Nota: coloca en los datos que la temperatura era 37C

Tablas de resultados

Tabla 1: contenido de protenas, actividad, y actividad especfica en cada

extracto

extracto Cantidad de actividad actividad

protena (mg/ml) (mol/min*C) especfica
(mol/mg*min*C)
1,51E-052,63E-
pulpa 2,250,33 1,70E-051,5E-06 06
9,00E-061,56E-
corteza 2,900,43 1,31E-051,2E-06 06
7,46E-061,30E-
tallo 5,610,83 2,09E-051,9E-06 06

Tabla 2: actividad, actividad especfica, velocidad inicial de reaccin a distintas

concentraciones de sustrato (casena) y cantidad constante de enzima (0,5ml)

Concentracin de Velocidad inicial actividad actividad

casena (g/ml) de reaccin (mol/min*C) especfica
(mol/L*min) (mol/mg*min*C)

1,250E-031,3E-
04 4,57E-05 4,94E-06 1,76E-06
2,500E-032,5E-
04 4,81E-05 5,20E-06 1,86E-06
3,750E-033,8E-
04 4,95E-05 5,36E-06 1,91E-06
5,000E-035,0E-
04 5,10E-05 5,51E-06 1,97E-06
6,250E-036,3E-
04 5,83E-05 6,31E-06 2,25E-06

Tabla 3: parmetros de la ecuacin de michelis menten

Parmetro
KM (g casena/ml) 1,85E-042,7E-05
Vmax (moles de tirosina/L*min) 5,224E-056,6E-07
 Discusin de resultados

La bromelina de la pia (Ananas comosus) se extrajo tanto de su pulpa, tallo y

corteza, tratando cada una por separado, para esto se valio de que la
bromelina es soluble en medios polares como el agua, pero insoluble en
medios apolares como la acetona, esto nos da una evidencia de la estructura
de esta enzima que debera tener muchos aminoacidos polares y ionizable y
una menor cantidad de los aminocidos alifticos, que confieren menor
solubilidad en el agua.

A cada uno de los extractos obtenidos se le determino la cantidad de protenas

totales por medio del mtodo de biuret, tabla 1, este se basa en la absorcin
de un complejo de cobre con los enlaces peptdicos, este complejo se forma en
medio alcalino, la reaccin es la siguiente(1):

De esto se observ que el tallo es la parte de la pia que tiene mayor

contenido de protenas, aunque esto no significa que sea la que contenga
mayor cantidad de bromelina, debido a que por el mtodo de biuret se
determinan todas las protenas presentes.

Para la determinacin de la actividad de la bromelina se baso en la reaccin de

lowry que consiste en una combinacin del reactivo del biuret con el de follin,
la funcin del reactivo de biuret es la ya mencionada, mientras que el de follin
se encarga de oxidar la tirosina libre por medio de la oxidacin de molibdeno y
walframio en su estado d oxidacin +6 al pasarlo a +5, esto hace que el
complejo que forman estos metales en solucin acuosa pase de un color
amarillo a uno azul(2), la tirosina libre proviene de la accin proteoltica de la
bromelina sobre la caseina, es decir, la ruptura de los enlaces peptdicos
presentes en la casena, la ruptura de estos enlaces no es especfica, sino que
la bromelina ataca casi cualquier en enlace peptdico de manera aleatoria, para
tener control del tiempo en que se dara la reaccin se valio de la adicion de
acido actico a la mezcla de reaccin el cual tiene como efecto la precipitacin
tanto de las casenas como de la bromelina, dejando solo los aminocidos en
solucin.

En cuanto al estudio de los parmetros cinticos de esta reaccin solo se

estudi el efecto de la concentracin inicial del sustrato sobre la velocidad,
esto se hizo solo sobre el extracto del tallo xq era el que se presumia que tenia
mayor actividad especifica (4) , aunque luego de realizar los clculos se
observo que la pulpa era la que tenia mayor actividad especifica, de aqu se
determino la constante de michelis menten y la velocidad mxima que puede
alcanzar la reaccin para la cantidad de enzima utilizada tabla 3, esto se hizo
por el mtodo del doble reciproco de Lineweaver-Burk (5), aunque comoadmite la misma
bibliografa no es uno de los mtodos mas precisos para determinar parmetros cinticos, en
cuanto al ajudste de los datos a la recta se observo un ajueste aceptable con un coeficiente de
regresin 0,96,de acuerdo a la definicin de Km que es una medida de la
estabilidad del complejo enzima sustrato frente a su disociacin se ve que este
complejo se encuentra en mucho menor cantidad que la enzima libre o
sustrato libre, por otro lado se ve que la velocidad mxima encontrada es
menor que la velocidad para la reaccin del tubo de ensayo 5, lo cual no tiene
sentido debido a la definicin de vmax, pero como se ve en el grafico, este
experimento se aleja del comportamiento esperado de la hiprbola, esto pudo
deberse a que el tubo de ensayo de este experimento pudo durar mas tiempo
que los 25 minutos reaccionando, lo que aumentara la concentracin final de
tirosina, hay que tener en cuenta que para la determinacin del efecto del
sustrato en la velocidad de reaccin la cantidad de reactivo de biuret
adicionado a cada tubo de ensayo fue mucho menor que la agregada a los
patrones, debido a que este se estaba acabando, por lo que el color en estos
fue mucho menos intenso y dando por lo tanto valores menos intensos de
absorbancia, por esta razn todos los valores quedaron por fuera del intervalo
de la curva de calibracin, por lo que se procedio a extrapolar, trayendo como
error que no se sabe si el comportamiento fuera del intervalo de la recta de
calibracin sigue la misma linealidad (3)

Conclusiones

El extracto con mayor actividad proteolitica especifica de la pia estudiada es

la pulpa, mientras el extracto con mayor cantidad de protenas fue el tallo

Aun con los errores cometidos en la determinacin del efecto del sustrato si se
observo el comportamiento hiperblico predicho por michelis menten

Referencias

1. https://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/bolarios/BiologiaCCAA/Guiones
/Practica1.htm
2. http://www2.uah.es/bioquimica/Sancho/farmacia/practicas/Lowry.pdf
3. https://books.google.co.ve/books?id=3oix-
tIRPAUC&pg=PA301&dq=error+de+extrapolaci
%C3%B3n+curva+de+calibracion&hl=es&sa=X&ved=0CBwQ6AEwAGo
VChMIh-f52umPxgIV0faACh0aQQBc#v=onepage&q=error%20de
%20extrapolaci%C3%B3n%20curva%20de%20calibracion&f=false
4. https://www.dspace.espol.edu.ec/bitstream/123456789/25407/1/Nuestra
%20Tesis%20Bromelina.pdf
5. horton