Angiogenesis, proses pembentukan pembuluh darah baru, merupakan persyaratan untuk

pertumbuhan yang berkelanjutan dan proliferasi tumor padat. Dengan demikian, pencarian
inhibitor dari proses ini telah menjadi garis terdepan penyelidikan dalam penelitian antikanker,
dan telah diterjemahkan ke dalam beberapa obat di pasar yang telah jelas meningkatkan hasil
pada pasien dengan jenis tumor yang berbeda dan penyakit metastasis. Di antara agen ini,
Bevacizumab (Avastin, Genentech Ltd) adalah obat antiangiogenic pertama yang disetujui oleh
FDA pada tahun 2004. Bevacizumab adalah antibodi monoklonal yang menargetkan faktor
pertumbuhan endotel vaskular (VEGF, juga dikenal sebagai VEGFA) dan menghalangi-nya dari
mengikat nya sesuai reseptor, sehingga menghalangi sinyal nya. Awalnya dianggap pengobatan
afirst-line untuk kanker kolorektal metastatik, juga diresepkan untuk pengobatan kanker jenis
lain, dan perkembangannya masih berdiri sebagai salah satu prestasi tengara penelitian
antikanker. Meskipun saat ini obat lain dengan mekanisme yang sama aksi telah berkembang
menjadi klinik, beberapa keterbatasan yang ada, seperti kurangnya efikasi pada beberapa pasien,
penampilan efek samping, dan resistensi obat. Di antara mereka, yang terakhir ini mungkin
merupakan faktor efficacylimiting yang paling penting dari terapi antiangiogenic saat ini. Ia telah
mengemukakan bahwa ketika VEGF signaling adalah farmakologi diblokir faktor proangiogenic
lainnya mengambil alih sinyal nya, sehingga mendukung angiogenesis tumor. Di tengah jalur
angiogenesis kompensasi, faktor pertumbuhan fibroblast (FGF) tampaknya memainkan peran
integral dalam resistensi terhadap terapi antiVEGF, dan studi yang berbeda telah menyarankan
peran penting dari FGF sinyal dalam perkembangan tumor klinis. Meskipun menargetkan FGF
sinyal tertinggal bahwa kinase tirosin reseptor lainnya, sekarang ada bukti substansial untuk
pentingnya FGF sinyal dalam patogenesis jenis tumor yang beragam. Oleh karena itu,
pengembangan senyawa yang menghambat jalur FGF menerima banyak perhatian, meskipun
mereka masih di awal pembangunan. Di antara FGFs berbeda, FGF-2, juga dikenal sebagai FGF
dasar (bFGF), telah fungsional terlibat dalam angiogenesis tumor dan itu adalah target yang
penting dari terapi antiangiogenic. Tidak dengan berdiri pentingnya memblokir angiogenesis
untuk terapi antitumor, telah menunjukkan bahwa pengobatan antiangiogenic lama akhirnya
menyebabkan tidak hanya untuk resistensi obat tetapi juga untuk migrasi tumor ditingkatkan dan
metastasis. Alasan utama untuk ini adalah bahwa senyawa antiangiogenic akhirnya akan
menghasilkan mikro hipoksia, yang ternyata pada sinyal proangiogenic, meningkatkan kadar
faktor-faktor yang mendorong perolehan suatu fenotip tumor invasif dan metastasis seperti nitrat
oksida (NO), VEGF, dan FGF. Selain itu, sel-sel yang sama sering mengekspresikan reseptor
membran serumpun faktor-faktor ini, sehingga sinyal autokrin.Dengan demikian, pengembangan
senyawa antitumor baru yang secara bersamaan memblokir angiogenesis dan menginduksi
penghambatan berkelanjutan dari sinyal proangiogenic dihasilkan oleh hipoksia saat masih
merupakan kebutuhan yang belum terpenuhi penting, karena agen ini harus obat yang lebih
efektif daripada yang saat ini di klinik dan harus kekurangan terkait kekambuhan lebih agresif
dengan metastasis dan resistensi obat. Dalam konteks ini, kami telah memulai sebuah proyek
yang bertujuan untuk identifikasi molekul kecil baru bisa memblokir FGF sinyal menggunakan
kami perpustakaan di rumah dan bFGF diinduksi uji proliferasi sel sebagai layar utama. Setelah
identifikasi hit awal, proses hit-to-lead berikutnya telah memungkinkan kita untuk
mengembangkan inhibitor baru angiogenesis (compound22) yang merusak sinyal proangiogenic
dalam kondisi hipoksia pada sel kanker payudara, blok mitogen-diaktifkan protein kinase
(MAPK) jalur, menghambat migrasi sel, dan mengatur satu set gen yang terkait dengan
angiogenesis. Selanjutnya, pemberian senyawa 22in model xenograft kanker payudara secara
signifikan menurunkan jumlah pembuluh darah pada tumor dan menghasilkan pengurangan
pertumbuhan tumor 46-55% di 38% dari hewan diperlakukan tanpa menimbulkan efek samping
beracun.
HASIL DAN DISKUSI

pusar sel endotel vena manusia (HUVECs) untuk mengidentifikasi hit kimia penurut dengan sifat
obat-seperti yang bisa setuju untuk optimasi lebih lanjut. Dari pemeriksaan ini,
carbamate1emerged sebagai hit awal dengan IC50value dari 317 pM. Kami memulai eksplorasi
perancah ini (Gambar 1) dengan memperkenalkan substituen pada kelompok karbamat dan
menjaga konstan metil ester bagian (seperti penghapusan menyebabkan menyelesaikan aktif dari
asam karboksilat yang sesuai, derivative2, IC50> 500M) serta fenolik yang gugus hidroksil
(senyawa 3-10). Senyawa Target disintesis seperti yang digambarkan dalam Skema 1. Reaksi
metil atau benzil 2,5-dihydroxybenzoate dengan chlorosulfonylisocyanate (CSI) diikuti oleh
benzil ester pembelahan antara karbamat 24yielded 1 dan 2, masing-masing. N-Monosubstituted
carbamates3 dan 4 diperoleh dengan penambahan metil 2,5-dihydroxybenzoate untuk etil dan
fenil isosianat dengan adanya N, N-diisopropiletilamina (Diea) sebagai dasar, sedangkan reaksi
metil 2,5-hydroxybenzoate dengan sesuai karbamoil klorida diberikan karbamat Disubstituted 5-
8.Piperazine 9was turunan disintesis oleh substitusi nukleofilik dari 4-nitrophenylchloroformate
dengan metil 2,5-dihydroxybenzoate diikuti dengan pengobatan karbonat dihasilkan dengan 1-
methylpiperazine. Atau, asilasi metil 2,5-dihydroxybenzoate dengan carbonylimidazol 25gave
derivatif antara 26, yang affordedfinal senyawa 10 oleh benzil eter deproteksi bawah hidrogenasi
palladiumcatalyzed. Carbamates2-10were disaring untuk kegiatan di uji proliferasi bFGF-
diinduksi (Tabel 1).
Nilai IC50 merupakan sarana dari dua hingga tiga percobaan independen dilakukan dalam
rangkap tiga. Dalam semua kasus, SEM adalah dalam 10% dari nilai rata-rata.

Dari hasil yang diperoleh, kesimpulan utama adalah bahwa penggantian hidrogen dari kelompok
karbamat oleh kelompok etil atau fenil memberi senyawa aktif (3and 4), sedangkan
disubstitution dari karbamat dengan rantai alkil merugikan untuk kegiatan (senyawa 5, 6 , dan 9,
IC50> 500M). Namun, ketika salah satu atau kedua substituen cincin aromatik, aktivitas
antiproliferatif dipulihkan (7, 8, dan 10). Di antara seri pertama dari senyawa, karbamat 3, 7, dan
8 pantas perhatian khusus karena mereka menunjukkan potensi tertinggi dalam menghambat
proliferasi sel, dengan nilai IC50 dari 17, 48, dan 35 pM, masing-masing. Dalam rangka untuk
memilih perancah terbaik untuk melanjutkan dengan proses optimasi, kita ditentukan beberapa
parameter farmakokinetik (Tabel 2). Meskipun paling ampuh

Sebuah data dinyatakan sebagai mean dari dua percobaan independen dilakukan dalam rangkap
dua. SEM dalam semua kasus adalah dalam 10% dari nilai rata-rata. ND, tidak ditentukan. Untuk
studi stabilitas, persentase senyawa yang tersisa setelah 1 jam diberikan

derivatif, 3, menunjukkan stabilitas mengecewakan rendah yang didiskualifikasi dari menjadi

calon yang cocok untuk optimasi lebih lanjut, compound7showed sifat yang baik, terutama
dalam hal kelarutan air, lipofilisitas, permeabilitas, dan stabilitas. Oleh karena itu, dipilih untuk
eksplorasi struktural lebih lanjut difokuskan pada apakah kelompok hidroksi fenolik diperlukan
untuk kegiatan dan untuk menentukan apakah mungkin untuk menggantikan gugus metil ester
tanpa penurunan aktivitas yang signifikan (compounds11-23; Gambar 1). Derivatif baru
disintesis seperti yang digambarkan dalam Skema 2. Disubstituted karbamat 11, 12, dan 14-
18were disiapkan oleh reaksi yang terjadi selama 5-hidroksibenzoat dengan N-metil-N-
phenylcarbamoyl klorida. Metil ester7was berubah menjadi amida 13 melalui reaksi dengan
metilamin. Akhirnya, fenil metil carbamates19-23were diperoleh kondensasi asam karboksilat 28
dengan alkohol yang sesuai atau amina dengan adanya karbodiimida 1-etil-3- (3-
(dimethylamino) propil) (EDC) sebagai reagen kopling. Semua ini senyawa baru disaring untuk
kegiatan (Tabel 3). Hasil penelitian kami menunjukkan bahwa gugus hidroksi fenolik sangat
penting untuk kegiatan, karena kedua metilasi nya (compound11) atau penghapusan
(derivative12) menyebabkan penurunan penting dalam kegiatan (IC50 (7) = 48MvsIC50 (11) =
118M dan IC50 (12) = 290M ; Tabel 3). Dengan demikian, kelompok hidroksi fenolik
disimpan di carbamates13-23, dan ester yang berbeda dan amida diperkenalkan dalam upaya
untuk menggantikan gugus metil ester awal. Upaya Ourfirst adalah untuk mempersiapkan
amide13, analog dari 7, tetapi perubahan ini menyebabkan penurunan aktivitas (nilai IC50
for7was 48M, sedangkan amida 13 menunjukkan nilai IC50 dari 67 pM; Tabel 3). Hasil ini
menunjukkan bahwa substitusi ester dengan amida mungkin akan melibatkan beberapa
pengurangan aktivitas biologis, jadi pertama kita terus ikatan ester tapi digantikan kelompok
metil oleh alifatik lainnya dan (hetero) kelompok aromatik mencari kegiatan yang lebih
baik. Dalam hal ini, kita kemudian bisa menggantikan ester dengan kelompok amida dan masih
mempertahankan nilai-nilai aktivitas yang baik. Dengan pemikiran ini, ester 14-20 disiapkan. Di
antara mereka, hasil terbaik dalam hal nilai-nilai IC50 diperoleh untuk benzil dan 3-
methylpyridinyl kelompok sebagai R1 substituen, senyawa 14 dan 18, dengan nilai IC50 dari 17
dan 16M, masing-masing (Tabel 3). Oleh karena itu, kedua kelompok R1 ini dipilih, dan analog
amides21-23were disintesis. Aktivitas biologis amida ini mirip dengan yang dari ester yang
sesuai, seperti yang ditunjukkan, misalnya, dengan nilai IC50 ester 14 dan 18 (17 dan 16M,
masing-masing) bila dibandingkan dengan nilai IC50 amida 21 dan 22 (22 dan 14M, masing-
masing). Oleh karena itu, kami menentukan sifat farmakokinetik mereka untuk memilih kandidat
terbaik untuk melanjutkan studi biologi. Dengan mempertimbangkan semua data ini (Tabel 2),
amida 22 menunjukkan keseluruhan profil terbaik dengan kelarutan tertinggi (175,7 M),
stabilitas (sekitar 100% di bawah tiga kondisi diuji), dan nilai-nilai permeabilitas. Dengan
demikian, senyawa ini dipilih untuk karakterisasi yang mendalam. Senyawa 22 Menghambat
Sinyal proangiogenic di MCF7 Sel Kanker Payudara bawah Kondisi hipoksia. Tumor hipoksia,
fitur umum dari banyak tumor padat, telah diidentifikasi sebagai pendorong utama untuk
mekanisme regulasi angiogenik. Oleh karena itu, wefirst meneliti apakah senyawa 22 mampu
menghambat sinyal proangiogenic dihasilkan oleh hipoksia di MCF7 garis sel adenokarsinoma
payudara manusia yang dipilih sebagai model. Hasil kami menunjukkan bahwa senyawa 22
menurunkan kadar penting proangiogenic faktor VEGF dan bFGF dalam sel MCF7 hipoksia
(Gambar 2A, B). Selain itu, derivatif ini juga menginduksi penurunan tingkat NO, yang berjalan
paralel dengan penghambatan yang kuat dari ekspresi iNOS (Gambar 2C, F). Mengingat
pentingnya peningkatan sinyal autokrin dalam kondisi hipoksia, terutama dalam hal aktivasi
reseptor yang sesuai, VEGFR dan FGFR, kami juga menilai apakah senyawa 22 terpengaruh
aktivasi mereka. Hebatnya, derivatif ini menghambat aktivasi kedua reseptor ini, karena
berkurang terfosforilasi (aktif) bentuk mereka (Gambar 2D, E). Efek utama dari aktivasi jalur
FGFR termasuk induksi proliferasi, migrasi, dan sinyal antiapoptotic. Peningkatan proliferasi
terutama dicapai melalui aktivasi kaskade MAPK, sedangkan induksi sinyal antiapoptotic
dimediasi oleh aktivasi dari jalur PI3K / AKT. Ini yang terakhir kelangsungan hidup sel jalur
tersebut juga diperkuat oleh aktivasi VEGFR. Oleh karena itu, kami meneliti apakah
compound22was mampu menekan fosforilasi kinase hilir AKT, MEK, dan ERK. Seperti yang
diharapkan, hipoksia mengaktifkan AKT dan jalur sinyal MEK dan ERK, seperti yang
ditunjukkan oleh peningkatan fosforilasi kinase ini, dan, sangat, inkubasi sel dengan senyawa 22
dicegah aktivasi ini (Gambar 3A). Yang penting, penghambatan ini jalur sinyal oleh senyawa 22
didampingi oleh penurunan migrasi sel hypoxiastimulated (Gambar 3B). Dalam rangka untuk
menentukan apakah penurunan migrasi adalah karena sitotoksisitas umum, kami melakukan
serangkaian eksperimen serupa di mana sel-sel diinkubasi dengan compound22for 48 jam,
setelah itu senyawa tersebut dihapus dan kemudian sel-sel yang

Tabel 3. Penghambatan bFGF-induced Sel Proliferasi Sel Manusia umbilical Vein endotel
(HUVECs) dengan Senyawa 11-23

Sebuah nilai IC50 merupakan sarana dari dua hingga tiga percobaan independen dilakukan
dalam rangkap tiga. Dalam semua kasus, SEM adalah dalam 10% dari nilai rata-rata.

Gambar 2.Compound 22 mengurangi produksi hipoksia yang disebabkan faktor proangiogenic

VEGF, bFGF, dan NO dan menghambat aktivasi reseptor yang sesuai mereka. Inkubasi sel
MCF7 dengan senyawa 22 (50M) dalam kondisi hipoksia secara signifikan mengurangi tingkat
(A) VEGF, (B) bFGF, dan (C) NO, menurunkan aktivasi (D) VEGF dan (E) reseptor FGF, dan
menurun (F) iNOS ekspresi (131 kDa band) .-aktin (42 kDa) ditampilkan sebagai kontrol
pemuatan. Data sesuai dengan rata-rata SEM dari setidaknya tiga percobaan independen, dan
gel perwakilan yang akan ditampilkan. Bar grafik di panel D dan E mewakili kepadatan optik
dari protein terfosforilasi immunoreactive dinormalisasi terhadap total protein yang sesuai, yang
dinyatakan sebagai persentase relatif terhadap normoxia. Grafik batang di panel F mewakili
densitas optik dari protein immunoreactive (iNOS) dinyatakan sebagai persentase relatif terhadap
normoxia *, P <0,05;. **, P <0,01; ***, P <0,001 (vs hipoksia kendaraan- sel diperlakukan) (uji
Student'st).

Gambar 3.Compound22 menghambat jalur sinyal hipoksia-diaktifkan dan menekan migrasi

sel. (A) bercak Barat Perwakilan terfosforilasi (pAkt) dan jumlah AKT (T-AKT), MEK1
terfosforilasi / 2 (pMEK1 / 2) dan jumlah MEK1 / 2 (T-MEK1 / 2), dan terfosforilasi ERK1 / 2
(pERK1 / 2) dan jumlah ERK1 / 2 (T-ERK1 / 2). Lysates diperoleh dari sel MCF7 diobati dengan
compound22 (50M) dalam kondisi hipoksia. Data sesuai dengan rata-rata SEM dari
setidaknya tiga percobaan independen. Bar grafik di panel A mewakili kerapatan optik dari
protein terfosforilasi immunoreactive dinormalisasi terhadap total protein yang sesuai, yang
dinyatakan sebagai persentase relatif terhadap normoxia *, P <0,05;. **, P <0,01
(Student'sttest). (B) Dalam vitro goresan (luka) yang dibuat oleh gesekan monolayers sel
konfluen dengan ujung pipet steril dan divisualisasikan dengan mikroskop fase kontras. Setelah
48 jam di bawah kondisi hipoksia, daerah luka yang tersisa itu diukur.Grafik batang merupakan
rata-rata SEM dari setidaknya tiga percobaan independen dan tiga differentfields. ***, P
<0,001 (vs sel DMSO-diperlakukan) (uji Student'st). Bar, 250 m.

Gambar 4.Compound22inhibits produksi faktor proangiogenic hipoksia diinduksi melalui HIF-

1. Tingkat (A) HIF-1mRNA setelah transfeksi sementara sel MCF7 dengan siRNA selektif
menargetkan HIF-1 (HIF-1siRNA) atau dengan nontargeted siRNA (C siRNA). Hasil
dinyatakan dalam satuan sewenang-wenang (au). bFGF (B) dan VEGF (C) tingkat dalam sel
MCF7 transiently transfected dengan Sirnas ditunjukkan di bawah normoxic dan kondisi
hipoksia dan ada / tidaknya dari compound22. Bercak Barat Perwakilan (D) BNip3 (22 kDa), (E)
Ang2 (65 kDa), dan (F) HIF-1 (132 kDa) dan HIF-2 (115 kDa). Dalam semua kasus, aktin (42
kDa), ditandai dengan panah, digunakan sebagai kontrol pemuatan. Lysates diperoleh dari sel
MCF7 diobati dengan compound22 (50M) dalam kondisi normoxic atau hipoksia seperti yang
ditunjukkan. Data sesuai dengan rata-rata SEM dari setidaknya tiga percobaan independen. Bar
grafik di panel D dan E mewakili kepadatan optik dari protein immunoreactive (BNip3 atau
Ang2, masing-masing) dinyatakan sebagai persentase relatif terhadap normoxia *, P <0,05;. ***,
P <0,001 (vs hipoksia kendaraan diperlakukan sel) (uji Student'st).
diinkubasi untuk tambahan 48 h. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa sel-sel memulihkan
kemampuan mereka untuk bermigrasi setelah penghapusan senyawa (Informasi Pendukung
Gambar S1). Selain itu, jumlah sel yang layak tetap mirip dengan yang di sel vehicletreated
(Informasi Pendukung Gambar S1E). Secara bersama-sama, data ini sangat menyarankan bahwa
senyawa 22 terutama mempengaruhi migrasi sel dan tidak mendorong sitotoksisitas
umum. Senyawa 22 Menghambat Produksi Hipoksia Induced Sinyal proangiogenic melalui
Hypoxia Inducible Factor-1-(HIF-1). Hipoksia intratumoral merupakan salah satu faktor
utama yang mendorong angiogenesis tumor, dan hipoksia-driven angiogenesis terutama
dimediasi oleh HIF-1, sering dianggap sebagai regulator master angiogenesis bawah
hipoksia. Selain itu, sel-sel kanker payudara MCF7, HIF-1is faktor yang terutama berkontribusi
terhadap ekspresi gen dalam kondisi hipoksia. Oleh karena itu, kami menganalisis apakah HIF-
1 terlibat dalam respon antiangiogenic ditimbulkan oleh senyawa 22. Untuk tujuan ini, kita
mengetuk-down selektif RNA campur kecil HIF-1using (Sirnas) (Gambar 4A). Seperti
ditunjukkan dalam Gambar 4B, C, hipoksia diinduksi peningkatan bFGF dan VEGF tingkat
dalam sel MCF7 transfected dengan nontargeted (kontrol) siRNA (CsiRNA), dan efek ini
dicegah oleh senyawa 22. Sebaliknya, pembungkaman genetik HIF-1abrogated yang meningkat
dalam dua faktor ini proangiogenic pada hipoksia stimulus, dan senyawa 22 tidak meningkatkan
efek ini. Hasil ini menunjukkan bahwa efek compound22on bFGF dan VEGF tingkat dimediasi
melalui HIF-1. Untuk lebih menganggap efek senyawa 22 modulasi HIF-1 dan tidak kepada
anggota lain dari keluarganya, terutama HIF-2, kami memilih dua protein, BNip3 dan Ang-2,
yang telah dijelaskan untuk terutama diatur oleh HIF-1and HIF-2, masing-masing. Seperti
yang diharapkan, dan konsisten dengan literatur, hipoksia meningkatkan kadar kedua protein,
BNip3 dan Ang-2. Hebatnya, senyawa 22 menurun hanya tingkat BNip3 (Gambar 4D) tanpa
mempengaruhi ekspresi Ang-2 (Gambar 4E). Hasil ini memberikan dukungan lebih lanjut untuk
keterlibatan spesifik HIF-1in efek yang disebabkan oleh compound22. Selain itu, dan
membuang dampak potensial dari hulu derivatif ini HIFs, kami memverifikasi bahwa senyawa
22 tidak mempengaruhi tingkat ekspresi baik dari HIF-1or HIF-2 (Gambar 4F). Profil Gene
antiangiogenic dari hipoksia MCF7 Sel Diobati dengan Compound 22. Untuk lebih menegaskan
profil antiangiogenic senyawa 22, kami menganalisis ekspresi gen 84 kunci yang terlibat dalam
angiogenesis di hipoksia
MCF-7 sel diperlakukan dengan senyawa ini. Kami mengidentifikasi 12

gen yang secara signifikan dipengaruhi oleh senyawa 22 (lipat

mengubah 2; Gambar 5). Seperti yang diharapkan, beberapa proangiogenic

gen yang menurunkan regulasi di hadapan compound22.

Diantaranya adalah beberapa sitokin seperti CCL11, IL-1, atau

yang PROK2 kemokin seperti yang telah dikaitkan dengan angiogenesis pada tumor padat

22-24

serta dikenal lainnya