones de 10 mL de agua destilada y se renen las fases acuosas con la
fraccin A.
5. Tratamiento de la fase orgnica: esta fase se trata con 5 mL de una solucin saturada de NaHCO3, se separan
las fases. Etiquetar la fase acuosa como fraccin B. Tratar esta fraccin como se indica en el inciso C.
5.1. Extraer la fase orgnica con 5 mL de NaOH 0.1 N. La fase acuosa resultante, etiquetarla como fraccin C y
trabajarla como se indica en el inciso C. La fase orgnica resultante marcar como R1.
6. Tratamiento de la fraccin A. La fase acuosa obtenida del inciso 4 se alcaliniza hasta pH = 10 con NaOH 2.5 N.
6.1. Extraer con dos porciones de CHCl3 de 10 mL (2 x 10 mL CHCl3) y separar las fases. Desechar la fase
acuosa resultante en el contenedor etiquetado como R2.
6.2. Concentrar la fase orgnica hasta sequedad en rotaevaporador. Etiquetar como fraccin D y tratarlo como se
indica en el inciso D. El disolvente orgnico resultante que se encuentra en el matraz de condensacin debe ser
desechado en el contenedor etiquetado como R1.
2. Realizar la extraccin con dos porciones de CHCl3 de 15 mL, separando las fases.
3. La fase orgnica se concentra hasta sequedad y el residuo se etiqueta como fraccin E y se trata como se
indica en el inciso D.
1. Colocar 1 mL de las fracciones B, C y F en tubos de forma separada y adicionar a cada una 5 mL del reactivo
para desarrollar color (Apndice II), agite, espere 2 min.
2. Determinar la absorbancia a 540 nm. Si la lectura de absorbancia no cumple con la ley de Lambert y Beer,
realice las diluciones necesarias, repita el procedimiento y vuelva a realizar la lectura.
3. Calcular la concentracin de AAS presente en su muestra, interpolando la lectura de absorbancia en la curva
patrn.
4. Despus de haber realizado la lectura y una vez obtenidos los resultados, las fracciones B, C y F se renen y
desechan en el contenedor etiquetado como R3.
1. Solucin patrn de salicilato de sodio (1000 g/mL): Pesar 25 mg de salicilato de sodio y disolverlo. Llevar
hasta 25 mL con agua destilada.
2. A partir de la solucin patrn de salicilato de sodio (1000 g/mL), preparar la curva patrn como se describe
a continuacin (realizar dos curvas patrn por grupo).
Alcuota de la
Aforo con agua
solucin patrn Concentracin (g/mL)
destilada
(mL)
0.5 10 50
1 10 100
3 10 300
5 10 500
7 10 700
En un tubo de ensaye colocar 1 mL de las soluciones recin preparadas y adicionar 5 mL del reactivo para
desarrollar color (Apndice II), agitar la muestra en un vrtex durante 1 min, esperar 2 min y determinar la
absorbancia a una longitud de onda de 540 nm, ajustando a cero con un blanco (1 mL de agua y 5 mL del
reactivo para desarrollar color).
D) CUANTIFICACIN DE CAFENA
1. Disolver por separado los residuos de las fracciones D y E en 5 mL de NaOH 0.1 N. Transferirlo a un matraz
volumtrico de 25 mL y aforar con NaOH 0.1 N.
2. Determinar la absorbancia de la solucin anterior a 275 nm utilizando NaOH 0.1 N como blanco. Si la
lectura de absorbancia obtenida no cumple con la ley de Lambert y Beer, realice las diluciones necesarias con
NaOH 0.1N.
3. Calcular la concentracin de cafena presente en su muestra, interpolando la lectura de absorbancia en la
curva patrn.
4. Despus de haber realizado la lectura y una vez obtenidos los resultados, las fracciones D y E se renen y
desechan en el contenedor etiquetado como R2.
Curva patrn
1. Solucin patrn de cafena (100 g/mL). Disolver 10 mg de cafena anhidra en 10 mL de NaOH 0.1 N y
afore con la misma solucin a 100 mL.
2. A partir de la solucin patrn de cafena (100 g/mL) preparar la curva patrn como se describe a
continuacin. Por grupo realizar dos curvas patrn.
Alcuota de la
Aforo con NaOH 0.1
solucin patrn Concentracin (g/mL)
N
(mL)
1 25 4
2 25 8
3 25 12
4 25 16
5 25 20
3. Determinar la absorbancia de la curva patrn a una longitud de 275 nm, ajustando a cero con un blanco
(NaOH 0.1 N).
CUESTIONARIO
1. En el caso de emplear una muestra biolgica indique cul es el objetivo de adicionar cido tartrico
adems de ajustar el pH?
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
2. Una vez desarrollado el guin para una eficiente extraccin de un xenobitico qu puntos del proceso y
propiedades fisicoqumicas considera que son crticos?
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
3. Complete la siguiente tabla e indique los datos de la regresin lineal de cada curva.
4. Interpole los datos de absorbancia de cada una de sus fracciones y calcule la concentracin de AAS y/o
cafena en su muestra indicando el procedimiento que sigui para realizarlo.
5. Es necesario considerar el factor de dilucin para calcular la concentracin inicial de los xenobiticos en su
muestra? Justifique su respuesta.
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
6. Complete las siguientes tablas y de acuerdo con los resultados grupales concluya cul es el mejor mtodo de
extraccin para los xenobiticos analizados.
7. En caso de no haber obtenido un rendimiento superior al 90% analice a que puede atribuirse el hecho.
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
Casarett, L.J. Caffeine biotransformation. En: Casarett & Doulls Toxicology: The basic science of poisons.
McGraw Hill, New York, 2001, p 1071.
Casarett, L.J. Salicylic acid, biotransformation. En: Casarett & Doulls, Toxicology: The basic science of
poisons. McGraw Hill, New York, 2001, p 203.
Clarke, E.G.C. Screening Tests for Common Drugs. En: Isolation and identification of drugs in pharmaceuticals
body fluids and post-mortem material. Vol. 1. Pharmaceutical Press, London, 1974, p 3-15.
Clarke, E.G.C. Extraction Methods in Toxicology. En: Isolation and identification of drugs in pharmaceuticals
body fluids and post-mortem material. Vol. 1. Pharmaceutical Press, London, 1974, p16-30.
Clarke, E.G.C. Colour Tests. En: Isolation and identification of drugs in pharmaceuticals body fluids and post-
mortem material. Vol. 1. Pharmaceutical Press, London, 1974, pp 123134.
Florey, K. Aspirine. En: Analytical Profiles of drug substances. Vol 8. Florey, K. (Ed.). Academic Press Inc.,
London, 1991, pp 1-11.
Goodman & Gilman. Las bases farmacolgicas de la teraputica. Vol I, (9 ed.) McGraw-Hill, Mexico, 1996,
pp 669-677.
Goodman & Gilman. Las bases farmacolgicas de la teraputica. Vol I, (9 ed.) McGraw-Hill, Mexico, 1996,
pp 721-727.
Klaassen, C.D., Analytic Toxicology. En: Toxicology the basic science of poisons. (5 ed.) McGraw-Hill, 1996,
pp 952-953.
Zubair, M.C., Hassan M.A. y Al-Meshal I.A. Caffeine. En: Analytical Profiles of drug substances, Vol. 15.
Florey, K. (Ed.). Academic Press Inc., London, 1991, p 71-150.
Para la realizacin de los clculos considere el proceso de extraccin en medio cido descrito en el
guin experimental y tome en cuenta las diluciones necesarias.
Las lecturas de absorbancia de las curvas patrn para AAS y cafena son las que se muestran a
continuacin:
Tabla 2. Curva patrn.
AAS Cafena
Concentracin A = 540 nm Concentracin A = 275 nm
[g/mL] [g/mL]
50 0.060 4 0.184
100 0.133 8 0.484
300 0.421 12 0.684
500 0.713 16 0.885
700 0.970 18 1.000
-3 -3
b = 5.8 x 10 b = 9.2 x 10
-3
m = 1.409 x 10 m = 0.0566
r= 0.999 r =0.996
Pesar 4 g de HgCl2 y disolverlo en 12 mL de HCl 1N. Adicionar 4 g de Fe(NO3)3 y agitar hasta su total
disolucin. Diluir con agua destilada a 100 mL (considerar cantidades adicionales para el blanco y curva patrn)
Colocar una cantidad aproximada de bicarbonato de sodio R.A., en 10 mL de agua destilada, hasta que no se
pueda disolver en fro.
OBJETIVO ACADMICO
Que el alumno sea capaz de extraer y cuantificar un xenobitico empleando sus propiedades cido-base y
reacciones de degradacin.
PROBLEMA
MATERIAL VEGETAL
Traer por equipo 50 g de cscara de limn, calabaza o chayote; o bien 50 g de hojas externas de col o coliflor.
REACTIVOS
Sulfato de sodio* (NaSO4) Malatin al 50%
Hidrxido de sodio* (NaOH) Fenoftalena*
Cloruro frrico* (FeCl3) Etanol (EtOH)
Sulfato cprico* (CuSO4) Tetracloruro de carbono (CCl4)
Acetona Disulfuro de carbono (CS2)
* Ver APNDICE II
DESARROLLO EXPERIMENTAL
1. Colocar 25 g del material de estudio (nicamente la cscara o superficie del vegetal) en un frasco de vidrio
de boca ancha y aadir 30 mL de CCl4, tapar y agitar vigorosamente durante 5 minutos.
2. Filtrar y recolectar cuando menos 20 mL (medir el volumen exacto con una probeta).
3. Desechar el material vegetal tratado con CCl4 colocndolo sobre un papel peridico, identificar como R1 y
colocar en la campana. Al finalizar la sesin los responsables de seguridad e higiene debern colocar R1 en
una bolsa de plstico y cerrarla.
4. Preparar un tubo problema con 10 mL del extracto filtrado midiendo con pipeta volumtrica. Adicionar a
cada tubo 0.2 mL de solucin de CS2 al 0.5% y 5 mL de etanol. Pasar esta mezcla a un embudo de
separacin y agitar suavemente.
5. Adicionar 15 mL de solucin cida de Na2SO4 al 9% y agitar cuidadosamente el embudo por 1 minuto.
6. Colectar la fase orgnica en un vaso de precipitado y filtrarla transfirindola nuevamente al embudo de
separacin enjuagado previamente con acetona. Etiquetar la fase acuosa como R2.
7. Aadir 5 mL de etanol, agitar y aadir 0.2 mL de NaOH 6N. Agitar nuevamente por 5 minutos, dejar
reposar durante 1 minuto y adicionar 15 mL de solucin de Na2SO4 al 9%. Mezclar, separar las fases,
recolectar la fase acuosa y desechar la fase orgnica etiquetndola etiquetar como R3.
8. Aadir 5 mL de CCl4 a la fase acuosa y una gota de indicador fenoftalena al 1%. Neutralizar gota a gota
con HCl 6N con agitacin continua hasta la desaparicin del color azul violeta.
9. Aadir 0.2 mL de solucin de FeCl3, agitar y desechar la fase orgnica en el recipiente etiquetado como R3.
10. Aadir a la fase acuosa 5 mL de CCl4 y 0.3 mL de solucin de CuSO4 al 3.5% y agitar. Colectar la fase
orgnica y desechar la fase acuosa etiquetndola como R4.
11. Leer la fase orgnica en el espectrofotmetro a 416 nm, ajustando previamente a 100% de transmitancia con
CCl4.
12. Una vez que se obtengan los resultados finales desechar la fase orgnica etiquetndola como R5.
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
Adrien. A. Selective Toxicity: the physicochemical basis of therapy. Ed. Chapman and Hall (6a ed.), London,
1979, pp 455463.
CremLyn, C. Pesticides and mode of action, John Wiley & Sons, New York, 1978.
Katzung. B. Farmacologa Bsica y Clnica. Ed. El Manual Moderno (7 ed.), Mxico. 1999, pp 119-121.
Klassen, C. D., Watkins, J.B. Casarette & Doull, Manual de Toxicologa. Ed. McGraw-Hill Interamericana,
Mxico, 2001, pp 615618, 624-634, 937.
Morifusa. E. Organophosphorus pesticides: Organic and Biological Chemistry. CRC Press, Cleveland, 1979,
pp 6277, 103, 196199.
Negherban, O.W. Handbook of toxicology: Insecticides. W. B. Saunders Comp., E.U.A., 1959, pp 451464.
Norris, M.V., Voil, W.A., Averall, P.R. (1954). Colorimetric estimation of malation residues. Journal of
Agricultural and Food Chemistry. 2, pp 570.
Robertson, W.O., Dreishbad, R.H. Manual de Toxicologa Clnica. Prevencin, Diagnstico y Tratamiento. El
Manual Moderno (6 ed.), Mxico, 1987, pp 95104.
White-Stevens, R. Pesticides in the Enviroment Part I and II, Marcel Dekker, Inc., New York, 1971.
CUESTIONARIO
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
3. Indique el procedimiento que sigui para realizar los clculos de concentracin de malatin en sus muestras.
5. De acuerdo con los resultados obtenidos concluya si existe un riesgo toxicolgico por el consumo del material
vegetal analizado.
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
6. En caso de encontrar una baja concentracin en alguna de las muestras. Comente cmo influira cada uno
de estos factores en el resultado del anlisis:
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________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
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________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
Nota: El CS2 es altamente txico, se absorbe por piel y vas respiratorias. Sus
efectos txicos incluyen irritacin de membranas, nausea, vmito, prdida de
conocimiento y convulsiones.
Fenolftalena al 1%
Para preparar 100 mL, pesar 1 g y aforar a 100 mL con EtOH.
OBJETIVO ACADMICO
PROBLEMA
Determinar cuantitativamente, en ratas tratadas con NaNO2, la reduccin en el porcentaje de MHb debida a la
administracin de azul de metileno.
REACTIVOS
EQUIPO
Espectrofotmetro UV-Vis
Centrfuga
Balanza para pesar animales
MATERIAL
ANIMALES DE EXPERIMENTACIN
PARTE EXPERIMENTAL
Nota: Todo material de vidrio que estuvo en contacto con muestras sanguneas deber
ser inactivado con NaClO previamente a su lavado.
13. Clculos:
CUESTIONARIO
1. Reporte los resultados grupales en las siguientes tablas:
Tabla 1. Lecturas espectrofotomtricas.
Azul de metileno
SSI NaNO2
Equipo + NaNO2
A1 A2 A3 A1 A2 A3 A1 A2 A3
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
2. Elaborar una grfica de barras con los resultados promedio de Hbt y MHbt para cada tratamiento.
3. Elaborar una grfica de barras con los resultados porcentuales de MHbt para cada tratamiento.
6. Observ algn cambio en la cantidad de Hbt en funcin de los xenobiticos administrados? Por qu?
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
Dreisbach, R. H. y Robertson, W.O. Tratamiento de los envenenamientos. En: Manual de toxicologa clnica,
prevencin diagnstico y tratamiento. Editorial El Manual Moderno (6 ed.), Mxico, D.F. 1988, pp
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Hall R., Malia, R.G. Investigation of hemolitic anaemias. Medical Laboratory Hematology. Ed. Butterworths,
Gran Bretaa. 1984, pp 327-333.
Klassen, C.D., Watkins, J.B. Casarett & Doull, Manual de Toxicologa. Ed. McGraw-Hill Interamericana (5
ed.), Mxico. 2001, pp 394-395.
Stahr, H. M. Inorganic and other Analisis. Analitical Methods in toxicology. Ed. John Wiley and sons, inc., USA.
1991, pp 5-7.
Nota: Tanto el cianuro de hidrgeno como los cianuros slidos o en disolucin son
txicos por absorcin por la piel, ingestin e inhalacin.
EDTA al 10% (preparar slo en caso de no haber heparina, consultar con el laboratorista o el profesor)
Pesar 1 g de EDTA y disolver en agua destilada, aforar a 10 mL.
R1: Solucin amortiguadora de fosfatos pH 6.6, KCN, NH4OH, K3[Fe(CN)6] y residuos de sangre.
Octubre de 2015