Le malattie da prioni Questi agenti patogeni anomali, la cui esistenza era considerata impossibile, sono oggi riconosciuti come responsabili di svariate malattie infettive, genetiche e spontanee uuindici anni fa [il presente arti- colo & stato pubblicato da «Le Scienze nel marzo 1995] susci- tai parecchio scetticismo quando mi az~ zardsh a ipotizzare che gli agenti infeti viin grado di provocare alcune malattie degenerative del sistema nervosa cen- ‘tale negli animali e, pid raramente, an- che nell’ uomo potessero essere costitul ti solamente ds materiale proteico. A. quell’epoca, un concetto del genere suonava come un’eresia, Il dogma uni- versalmente accettato era che gli agenti infettivi che tasmettono le malattie de- vono disporte di materiale genetico, co” stituito dagli acidi nocleici (DNA € RNA), per propagare 'infezione in w1 cospite, Anche i virus si basano sugli acidi nucleici per dirigere la sintesi del le proteine indispensabili alla loro so- pravvivenza e duplicazione. In seguito, quando i miei colleghi e io proponemmo che queste «particelle in- fettive proteiche» - 0 «prioni», come le chiamai - potessero essere responsabili di malatie ereditati, oltre che wrasmissibi Ii, incontrammo 10 stesso scetticismo. Analoga accoglienza fu fatta all'ipotesi ‘con cui sostenevamo che i prioni riesco- ro a roltiplicarsi in maniera incredibile, trasformando molecole proteiche norma Ii in altte pericolose attraverso un cam- ‘biamento di conformazione. Oxgi, tuttavia, una grande quantita di dati sperimentali e clinici avvalora in ‘maniera convincente la correttezza di ut- tee tre le ipotesi. I prioni sono effettiva- mente responsabili di patologie trasmis- sibili ed ereditarie dovute a cambiamenti di conformazione proteica, Possono an- che causare malattie sporadiche, nelle quali non & dimostrabile né trasmissione {ra individui né predisposizione genetica, ‘Inoltre pare che, accanto ai prioni che provocano le patologie finora studiate, vi 48° screyzr quaderni n. 116 possano essere prioni costituitt da protei- ne alguanto diverse che potrebbero con- tribuire ad altre malattie neurodegenera- tive molto comuni nell’ uomo, come pure ad aleune malattie muscolari Le malattie da prioni note, tutte letali vengono talvolta denominate encefalopa- 40.000 35.000 30.000 28000 20.000 15000 (CAS! CONFERMATIDI MALATTIA 10.000 5000 JOA GENNAIO A MAGGIO) al SPS FESISF Capt lbestiamevengon cremat Der imped a dsone deta entalopaia sponsor boring, cmt dla mucea paz ‘Questa patologia che in Gran Brtagna ‘ha colpito oltre 130.000 bovini dalla met’ el al ottant, buna dele prechle ula wearodepneratve oral deal animaledt'vom ces tene ano esate da prin ola da protein ei Sta ra cercando stable se lama pub sere trasmese dl ov ‘i uomo tame consumo. di Stanley B. Prusiner tie spongiform. 11 nome deriva dalla pre- senza di bolle e cavitd nella corteccia ce- rebrale (status spongiosus). Queste pato- logie, che possono essere Iatenti per anni (© anche per decenni nell’uomo), son diffuse negli animali, La forma pit comune & lo serapie, 0virosi nervosa degenerativa della pecora Gili animali colpiti perdono la coordina- zione dei movimentie, alla fine, diventa- no incapaci di reggersi sulle zampe. Inoltre soffrono di un prurito cosi inten~ soda indurli a raschiar via parti del man- tello (to scrape, in inglese, da cui il no- me della malattia). Altre malattie da prioni negli animali sono I’encefalopatia trasmissibile del visone, latrofia eronica del cervo mulo e dellalce, Pencefalopa- tia spongiforme felina e I'encefalopatia spongiforme bovina. Quest’ultima, chia- ‘mata popolarmente «malattia delle vac- che matte», & la pid pericolos Gerald A, H. Wells © John W. Wi- lesmith del Central Veterinary Labora- tory di Weybridge, in Inghilterra, iden- tificarono questa malattia nel 1986, do- poche aveva cominciato a colpire il be- stiame bovino in Gran Bretagna provo- cando perdita di coordinazione ¢ una condizione di insolita agitazione. L’ori- gine dell'incipiente epidemia venne presto individuata in un integratore ali- mentare che conteneva came e farina d’ossa di ovini, Il metodo di lavorazio- ne delle carcasse degli ovini era stato modificato alla fine degli anni settanta;, mentre il procedimento precedente eli minava l'agente dello scrapie dall'inte gratore, quello nuovo non era evidente mente in grado di farlo, Tl Governo bri tannico viet I'uso di integratori_ali mentari di origine animale nel 1988, € probabilmente l'epidemia @ ora in fase calante, Tuttavia molte persone conti huano a essere preoccupate di potersi un giorno ammalare per aver consuma- 10 carne contaminata Le malattie da prioni umane sono pit misteriose. Il kuru & stato osservato solo nella tibi Fore di Papua Nuova Guinea, che lo chiama «morte che ride». Vincent Zigas dell’Australian Public Health, Service e D. Carleton Gajdusek degli US National Institutes of Health deserissero il kuru ne! 1957, notando che molti indi ¢geni venivano colpiti da una strana e let Te malatia caratterizzata da perdita di coordinazione (atassia) ¢ spesso, pid tar di, da demenza, Gli individui colpiti ave- vano probabilmente contratto il kuru in seguito a cannibalismo rituale: Ia tribiy Fore usava onorare i defunti mangiando- ne il cervello, La pratica & da allora ces- sata e il kuru pressoché scomparso. La malattia di Creutzfeldt-Jakob, vi cceversa, & presente in tutto il mondo e di solito si manifesta come demenza, Per lo pi appare sporadicamente, dato che col: pisce una persona su un milione, tipica. ‘mente intorno ai 60 anni. Circa il 10-15 per cento dei casi ereditario; un piccolo ‘numero di essi & purtrappo iatrogeno, os: sia @ trasmesso accidentalmente nel ten: tativo di curare qualche altra patologia. ‘A quanto si sa, la malattia di Creutefeldt “Jakob iatrogena pud venire trasmessa tramite trapianto di cornea, impianto del Ia dura madre o di elettrodi nell’encet lo, uso di strumenti chirurgici contami- nati o trattamento con ormone della cre- scita ottenuto da ipofisi umana (prima che divenisse disponibile 'ormone della crescita prodotto con la tecnologia del DNA ricombinante). Le altre due malattie da prioni umane sono la malattia dit Gerstmann- ler-Scheinker (che si manifesta con sia e altri sintomi di danno al cervelletto) Vinsonnia familiare fatale (nella quale la difficolta a prender sonno @ seguita da demenza). Entrambe queste patologie sono generalmente ereditarie e appaiono tipicamente verso la mezza et. L'inson- nia famniliare fatale & stata scoperta solo Le scieze quademnin. 116 49 4 Hi recente da Elio Lugaresi e Rossella Medori dell'Universita di Bologna e da Pierluigi Gambett della Case ‘Wester Reserve University Comins a interessarmt alle mala tie da prioni nel 1972, mentte ero interno di neurologia presso la School of Medicine dell'Universiti della Cali- fornia @ San Francisco. Uno dei miei pa- ienti mori per la malattia di Creutzfeldt- Jakob e io votli eseminare la letteratura scientifica disponibile su questa e altre patologie correlate. Appresi cos) che lo scrapie, la malattia di Creutzteldt-Jakob e il kuru erano tutti trasmissibili inocu Jando estrati cerebrali di animali amma- lati nel cervello di animali sani. Siritene- vva che le infezioni fossero eausate da un virus a lenta azione, ma nessuno era an- cora riuscito a isolare il colpevole. Nel corso della lettura mi imbattei in tun articolo sorprendente, nel quale Tik- vah Alper e colleghi dell’ Hammersmith Hospital di Londra proponevano che agente dello scrapie potesse essere pri- vo di acidi nucleic, di solito degradabili ‘mediante radiazioni ultraviolette 0 ioniz= zanti, Questo perché, anche quando gli acidi nucleici degli estratt cerebrali ott: ‘mati da animali ammalati avrebbero do- vuto essere distrutti da questi trattamenti, i campioni conservavano Ja capacitd di trasmettere lo scrapie, Se il microrgani- smo mancava di DNA e di RNA, allora non poteva essere un virus 0 un alto tipo noto di agente infettivo, dato che tutti contengono materiale genetico. Che cos'era dunque? I ricercatori avevano, molte idee - che comprendevano scher- zosamente anche il linoleum ¢ la krypto. nite - ma nessuna risposta certa, Cominciai immediatamente a cercare i sisolvere questo mistero. I primo passo doveva essere semplicemente pre: pparatorio: Ia purificazione del matesiale infettivo nel tessuto cerebrale di animali affetti da serapie, in modo da poteme analizzare la composizione. Si trattava diun compito formidabile; molti studio si in passato avevano tentato senza esit. ‘Ma, con I'ottimismo della gioventi, per- severai, Nel 1982 i miei colleghi e io ci trovavamo ormai a buon punto, essendo riusciti a ottenere estratti encefalici di criceto costituiti quasi esclusivamente da materiale infettivo, Avevamo inolire sottoposto questi estriti a tutta una serie di analisi messe a punto per rivelare ba composizione dell’ agente patogeno, Le malattie da prioni nell'vomo, che possono avere un tempo di incubazione anche di 30 1, causano tutte un progessivo dectino delle capa cognitive e delle funzioni ‘motorie; pertanto le distinzioni tra 'una e Valtra di esse sono talvolta poco nette. Via via che si riconoscono le mutazioni genetiche che stanno alla buse delle forme | nove famigie alargato remo, segut a eson- | | | ae denenza ' | 50 tn sear quate 16FONTE: Fed. Coban La proteina prionica (PrP) ¢ generalmente innocua. Nella forma benigna, il suo scheletro si ipiega formando diverse eliche (mostrae come spirali nel plausibile modello a nastro ‘asinisira, come cilindri nello schema in alto a destra). La PrP si converte nella forma infetiva che causa lo scrapie - un prione - quando gran parte dello scheletro si distende, formando i cosiddett filament beta (rappresentati come frecce nella strultura poveica in basso a destra. 1 sit in rosso nel modello a nastro delta PrP normale evidenziano ‘posizioni nelle quali la sosttazione di un amminoacido promuove probabilmente avvofgimento nella forma infettiva della molecola. ve si trovavano le istruzioni che specifi- eavano la sequenza degli amminoacidi nella PrP? Erano trasportate da un seg- ‘mento non identificato di DNA associato alla PrP, o forse erano contenute in un gene situato nei cromosomi delle cellu Ie? La chiave per rispondere a questo enigma fu l'identificazione, nel 1984, di cirea 15 amminoacidi a un'estremita de!- [a proteina PrP. Fu ilzeio gruppo a indi- Viduare questa breve sequenza ammi- noacidica in collaborazione con Leroy E. Hood e colleghi del CalTech. La conoscenza di questa sequenza ppermise a noi ead altri di costruire sonde rmolecolari capaci di indicare se le cetia- Je di mammifero recassero un gene pet la PrP, Servendosi di sonde preparate dal ‘gruppo di Hood, Bruno Oesch, che lavo~ rava nel laboratorio di Charles. Wei smann all'Universiti di Zurigo, dimostrd che le cellule del ericeto contengono ef- fettivamente un gene per fa P1P. Pit o ‘meno nello stesso periodo, Bruce Che- seboro dei National Institutes of Health prepatd le proprie sonde e stabili che an- che le cellule di topo ospitano questo ge- ne. Questo lavoro consenti di isola il ‘gene e di determinare che esso risiede ‘non nei prioni, ma nei cromosomi del criceto, dell"vomo ¢ di tutti gli altri mammiferi esaminati, Per di pit) ste queste specie producono quasi costante- mente PrP senza ammalari Questa scoperta ci fece pensare a uno sbaglio colossale: la PrP non aveva nien- te a che fare con le malatie da prioni. Un'altra possibilita era che la PrP potes- se essere simtetizzata in due forme, una ‘che generava la malattiae una che non lo faceva. Ben presto dimostrammo che questa interpretazione era quella correta L'indizio fondamentale fu dato dal fatto che la PrP trovata nel cervello di animali infett resisteva alla degradazio- ne da paste di enzimi cellular, le protea- si, mentre la maggior parte delle proteine cellular viene degradata assai facilmen- te, Sospettai percid che, se esisteva una forma normale, non pericolosa, di PrP, anch'essa sarebbe stata suscetibile di degradazione. Ronald A. Barry del mio gruppo di ricerca identificd questa ipote- tica forma sensibile alle proteasi Diven- re cosi chiaro che la PrP che causa Io scrapie & un Variante della proteina nor- male. Chiamammo dunque Ia proteina normale PrP cellulare e quella infettva (resistente alle proteasi) PrP dello scra- pie. Quest'ultimo termine viene ora im- piegato per indicare le molecole eredita- rie proteiche che costituiscono i prioni DinaySenaovehy responsabili di tutte le malatie simili al lo scrapie negli animali e nell’womo, Winizio avevamo sperato di poter utilizzare il gene per la PrP per pro- durre molecole pure di questa proteina; avremmo cost potuto inocularla in a mali, certi che nessun virus elusivo fosse associato a essa. Se gli animali avessero Contratto lo scrapie, aveemmo dimostrato che fe molecole proteiche potevano tra- smettere la malattia. Nel 1986, tuttavia, avevamo ormai stabilito che questo me- todo non poteva funzionare. Per prima cosa, si dimostrd molto difficile indure i gene a sintetizzare gli ati livelli di PrP necessari:inoltt ia proteina che veniva Prodotta in questo modo era la forma cel- lulare normale. Fortunatamente, ricerche condotte allo scopo di risolvere un diver- so problema ci indicarono un metodo al- temativo per dimostrare che iprionipote- vvano trasmettere lo scrapie senza l'ausi- tio di acidi nucleici associati. ‘In molt casi, le malattie umane simili allo scrapie sembrano manifestarsi senza che vi sia stata trasmissione da un ospite allalto, ¢ in alcune famiglic paiono es- sete ereditarie. (Oggi sisa che circa it (0 per cento dette malate da prioni umane sono familiar e colpiscono circa la meta dei membri delle famiglie interessate.) Fu questa partcolarita ad attrare 1a. no- sira attenzione. 1 prioni potevana essere ancora pitt strani di quanto avessimo pensato in origine? Erano forse respon- sabili del manifestarsi di patologie sia ereditarie sia trasmissibili? Nel 1988 Karen Hsiao e io scoprim- mo aleuni fra i primi dati che conferma- vyano come le malattie da prioni umane potessero essere ereditate. Ci procuram- ‘mo cloni di un gene per la PrP often dda un uomo nella cui famiglia si era ma- nifestata la malattia di Gerstmann- Strdussler-Scheinker, e che stava moren- do per Ia stessa patologia. Paragonamnio poi questo gene con i geni per Ia PrP ot- tenuti da una popolazione sana e trovam ‘mo una minuscola anomalia, quella che viene chiamata mutazione puntiforme. Per comprendere la natura di questa mutazione @ opportuno avere un’idea dell'organizzazione dei geni. Questi so- no costituiti da due filamenti di DNA (composto a sua volta da nucleotii), che differiscono T'uno dall'altro nelle basi azotate in essi contenute. Le basi di un filamento si combinano con quelle dell’alto filamento formando coppie di basi: i «pioli» della familiare «scaletta> del DNA. Ole « enere insieme la mo- Iecola del DNA, queste coppie di basi esprimono la sequenza degli amminoa- Cidi che devono essere legati insieme et produrre una particolare proteina Tre coppie di basi - un"unitd chiamata rescirnze quademin 116 STnity Setiovly Pao: “oO en INTRACELLULARE wouEcous oi x ORIGIALE mT -) 52 ursctenze quademi n, 16 ccodone - specificano insieme un singo- Jo amminoacido. Nel nostro paziente moribondo solo una coppia di basi (su oltre 750 del gene per la PrP) era sosti- tuita da_una coppia diversa. Questo cambiamento aveva a sua volta alterato T'informazione trasportata dal codone 102, provocando Finserimento di una leucina al posto di una prolina nella PrP sintetizzata dal paziente. Con aiuto di Tim J. Crow del North- wick Park Hospital di Londra e di Jurg Ott della Columbia University e colleghi individuammo la stessa mutazione in ge- nil provenienti da molti pazienti affetti dalla malattia di Gerstmann-Strausser- Scheinker e dimostrammo che alta in- cidenza familiare era statisticamente si- gnificaiva, In altri termini, stabilimmo una correlazione genetica fra la mutazio- ne e la patologia, Negli ultimi sei anni sono state individuate da sumerosi grup- cercatori 18 mutazioni in famiglie colpite da malattie da prioni ereditae: per cingue di queste mutazioni & stato ‘dentificato un numero di casi sufficiente a stabilire la correlazione genetica La scoperta di mutazioni ci ha fornito tun modo pet eliminare la possibilta che un acido mucleico fosse associato alle protcine dei prone ne dirigesse la repli- cazione. Ormai potevamo ottencre topi geneticamente alterati che recassero un ‘gene pet la PrP mutante. Se la presen- za del gene alterato in questi animali saransgenici» avesse di per sé causato lo scrapie, ¢ se il tessuto cerebrale prelevato da essiavesse provocato lo scrapie in animali sani avremmo ottenuto una vali- da prova che la proteina codificata dal gene mutante fosse Iunica responsabile della trasmissione della malatia. Studi dda me condotti con Karen Hsiao, Dar- Jene Groth del mio gruppo e Stephen J DeArmond, responsabile di un altro la boratorio dell’ Universita della California a San Francisco, hanno permesso di di- mostrar che lo scrapie pud essere indot toe trasmesso in questo modo. Questi risultati sugli_ animali ricorda- ‘no quelli ottenuti nel 1981, quando Gaj- dusek, Colin L. Masters € Clarence J. Gibbs, Jr. dei NIH, trasmisero la malat- tia di Gerstmann-Striussler-Scheinker appareniemente ereditaria alle scimmie. Osservazioni simili sono state effettuate da Jun Tateishi e Tetsuyuki Kitamoto della Kyushu University che hanno tra smesso la malatia di Creutzietdt-Jakob ereditaria ai topi. Nel complesso, gi st di sulla tramissione hanno dimostrato che i prioni rappresentano effettivamente tuna insolita classe di agenti_infettivi composti solo da una molecola proteica dei mammiferi modificata. Questa con- clusione & rafforzata dal fatto che lassi dua ricerca di un acido nucleico specifi- co dello scrapie non ha fornito alcuna prova che simile materiale genetico sia Tealmente associato ai prion. Gili scienziati che continuano a prefe- rire la teoriavirale potrebbero sostenere che non abbiamo ancora provato le no- stre’affermazioni. Se il gene per la PrP codificasse per una proteina che, in se~ guito a mutazione, potesse facilitare Pin- fezione da parte di un virus ubiquitario, allora sarebbe la mutazione a causare VPinfezione virale cerebrale, Quindi 'ino- culazione di estratti di tessuto cerebrale del!’animale mutante diffonderebbe Iin- fezione a un altro ospite. Tuttavia, man- ‘cando ogni indicazione della presenza di un virus Yipotesi appare insostenibil. Oltre'a dimestrare che una proteina ‘pud moltiplicarsie provocare una malat- tia senza l'ausilio degli aciat nucleic, ab- biamo compreso pit a fondo come !a PrP dello scrapie si propaghi nelle cellule. Restano da approfondire molti dettagi, ‘ma un aspetto sembra ben chiaro la prin- cipale differenza fra la PrP normale € quella dello scrapie & conformazionale Evidentemente la proteina che causa 10 serapie si propaga entrando in contatto con le molecole normal di PrP e provo- candone in qualche modo lo svolgimento ¢ il passaggio dalla conformazione usta- lea quella della PrP dello scrapie. Questo ‘cambiamento da origine a una reazione catena in cui le molecole appena tasfor- mate modificano la forma di altre mole- cole normali di PrP e cosi via, Quest: ‘La propagazione della PrP dello scrapie nei neuroni sembra avvenire mediante una sorta, di effetto «domino» su una membrana interna. Secondo una dele ipotesi pit accreditate, il processo inizia (a) quando una molecola della PrP dello scrapie (in rosso) viene a contatto con una molecola di PrP normale (in marrone) ene induce il riavvolgimento nella conformazione dello scrapie (b). Le molecole cosi formate attaceano allora altre molecole di PrP normale (c). Queste molecokecominciano a loro volta ad attaccare altre molecole normall e cost via (freccia rateggiata, fina a che la PrP dello seraple si accumula a livelli pericolosi(d).ceventi si verificano, a quanto pare, su una ‘membrana nell iacerno della cellu. ‘Abbizmo cominciato a pensare che le difference fra le due forme di PrP debba- ro essere conformazionali dopo che altre ipotesi si etano dimostrate improbabili. Per esempio, si sa da tempo che la forma infettiva ha. spesso Ia stessa sequenza amminoacidica di quella normate. Natu- ralmente, molecole identiche possono es- sere modificate chimicamente in modo da alterame l'ativit, Le ricerche esegui- te da Neil Stahl © Michael A. Baldwin nel mio laboratorig non hanno perd rive- lato alcuna differenza di questo tipo. Toyets m2, satamente,iersco no le strutture della forma normale & ai quella patologica della PrP? Studi ef- fettuati da Keh-Ming Pan del nostro sruppo indicano che la proteina normale ® costtuita soprattutto da alfa eliche, re- gioni nelle quali lo scheletro proteico si avvolge in uno specifico tipo di spirale; Ia forma che provoca lo scrapie, invece, contiene filamenti beta, ossia regioni do- ve lo scheletro proteico 8 completamente disteso, Una serie di quest flamentifor- 1a ur foglietto beta. Fred E. Cohen, che dirige un altro laboratorio dell"Univer~ sit della California @ San Francisco, ha ilzzato modelli molecolari per cercare di cicostrure la strutura della proteina normale. I suoi caleoli indicano che fa proieina probabilmente siayvolge in una struttura compatta avente quattro eliche nella pane centrale. Si sa di meno sulla siratura, o sulle stutture, della proteina che causa lo scrapie. I dati che sostengono Pipotesi secon- do cui la PrP dello scrapie pud indurre una molecola di PrP con alfa eliche @ trasformarsi in una struttura con fogiet ti beta vengono prevalentemente da due important studi condotti da ricercatori del mio gruppo. Marfa Gasset ha sco perto che peptdi sintetici corisponden {i a tre delle quatto ipotetiche regioni ad alfa elica della PrP possono avvol- gersi in modo da formare fogliet beta E Jack Nguyen ha dimostrato che, nel Ja loro conformazione a fogletto beta, questi peptidi possoxo imporre la stessa struttura a peptidi a elica della PrP. Pit di recente, Byron W. Caughey dei Ro- cky Mountain Laboratories ¢ Peter T. Lansbury del Massachusetts Inttute of Technology hanno riferito che la PrP cellulare pud essere convertita in pro- vetta nella forma infettiva mescotando insieme le due proteine Le molecole di PrP prodotte da geni ‘mutant probabilmente non adottano la conformazione che causa lo scrapie nel ‘momento della sintesi; in caso contra- rio, i portatori dei geni mutanti si am- malerebbero nella prima infanzia. Ri- (chiazze bianche) 2 una caratteristca frequente nelle malattie da prioni e conferisce al cervello un aspetta spugnoso, (Questa microfotografia mostra la corteccla cerebrale di un paziente colpito da malattia i Creutzfeldt-Jakob. teniamo che le mutazioni del gene per la PrP rendano fe proteine risultanti su- scettibili al passaggio da una conforma- zione ad alfa elica a una a foglietto beta Presumibilmente occorre tempo perché ‘una molecola effettui spontaneamente il passaggio. e ancora pil tempo perch la PrP dello scrapie si accumuli e daxneg- i i tessuti cerebrali fing al punto da produrre sintomi, Fred Cohen e io pensiamo di poter spiegare perché le varie mutazioni che sono state osservate nei gen per la PxP possano facilitare V'avvolgimento nella conformazione a fogtietio beta. Mol- te delle mutazioni scoperte nell'uomo provocano 1a sostituzione dino degli amminoacidi situai nelle quattro ipoteti- che eliche 0 sui loro confini. L’inseri- ‘mento di ammincacidi scorrett in queste posizioni potrebbe destabilizzare I'elica, aumentando cost la probabilta che la e- gione interessata ¢ le sue vicine si riav- volgano in una conformazione a foglieto beta. Viceversa, Hermann Schitze! del ‘mio laboratorio ha osservato che le inno- cue differenze che distinguono il gene ‘umano per la PrP da quelli delle scimmie antropomorfe e degli altri primati riguar- dano amminoacidi che si wovano al di faori dei domint. a elica propost, in parti della molecola in cui le differenze non hanno presumibilmente alcun effeto di rilievo sulla stabilta della regione acica fessuno sa esattamente come la pro- pagazione della PrP dello scrapie dannegai le cetfule. Nelle colture celula- Fi a conversione della PrP normale nella forma infettiva avviene all'intemo dei neuroni, dopo di che la PrP dello serapie si accumula in vescicole intracellular, i lisosomi. Nel cervello i lisosomi rigonfi potrebbero verosimilmente esplodere € ‘damneggiare le cellule. Via via che le cel- fle ammalate mugiono, creando lacune nel tessuta i Toro prioni vengono liberati € vanno ad attaccare altre cellule. Sappiamo con certezza che il taglio della PrP dello scrapie & il processo che produce i frammenti di PrP che si accu- ‘mulano sotto forma di placche nel ces- vello di alcuni pazienti. Questi aggrega- ti assomigliano alle placche della ma- lattia di Alzheimer, sebbene queste ulti- ‘me sigao costituite da una proteina di- versa. Le placche di PrP sono un utile indizio di infezione da prioni, ma non sembrano essere una causa importante delle menomazioni, In molt esseri uumani © animali colpiti da malatie da prioni, esse non si manifestano affatt. ‘Anche se-non sappiamo ancora molto su come la PrP dello scrapie danneggi il tessuto cerebrale, possiamo prevedere che la conoscenza della struttura tridi- mensionale della proteina condurra alla scoperta di terapie. Se, per esempio, il modello strutturale del fascio di quattro cliche & corretto, si potrebbe progettare tun composto capace di legarsi a una ta- sca centrale formata dalle quattro eli- che. Grazie al legame il farmaco stabi- lizzerebbe le eliche e impedirebbe loro i trasformarsi in foglieti beta Un’altra idea per un trattamento & ispirata da ricerche nelle quali Weiss- mann e colleghi hanno applicato tecni- che di ingegneria genetica per ottenere topi che mancavano dei gene per la PrP. Inattivando un gene e’osservando le con- seguenze della sua perdita, si possono spesso dedurre le funzioni’ normali del prodotto proteico di quel gene. In questo caso, tuttavia, gli animali privi di PrP non avevano alcuna anomalia individua- bile. Se risultasse che la PrP & realtente non essenziale, si potrebbe un giomo pensare a terapie antisenso o anti-gene peri pazienti affetti da malattic da prio- ni, Queste terapie mirano a impedire ai ‘geni di sintetizzare le proteine indeside- rate e sarebhero potenzialmente in grado di bloccare la produzione di PrP cellula- re, Esse impeditebbero percid alla PrP propagarsi 53 x scuenze quudernin, 116PPP MUTANTE UN TOPO cHE PRODUCE LIVELLI ELEVATIDI PrP MUTANTE EINIZIALMENTE SANO versi studi hanno dimostrato che prioni costituti solo [da PrP sono in grado di trasmettere 'infezione da un animale altaltro. In uno di questi esperiment ‘uci colleghi hanno ottenuto topi transgenici dotati di di- verse copie di un gene mutante per la PrP (a); questi ani- mali producevano livelii elevati di PrP mutante, che in par- CERVELO. oe a ' ‘autore @ i Un esperimento convincente te sembrava adottare la conformazione dello scrapie. Alla fine tutt | topi hanno mostrato sintomi di danno cerebrale @ sono mort (b). | ricercatori hanno allora inoculato tessu- to cerebrale degli animali ammalati in topi geneticamente alterati che producevano bassi lvell della stessa proteina PrP mutante. (Questi topi erano stati prescelti perché la TessuTo CEREBRALE b IL Top MUTANTE SIAMMALA E NUORE Vale la pena di osservare che i topi on il gene inattivato ci hanno consentito 4i mettere alla prova I'ipotesi dei prioni Se gli animali si fossero ammalati dopo Tinooulazione con prioni, cfd avrebbe indicato che queste.molecole possono rmoltiplicarsi anche in assenza di una fonte di molecole di PrP. Come mi aspettavo, Vinoculazione non ha provo- cato lo scrapie © non & stata individuata traccia di duplicazione dei prioni enigma di come la PrP dello scrapie si moliplichi e provochi la malatia non 2 solo che cominci a trovare soluzione. Un alto problema in sospeso - it mistero di come i prionicosttuiti da un solo tipo di proteina possano dare effetti marcata- mente differenti ~ comincia a essere chiarto. Iain H. Pattison dell Agricul- ture Research Couneil di Compton, in Inghiltera,& stato il primo a richiamare Vattenzione sul fenomeno. Anni fa, esl oittenne prioni da due gruppi distint di capre: una delle sostanze rendeva gli ani- ‘mali sonnolenti, mentre I'ltra Ii rendeva iperativi. Ora sappiamo anche che aleu- ni prioni causano rapidamente la malat- tia, mentre altri Jo fanno con lentezza Jan G. Dickinson, Hugh Fraser Moira E. Bruce dellInstcute for ‘Animal Health di Edimburgo, che hanno esaminato i diversi effet di differenti pion isolati da top, sono fra coloro che notano come solo gli agenti patogeni ccontenentiacidi nucieici presentino mol- tepliciceppi. Pertanto, come asseriscono essie alt, Iesistenza di «ceppi» prionici indica che Vipotesi dei prioni deve essere errata, responsabili dello scrapie ¢ delle Corselate sarebbero dei virus S4 ue scmnze quaderni a. 116 Tuttavia, dato che i tentativi di individua- re acidi nucleici virali non hanno avuto esito, la spiegazione delle differenze de- ve essere cercata altrove. Una possibilita & che i prioni possano adottare conformazioni multiple. Se av- volto in un modo, il prione potrebbe tra- sformare la PrP normale nella forma in- fettiva con elevata efficienza, dando or gine a brevi periodi di incubazione. Se ayvolto in un altro modo, potrebbe fun- Zionare in maniera meno efficiente. Cosi pure, le molecole con una conformazio- ne potrebbero essere altratte da popola- Zioni di neuroni di una zona del cervello, ‘mentre quelle con un'altra conformazio- ve avrebbero bersagli preferenziali di versi, producendo cosi sintomi differen- ti. Considerando che la PrP pud avvol- gersi in almeno due modi, non sarebbe sorprendente scoprire che pud adottare anche alte strutture. Dalla met degli anni ottanta cerchia- mo anche di chiarire un fenomeno chia- mato «barriera tra specie». I termine si riferisce al fatto che qualcosa rende dif- ficile per i prioni prodotti da una specie provocare malattia in animali di un’al- tra specie, a barriera fu scoperta da Pattison, cche negli anni sessanta incontrd problemi nel trasmettere Io scrapie da bovini a roditori, Per determinare la causa di questa difficolta, il mio collega Michael R. Scott e io abbiamo ottenuto topi transgenici che esprimevano il ge- ne per la PrP del criceto siriano, ossia che sintetizzavano Ia proteina PrP del criceto. Il gene del topo differisce da quello del ericeto in 16 codoni su 254, 1 topi normali a cui vengono inceulati prioni di criceto raramente sviluppano lo scrapie, ma i topi transgenici si am- malano nel giro di due mes. Concludemmo cosi che avevamo fat- to cadere la barrera fra specie inseren- do i geni del criceto nel topo. Inolte, in base @ questo ad altri esperimenti, ab- biamo compreso che la barriera sta nel- la sequenza amminoacidica della PrP: quanto pi la sequenza della molecola di PrP dello scrapie assomiglia a quella della PrP dell‘ospite, tanto pid) facil- ‘mente quest’ ultimo sviluppera la malat- tia da prioni. In un altro esperimento, per esempio, abbiamo esaminato topi transgenici che portavano il gene per la PrP del criceto siriano in aggiunta al lo- ro gene naturale. Quest topisintetizza- vano forme normal di PP sia di criceto sia di topo. Quando inoculammo loro prioni di topo, essi produssero altri pri- ‘ni di topo: quando inoculammo prion di criceto, osservammo viceversa la sin- tes di prion di ericeto. Da questo feno- meno concludemmo che i prion intera- giscono preferenzialmente con PrP cel- Tulare di composizione omologa. Lattrazione della PrP dello scrapie per la PrP cellulare avente la sessa se- {quenza spiega probabilmente perch in Inghilterra lo scrape sia stato tasmesso ai bovini da un alimento contenente tes- suti di ovini: le due molecole PrP diffe- riscono solo in sete posizioni Invece la differenza nelle sequence della PrP u- mana e bovina & notevole: vi sono am- ‘minoacidi diversi in pit di 30 posizioni Considerando questo fatto, la probabi- Jit di trasmissione dai bovini all’ uomo sembrerebbe bassa. Questa affermazio-© UNTOPO CHE PRODUCE BASSI LVELLIDI PrP MUTANTE SIAMMALA DOPO LINOCULAZIONE — rr ne & confermata da studi epidemiologici condotti da W. Bryan Matthews, pro- fessore emerito dell’Universita di Ox- ford, il quale non ha trovato alcuna cor- relazione tra scrapie degli ovini e ma- lattia di Creutzfeldt-lakob in zone in cui 2 diffuso l’allevamento ovino. 'altra parte due allevatori che aveva- no bovini colpitidallo scrapie nelle loro stalle sono recentemente deceduti a cau- sa della malattia di Creutzfeldt-Ja-kob. Pad darsi che la loro morte non. abbi nulla a che fare con l’epidemia dei bovi- ni, ma & necesserio tenere la situazione sotto controllo. Pud darsi che alcue re- ‘ioni della molecola di PrP siano pid im- pportanti di altre per superare la barriera tra specie. Se cosi fosse, ¢ se la PrP bov nna assomigliasse parecchio a quella ‘umana nelle regionicritiche, allora il ri- schio potrebbe essere pid alio di quanto faccia pensare il semplice confronto del- le sequenze amminoacidiche complete. ‘Abbiamo considerato la possiilita che alcune regioni della molecola di PrP po- tessero essere particolarmente silevanti nei confronti della barriera tra specie, quando uno studio correlato a questo ar” gomento ha dato rsultatiinattesi. 11 mio collega Glenn C. Telling aveva ottenuto topi transgenici che recavano un gene per la PrP ibrido, consistente in segmenti co- dificanti del gene umano fiancheggiati a entrambi i lati da segmenti murini; il ge~ ne sintetizzava una proteinaibrida. Dopo di che, introdusse tessuto cerebrale di pa- Zienti'morti di malattia di Creutzfeldt- Jakob o di Gerstmann-Striussler-Schein- ker negti animals transgenici e osservd che, stranamente,essi si ammmalavano pitt frequentemente ¢ rapidamente che non i PrP dello scrapie @ attratta soprattutto da molecole di PrP aventi la medest- ma composizione.) | topi di controllo, a cui non era stato inoculato tessuto, ‘non si sono amrmalati (a dimostrazione del fatto che la sintesi di bassi lvell della proteina aberrante non @ pericolosa), contrariamente a molti di quelli trattati (c). Inoltre il tessuto cerebrale trasferito dai topi ammalati alle loro controparti sane ha provocato ancora malattia (d). Se la proteina aberrante ‘non fosse in grado di trasmettere infezione, nessuno degli animali inoculat si dUNTOPO IDENTICO SIAMMALA DOPO AVER RICEVUTO UNINOCULAZIONE DI TESSUTO DEL TOPO PRECEDENTE topi recanti il gene umano completo per 1a iP, it cui prodotto proteico diverge da quello murino in 28 posizioni. Questo ri- sultato implicava che una somiglianza nella regione centrale della molecola di PrP pottebbe essere pitt importante che non una in altri segment io conferma anche osservarioni pre- cedenti - compiute da Shu-Lian Yang del laboratorio di DeArmond e da Albert ‘Taraboulos del mio gruppo - secondo cui molecole sintetizzatedall'ospite possono influenzare il comportamento della PrP dello scrapie. Abbiamo ipotizzato che, nello studio sul gene ibrido, una proteina ‘murina, forse una «chaperonina> (protei- na che assisteall’avvolgimento delle ca- ‘ene proteiche appena sintetizzate), ab- bia riconosciuto una delle due regioni ‘murine della PrP ibrida; essa si legata a quella regione e ha conteibuito afar riav- Yolgere la molecolaibrida nella confor- razione della PrP dello scrapie. La cha- peronina non forniva una simile assisten- 7a nei topi che sintetizzavano una PrP to- talmente umana, presumibilmente per- ché la proteina umana era priva di un sito Gi legame peril fattore murino. rm dato imprevisto & recentemente Jemerso da studi su topi transgenici cche sintetizzano quantita insolitamente levate di proteina PrP normale, De- Armond, David Westaway del nostro ‘gruppo, e George A. Carlson del Mc- Laughlin Laboratory di Great Falls, nel Montana, hanno osservato che alcuni {opi transgenici anziani manifestavano rigiditd e riduzione dell'attivit’ di puli- ia, Cercando la causa del fenomeno, stabilimmo che la produzione di quan- tite eccessive di PrP pud portare nel tempo a neurodegenerazione e, sorpren- dentemente, alla distruzione dei muscoli © dei nervi periferici. Queste scoperte ampliano lo spettro delle matattie da prioni e hanno indotto a cercare anche nell’uomo patologie analoghe che colpi- scano il sistema nervoso periferico € i muscoli Lo studio degli animali che produco- 1no livelli elevati di PrP ha dato anche al- tri esit positivi, sotto forma di indizi ri ‘guardanti linsorgenza della forma spo- radica della malattia di Creutzfeldt- Jakob. Per un certo periodo ritenni che la malattia sporadica potesse iniziare quando i processi degenerativi che si ve~ rificano naturalmente nel tempo portava- no a una mutazione del gene per la PrP in almeno una celtula dell organismo. Alla fine la proteina mutante poteva con- vertrsi nella PrP dello scrapie e propa- garsi gradualmente, fino a che il suo ac- cumulo superava la soglia necessaria per il manifestarsi della malattia. Gli studi sti topi indicano che, a un certo punto della vita di quel’individuo su un milio- ne che sviluppa la forma sporadica della rmalattia di Creutzfeldt-Jakab, a PrP cel- lulare pud trasformarsi spontaneamente nella forma patologica. Gli esperimenti suggeriscono anche la possibilta che gli individui colpti dalla malattia di Creutz- feldtJakob sporadica producano un ec cesso di PrP, ma non sappiamo ancora se Te cose stiano realmente cos Oggi possediamo modelli animali di tutte le malatie da prioni umane note. Nel corso dei nostri lavori pit recenti & emerso inaspettatamente un modello per una malattia da prioni, sporadica Topi a cui vengono inoculati estrattice- rebrali di animali infettati dallo scra- pie © di persone colpite dalla malattia di Creutefeldt-Jakob costituiscono da ‘molto tempo un modello per le forme infettive delle malattie da prioni. E le ‘malate da prioni ereditarie trovano un ‘modello nei topi transgenici portatori di geni mutanti per la PrP. Queste rappre- sentazioni animali delle malattie da prioni umane dovrebbero non solo per- metterci di comprendere pid a fondo in che modo i prioni causino la degenera- zione cerebrale, ma anche fornire Vop- portunita di provare terapie per queste imalattie terrbil. Da: «Le Scienze», n, 319, marzo 1995. STANLEY B. PRUSINER & professore i biochimica presso Ia School of Me- dicine dell’'Universita della California a San Francisco. Per la sua scoperta dei prioni@ stato insignito nel 1997 del pre mio Nobel per la Medicina. Le scimzr quidemin. 116 SS