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Neurologa.

2013;28(8):497502

NEUROLOGA
www.elsevier.es/neurologia

ORIGINAL

Anlisis morfolgico de la regin del hipocampo asociado a una


tarea conductual innata en el modelo de ratn transgnico
(3xTg-AD) para la enfermedad de Alzheimer
E. Orta-Salazar a , A. Feria-Velasco a , G.I. Medina-Aguirre b y S. Daz-Cintra b,

a
Centro Universitario de Ciencias Biolgicas y Agropecuarias. Universidad de Guadalajara, Zapopan, Jalisco, Mxico
b
Instituto de Neurobiologa (INB), Campus UNAM-Juriquilla, Quertaro, Mxico

Recibido el 22 de enero de 2013; aceptado el 22 de enero de 2013


Accesible en lnea el 23 de agosto de 2013

PALABRAS CLAVE Resumen


Enfermedad de Introduccin: Se han dise
nado diferentes modelos animales de la enfermedad de Alzheimer
Alzheimer; (EA) para apoyar la hiptesis de que la neurodegeneracin (prdida de neuronas, sinapsis y
Ratn transgnico; gliosis reactiva) asociada al depsito de A y tau en estos animales es similar a la del cerebro
Hipocampo; humano. Estas alteraciones producen cambios funcionales que se inician con el deterioro en la
rea CA1; habilidad para realizar actividades de la vida cotidiana, prdida de la memoria y, en general,
Neurona; trastorno neuropsiquitrico. La alteracin neuronal desempe na un papel importante en las
Morfologa etapas tempranas de la enfermedad, especialmente en el rea CA1 del hipocampo de animales
y humanos.
Mtodos: Se utilizaron ratones WT y 3xTg-AD hembras de 11 meses de edad, para el anlisis
conductual (construccin del nido) e histolgico en la regin CA1 del hipocampo dorsal.
Resultados: Los ratones 3xTg-AD mostraron deciencia del 50% en la calidad de construccin
del nido asociado a un aumento del 26 6% (p < 0,05) de neuronas da nadas en comparacin con
el grupo WT.
Conclusiones: El deterioro de la capacidad para llevar a cabo las actividades de la vida diaria
(en el hombre) y la construccin del nido (en el ratn 3xTg-AD) estn relacionados con las
alteraciones en los circuitos nerviosos observados en la EA. Estas alteraciones son controladas
por el hipocampo que en el anlisis post mortem (en el humano), as como en la regin CA1 (en
el modelo de ratn 3xTg-AD) se han relacionado con alteraciones en el depsito de las protenas
A y tau que comienzan a acumularse al inicio de la EA.
2013 Sociedad Espaola de Neurologa. Publicado por Elsevier Espaa, S.L. Todos los derechos
reservados.

Autor para correspondencia.


Correos electrnicos: yoldi@servidor.unam.mx, soayolandadiaz@yahoo.com (S. Daz-Cintra).

0213-4853/$ see front matter 2013 Sociedad Espaola de Neurologa. Publicado por Elsevier Espaa, S.L. Todos los derechos reservados.
doi:10.1016/j.nrl.2013.01.014
498 E. Orta-Salazar et al

KEYWORDS Morphological analysis of the hippocampal region associated with an innate


Alzheimer disease; behaviour task in the transgenic mouse model (3xTg-AD) for Alzheimer disease
Transgenic mouse;
Hippocampus; Abstract
CA1 area; Introduction: Different animal models for Alzheimer disease (AD) have been designed to sup-
Neuron; port the hypothesis that the neurodegeneration (loss of neurons and synapses with reactive
Morphology gliosis) associated with A and tau deposition in these models is similar to that in the human
brain. These alterations produce functional changes beginning with decreased ability to carry
out daily and social life activities, memory loss, and neuropsychiatric disorders in general. Neu-
ronal alteration plays an important role in early stages of the disease, especially in the CA1
area of hippocampus in both human and animal models.
Methods: Two groups (WT and 3xTg-AD) of 11-month-old female mice were used in a beha-
vioural analysis (nest building) and a morphometric analysis of the CA1 region of the dorsal
hippocampus.
Results: The 3xTg-AD mice showed a 50% reduction in nest quality associated with a signicant
increase in damaged neurons in the CA1 hippocampal area (26% 6%, P < .05) compared to the
WT group.
Conclusions: The decreased ability to carry out activities of daily living (humans) or nest buil-
ding (3xTg-AD mice) is related to the neuronal alterations observed in AD. These alterations are
controlled by the hippocampus. Post-mortem analyses of the human hippocampus, and the CA1
region in 3xTg-AD mice, show that these areas are associated with alterations in the deposition
of A and tau proteins, which start accumulating in the early stages of AD.
2013 Sociedad Espaola de Neurologa. Published by Elsevier Espaa, S.L. All rights reserved.

Introduccin y la construccin del nido, ambas conductas reguladas por


el hipocampo, rea en donde se inicia la alteracin neuro-
A nales del siglo xix se iniciaron los estudios de nal en la EA. Esto permite que los modelos animales sean
las alteraciones neuronales en diferentes enfermedades una ayuda para una mejor aproximacin en el conocimiento
neurodegenerativas1 . A mediados de los a nos cincuenta del desarrollo de la enfermedad y por ello se han elaborado
se inicia el estudio topogrco post mortem de estas diversos modelos transgnicos en el ratn13 . As, su manipu-
alteraciones en la enfermedad de Alzheimer (EA)2 , que se lacin gentica es una estrategia para investigar la funcin
caracterizan por la atroa cerebral difusa, la dilatacin de las protenas humanas mutadas, como la precursora ami-
de los ventrculos y el aumento en la profundidad de los loide o APP, la presenilina (PSEN), la apolipoprotena E y la
surcos, as como disminucin del peso y volumen cere- protena tau, que se sobreexpresan en estos ratones y que
bral asociados con la disminucin neuronal35 . La atroa de forman las PN y las MNF14,15 .
las neuronas afecta principalmente a las cortezas entorri- El modelo del ratn triple transgnico (3xTg-AD) se
nal, temporal y frontal, as como a la regin CA1 del gener en el laboratorio de LaFerla, por Oddo en 2003,
hipocampo68 . En estas reas se inicia la formacin de las microinyectando simultneamente 2 genes (APP y tau) en
placas neurticas (PN) por la beta amiloide (A, por sus siglas una sola celda a embriones de ratn PS1M146 v (transgnico
en ingls) y de las mara nas neurobrilares (MNF) que pro- que sobreexpresa APP humana o tipo wild-type [WT], a su
bablemente conllevan a la alteracin neuronal, por lo que vez generado de un hbrido de 129/C57BL6). As, el 3xTg-AD
se ha elegido determinar y correlacionar la muerte neuronal expresa la APPSWE , MAPT301L y es Knock-in para PSEN1 M146L
con la evolucin cronolgica de la demencia9 . Los estudios (PSEN1-KI)1618 . Estos ratones muestran depsitos de A
de la relacin entre memoria y A en ratones transgnicos dependiente de la edad en regiones cerebrales especcas,
que expresan la protena precursora de amiloide (APP) y as como dcit cognitivo relacionado con A intraneuronal,
sus variantes sugieren que el envejecimiento promueve la por lo que es un modelo que permite investigar el desarrollo
formacin de mediadores solubles de A, que es un pp- y el tratamiento de la neurodegeneracin en la EA13 . Ade-
tido heterogneo con residuos carboxilo terminales (Val40 ms, permite hacer conclusiones sobre el depsito de A en
[Ax-40], Ala42 [Ax-42], o Thr43 [Ax-43]], siendo el dep- el cerebro y cmo este precede a la enfermedad en que la
sito de Ax-42 y Ax-43 el que ocurre tempranamente en protena tau est involucrada (en el modelo animal). Se ha
el desarrollo de la afeccin y con efectos negativos sobre demostrado tambin que el acmulo intraneuronal de Ax-
la memoria10 . En el humano, en las ltimas dcadas se ha 42 se asocia a la deciencia sinptica temprana en el ratn
requerido de una mejor calidad para el diagnstico tem- APPP/PS1Ki19 , en las reas cerebrales relacionadas con la
prano porque, adems de las deciencias en la memoria, hay memoria como son la corteza de asociacin, el sistema lm-
un deterioro neuropsiquitrico que incluye alteraciones en bico y de manera importante el hipocampo, se encuentran
la vida social relacionadas con alteraciones en la actividad niveles elevados del mARN del APP de 13-16 meses de edad y
sinptica11 y con la habilidad para llevar a cabo activida- los niveles de A se elevan desde la edad de 6 meses. Actual-
des de la vida cotidiana. Segn Deacon12 , en los animales de mente, no hay reportes sobre el anlisis de una conducta
laboratorio se puede hacer la analoga con esta enfermedad, innata y el anlisis morfolgico en la regin del hipocampo
considerando sus hbitos naturales como el amadrigamiento dorsal en este modelo de ratn triple transgnico (3xTg-AD)
Anlisis morfolgico de la regin del hipocampo asociado a una tarea conductual innata 499

de la EA, por lo que el presente trabajo consisti en estable- tarde hasta la ma nana siguiente (8:00 a.m.) y consisti en
cer una relacin entre la conducta de nidacin (natural en colocar un cuadro de algodn prensado de 5 cm de lado en la
el roedor) y la alteracin anatomofuncional del hipocampo caja habitacin, una hora antes del ciclo de luz (7:00 p.m.)
para con ello contribuir al conocimiento ms amplio de algu- o de reposo. Se tomaron imgenes 15 min antes de la fase
nos procesos de da no y muerte neuronal observados en esta de actividad, en las que se evalu la construccin del nido y
enfermedad. el criterio utilizado fue de solo 3 categoras de las 5 descri-
tas por Deacon20 : a) si el algodn permaneci en gran parte
intacto (> 90% desmenuzado); b) si la mayora del algodn
Metodologa fue desmenuzada (< 90%) con o sin nidacin identicable (si
hay nidacin, esta es plana); y c) si el nido estaba hecho casi
Sujetos perfecto: > 90% del algodn desmenuzado, en forma de un
crter y con las paredes superiores a la altura corporal del
El protocolo dise
nado para este trabajo se realiz conforme ratn (acurrucado) en ms de un 50% de la circunferencia
a las normas internacionales para el manejo y uso de ani- (g. 1).
males de experimentacin establecidas por los National
Institutes of Health (NIH) y la National Academy of Science, Anlisis morfomtrico
y fue presentado y aprobado por el Comit de Biotica del
Instituto de Neurobiologa (INB) de la Universidad Nacional Seis hembras WT y 6 3xTg-AD, aleatoriamente escogidas
Autnoma de Mxico. Los ratones que se utilizaron como de los 20 animales empleados para el estudio conductual,
control fueron hbridos de la cepa 129/C57BL/6 y el ratn fueron anestesiadas i.p. con una dosis de pentobarbital
3xTg-AD de la misma cepa; ambos se mantuvieron en el bio- (300 g/kg de peso corporal) y con perfusin intracardiaca
terio del INB en cajas de policarbonato (12 12 25 cm) de paraformaldehdo al 4% en solucin amortiguadora de fos-
conectadas a racks de aire lavado y en cuartos con condicio- fatos (PBS, pH 7,4, 0,1 M) y 1.000 U de heparina y procana al
nes controladas de temperatura (22 C) y humedad ambiental 0,1%. Los cerebros fueron extrados del crneo y posjados
relativa del 50%,con un ciclo de luz/oscuridad de 12/12 h, por 24 h en paraformaldehdo al 4% en PBS a temperatura
inicindose a las 8:00 a.m., con agua y alimento ad libi- ambiente. Se realizaron cortes sagitales seriados de 50 m
tum con una dieta para ratn del laboratorio Purina Chow de espesor en un vibrtomo (sistema de seccionado de teji-
(Formula 5001). dos modelo 3000; Pelco International). Ambos hemisferios
Para el estudio se utilizaron solo ratones hembra de fueron utilizados para los estudios morfolgicos y te nidos
11 meses de edad, obtenidos de las cruzas de las unidades con la tcnica convencional de Klver-Barrera para visua-
reproductivas originales, destetados a los 30 das de edad, lizar la morfologa neuronal y las bras mielinizadas en la
y los 3xTg-AD, que son homocigotos para la EA, poseen los regin CA1 del hipocampo, Bregma 1,922,28 mm lateral21 .
3 genes (APPSwe y tauP301L y PS1M146V knock-in) comparados Para el anlisis morfomtrico se contaron las neuronas
con los ratones no transgnicos (129C57BL/6) o WT, alo- del rea CA1 del hipocampo en su totalidad, que corres-
jados 3 por caja desde el destete hasta el momento del pondi a un rea de 262,5 125 m, con el empleo de un
experimento. microscopio ptico NIKON modelo Eclipse 50i equipado con
una cmara DS-U2 S. Para la cuanticacin tanto de clu-
Genotipicacin del ratn 3xTg-AD las con caractersticas normales como con caractersticas de
dano neuronal fue empleado el programa Q-Win y se utiliz
Se realiz la extraccin de ADN del segmento ms caudal un sofware ImageJ (NIH, EE. UU.).
de la cola (aproximadamente 0,3 cm de largo) del ratn Se contaron las neuronas en estas imgenes y se expresa-
3xTg-AD, que fue colocado en tubos eppendorf de 1,5 ml con ron como nmero de neuronas por rea determinada (m).
500 l de 0,05 M NaOH; los fragmentos se incubaron a 95 C Las neuronas fueron cuanticadas de aspecto normal y las
por 15 min; despus se a nadieron 50 l de solucin stock identicadas con aspecto de da no (hipercromatismo cito-
(1 M Tris, 10 mM EDTA, pH 8); se realiz una reaccin en la plasmtico, encogimiento celular y fragmentacin nuclear).
cadena de la polimerasa (PCR) para comprobar la presencia
de los genes de la PPA (PPA) y de la protena tau, as como
del gen de la presenilina 1 (PS1PSEN1). La genotipicacin Resultados
se llev a cabo en 2 reacciones; primero se amplicaron
2 productos de PCR con oligoespeccos para PPA y tau, de Anlisis cualitativo de la conducta de construccin
500 pb y 350 pb, respectivamente, y se visualizaron en un del nido
gel de agarosa al 1%, y en una segunda reaccin, se amplic
un producto de PCR de 530 pb y se llev a cabo una diges- Las hembras control o WT de 11 meses de edad, 6 de las 10,
tin 2 h a 37 C de este producto con la enzima BstEII y que construyeron el nido segn el criterio 3, lo que represent el
gener 2 fragmentos de 180 pb y 350 pb. 60% de la capacidad para construir un nido de buena calidad
y solo una hembra lo construy de pobre calidad (10%); en los
Estudio conductual animales 3xTg-AD, fueron 5 las que lo construyeron de pobre
calidad (etapa 2), lo que represent el 50%, y solo 2 (20%) lo
Se midi la prueba conductual de construccin del nido en hicieron bien, o sea la etapa 3. En ambos grupos experimen-
10 ratones hembra WT y 10 transgnicos (3xTg-AD), de 11 tales, 3 hembras no construyeron nido, lo que representa el
meses de edad. La prueba se ejecut desde el nal de la 30% (g. 1). De estos 20 animales, se escogieron de manera
500 E. Orta-Salazar et al

1 2 3

3/10 1/10 6/10


WT

3/10 5/10 2/10


3xTg-AD

Figura 1 Ejemplos de la construccin del nido por ratones hembra de 11 meses de edad en los 2 grupos estudiados wild type (WT)
y transgnicos (3xTg-AD). Se observa que los WT tuvieron mejor calidad en la construccin del nido en relacin con los 3xTg-AD. En
cada panel, se indica el nmero de animales que realizaron cada nivel de la prueba.

aleatoria, 12 que fueron los que se consideraron para el estu- la diferencia se encontr en la calidad de construccin, que
dio morfomtrico comparativo del rea CA1 del hipocampo fue del 60% en los WT, lo que indica que su hipocampo se
dorsal. encuentra sin alteracin tisular, ya que es una buena prueba
para la evaluacin del bienestar animal. Por el contrario,
Anlisis morfolgico de las neuronas piramidales de en el animal transgnico, solo el 20% de los animales cons-
la regin CA1 del hipocampo truy bien el nido y el 50% lo hizo mal, indicando que existe
desconexin y prdida neuronal asociadas a la aparicin de
estas protenas, e incluso la formacin de las placas entre el
Para determinar la proporcin de clulas normales y con
CA1 y el subiculum, y conforme avanza la enfermedad, esta
caractersticas de da no en la regin CA1 del hipocampo,
regin cerebral es una de las ms afectadas22 .
fueron cuanticadas el nmero de neuronas de ambas
En el estudio no encontramos cambios signicativos en
caractersticas en el grupo experimental (3xTg-AD) y en
el nmero de clulas normales, lo que coincide con datos
el grupo WT. Se encontr un mayor nmero de neuronas
reportados en otras afecciones, como la enfermedad de
con caractersticas de da no en el ratn 3xTg-AD. Utilizando
Huntington23 . Por el contrario, en el rea CA1 del este ratn
ANOVA de una va se encontr una diferencia signicativa
(3xTg-AD) encontramos que no solo se aument la densidad
(F1,430 = 56,074, p < 0,0001), con un aumento de 26 6% en
de clulas anormales, sino, adems, observamos diversos
clulas anormales en el grupo 3xTg-AD en comparacin con
estadios degenerativos neuronales como fueron signos cla-
el grupo WT, como se muestra en la gura 2.
ros de picnosis, condensacin y acmulo intracelular de A y
tau en esta edad (resultados en proceso). Esas alteraciones
se han comunicado tambin en esta regin CA1 del hipo-
Discusin campo post mortem del humano en etapas avanzadas de la
EA6,7,24,25 . Las caractersticas especcas de la EA se asocian
Los resultados indican una relacin entre la deciencia de a la presencia de PN y MNF, que se encuentran de manera
la conducta natural de construir nido (regulada por el hipo- predominante en esta regin cerebral23 . Adems, nuestros
campo) asociada a la alteracin neuronal del campo CA1 en resultados son consistentes con lo encontrado en el modelo
el hipocampo dorsal de las hembras 3xTg-AD de 11 meses de de ratn transgnico PSAPP, en donde se observ disfun-
edad con la afeccin desarrollada. Esta relacin es impor- cin de neuronas en la regin CA1 del hipocampo26 y un 14%
tante ya que el proceso de da no y muerte neuronal tiene de disminucin neuronal fue reportado en el modelo APP23,
su origen en esta importante rea que regula la memoria asociado con la presencia de placas neurticas de A26,27 .
de tipo espacial. Asimismo, se podra hacer una analoga de Esta disfuncin neuronal y la muerte celular desempe nan
la conducta alterada en el humano para llevar al cabo los un papel importante en las etapas tempranas e interme-
eventos de la vida cotidiana al inicio de la enfermedad. dias de la enfermedad27 . El depsito de A intraneuronal es
Es interesante que una conducta tan sencilla y natural en el origen de la cascada de eventos patolgicos que dejan
los murinos en general pueda dar informacin tan especca la neurodegeneracin en la EA, con sntomas clnicos cl-
del da no tisular que se inicia en el hipocampo y en el pri- sicos, como la prdida de la memoria y los cambios en
mer relevo que es la corteza subicular, en donde se observa la personalidad28,29 . Se ha reportado que este depsito de
a esta edad el depsito de A en forma de placas y de A precede a la formacin de las mara nas neurobrila-
la tau. Se hizo el ajuste a 3 de los 5 criterios de Deacon20 res con la prdida de neuronas hipocampales y corticales
para la evaluacin de la construccin del nido y se encontr que provoca las alteraciones neuropatolgicas, que se han
que solo 3 animales (30%) en ambos grupos (WT y 3xTg-AD) descrito en el cerebro de los pacientes con la EA, lo que
no construyeron de manera adecuada el nido; sin embargo, resulta en una disminucin del peso y el volumen cerebral5 .
Anlisis morfolgico de la regin del hipocampo asociado a una tarea conductual innata 501

Clulas con caractersticas morfolgicas normales


5000
Control 3xTg-AD 4500
CA 4000
CA
1 3500
1 CA
4x CA 3000
3 3
2500
GD GD 2000
1500

No. Neuronas/0.1mm2
1000
500
0
20 x SP SP

Clulas con caractersticas de dao


500

400

100 x 300

200

100

Figura 2 Cortes sagitales representativos del rea CA1 del hipocampo te nido con la tcnica de Klver Barrera de hembras de 11
meses de edad. Las barras en cada gura representan 1.000, 100 y 25 m en fotomicrografas tomadas con los objetivos de 4, 20 y
100X, respectivamente. Las echas azules indican neuronas con caractersticas de da
no en el stratum pyramidale (sp) del rea CA1
del hipocampo; giro dentado (GD) y del rea CA3. Las grcas muestran un incremento signicativo en la densidad de las clulas
anormales en el ratn 3xTg-AD. Las echas blancas muestran neuronas piramidales normales en ambos grupos. Las grcas expresan
el nmero de neuronas con aspecto normal (grca superior) y neuronas con caractersticas de da no (grca inferior), calculadas
en un rea de 0,01 mm2 en ambos grupos de ratones estudiados (WT y 3XTg-AD). Las cifras corresponden al promedio EEM. *
p < 0,0001.

Esta prdida neuronal tiene su origen en la alteracin Financiacin


sinptica11 y se correlaciona con la disfuncin cognitiva pro-
gresiva, lo que se asocia a que el nmero de neuronas Este trabajo fue nanciado parcialmente por el CONACYT
reducido determina la capacidad funcional de estructuras (Beca No. 295523; proyecto No. CB-2012/178841) y la UNAM-
cerebrales como el hipocampo29 . DGAPA (IN201613).
En un estudio realizado por Spires et al., en el 20064 ,
muestran una disminucin neuronal en esta rea hipocam-
pal en un modelo de ratn para taupata, lo que ha permitido Conicto de intereses
una correlacin del da no neuronal que se inicia intra-
celularmente y contina de manera progresiva con estas Los autores declaran que no existe ningn conicto de
caractersticas especcas de la EA24 . Se ha comunicado en inters.
otros trabajos que ocurre una prdida neuronal del 25 al
70% en diferentes reas del hipocampo por la EA30,31 , pero
de forma especial en el rea CA1 con una disminucin neuro- Agradecimientos
nal signicativa en cerebros de pacientes con esta afeccin
en comparacin con cerebros normales21,3033 . Los autores desean agradecer a la Unidad de Proteogenmica
As, en este modelo de ratn 3 xTg AD, hemos encontrado del INB y a los tcnicos acadmicos A. Aguilar Vzquez y M.
que las hembras con la enfermedad tienen un deterioro en Servn Garca por su ayuda con el cuidado de los animales.
la manifestacin conductual de construccin del nido, aso-
ciada a la alteracin neuronal del hipocampo, estructura
que regula la memoria de tipo espacial y que es, ade- Bibliografa
ms, una conducta natural, comparado con el animal WT
que no presenta esta alteracin. Adems, hay una rela- 1. Thompson H. The total number of functional cells in the cere-
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