CROMATOGRAFIA

Princpio Bsico
Separao de misturas por interao diferencial dos seus
componentes entre uma FASE ESTACIONRIA (lquido ou
slido) e uma FASE MVEL (lquido ou gs).

Adaptado do original Prof. Fabio Augusto (Unicamp)

 CROMATOGRAFIA
Modalidades e Classificao

Cromatografia
FM = Lquido
Lquida

Cromatografia
FM = Gs
Gasosa (CG)

Cromatografia
Slida
Gs-Slido (CGS)
Em CG a FE
pode ser:
Cromatografia
Lquida
Gs-Lquido (CGL)
 CROMATOGRAFIA GASOSA
Aplicabilidade

Quais misturas podem ser separadas por CG ?

(para uma substncia qualquer poder ser

arrastada por um fluxo de um gs ela
deve ser dissolver - pelo menos parcialmente -
nesse gs)

Misturas cujos constituintes sejam

VOLTEIS (=evaporveis)

DE FORMA GERAL:
CG aplicvel para separao e anlise
de misturas cujos constituintes tenham
PONTOS DE EBULIO de at 300oC
e que termicamente estveis.
 INSTRUMENTAO
Gs de Arraste
Fase Mvel em CG: NO interage com a amos-
tra - apenas a carrega atravs da coluna. Assim
usualmente referida como GS DE ARRASTE

Requisitos:
INERTE No deve reagir com a amostra, fase
estacionria ou superfcies do instrumento.

PURO Deve ser isento de impurezas que

possam degradar a fase estacionria.

Impurezas tpicas em gases e seus efeitos:

oxida / hidroliza algumas FE

H2O, O2 incompatveis com DCE

hidrocarbonetos rudo no sinal de DIC

 INSTRUMENTAO
Gs de Arraste

Requisitos:
CUSTO Gases de altssima pureza podem ser
muito caros.

A = 99,995 %
CUSTO

C
B = 99,999 %
B
A C = 99,9999 %)
PUREZA

COMPATVEL COM DETECTOR Cada detector

demanda um gs de arraste especfico para
melhor funcionamento.
Seleo de Gases de Arraste em Funo do Detector:

DCT He , H2
DIC N2 , H2
DCE N2 , Ar + 5% CH4
 INSTRUMENTAO
Alimentao de Gs de Arraste

Componentes necessrios linha de gs:

controladores de vazo / presso de gs
dispositivos para purificao de gs (traps)

3
4 6

1 - Cilindro de Gs
2 - Regulador de Presso Primrio
3 - Traps para eliminar impurezas do gs
4 - Regulador de Presso Secundrio
5 - Regulador de Vazo
6 - Medidor de Vazo
Nota: Tubos e Conexes: Ao Inox ou Cobre
 INSTRUMENTAO
Dispositivos de Injeo de Amostra
Os dispositivos para injeo (INJETORES ou
VAPORIZADORES) devem prover meios de
introduo INSTANTNEA da amostra na
coluna cromatogrfica

Injeo instantnea:
t=0

t=x

Injeo lenta:

t=0

t=x
 INSTRUMENTAO
Injetor on-column Convencional

1 - Septo (silicone)
2 - Alimentao de gs de arraste)
3 - Bloco metlico aquecido
4 - Ponta da coluna cromatogrfica
 INSTRUMENTAO
Injeo on-column de lquidos

1 2 3

1 - Ponta da agulha da microseringa introduzida no

incio da coluna.
2 - Amostra injetada e vaporizada instantneamente
no incio da coluna.
3 - Plug de vapor de amostra forado pelo gs de
arraste a fluir pela coluna.
 INSTRUMENTAO
Parmetros de Injeo

TEMPERATURA DO INJETOR Deve ser sufi-

cientemente elevada para que a amostra vapo-
rize-se imediatamente, mas sem decomposio

Regra Geral: Tinj = 50oC acima da temperatura

de ebulio do componente menos voltil

VOLUME INJETADO Depende do tipo de

coluna e do estado fsico da amostra
Amostras Amostras
COLUNA Lquidas Gasosas

empacotada 0,2 L ... 20 L 0,1 ml ... 50 mL

= 3,2 mm (1/4)

capilar 0,01 L ... 3 L 0,001 ml ... 0,1 mL

= 0,25 mm

Slidos: convencionalmente se dissolve em um

solvente adequado e injeta-se a soluo
 INSTRUMENTAO
Microsseringas para Injeo

LQUIDOS Capacidades tpicas: 1 L, 5 L e 10 L

Microseringa de 10 L:

mbolo agulha (inox 316)

corpo (pirex)

Microseringa de 1 L (seo ampliada):

corpo agulha

guia
mbolo (fio de ao
soldado ao guia)
 INSTRUMENTAO
Colunas: Definies Bsicas

EMPACOTADA CAPILAR
= 3 a 6 mm = 0,1 a 0,5 mm
L = 0,5 m a 5 m L = 5 m a 100 m
Recheada com slido pul- Paredes internas recober-
verizado (FE slida ou FE tas com um filme fino (fra-
lquida depositada sobre o de m) de FE lquida
as partculas do recheio) ou slida
 INSTRUMENTAO
Temperatura da Coluna

Alm da interao com a FE, o tempo que um

analito demora para percorrer a coluna depende
de sua PRESSO DE VAPOR (p0).

Estrutura qumica
do analito
p0 = f
Temperatura
da coluna

Temperatura Presso Velocidade

da de de
coluna vapor migrao

ANALITO ELUI MAIS RAPIDA-

MENTE (MENOR RETENO)
 INSTRUMENTAO
Temperatura da Coluna

TEMPERATURA DA COLUNA

CONTROLE CONFIVEL DA TEMPERATURA

DA COLUNA ESSENCIAL PARA OBTER
BOA SEPARAO EM CG
 INSTRUMENTAO
Forno da Coluna

Caractersticas Desejveis de um Forno:

AMPLA FAIXA DE TEMPERATURA DE

USO Pelo menos de Tambiente at 400oC.
Sistemas criognicos (T < Tambiente) podem
ser necessrios em casos especiais.

TEMPERATURA INDEPENDENTE DOS

DEMAIS MDULOS No deve ser
afetado pela temperatura do injetor e
detector.

TEMPERATURA UNIFORME EM SEU

INTERIOR Sistemas de ventilao interna
muito eficientes para manter a
temperatura homognea em todo forno.
 INSTRUMENTAO
Forno da Coluna

Caractersticas Desejveis de um Forno:

FCIL ACESSO COLUNA A operao

de troca de coluna pode ser frequente.

AQUECIMENTO E ESFRIAMENTO
RPIDO Importante tanto em anlises de
rotina e durante o desenvolvimento de
metodologias analticas novas.

TEMPERATURA ESTVEL E
REPRODUTVEL
A temperatura deve ser mantida com
exatido e preciso de 0,1C.

Em cromatgrafos modernos (depois de 1980),

o controle de temperatura do forno totalmente
operado por microprocessadores.
 INSTRUMENTAO
Forno da Coluna

Caractersticas Desejveis de um Forno:

FCIL ACESSO COLUNA A operao

de troca de coluna pode ser frequente.

AQUECIMENTO E ESFRIAMENTO
RPIDO Importante tanto em anlises de
rotina e durante o desenvolvimento de
metodologias analticas novas.

TEMPERATURA ESTVEL E
REPRODUTVEL
A temperatura deve ser mantida com
exatido e preciso de 0,1C.

Em cromatgrafos modernos (depois de 1980),

o controle de temperatura do forno totalmente
operado por microprocessadores.
 INSTRUMENTAO
Programao Linear de Temperatura
Misturas complexas (constituintes com
volatilidades muito diferentes)
separadas ISOTERMICAMENTE:

TCOL BAIXA:
- Componentes mais
volteis so separados
- Componentes menos vol-
teis demoram a eluir, saindo
como picos mal definidos

TCOL ALTA:
- Componentes mais vol-
teis no so separados
- Componentes menos vol-
teis eluem mais rapidamente
 INSTRUMENTAO
Programao Linear de Temperatura
A temperatura do forno pode ser variada
linearmente durante a separao:

Consegue-se boa
separao dos
componentes da
amostra em menor
tempo

Parmetros de uma programao de temperatura:

TINI Temperatura Inicial

TEMPERATURA

TFIM
TFIM Temperatura Final
R
tINI Tempo Isotrmico Inicial
TINI
tFIM Tempo Final do Programa
tINI tFIM
R Velocidade de Aquecimento
TEMPO
 INSTRUMENTAO
Programao Linear de Temperatura
Possveis problemas associados PLT:

VARIAES DE VAZO DO GS DE ARRASTE

A viscosidade de um gs aumenta com a
temperatura.

viscosidade vazo

DERIVA (DRIFT) NA LINHA DE BASE Devido

ao aumento de volatilizao de FE lquida
 INSTRUMENTAO
Detectores
Dispositivos que examinam continuamente o
material eluido, gerando sinal quando da pas-
sagem de substncias que no o gs de arraste

Grfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMA

Idealmente: cada substncia separada aparece
como um PICO no cromatograma.
 INSTRUMENTAO
Detectores
Mais Importantes:
DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TRMICA
(DCT OU TCD) Variao da condutividade
trmica do gs de arraste.

DETECTOR POR IONIZAO EM CHAMA (DIC

OU FID) ons gerados durante a queima
dos eluatos em uma chama de H2 + ar.
DETECTOR POR CAPTURA DE ELTRONS
(DCE OU ECD) Supresso de corrente
causada pela absoro de eltrons por
eluatos altamente eletroflicos.
ANALGICO
Registradores XY
REGISTRO
DE
SINAL DIGITAL
Integradores
Computadores
 O Cromatgrafo a Gs
1 6

3
1 - Reservatrio de Gs e Controles de Vazo / Presso.
2 - Injetor (Vaporizador) de Amostra.
3 - Coluna Cromatogrfica e Forno da Coluna.
4 - Detector.
5 - Eletrnica de Tratamento (Amplificao) de Sinal.
6 - Registro de Sinal (Registrador ou Computador).
Observao: em vermelho: temperatura controlada
 COLUNAS CAPILARES
Colunas Capilares: Injeo
Baixa capacidade de processamento de amostra
(sub-microlitro)

Injeo direta com microseringa muito difcil !!!

Injetores com diviso (splitters) Sistema

pneumtico despreza frao da amostra injetada
1
2
1 - Septo;
3 2 - Entrada de gs de arraste;
3 - Liner (misturador);
5 4 - Coluna Capilar
4 5 - Purga de gs de arraste;
6 - Vlvula de controle de purga.

6
- Menor sensibilidade (boa parte da amostra desprezada)
- Diviso da amostra raramente uniforme (frao purgada
dos constituintes menos volteis sempre menor)
- Ajuste da razo de diviso mais uma fonte de erros
 DETECTORES
Definies Gerais
Dispositivos que geram um sinal eltrico
proporcional quantidade eluida de um analito

~ 60 detectores j usados em CG

~ 15 equipam cromatgrafos comerciais

4 respondem pela maior parte das aplicaes

DCT TCD DIC FID

Detector por Detector por
Condutividade Ionizao em
Trmica Chama

DCE ECD EM MS
Detector por Detector Es-
Captura de pectromtrico
Eletrons de Massas
DETECTORES
Classificao

UNIVERSAIS:
Geram sinal para qualquer
substncia eluida.

SELETIVOS:
Detectam apenas substncias
com determinada propriedade
fsico-qumica.

ESPECFICOS:
Detectam substncias que
possuam determinado elemento
ou grupo funcional em suas
estruturas
 DETECTORES
Detector por Condutividade Trmica
PRINCPIO Variao na condutividade trmica do
gs quando da eluio de um analito.

Cela de Deteco do DCT:

i
1 Bloco metlico (ao)
2 Entrada de gs de arraste
5
3 3 Sada de gs de arraste
4 Filamento metlico aquecido
4 5 Alimentao de corrente
eltrica para aquecimento do
2 1 filamento
 DETECTORES
Caractersticas Operacionais do DCT
SELETIVIDADE Observa-se sinal para qualquer subs-
tncia eluida diferente do gs de arraste = UNIVERSAL

SENSIBILIDADE / LINEARIDADE Dependendo da

configurao particular e do analito: QMD = 0,4 ng a 1
ng com linearidade de 104 (ng - dezenas de g)

VAZO DE GS DE ARRASTE O sinal proporcional

concentrao do analito no gs de arraste que
passa pela cela de amostra.

Fc = 0

VAZO DE GS DE ARRASTE VARIAO DA VAZO DE GS

CONSTANTE DURANTE A DE ARRASTE DURANTE A
ELUIO ELUIO

Com DCT, a rea dos picos cromatogrficos MUITO

dependente da vazo do gs de arraste !!!
 DETECTORES
Caractersticas Operacionais do DCT
NATUREZA DO GS DE ARRASTE Quanto maior a
diferena entre a condutividade trmica do gs de
arraste puro, A, e do analito, X, maior a resposta.

QUANTO MENOR A MASSA MOLECULAR DO GS DE

ARRASTE, MAIOR A RESPOSTA

Gs de arraste com DCT: He ou H2

outro
He ou H2
gs

1 2 1 2
Usando He ou H2 como gs de arraste,
1
maximizado: MAIOR RESPOSTA
Com outros gases, eventualmente
2
X > A: PICOS NEGATIVOS
 DETECTORES
Caractersticas Operacionais do DCT
FATORES DE RESPOSTA Quanto menor a condutividade
trmica do analito, maior o sinal.

Os fatores de resposta dependem da

condutividade trmica do analito

Quantidades iguais de substncias diferentes geram

picos cromatogrficos com reas diferentes !!!

CHCl3
Mistura de quantidades
C2H5OH
equimolares de:
C2H6
Etano = 17,5

Clorofrmio = 6,0

Etanol = 12,7
 DETECTORES
DCT: Aplicaes

1 Separao e quantificao de compostos que no geram

sinal em outros detectores (gases nobres, gases fixos)

Separao de Gases Fixos e Hidrocarbonetos:

Gs de Arraste: He @ 3 ml.min-1
TCOL: 40C Detector: DCT

1 N2 2 CH4
3 CO2 4 n-C2
5 NH3 6 n-C3
7 i-C4 8 n-C4

2 Por ser um detector no-destrutivo, pode ser usado em

CG preparativa ou deteco sequencial com dois
detectores em tandem
 DETECTORES
Detector por Ionizao em Chama
PRINCPIO Formao de ons quando um composto
queimado em uma chama de hidrognio e oxignio

O efluente da coluna
misturado com H2 e O2 e
queimado. Como numa
chama de H2 + O2 no
existem ons, ela no conduz
corrente eltrica.

Quando um composto
orgnico elui, ele tambm
queimado. Como na sua
queima so formados ons, a
chama passa a conduzir
corrente eltrica
 DETECTORES
Caractersticas Operacionais do DIC
SELETIVIDADE Seletivo para substncias que contm
ligaes C-H em sua estrutura qumica.
(como virtualmente todas as substncias analizveis por CG so
orgnicas, na prtica o DIC UNIVERSAL)

Compostos que NO produzem resposta no DIC:

Gases nobres NH3, NxOy
H2, O2, N2 SiX4 (X = halognio)
CO, CO2, CS2 H2O
CCl4, HCOOH, HCHO *

CH4
DIC
CO2
O2
DCT N2

SENSIBILIDADE / LINEARIDADE QMD tpicas = 10 pg

a 100 pg com linearidade entre 107 e 108 (pg a mg)
 DETECTORES
Detector por Captura de Eletrons
PRINCPIO Supresso de um fluxo de eletrons
lentos (termais) causada pela sua absoro por
espcies eletroflicas
Um fluxo contnuo de
eletrons lentos
estabelecido entre um
ando (fonte radioativa
-emissora) e um catodo.

Na passagem de uma
substncia eletroflica
alguns eletrons so
absorvidos, resultando
uma supresso de
corrente eltrica.
 DETECTORES
Detector por Captura de Eletrons

1
2

1 Ando (fonte radioativa - emissora)

2 Sada de gases 3 Catodo

4 Cavidade 5 Coluna cromatogrfica

 DETECTORES
Caractersticas Operacionais do DCE
SENSIBILIDADE / LINEARIDADE QMD = 0,01 pg a 1 pg
(organoclorados), linearidade ~ 104 (pg a ng)

10 fg Lindano (C6H6)
-ECD HP-6890

PESTICIDAS
1 tetracloro-m-xileno
~250 fg cada analito 2 - BHC
3 Lindano
4 Heptachlor
5 Endosulfan
6 Dieldrin
7 Endrin
8 DDD
9 DDT
10 Metoxychlor
10 decaclorobifenila

O DCE O DETECTOR PREFERENCIAL PARA

ANLISES DE TRAOS DE ORGANOALOGENADOS E
SIMILARES
 DETECTORES
DCE: Aplicaes
Contaminantes em ar atmosfrico - deteco paralela DIC
+ DCE

DIC

DCE

1, 2, 3 - Hidrocarbonetos aromticos
4, 5, 6 - Hidrocarbonetos clorados
 ANLISE QUALITATIVA
ndice de Reteno de Kovts
FUNDAMENTO Os tR isotrmicos para uma srie
homloga de compostos dependem logaritmicamente
do nmero de tomos de carbono na cadeia.

Separao isotrmica de
uma mistura de n-alcanos
(n-C4, n-C5, ... n-C16)

Um grfico de log(tR) em
funo do nmero de
tomos de carbono do
analito nC LINEAR
 ANLISE QUALITATIVA
ndice de Reteno de Kovts
O ndice de reteno de Kovts I para um analito
definido por:

tR (A) Tempo de reteno

ajustado do analito A
tR (N) Tempo de reteno
ajustado do n-alcano com N
carbonos
tR (n) Tempo de reteno
ajustado do n-alcano com n
carbonos (n = N + 1)

Ex.: um analito com I = 874 teria um tempo de

reteno ajustado equivalente ao de um n-alcano
hipottico com cadeia de 8,74 tomos de carbono
 ANLISE QUALITATIVA
Espectrmetro de Massas
1 3

2 4

1 Cmara de Ionizao Eletrons gerados por um

filamento aquecido bombardeam a amostra. Os fragmentos
ionizados (carga +1) so repelidos pelo eletrodo positivo e
conduzidos ao separador magntico.

2 Sada de Vcuo Todo o interior do EM deve estar sob

alto vcuo (natm).

3 Separador Magntico A ao do campo magntico

deixa apenas ons com determinada razo Massa / Carga
atravessar esta rea do equipamento.

4 Detector Uma vlvula fotomultiplicadora ou um fotodiodo

gera um sinal eltrico proporcional ao nmero de ons que
incide sobre o elemento.
 ANLISE QUALITATIVA
CG-EM: Gerao do Cromatograma
Espectros de massas completos coletados e
arquivados em intervalos regulares de tempo

Gerao do cromatograma a partir dos espectros:

CROMATOGRAMA DE ONS TOTAIS (TIC = To-

tal Ion Chromatogram)
Para cada espectro o nmero total de ons detectados
na faixa de massas varrida somado e plotado em
funo do tempo, gerando o cromatograma.

MONITORAMENTO DO ON SELECIONADO
(SIM = Single Ion Monitoring)
Seleciona-se um fragmento resultante da fragmentao
da espcie de interesse. Gera-se o cromatograma
plotando-se o nmero de ond detectados com a massa
desse fragmento em funo do tempo.

TIC SIM
Universal Seletivo
Similar a DIC Maior Sensibilidade
 INSTRUMENTAO
Dispositivos de Injeo de Amostra
Os dispositivos para injeo (INJETORES ou
VAPORIZADORES) devem prover meios de
introduo INSTANTNEA da amostra na
coluna cromatogrfica

Injeo instantnea:

t=0

t=x

Injeo lenta:

t=0

t=x