KIMIA ANALISIS DASAR

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

KELOMPOK 5 :
Amalia Rahmah (061540421594)
Darnia Anita (061540421596)
Marlisa (061540421605)
Trisna Dewi (061540421612)

Dosen Pembimbing : Dr. Ir Rusdiana Sari M. Si

POLITEKNIK NEGERI
SRIWIJAYA TAHUN AKADEMIK
2015/2016
 DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR....... ii
BAB I PENDAHULUAN..1
1.1 LATAR BELAKANG .... 1
1.2 RUMUSAN MASALAH........ 1
1.3 TUJUAN..... 1
BAB II DASAR TEORI....... 2
2.1 PENGERTIAN HPCL ...... 2
2.2 PRINSIP KERJA HPLC. 2
2.3 JENIS HPLC...... 4
2.4 DERIVATISASI HPLC..... 5
BAB III INSTRUMENTASI ...... 8
3.1 WADAH FASE GERAK (RESEVOIR) .. 8
3.2 POMPA ............. 9
3.3 TEMPAT INJEKSI 10
3.4 KOLOM............. 11
3.5 DETEKTOR........ 12
BAB IV APLIKASI...... 15
4.1 APLIKASI HPLC DALAM KEHIDUPAN....... 15
4.2 KEUNGGULAN DAN KEKURANGAN HPLC...... 20
BAB V PENUTUP....... 21
5.1 KESIMPULAN... 21
DAFTAR PUSTAKA....... 22
 BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Kromatografi adalah istilah umum untuk berbagai cara pemisahan berdasarkan partisi
cuplikan antara fasa yang bergerak, dapat berupa gas atau zat cair, dan fasa diam, dapat
berupa zat cair atau zat padat. Kita biasanya menganggap Tswett sebagai penemu
kromatografi, yang pada tahun 1903 menguraikan karyanya mengenai pemakaian kolom
kapur untuk memisahkan pigmen dalam daun. Istilah kromatografi dipakai oleh Tswett
untuk menggambarkan daerah berwarna yang bergerak ke bagian bawah kolom
Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan unsur-unsur yang akan dipisahkan
terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasa-fasa ini membentuk suatu lapisan stasioner
dengan luas permukaan yang besar dan yang lainnya merupakan cairan yang merembes lewat
atau melalui fase yang stasioner. Fasa stasioner mugkin suatu zat padat atau suatu cairan, dan
fasa yang bergerak mungkin suatu cairan atau suatu gas. Maka semua jenis kromatografi
yang dikenal, terbagi menjadi empat golongan: cair-padat, gas-padat, cair-cair, dan gas-cair.
Pembahasan teknik kromatografi modern, baru lengkap bila disebut kromatografi
cairan kinerja tinggi (HPLC). Kromatografi cairan kolom klasik merupakan prosedur
pemisahan yang sudah mapan dalam mana fase cair yang mobil mengalir lambat-lambat
lewat kolom karena gravitasi. Umumnya metode itu dicirikan oleh efisiensi kolom yang
rendah dan waktu pemisahan yang lama. Namun sejak kira-kira tahun 1969, perhatian dalam
teknik kolom cairan hidup kembali dengan sangat menyolok karena dikembangkannya sistem
tekanan tinggi oleh Kirchland dan Huber, yang bekerja pada tekanan sampai 2,07 x 107 Nm-2
(3000 p.s.i). Dalam metode ini digunakan kolom berdiameter kecil (1-3 mm) dan eluen
dipompakan ke dalamnya dengan laju alir yang tinggi (sekitar 1-5 cm 3m-1). Pemisahan
dengan metode ini dilakukan jauh lebih cepat (sekitar 100 kali lebih cepat) daripada dengan
kromatografi cairan yang biasa. Meskipun peralatan yang tersedia di pasar dewasa ini agak
mahal, HPLC telah terbukti luas penggunaannya dalam kimia organik

1.2 Rumusan Masalah

1. Pengertian HPLC
2. Jenis- jenis HPLC
3. Instrument HPLC
4. Prinsip kerja HPLC
5. Aplikasi HPLC
6. Manfaat Penggunaan HPLC
7. Kelebihan dan Kekurangan HPL

1.3 Tujuan
1. Mengetahui Pengertian dan Jenis-Jenis HPLC
2. Mengetahui Instrument dan prinsip kerja HPLC
3. Mengetahui Aplikasi dan Manfaat Penggunaan HPLC
4. Mengetahui Kelebihan dan Kekurangan HPLC
 BAB II
DASAR TEORI

2.1 Pengertian HPLC

Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut dengan High
Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan metode yang tidak destruktif dan
dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. HPLC secara mendasar
merupakan sebuah perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut
yang menetes melalui kolom di bawah pengaruh gravitasi, HPLC didukung oleh pompa yang
dapat memberikan tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Hal ini membuat HPLC dapat
memisahkan komponen sampel lebih cepat. Saat ini, HPLC merupakan teknik pemisahan
yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel
dalam berbagai bidang, antara lain : farmasi, lingkungan, bioteknologi, polimer, dan industri-
industri makanan. Beberapa perkembangan HPLC terbaru antara lain : miniaturisasi sistem
HPLC, penggunaan HPLC untuk analisis asam-asam nukleat, analisis protein, analisis
karbohidrat, dan analisis senyawa-senyawa kiral.
Secara umum KCKT digunakan dalam kondisi-kondisi berikut:
1. Pemisahan berbagai senyawa organik maupun anorganik, ataupun spesimen biologis

2. Analisis ketidakmurnian (impurities)

3. Analisis senyawa-senyawa yang tak mudah menguap (non-volatil)

4. Penentuan molekul-molekul netral, ionik maupun zwitter ion

5. Isolasi dan pemurnian senyawa

6. Pemisahan senyawa-senyawa dengan struktur kimia yang mirip

7. Pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah kecil (trace elements)

2.2 Prinsip kerja HPLC

Mula-mula solven diambil melalui pompa. Solven ini dikemudian masuk ke dalam
katup injeksi berbutar, yang dipasang tepat pada sampel loop. Dengan pertolongan
mikrosiring, sampel dimasukan ke dalam sampel loop yang kemudian bersama-sama dengan
solven masuk ke dalam kolom. Hasil pemisahan dideteksi oleh detector, yang
penampakannya ditunjukan oleh perekam (pencatat = recorder). Tekanan solven di atur
dengan pengatur dan pengukur tekanan. Pompa pemasuk solven pada tekanan konstan hingga
tekanan kurang lebih 4500 psi dengan laju alir rendah, yakni beberapa milliliter per menit.
Rekorder menghasilkan kromatogram zat-zat yang dipisahkan dari suatu sampel. Tahap
pemekatan dengan ekstraksi solven dan penguapan untuk memperkecil volum sering kali
diperlukan sebelum pengerjaan sampel dengan HPLC. Hal ini terutama sering dilakukan
untuk analisis senyawa-senyawa hidrokarbon aromatic polisiklik (PAH) atau residu pestisida
dalam makanan.
Sebagai alternative lain, sampel air dapat di absorpsi oleh suatu adsorben padat (C8
atau C18 yang terikat pada silica gel), diikuti dengan desorpsi dalam suatu solven yang
kemudian langsung dimasukan kedalam kolom. Suatu solven dengan polaritas rendah,
misalnya CH3 berair yang secara bertingkat mengalami perubahan menjadi CH3OH murni,
menjamin pemisahan yang baik pada C-18 yang terikat pada silica gel.
Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan
kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai fasa
geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC
digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran analit akan terpisah
berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannya untuk sampai ke detektor (waktu retensinya)
akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya terpisah.
Urutan skala polaritas : golongan fluorocarbon < golongan hidrokarbon < senyawa
terhalogenasi < golongan eter < golongan ester < golongan keton < golongan alkohol <
golongan asam.
 HPLC dapat menganalisa secara kualitatif dan kuantitatif. Pada proses kualitatif cara
yang paling umum untuk mengidentifikasi adalah dengan melihat Retention time (RT). Peak
yang mempunyai RT yang sama dengan standard umumnya adalah sebagai peak milik analat.
Selain melihat RT hal lain yang perlu dilihat adalah spektrum 3D dari signal kromatogram.
Zat yang sama akan mempunyai spektrum 3D yang juga sama. Sehingga jika spektrum 3D
antara dua zat berbeda, maka kedua zat tersebut juga dipastikan adalah zat yang berlainan,
meskipun memiliki RT yang sama.
Kemudian melalui analisa kuantitatif dapat diketahui kadar komponen yang dianalisis
di dalam sampel. Yang berperan dalam proses separasi pada system HPLC adalah kolom.
Ada kolom yang digunakan untuk beberapa jenis analisa, misalnya kolom C18 yang dapat
digunakan untuk analisa carotenoid, protein, lovastatin, dan sebagainya. Namun ada juga
kolom yang khusus dibuat untuk tujuan analisa tertentu, seperti kolom Zorbax carbohydrat
(Agilent) yang khusus digunakan untuk analisa karbohidrat (mono-, di-, polysakarida).
Keberhasilan proses separasi sangat dipengaruhi oleh pemilihan jenis kolom dan juga fasa
mobil.
Setelah komponen dalam sample berhasil dipisahkan, tahap selanjutnya adalah proses
identifikasi. Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram. Dalam
kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis komponen
dalam sample.

Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai

kromatogram dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk (overlap).
Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi. Oleh karena itu
biasanya untuk sample jenis ini dilakukan tahapan preparasi sample yang lebih rumit agar
sample yang siap diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih dari impuritis. Sample farmasi
biasanya jauh lebih mudah karena sedikit mengandung komponen selain zat aktif. Sample ini
umumnya hanya melalui proses pelarutan saja.

2.3 Jenis- Jenis HPLC

Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya
lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non
polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali
HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik. Selain klasifikasi
di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau
berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:

1. Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom
dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan
fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian
sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan
alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada
 silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat
sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor.

2. Kromatografi fase terikat (Kromatografi Partisi)

Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi
atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah
hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau
dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau
C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik. Sebagai fase gerak adalah
campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang
bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase
gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya
spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih
lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies
yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.

3. Kromatografi penukar ion

HPLC penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion
dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun
demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin. Kebanyakan
pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat
ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan
juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak
dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak.
Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan
oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus
penukar ion pada resin.

4. Kromatografi Pasangan ion

Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik
dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik
ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.

5. Kromatografi Eksklusi Ukuran

Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan
untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton. Fase
diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut
dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul
solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu,
kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh
lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan
tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan
eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe
kromatografi yang lain.
6. Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat
spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap
sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada
sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi).
Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran
yang sangat kompleks.

2.4 Derivatisasi Pada HPLC

Derivatisasi melibatkan suatu reaksi kimia antara suatu analit dengan suatu reagen
untuk mengubah sifat fisika-kimia suatu analit. Tujuan utama penggunaan derivatisasi
pada HPLC adalah untuk:

1. Meningkatkan deteksi

2. Merubah struktur molekul atau polaritas analit sehingga akan menghasilkan puncak
kromatografi yang lebih baik

3. Merubah matriks sehingga diperoleh pemisahan yang lebih baik

4. Menstabilkan analit yang sensitif.

Detektor yang paling banyak digunakan dalam HPLC adalah detektor UV-Vis
sehingga banyak metode yang dikembangkan untuk memasang atau menambahkan gugus
kromofor yang akan menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu. Di samping itu,
juga dikembangkan suatu metode untuk menghasilkan fluorofor (senyawa yang mamapu
berfluoresensi) sehingga dapat dideteksi dengan fluorometri.

Suatu reaksi derivatisasi harus mempunyai syarat-syarat sebagai berikut, yakni:

produk yang dihasilkan harus mampu menyerap baik sinar ultraviolet atau sinar tampak atau
dapat membentuk senyawa berfluoresen sehingga dapat dideteksi dengan spektrofluorometri;
proses derivatisasi harus cepat dan menghasilkan produk yang sebesar mungkin (100 %);
produk hasil derivatisasi harus stabil selama proses derivatisasi dan deteksi; serta sisa
pereaksi untuk derivatisasi harus tidakmenganggu pemisahan kromatografi.7)

Berbagai macam bahan penderivat telah tersedia antara lain :

Gugus Reagen untuk dapat Reagen untuk dapat
fungsional dideteksi dengan UV-Vis dideteksi dengan
Fluoresen
Asam-asam p-nitrobenzil-N,N- 4-bromometil-7-
kaboksilat; diisopropilisourea asetoksikumarin;
asam-asam (PNBDI); 3,5- 4-bromometil-7-
lemak;asam- dinitrobenzil-N,N- metoksikumarin;
asam fosfat diisopropilisourea
 (DNBDI); p-bromofenasil
bromida (PBPB)
Alkohol 3,5-dinitrobenzil klorida
(DNBC); 4-
dimetilaminiazobenzen-4-
sulfinil (Dabsyl-Cl); 1-
naftilisosianat (NIC-1).
Aldehid; keton p-nitrobenziloksiamin Dansil hidrazin
hidroklorida (PNBA); 3,5-
dinitrobenziloksiamin
hidroklorida (DNBA);
Amin primer Fluoresamin
o-ftalaldehid (OPA)
Amin primer 3,5-dinitrobenzil klorida 7-kloro-4-nitrobenzo-
(1o) dan (DNBC); N-suksinimidil- 2-oksa-1,3-diazol
sekunder (2o) p-nitrofenilasetat (SNPA); (NBD-Cl); 7-fluoro-
N-suksinimidil-3,5- 4-nitrobenzo-2-oksa-
dinitrofenilasetat 1,3-diazol (NBD-F);
(SDNPA); 4- Dansil klorida
dimetilaminiazobenzen-4-
sulfinil (Dabsyl-Cl); 1-
naftilisosianat (NIC-1).
Asam-asam 4-dimetilaminiazobenzen- Fluoresamin
amino (peptida) 4-sulfinil (Dabsil-Cl) o-ftalaldehid (OPA)
7-kloro-4-nitrobenzo-
2-oksa-1,3-diazol
(NBD-Cl); 7-fluoro-
4-nitrobenzo-2-oksa-
1,3-diazol (NBD-F);
Derivatisasi ini dapat dilakukan sebelum analit memasuki kolom (pre-column
derivatization) atau setelah analit keluar dari kolom (post-column derivatization)
 BAB III
INSTRUMENTASI

Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak (Reservoir) ,
pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung
buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam. Diagram skematik
sistem kromatografi cair dapat dilihat pada gambar di bawah ini :

3.1 Wadah fase gerak (Reservoir)

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun
labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya
dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut.
Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan deggasing
(penghilangan gas) yang ada pada fase gerak. Sebab
adanya gas dalam fase gerak akan mengganggu
detektor sehingga akan mengacaukan hasil analisis.
Fase gerak biasanya terdiri atas campuran pelarut
yang dapat bercampur yang secara keseluruhan
berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi
dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas
keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase
normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan
meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar
daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.

Fase Gerak
Fase gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pelarut.
Selain berfungsi sebagai pembawa komponen-komponen campuran campuran menuju
detector, fase gerak dapat berinteraksi dengan solut-solut. Oleh karena itu, fase gerak dalam
HPLC merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan proses pemisahan.
Secara umum ada dua tipe fase gerak:

1. Fase gerak/eluen isokratik, yaitu eluen dengan komposisi pelarut yang tidak berubah
selama percobaan kromatografi

2. Fase gerak/eluen gradien, yaitu fase gerak dengan komposisi pelarut yang berubah
selama masa kromatografi

Ada begitu banyak pilihan fase gerak yang dapat kita gunakan (pelarut/larutan) serta
kemungkinan gradiennya akan menghasilkan kesempatan untuk mengoptimalkan pemisahan-
pemisahan campuran kompleks dari segi resolusi maupun waktu. Secara normal elusi
isokratik akan lebih mudah dikerjakan daripada elusi gradien.

Seringkali campuran pelarut merupakan fase gerak yang lebih baik daripada cairan
murni, namun pekerjaan optimasi berbagai komposisi pelarut untuk fase gerak secara coba-
coba tentu tidak mudah dilakukan.
Persyaratan fase gerak HPLC:
1. Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan dianalisis.
2. Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat
mengganggu interpretasi kromatografi.
3. Zat air harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom.
4. Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak beracun.
5. Zat air tidak kental. Umumnya kekentalan tidak melebihi 0,5 cP (centi Poise).
6. Sesuai dengan detector.

Jenis HPLC berdasarkan kepolaran fase diam dan fase gerak:

a. HPLC fase normal: HPLC dengan kombinasi antara fase diam polar dan fase gerak non-
polar. Fase diam yang digunakan seperti silica, alumina, atau trietilenaglikol yang
dilapiskan pada partikel silica. Sedangkan fase gerak yang digunakan adalah heksana
atau i-propileter.
b. HPLC fase terbalik: HPLC dengan kombinasi antara fase diam non-polar dan fase gerak
polar. Fase gerak yang digunakan seperti air, methanol, atau asetinitril. Fase gerak yang
baik memberikan factor kapasitas k pada rentang yang sesuai. Untuk cuplikan dengan
2-3 komponen, sebaiknya menggunakan fase gerak yang memberikan k antara 2-5

3.2 Pompa
 Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai
syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni:
pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang
umum dipakai untuk pompa adalah gelas,
baja tahan karat, Teflon, dan batu
nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya
mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi
dan mampu mengalirkan fase gerak dengan
kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan
preparatif, pompa yang digunakan harus
mampu mengalirkan fase gerak dengan
kecepatan 20 mL/menit.
Tujuan penggunaan pompa atau sistem
penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung
secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa
dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak
yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum
dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.
Tiga jenis pompa yang digunakan dalam HPLC:
a. Pompa reciprocating
Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara gerakan
piston mundur-maju yang dijalankan oleh motor. Piston berupa gelas dan berkontak
langsung dengan pelarut. Ketika piston mundur maka bola gelas bawah terangkat dan
pelarut masuk, sebaliknya ketika piston maju maka bola bawah menutup saluran pelarut
dan pelarut yang telah berada di ruang pompa didorong masuk ke dalam kolom.
b. Pompa displacement
Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang dilengkapi pendorong
yang digerakkan oleh motor. Pompa ini juga menghasilkan aliran yang cenderung tidak
bergantung pada tekanan balik kolom dan viskositas pelarut.
c. Pompa pneumatic
Dalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi. Pompa jenis ini murah dan
bebas pulsa. Akan tetapi mempunya keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan
(<2000 psi) serta kecepatan alir bergantung pada viskositas pelarut dan takanan balik
kolom.

3.3 Tempat Injeksi

Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom,
harus dengan disturbansi yang minimum dari material
kolom. Sampel yang akan dipisahkan dimasukkan ke
dalam kolom secara otomatis atau manual melalui injeksi. Volume injeksi
sangat tepat karena mempunyai sampel loop dengan
variabel volume (misalnya 20 500 L).
Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan :
a. Stop-Flow
 Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup, dan aliran
dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil clan
resolusi tidak dipengaruhi

b. Septum
Septum yang digunakan pada HPLC sama dengan yang digunakan pada Kromtografi Gas.
Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60-70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak
tahan dengan semua pelarut-pelarut Kromatografi Cair. Partikel kecil dari septum yang
terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.

c. Loop Valve
Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar dari 10
dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume
yang lebih kecil dapat diinjeksifan secara manual). Pada posisi LOAD, sampel diisi
kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila VALVE difungsikan, maka sampel akan masuk
ke dalam kolom. Berikut digambarkan sampel injektor pada HPLC yaitu:

Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang
mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari
tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop)
internal atau eksternal.

Posisi pada saat memuat sampel Posisi pada saat menyuntik sampel
Syarat- syarat injektor yang baik :
Dapat memasukkan sampel ke dalam kolom dalam bentuk sesempit mungkin
Mudah digunakan
Keberulangan tinggi
Dapat bekerja walaupun ada tekanan balik

3.4 Kolom
Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom
konvensional dan kolom mikrobor. Kolom merupakan
bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk
berlangsungnya proses pemisahan solut/analit. Kolom
mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan
kolom konvensional, yakni:
a. Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan
kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat
(10 -100 l/menit).
b. Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika
digabung dengan spektrometer massa.
c. Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom
ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis. Meskipun
demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom konvensional dan
kurang bermanfaat untuk analisis rutin.

Fase Diam
Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi,
silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan
silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH). Silika dapat
dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-
reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus
fungsional yang lain.
Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan
karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang,
maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang
polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika
yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang
bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan.

3.5 Detektor
Detektor merupakan bagian integral dari peralatan analitik kromatografi cair ini.
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang
mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif)
seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang
 spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara
spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor
fluoresensi, dan elektrokimia.

a. Detektor Spektrofotometri/UV-Vis
Deteksi spektrofotometri umumnya hanya dalam
daerah ultraviolet. Idealnya, spektrofometri yang
nyata dengan pemilihan panjang gelombang yang
sempurna akan memberikan fleksibilitas yang
maksimal untuk mendeteksi berbagai macam zat
terlarut dengan sensitivitas yang sangat baik.
b. Detektor fluoresensi
Merupakan detektor yang didasarkan atas fluoresens.
c. Detektor elektrokimia
Lazimnya, larutan efluen dari dalam kolom memasuki sebuah sel dimana larutan tersebut
mengalir diatas permukaan sebuah elektroda yang diberi potensial pada satu harga,
dimana komponen-komponen sampel mengalami reaksi transfer elektron.

Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:

a. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel
b. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang
sangat kecil
c. Stabil dalam pengopersiannya
d. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita
e. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas
(kisaran dinamis linier)
f. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak

Karakteristik detector HPLC:

Dasar Jenis Maksimum Peka terhadap Sensitivitas
Pendeteksian sensitifitas kecepatan alir suhu
Absorbsi UV Spesifik 2 x 10-16 Tidak Rendah
Absorbsi IR Spesifik 10-6 Tidak Rendah
Flourometri Spesifik 10-11 Tidak Rendah
Indek bias Umum 1 x 10-7 Tidak + 10-4 0 C
Konduktometri Spesifik 10-8 Ya 2% 0C
Spektometri Umum 10-10 Tidak Tidak ada
massa
elektrokimia Spesifik 10-12 Ya 1,5% 0C

Beberapa detektor yang paling sering digunakan pada HPLC dengan karakteristik detektor
seperti berikut :

Sensitifita Kisaran
Detektor Karakteristik
s (g/ml) linier
Absorbansi Uv-vis
Fotometer filter 5 x 10-10 104 Sensitivitas bagus, paling sering
Spektrofotometer 5 x 10-10 105 digunakan, selektif terhadap gugus-
spektrometer photo- > 2 x 10-10 105 gugus dan struktur-struktur yang tidak
diode array jenuh.
Fluoresensi 10-12 104 Sensitifitas sangat bagus, selektif,
Tidak peka terhadap perubahan suhu
dan kecepatan alir fase gerak.
Indeks bias 5 x 10-7 104 Hampir bersifat universal akan tetapi
sensitivitasnya sedang. Sangat sensitif
terhadap suhu, dan tidak dapat
digunakan pada elusi bergradien
Elektrokimia
Konduktimetri 10-8 104 Peka terhadap perubahan suhu dan
Amperometri 10-12 105 kecepatan alir fase gerak, tidak dapat
digunakan pada elusi bergradien.
Hanya mendeteksi solut-solut ionik.
Sensitifitas sangat bagus, selektif tetapi
timbul masalah dengan adanya
kontaminasi elektroda
 BAB IV

APLIKASI HPLC

4.1 Aplikasi HPLC Dalam Kehidupan

Beberapa aplikasi HPLC dalam kehidupan :

HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi dan
pestisida.
Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat
dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.
Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan
dengan kolom butiran berlapis zat berpori
Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-SAX
Dapat memisahkan vitamin-vitamin yang larut dalam air.
Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia.
Kromatografi cairan kinerja tinggi (KCKT/HPLC) digunakan untuk memisahkan
golongan-golongan takatsiri, misalnya terpenoid tiggi, segala jenis senyawa fenol,
alkaloid, lipid dan gula.
HPLC cocok digunakan untuk memisahkan minyak atsiri. Minyak atsiri terdiri atas
campuran yang sangat rumit menjadi golongan-golongan senyawa atau memisahkan
golongan senyawa menjadi komponen-komponennya.

Parasetamol

Nama Kimia : 4- Hidroksiasetanilida

Rumus Molekul : C8H9NO2

Berat Molekul : 151,16 gr/mol

Pemerian : serbuk, putih, tidak berbau, rasa sedikit pahit.

 Kelarutan : larut dalam air mendidih dan dalam natrium hidroksida 1 N, mudah
larut dalam etanol. larut dalam etanol. (Depkes RI, 1995).

Parasetamol atau N-asetil-p-aminofenol atau asetaminofen merupakan derivat para-

amino fenol yang berkhasiat sebagai analgesik-antipiretik. Asetaminofen merupakan
pengganti yang baik untuk analgesik dan antipiretik aspirin pada penderita dengan keluhan
saluran cerna dan pada mereka dengan perpanjangan waktu perdarahan yang tidak
menguntungkan. Asetaminofen merupakan analgetik dan antipiretis.

Parasetamol adalah senyawa yang memiliki sifat polar dan gugus kromofor yang
dimilikinya menyebabkan senyawa ini dapat menyerap sinar UV. Karakteristik senyawa ini
memungkinkan analisis dengan teknik HPLC menggunakan kolom nonpolar seperti C-18 dan
fasa gerak polar seperti methanol/ air. Parasetamol diabsorbsi cepat dan sempurna melalui
saluran cerna. Konsentrasi tertinggi plasma dicapai dalam waktu jam dan masa paruh
plasma antara 1-3 jam. Obat ini tersebar ke seluruh tubuh. Dalam plasma, 25% parasetamol
terikat protein plasma. Parasetamol digunakan sebagai analgesic dan antipiretik. Pengujian
kadar parasetamol dalam obat menggunakan teknik HPLC , dalam proses analisisnya HPLC
memiliki beberapa tahapan. Diawali dengan menginjeksikan sampel uji yaitu larutan obat
yang sebelumnya telah disaring dengan membran PTFE ke dalam kolom HPLC dengan
injektor khusus / syringe yang bervolume 20 L, penyaringan sebelum penginjeksian ini
dilakukan agar tidak terjadi penyumbatan didalam kolom dan menghilangkan gas dari
pelarutnya. Sampel didorong cepat saat melalui kolom dengan bantuan pompa bertekanan
tinggi. Di dalam kolom, komponen- komponen pada sampel dipisahkan berdasarkan pada
perbedaan kekuatan interaksi solut terhadap fasa diamnya. Solutyang interaksinya kurang
kuat akan keluar lebih lambat dari kolom daripada solut lainnya.Komponen akan keluar dari
kolom dengan kecepatan yang berbeda dan terdeteksi oleh detektor. Detektor yang digunakan
adalah detektor UV karena parasetamol merupakan senyawa organik yang dapat menyerap
sinar UV.

Pengujian ini menggunakan panjang gelombang 243 nm dengan mempertimbangkan

panjang gelombang methanol yaitu 205 nm dan air yaitu 190 nm. Teknik yang dilakukan kali
ini merupakan reverse phase atau fasa terbalik karena teknik ini menggunakan pelarut polar
sebagai fasa gerak sedangkan fasa diamnya menggunakan pelarut non- polar. Penggunaan
fasa gerak dan fasa diam yang berbeda kepolarannya ini bertujuan agar sampel uji tidak
bereaksi dengan fasa diamnya saat melewati kolom HPLC. Sampel melewati kolom HPLC
tentunya memiliki jangka waktu yang terukur dan juga menjadi parameter, waktu yang
dibutuhkan sampel untuk melewati kolom ini disebut waktu retensi. Dalam pengujian
parasetamol dalam obat, waktu retensi yang terukur adalah antara 2,19 hingga 2,2.

Selanjutnya hasil analisis dengan HPLC ini menghasilkan suatu citra berupa
kromatogram. Kromatogram ini merupakan grafik antara intensitas komponen yang dibawa
oleh fasa gerak terhadap waktu retensi. Seharusnya tampilan kromatogram ini berupa grafik
lurus, lancip, dan simetris. Tetapi data yang diperoleh pada percobaan ini sedikit melebar dan
tidak simetris tentunya. Ini disebabkan antara lain oleh adanya difusi didalam kolom HPLC,
difusi yang terjadi adalah difusi longitudinal dan difusi transfer massa. Difusi longitudinal itu
sendiri disebabkan oleh penyebaran komponen yang tidak sama sedangkan difusi transfer
massa disebabkan oleh kecepatan komponen yang tidak merata. Terdapat beberapa parameter
pemisahan dalam HPLC, yaitu laju alir eluen yaitu sebesar 0,5 mL/ menit, ketebalan stasioner
kolom C-18 yaitu 15 cm, ukuran partikel analit, dan laju difusi yang sudah disebutkan diatas.

Parameter- parameter ini dapat menyebabkan kejanggalan dalam pencitraan

kromatogram seperti pelebaran pada puncak. Adanya pelebaran puncak pada kromatogram
mengindikasikan terjadinya overlapping analit yang belum terpisahkan dalam kolom.
Semakin tinggi laju difusinya maka komponen dalam sampel akan semakin sulit dipisahkan
secara efisien. Dari grafik luas area terhadap konsentrasi (ppm) dapat dihitung kadar
parasetamol dalam sampel obat. Data yang diperoleh menunjukkan bahwa dari sampel obat
sebanyak 12,5 mg diperoleh kadar parasetamol sebesar 83,444 % sedangkan dari massa rata-
rata tablet obat sebesar 738,2 mg diperoleh massa parasetamol pada tiap tablet obat sebesar
615,9836 mg. Dapat disimpulkan bahwa kadar parasetamol dalam tablet obat adalah sebesar
615,98 mg per tabletnya

Beberapa contoh penelitian :

Analisis Anion Nitrat (NO3-)

Nitrat sebagai hasil proses alami atau industri akan bisa memasuki bahan alam atau
bahan industri seperti air yang sangat dibutuhkan manusia atau untuk kebutuhan industri.
Kandungan dalam jumlah tertentu akan sangat mempengaruhi kualitas air tersebut. Untuk itu
diperlukan suatu metode analisis yang teruji untuk mengukur kandungan nitrtat tersebut.
Dengan menggunakan HPLC sebagai instrumen analisis dan dengan pengembangan metode
dapat diketahui validitas penggunaan HPLC untuk analisis anion nitrat. Dari beberapa model
pemutakhiran HPLC diketahui metode analisis HPLC dengan kolom IC Pak Anion serta
eluen campuran Na-Borat glukonat : Butanol : Asetonitril (1:1:10) dan detektor
Konduktivitas dapat menganalisis ion nitrat dalam air tangki reaktor, dengan batas deteksi
3,661 ppm dan sensitivitas 0,01 ppm serta uji recovery 110,41+ 1,59%.

Analisis Vitamin C

Metode HPLC juga dapat digunakan sebagai dasar dari analisis vitamin C, yakni
dalam menentukan susunan kimianya.Susunan kimia vitamin C ditemukan pada tahun 1933
oleh ilmuwan Inggris dan Swiss. Isolasi asam askorbat mula-mula ditemukan oleh King dari
USA dan Szent-Gyorgy dari Hungaria. Vitamin ini mempunyai dua bentuk, yaitu bentuk
oksidasi (bentuk dehydro) dan bentuk reduksi. Kedua bentuk ini mempunyai aktivitas
biologi. Dalam makanan bentuk reduksi yang terbanyak. Banyak dehydro dapat terus
teroksidasi menjadi diketogulonic acid yang inaktif.

Analisis Ekstrak Etanol Rimpang Tanaman Zingiberaceae

 Rimpang tanaman Zingiberaceae pada umumnya mengandung metabolit sekunder
golongan minyak atsiri sebagai zat kandungan yang menguap dan golongan lain berupa zat
yang tidak menguap dan bahkan pada beberapa Curcuma spp. dan Kaempferia spp. terdapat
komponen utama yang terkristalkan dari ekstrak total yang diuapkan pelarutnya (etanol,
heksan) sebagai komponen utama. Banyaknya komponen kandungan dalam rimpang dengan
berbagai polaritas menuntut penggunaan metoda analisis kromatografi instrumental dengan
selektifitas (resolusi) yang tinggi, kromatografi cari kinerja tinggi (HPLC) untuk komponen
yang termolabil, seperti dilakukan untuk stabilitas kandungan gingerol dari rimpang Jahe dan
andrografolid dari Sambiloto.

Untuk mendapatkan metoda HPLC dengan resolusi tinggi dibutuhkan cara eluasi
gradient, dengan program menurun polaritasnya, yaitu mulai dari 10% metanol sampai
metanol 100% dan pada umumnya ditambahkan asam fosfat sebagai cara untuk menekan
ionisasi senyawa metabolit sekunder tanaman yang umumnya bersifat asam, seperti prinsip
pasangan ion.

Sampel analisis HPLC dibuat dari simplisia rimpang bentuk serbuk dimaserasi-
perkolasi dengan pelarut bahan sampai diperoleh perkolat 10 kali berat bahan. Perkolat
diuapkan dengan rotavapor sampai diperoleh kepekatan 1 ml ekstrak = 1 gram serbuk
simplisia, diperoleh suatu ekstrak total. Sebelum ekstrak dianalisis HPLC, dilarutkan kembali
dalam metanol ( 10X), kemudian dilakukan filtrasi melalui " Sepak " (SPE C18 1 X 1 cm)
untuk selanjutnya diinjeksikan sejumlah 20 ul ke HPLC.

Kondisi HPLC dalam penelitian adalah sbb.: Eluasi dilakukan gradien pada kondisi awal
Solvent-A (As-fosfat 0,1 N dalam aquabidestillata) : Solvent B

(Metanol pro HPLC) = 90 10; kemudian program gradien linear selamn 35 menit
menuju 100% Metanol, dilanjutkan 15 menit Metanol 100%, dilanjutkan program pencucian
kolom dengan 40% MetOH selama 10menit, dan diakhiri kembali kekondisi awal (10%
MetOH) dalam waktu 5 menit. Kromatogram direkam selama total waktu 60 menit. Setiap
kali injeksi bahan uji (ekstrak) memerlukan waktu 75 menit, kemudian dapat langsung
diinjeksikan bahan uji berikutnya. Analisis HPLC dilakukan pada setiap sampel ekstrak
dengan kondisi eluasi dan deteksi pada panjang gelombang 254 nm 365 nm. Analisis data :
Sidik jari HPLC masing-masing ekstrak dianalisis dan dibedakan berdasarkan jumlah puncak
komponen dan waktu retensinya untuk dicari karakterisasinya jika ada dalam campuran atau
dalam produk.

Dari hasil pengamatan kromatogram, dapat disimpulkan bawah pada ekstrak

C.domestica, C.xanthorrhiza dan C.zedoaria, jumlah puncak pada 254nm sama dengan
jumlah puncak yang muncul pada 365nm juga dan jumlah puncak pada 365nm lebih besar
dari pada jumlah puncak 254nm, sehingga untuk membuat sidik jari kromatogram HPLC
terbaik digunakan deteksi pada 365nm. Pada ekstrak Alpinia galanga, Z.cassumunar,
Z.zerumbet dan K.galanga, jumlah puncak pada 365nm sama dengan jumlah puncak yang
muncul pada 254nm juga dan jumlah puncak pada 254nm lebih besar dari pada jumlah
puncak 365nm, sehingga untuk membuat sidik jari kromatogram HPLC terbaik digunakan
deteksi pada 254nm. C heyneana, C aeroginosa, Z offinalis, K pandurata, K angustifolia dan
K rotunda jumlah puncak yang muncul sama pada 254nm dan 365nm lebih kecil dari jumlah
puncak pada 254nm dan pada 365nm, sehirigga untuk pembuatan sidik jari kromatogram
HPLC harus digunakan kombinasi deteksi pada 254nm clan 365nm.

Pengukuran Tingkat Kematangan Buah Manggis

Mutu buah-buahan segar saat ini umumnva masih dievalusi secara manual yang
menggunakan tanda-tanda visual seperti warna kulit. Hasil evaluasi visual yang hanya
menilai sifat fisik bagian luar ini tidak selalu mencerminkan tingkat kematangan dan
kerusakan bagian dalam buah. Bila ingin menentukan mutu bagian dalam buah harus
digunakan cara kimia basah (HPLC) yang bersifat merusak. Dalam menanggulangi masalah
ini perlu dilakukan suatu penelitian mengenai teknologi tertentu yang dapat dimanfaatkan
untuk menentukan mutu bagian dalam buah-buahan secara tidak merusak.

Hasil penelitian tugas akhir yang telah dilakukan menunjukkan bahwa metode
ultrasonik dapat dipakai untuk menentukan tingkat kematangan buah manggis secara tidak
merusak. Berdasarkan basil kalibrasi 80 buah manggis, kecepatan gelombang ultrasonik yang
merambat melalui buah manggis untuk tiap tingkat kematangan mempunvai nilai yang
berbeda-beda. Buah manggis yang masih mentah mempunyai kecepatan gelombang
ultrasonik rata-rata 337.4 m/s, untuk buah setengah matang 369.1 m/s, buah matang 397.4
mis, serta untuk buah Iewat matang mempunyai nilai kecepatan rata-rata 449.6 mis. Nilai
kecepatan rata-rata gelombang ultrasonik yang merambat pada tiap tingkat kematangan buah
digunakan untuk membuat suatu persamaan empiris. Persamaan ini menghubungkan tingkat
kematangan terhadap kecepatan gelombang ultrasonik untuk memperkirakan tingkat
kematangan berdasarkan ultrasonik. diperoleh Tk = 0.0268 V 7.9258.

Persamaan empiris yang diperoleh diuji dengan pengukuran kecepatan pada berbagai
kondisi buah dengan warna visual yang beraneka ragam. Berdasarkan basil uji coba 100 buah
manggis diperoleh perbedaan perkiraan kematangan antara ultrasonik dan warna kulit.
Perbedaan tersebut mencapai 21%, hal ini menunjukkan bahwa warna kulit belum tentu
mencerminkan tingkat kematangan dan kerusakan bagian dalam buah.

Pendugaan Kandungan Senyawa Bioaktif Atau Senyawa Penciri Beberapa Tanaman Obat

Secara kualitatif dan kuantitatif suatu senyawa aktif dapat diketahui antara lain
melalui metode HPLC (High Performance Liquid Chromatography) dan FTIR (Fourier
Trasfrorm Infrared). Penentuan kandungan senyawa aktif atau senyawa penciri dilakukan
melalui proses yang panjang meliputi penghancuran bahan, pelarutan, dan pengukuran
dengan HPLC dan FTIR. Proses ini memerlukan waktu dan biaya yang relatif mahal. Untuk
itu sangat diperlukan metode yang handal tetapi relatif mudah untuk dioperasikan. Alternatif
cara penentuan lain yang menyatakan hubungan antara kandungan senyawa aktif atau penciri
hasil pengukuran HPLC dengan data hasil pengukuran FTIR (absorban).
 Ketersediaan model ini akan menghemat waktu dan biaya. Pada tahun pertama
dilakukan penentuan metode ekstraksi terbaik untuk senyawa aktif Gingerol dan Kurkumin
yang berasal dari hasil pengamatan contoh petani jahe dan temulawak daerah Kulonproggo
dan Karanganyar. Pada tahun pertama penyusunan model kalibrasi menggunakan dua sumber
yaitu data simulasi dan data pengamatan petani jahe dan temulawak daerah Kulonprogo dan
Karanganyar. Pendekatan terbaik untuk kalibrasi yang diperoleh pada tahun pertama
digunakan untuk penyusunan model kalibrasi data persentase transmitan Gingerol dan
Kurkumin tanaman hasil percobaan pada tahun kedua. Model kalibrasi yang diperoleh pada
tahun kedua merupakan model terbaik berdasarkan data simulasi, data hasil pengamatan
(Karanganyar dan Kulonprogo) serta data hasil percobaan. Pada tahun ketiga dilakukan
validasi model kalibrasi yang diperoleh apda tahun sebelumnya dengan cara menerapkannya
pada data konsentrasi dan persentase transmitan Gingerol dan Kurkumin yang berasal dari
hasil pengamatan jahe dan temulawak yang diambil dari contoh Bogor, Cianjur, Kuningan,
Majalengka dan Sukabumi.

4.2 Keunggulan dan Kerugian HPLC

KCKT adalah suatu metode yang menggabungkan koefisien kolom dan kecepatan
analisis. KCKT termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan fasa
gerak cairan dan fasa diam cairan atau padat. Kelebihan KCKT antara lain adalah:

HPLC dilengkapi dengan adanya pompa, Pompa ini menghasilkan tekanan sekitar 400
atm untuk mengalirkan eluen dengan tekanan tinggi dan konstan sehingga memperingan
kerja kolom dan juga pemisahan sehingga waktu lebih sedikit. pada pompa dikenal dua
sistem dalam teknik pemisahan yaitu isokratik dan gradient,namun gradient lebih bersifat
akurat karena masing-masing pompa mengatur laju alir larutan yang berbeda.

HPLC memiliki keunggulan kolom, Dimana kolom HPLC ini lebih pendek dan lebih
kecil dibanding GC misalnya. Diameter untuk internal kolom HPLC 4.6 mm sehingga
dapat memberikan permukaan kontak yang lebih luas diman mempengaruhi
sempurnanya pemisahan yang semakin baik. Dan panjang kolom HPLC adalah 150-250
mm. dan yang perlu diingat adalah kolom HPLC dapat digunakan kembali dengan cara
direnerasi dengan mencucinya hingga bersih dengan pelarut yang sesuai.

HPLC mempunyai detektor yang amat sangat sensitif dan peka. HPLC memiliki
beberapa detector misalnya: Detektor ultraviolet, detektor fluorometrik, dan detektor
elektrokimia.

Waktu retensi, waktu yang dibutuhkan senyawa untuk melalui kolom hingga ke detektor
disebut waktu retensi yang diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai
sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu.biasanya
dipengaruhi oleh : tekanan yang digunakan, kondisi dari fase diam, komposisi pelarut
yang tepat, dan temperatur kolom.
 Kromatogram, kromatogram menunjukkan hasil yang didapat. Kromatogram yang
diinginkan adalah kromatogram yang lurus tinggi dengan lebar sekecil mungkin. Bukan
dengan bentuk lainnya,karena bentuk tersebut menandakan pemisahan dilakukan dengan
sangat baik. Namun dalam kromatogram kita menemukan beberapa puncak kecil atau
yang mengganggu dan disebut denga noise. Noise muncul jika sampel kita ataupun
pelarut yang kita gunakan belum pure,belum murni dari pengotor-pengotor yang
mungkin tidak sengaja masuk kedalamnya

Kekurangan KCKT antara lain adalah:

Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dahulu

Hanya bisa digunakan untuk asam organic

Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradient elusi

Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas

BAB V
PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Kromatografi Padat-Cair (adsorbsi) adalah kromatografi pembagian dimana
partisi terjadi antara fase gerak dan fase diam yang kedua-duanya zat cair.
Kromatografi Cair-Cair adalah kromatografi penyerapan. Sebagai adsorben
digunakan silika gel, alumina, penyaring molekul atau gelas berpori dipak dalam
sebuah kolom dimana komponen-komponen campuran dipisahkan dengan adanya
fase gerak.
KCKT merupakan teknik analisis pemisahan sekaligus penentuan kualitatif
maupun kuantitatif yang banyak digunakan pada senyawa-senyawa yang
mempunyai titik didih tinggi yang tidak dapat dilakukan dengan analisis secara
kromatografi gas.
Kromatografi Penukar Ion tergantung pada penukaran (adsorpsi) ion-ion di antara
fase gerak dan tempat-tempat berion dari pengepak.
Kromatografi Eksklusi/ Permeasi Gel (GPC) merupakan pemisahan didasarkan
pada ukuran molekul dari zat padat
 DAFTAR PUSTAKA

Johnson, E. L. and Steven son, R (1978). Basic liquid chromatography. Varian, California
Lindsay, S. 1992. High performance liquid chrotomagraphy.second edition, John Wiley
&Sons,
Chischer, New York, Brisbane, Toronto, Singapore
http://elchem.kaist.ac.kr/vt/chem-ed/sep/lc/hplc.htm
http://www.chemguide.co.uk/analysis/chromatography/hplc.html
http://commons.wikimedia.org/wiki/File:HPLC.gif 14/
http://en.wikipedia.org/wiki/High-performance_liquid_chromatography