PRCTICA 2

ANLISIS CUANTITATIVO DE CARBOHIDRATOS

OBJETIVO GENERAL

Comparar curvas de calibracin de diferentes carbohidratos para cada uno de cinco diferentes mtodos de anlisis cuantitativo de
carbohidratos; a saber: Antrona para hexosas, Bial para pentosas, DNS para azcares reductores y Fenol-Sulfrico para azcares totales.

Objetivos conductuales

Durante la sesin prctica el estudiante deber:

Para cada uno de los cuatro mtodos, elaborar la curva de calibracin de dos o tres sustancias tipo para la prueba y un par de
concentraciones de otras tres sustancias que puedan ser interferencias.
Posteriormente la sesin prctica el estudiante deber ser capaz de:
Comparar las curvas de calibracin de las sustancias tipo y discutir sus similitudes o diferencias y evaluar los resultados obtenidos para las
sustancias interferentes.
Explicar con ecuaciones cada una de las pruebas.

MARCO TERICO

Las pruebas cualitativas que utilizamos en la Prctica 1, pueden usarse para el anlisis cuantitativo de los carbohidratos.
La Determinacin de Hexosas Totales con Antrona se basa en la Prueba de Antrona [Ashwell, 1957], que como discutimos en la Prctica 1.
En ella, las hexosas se deshidratan a hidroximetilfurfural por las hexosas en presencia de cido sulfrico concentrado. Este luego reacciona
con el antranol, un tautmero enlico de la antrona para dar un color verde en soluciones diluidas y un color azul en soluciones
concentradas.
La fructosa y la glucosa reaccionan dando una coloracin de igual intensidad con mximo a 620 nm. A dicha longitud de onda, la galactosa
da un 54% del color de la glucosa. Las pentosas son mucho menos sensitivas con mximo a 600 m . El cido ascrbico da un color rojo
cereza y el triptofano un color rojo naranja con pico a 515 nm. El cido glutmico y la gelatina dan color azul con pico a 620 m . Los
mono-, di- y trisacridos, as como las dextrinas, dextranos, almidones, polisacridos vegetales y gomas dan tambin un resultado positivo.
Los alcoholes de azcares no dan color.
La Prueba de Bial da origen a la Determinacin de Pentosas con Orcinol [Ashwell, 1957]. El mtodo original propuesto por Bial utiliza 20
minutos de reaccin en los cuales solo el 88% de la reaccin se ha dado para las pentosas libres y la ribosa-3-fosfato. Horecker encontr
que la mxima produccin de color se da a los 40 minutos. Sin embargo, el mayor tiempo de calentamiento afecta la interferencia de otros
azcares. La glucosa puede convertirse en un problema en este caso al igual que la fructosa o las tetrosas. En estos casos, se
recomienda determinar la absorbancia a 580 y 670 m. Esto porque la glucosa absorbe igual a ambas longitudes de onda.
Otro mtodo muy utilizado en el anlisis de carbohidratos es la Determinacin de Azcares Reductores con DNS [Miller, 1959]. Existen
diversos mtodos de anlisis de azcares reductores basados precisamente en la facilidad de oxidacin que tiene el carbono hemiacetlico
libre de los azcares. Entre ellos tenemos mtodos tales como el de Somogyi-Nelson, el de Barfoed, el de Benedict y el del cido 3,5-
dinitrosaliclico. Todos estos mtodos tienen buen comportamiento cuantitativo, pero son poco especficos. Esto se debe a que muchas
sustancias reductoras pueden interferir en los mismos; por ejemplo, aminocidos tales como la cistina, la tirosina y el triptofano son
interferentes.
La reaccin de oxidacin-reduccin en este caso es la oxidacin del carbonilo del azcar reductor para formar el cido mientras que el cido
3,5-dinitrosaliclico se reduce a cido 3-amino, 5-nitrosaliclico. Las hexosas, disacridos, oligosacridos y polisacridos y sus derivados
que posean un grupo reductor libre, reaccionan para dar un color anaranjado amarillento con mximo de 485-490 m. Las pentosas,
metilpentosas y cidos urnicos presentan el mximo a 480 m. La intensidad del color vara con el azcar y los valores obtenidos para
mezclas son arbitrarios.
Finalmente, existe un mtodo utilizado para analizar azcares totales, el Mtodo de Fenol-Sulfrico para Azcares totales [Ghose, 1987].
Este mtodo tiene los mismos principios que los mtodos de Antrona y Molisch: Simplemente que el reactivo que va a condensarse con el
derivado del furfural es el fenol. Al igual que en la reaccin de Molisch, se aprovecha el calor generado por la reaccin exotrmica entre el
cido y el agua en lugar de calentar. Eso s, se debe agregar el cido rpidamente (entre 5 y 10 segundos) y lograr una buena mezcla para
aprovechar al mximo el calor de reaccin. Al igual que con el mtodo de DNS, para soluciones relativamente puras de un solo azcar se
puede construir y usar la curva de calibracin preparada con ese mismo azcar, pero para mezclas los valores son totalmente arbitrarios.

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MATERIALES Y REACTIVOS

Lista de Materiales

NOTA: Los EQUIPOS son de dos personas y los GRUPOS se estimaron con 8 equipos (16 personas).

MATERIALES POR EQUIPO POR GRUPO

Agitador Vortex 1 8
Baln aforado de 50.00 mL 1 8
Bao de metal para acomodar la gradilla para tubos de 16100 mm 2 16
Calentadores elctricos de superficie de cermica o metlica 1 8
Celdas para espectrofotmetro 2 16
Espectrofotmetro con lectura de 400 a 700 nm y filtros correspondientes 1 4
Gradilla para tubos de ensayo de 16100 mm resistente a la temperatura capaz de acomodar al menos 20 1 8
tubos
Pipeta graduada de 0.100 mL (o micropipeteador graduable de 10 -100 L) 1 8
Pipeta graduada de 1.00 mL (o micropipeteador graduable de 100 -1000 L) 1 8
Pipeta graduada de 2.00 mL (o macropipeteador graduable de 0.2 - 2.0 mL) 1 8
Pipeta graduada de 5.00 mL (o macropipeteador graduable de 0.50 - 5.00 mL) 1 8
Tubos de ensayo de 16100 mm 20 160

Lista de Reactivos

MATERIAL POR EQUIPO POR GRUPO

cido sulfrico concentrado 100 mL 1000 mL
Reactivo de Antrona 100 mL 1000 mL
Reactivo de Cloruro Frrico 100 mL 1000 mL
Reactivo de Orcinol 10 mL 100 mL
Reactivo de DNS 100 mL 1000 mL
Reactivo de Fenol 4 mL 40 mL
Solucin Madre de Glucosa de 2.00 mg/mL 2 mL (todos) 20 mL
Solucin Patrn de Arabinosa de 200 g/mL 24 mL (1 equipo) 50 mL
Solucin Patrn de 2-Desoxirribosa de 200 g/mL 24 mL (1 equipo) 50 mL
Solucin Patrn de Fructosa de 200 g/mL 24 mL (1 equipo) 50 mL
Solucin Patrn de Galactosa de 200 g/mL 24 mL (1 equipo) 50 mL
Solucin Patrn de Glucosa de 200 g/mL 24 mL (todos) 250 mL
Solucin Patrn de Lactosa de 200 g/mL 24 mL (1 equipo) 50 mL
Solucin Patrn de Ribosa de 200 g/mL 24 mL (1 equipo) 50 mL
Solucin Patrn de Sacarosa de 200 g/mL 24 mL (1 equipo) 50 mL
Solucin Patrn de Xilosa de 200 g/mL 24 mL (1 equipo) 50 mL
Solucin Patrn de Arabinosa de 25 g/mL 24 mL (1 equipo) 50 mL
Solucin Patrn de 2-Desoxirribosa de 25 g/mL 24 mL (1 equipo) 50 mL
Solucin Patrn de Fructosa de 25 g/mL 24 mL (1 equipo) 50 mL
Solucin Patrn de Galactosa de 25 g/mL 24 mL (1 equipo) 50 mL
Solucin Patrn de Glucosa de 25 g/mL 24 mL (1 equipo) 50 mL
Solucin Patrn de Lactosa de 25 g/mL 24 mL (1 equipo) 50 mL
Solucin Patrn de Ribosa de 25 g/mL 24 mL (todos) 200 mL
Solucin Patrn de Sacarosa de 25 g/mL 24 mL (1 equipo) 50 mL
Solucin Patrn de Xilosa de 25 g/mL 24 mL (1 equipo) 50 mL

Preparacin de los Reactivos

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 NOTA: La preparacin de los reactivos puede no seguir precisamente la de los documentos citados. En muchos
casos, se ha modificado el mtodo de preparacin con base en la experiencia previa.
cido sulfrico concentrado
PELIGRO: El cido sulfrico concentrado (H2SO4 95-97%) es corrosivo a los metales (Categora 1), altamente corrosivo a la piel y a
los ojos (categora 1A) causando quemaduras severas.

Reactivo de Antrona [Ashwell, 1957]

NOTA: Los mejores resultados se obtienen con el reactivo recin preparado y mantenido en un bao de agua con hielo. Sin
embargo, el reactivo se puede mantener de 7 a 8 das si se conserva entre 0 y 4C.
PELIGRO: El Reactivo de Antrona, por su alto contenido de cido sulfrico, es corrosivo a los metales (Categora 1), altamente
corrosivo a la piel y a los ojos (categora 1A) causando quemaduras severas.
En un beaker de 150 mL, coloque100 mL de cido sulfrico concentrado.
PELIGRO: El cido sulfrico concentrado (H 2SO4 95-97%) es corrosivo a los metales (Categora 1), altamente corrosivo a la piel y a
los ojos (categora 1A) causando quemaduras severas.
Agregue, lentamente, y con constante agitacin con varilla de vidrio, 200 mg de antrona; y mantenga la agitacin hasta
disolverlos totalmente.
NOTA: La antrona [9(10H)-antracenona C14H10O) no est clasificada como una sustancia peligrosa.
ENVASADO: Coloque en un frasco de vidrio oscuro con gotero.
ALMACENAMIENTO: Si se prepar fresco para usar el mismo da, coloque el beaker con el reactivo en un bao de agua con hielo
(0C-4C). Si se va a usar en los prximos 7 a 8 das, mantngase refrigerado a 0-4C.

Reactivo de Cloruro Frrico [Ashwell, 1957]

PELIGRO: Por su alto contenido de cido clorhdrico concentrado (HCl concentrado el Reactivo de Cloruro Frrico es corrosivo
para metales (categora 1) y provoca irritacin cutnea (categora 2), irritacin ocular grave (categora 2) e irritacin en las vas
respiratorias (categora 3).
Disuelva 16.7 g de cloruro de hierro hexahidrato (FeCl3 6H2O) en 100.0 mL de HCl concentrado.
PELIGRO: El cloruro de hierro hexahidratado (FeCl 3 6H2O) es nocivo en caso de ingestin (toxicidad aguda categora 4), provoca
irritacin cutnea (categora 2), irritacin ocular (categora 2) y provoca lesiones oculares graves (categora 1).
PELIGRO: El cido clorhdrico (HCl) concentrado puede ser corrosivo para metales (categora 1) y provoca irritacin y lesiones
graves cutneas (categora 1B), irritacin y lesiones graves oculares (categora 1B) e irritacin en las vas respiratorias (categora
3).
PRECAUCIN: Se debe trabajar en la capilla por los vapores de HCl que libera el reactivo.
ENVASADO: Se debe guardar en frasco de vidrio con gotero.
ALMACENAMIENTO: Se puede almacenar a temperatura de laboratorio (15C-25C).

Reactivo de DNS [Ghose, 1987]

PELIGRO: El Reactivo de DNS puede ser nocivo en caso de ingestin y puede provocar irritacin y quemaduras en la piel as como
irritacin y quemadura ocular grave debido a su alcalinidad y contenido de fenol.
En un beaker de 2 litros, coloque 1416 mL de agua destilada; agregue al beaker con agua, 10.6 g de cido 3,5-
dinitrosaliclico y 19.8 g de NaOH.
ATENCIN: El cido 3.5-dinitrosaliclico (C7H4N2O7) es nocivo en caso de ingestin (toxicidad aguda categora 4).
PELIGRO: El hidrxido de sodio (NaOH) es corrosivo para los metales (categora 1) y provoca quemaduras graves en la piel y
lesiones oculares graves (categora 1A). Su ingestin puede resultar en quemaduras graves internas.
A la disolucin anterior, agregue 306 g de tartrato de sodio y potasio y agite hasta disolver.
NOTA: El tartrato de sodio y potasio tetrahidrato (C4H4KNaO64H2O) no est clasificado como una sustancia peligrosa.
Seguidamente, agregue 7.6 mL de fenol fundido a 50C y, nuevamente, agite hasta disolver.
PELIGRO: El fenol (C6H6O) es nocivo en caso de ingestin (toxicidad aguda categora 3), contacto con la piel (toxicidad aguda
categora 3) o inhalacin (toxicidad aguda categora 3). Provoca quemaduras graves en la piel (corrosivo, categora 1B) y lesiones
oculares graves. Se sospecha que provoca defectos genticos (mutagenicidad en clulas germinales categora 2), puede provocar

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 daos en los rganos tras exposiciones prolongadas o repetidas (toxicidad categora 2) y es txico para los organismos acuticos
(categora 2) con efectos nocivos duraderos.
Finalmente, agregue 8.3 gramos de metabisulfito de sodio y agite hasta disolver.
PELIGRO: El metabisulfito de sodio (Na 2S2O5) es nocivo en caso de ingestin (toxicidad aguda categora 4) y provoca lesiones
oculares graves (categora 1).
Tome una alcuota de 3.0 mL de la solucin anterior y titlela con solucin 0.100 M de HCl.
NOTA: El cido clorhdrico 0.1M (HCl 0.1M) no est clasificado como una sustancia peligrosa.
Debera consumir entre 5 y 6 mL del HCl 0.100 M.
Si se consume menos volumen de HCl 0.100 M, agregue a la solucin final 2 g de NaOH por cada mililitro de HCl 0.100M
consumido de menos.
PELIGRO: El hidrxido de sodio (NaOH) es corrosivo para los metales (categora 1) y provoca quemaduras graves en la piel y
lesiones oculares graves (categora 1A). Su ingestin puede resultar en quemaduras graves internas.
ENVASADO: Coloque en un frasco de vidrio claro.
ALMACENAMIENTO: Se puede almacenar a temperatura de laboratorio (15C-25C).

Reactivo de Fenol al 80% p/p [Ashwell, 1966]

PELIGRO: Por su alto contenido de fenol el Reactivo de Fenol al 80% es corrosivo para metales (categora 1) y provoca irritacin
cutnea (categora 2), irritacin ocular grave (categora 2) e irritacin en las vas respiratorias (categora 3).
En una capilla de gases, coloque un beaker de 150 mL en una balanza granataria y pese en el mismo 80 g de fenol
redestilado.
PELIGRO: El fenol (C7H8O2) es nocivo en caso de ingestin (toxicidad aguda categora 4), provoca irritacin cutnea (categora 2),
irritacin ocular (categora 2) e irritacin en las vas respiratorias (categora 3).
PRECAUCIN: Se debe trabajar en la capilla por los vapores de fenol son txicos.
Entonces, agregue al fenol en el beaker de 150 mL. 20 mL de agua destilada y mezcle bien.
ENVASADO: Se debe guardar en frasco de vidrio.
ALMACENAMIENTO: La solucin es estable durante meses a temperatura de laboratorio (15C-25C). Puede desarrollar un color
amarillo plido con el tiempo, pero este cambio de tonalidad no interfiere con el ensayo.

Reactivo de Orcinol [Ashwell, 1957]

PELIGRO: Por su alto contenido de orcinol el Reactivo de Orcinol es corrosivo para metales (categora 1) y provoca irritacin
cutnea (categora 2), irritacin ocular grave (categora 2) e irritacin en las vas respiratorias (categora 3). Adems, en caso de
ingestin, adems de provocar quemaduras (por el cido concentrado) pude ser nocivo (por el orcinol).
Pese 10 g de orcinol y disulvalos en 100 mL de etanol al 95%.
PELIGRO: El orcinol (C7H8O2) es nocivo en caso de ingestin (toxicidad aguda categora 4), provoca irritacin cutnea (categora 2),
irritacin ocular (categora 2) e irritacin en las vas respiratorias (categora 3).
PELIGRO: El etanol al 95% (C2H5OH al 95%) es un lquido inflamable (categora 2), provoca irritacin ocular grave (categora 2),
provoca irritacin de la piel y vas respiratorias y puede ser daino si se ingiere.
ENVASADO: Coloque en un frasco de vidrio oscuro con gotero.
ALMACENAMIENTO: Se debe preparar fresco cada da.

Soluciones Madre de Azcares de 2.00 mg/mL

Prepare una Solucin Madre de 2.00 mg/mL para cada uno de los siguientes azcares: Arabinosa, 2-Desoxirribosa,
Fructosa, Galactosa, Glucosa, Lactosa, Ribosa, Sacarosa y Xilosa.
Para ello, pese 0.2000 g del azcar anhidro seco y colquelos en un beaker de 100 mL.
NOTA: Ninguno de los azcares arriba mencionados est clasificado como una sustancia peligrosa.
Agregue al beaker 30 mL de agua destilada y disuelva el azcar.
Finalmente, transfiera, cuantitativamente, la solucin del beaker a un baln aforado de 50 mL y afore a la marca con agua
destilada.
ENVASADO: Coloque en botella plstica oscura.

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 ALMACENAMIENTO: Se debe guardar en congelacin, hasta antes de usar.

Solucin Patrn de Azcares de 200 g/mL

Con una pipeta volumtrica de 5.00 mL, tome una alcuota de 5.00 mL de Solucin Madre de 2.00 mg/mL del azcar y
dispnsela en un baln aforado de 50.00 mL. Afore a la marca con agua destilada.
ENVASADO: Coloque en botella plstica oscura.
ALMACENAMIENTO: Se debe guardar en congelacin, hasta antes de usar.

Solucin Patrn de Azcares de 25 g/mL

Con una pipeta graduada de 10.00 mL, tome una alcuota de 6.25 mL de Solucin Patrn de 200 g/mL del azcar y
dispnsela en un baln aforado de 50.00 mL. Afore a la marca con agua destilada.
ENVASADO: Coloque en botella plstica oscura.
ALMACENAMIENTO: Se debe guardar en congelacin, hasta antes de usar.

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PROCEDIMIENTO:

Determinacin de Hexosas Totales con Antrona [Ashwell, 1957]

Cada equipo har una curva de calibracin para glucosa y otro azcar asignado.
Para cada curva, prepare soluciones de 0, 20, 40, 60, 80 y 100 g/mL del azcar a analizar de acuerdo al siguiente
procedimiento.
Identifique seis tubos de ensayo de 16100 mm con los nmeros 0, 20, 40, 60, 80 y 100 y colquelos en una gradilla para
tubos de ensayo.
NOTA: Use un marcador indeleble resistente al agua en ebullicin.
NOTA: Estos nmeros corresponden a la concentracin, en g/mL, de la disolucin del azcar a probar, que se medir para
confeccionar la curva de calibracin.
Dispense en dichos tubos los volmenes de Solucin Patrn de 200 g/mL del azcar, y de agua destilada, indicados en el
Cuadro 1 a continuacin.
CUADRO 1. PREPARACIN DE CURVA DE CALIBRACIN PARA HEXOSAS CON ANTRONA
Identificar los tubos por contenido de azcar en g/mL 0 20 40 60 80 100

Agregue a cada tubo los mililitros indicados de Solucin Patrn de 200

0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00
g/mL del azcar.
Agregue a cada tubo los mililitros indicados de agua destilada y mezcle
2.00 1.80 1.60 1.40 1.20 1.00
bien en el Vortex.
Coloque todos los tubos identificados en un bao de agua con hielo (0-4C) y djelos alcanzar la temperatura del bao.
Agregue a cada tubo poco a poco, con agitacin y manteniendo en el bao fro 4.00 mL de Reactivo de Antrona.
Mezcle bien el contenido del tubo de ensayo en el Vortex y coloque nuevamente el tubo en el bao de agua con hielo.
Saque los tubos del bao de agua con hielo y djelos alcanzar la temperatura ambiente.
Coloque una bola de vidrio en la boca de cada tubo.
Coloque la gradilla con los tubos tapados en un bao hirviendo por 15 minutos.
Remueva la gradilla con los tubos del bao de agua hirviendo.
Deje los tubos enfriar hasta temperatura ambiente.
Lea la absorbancia a 625 nm, usando el tubo marcado 0 como blanco de reactivo, y anote en el Cuadro 2, en la fila
correspondiente al azcar utilizado.
CUADRO 2. CURVAS DE CALIBRACIN PARA HEXOSAS CON ANTRONA
Concentracin del azcar en g/mL 0 20 40 60 80 100

Absorbancia para Arabinosa 0.000

Absorbancia para 2-Desoxirribosa 0.000
Absorbancia para Fructosa 0.000
Absorbancia para Galactosa 0.000
Absorbancia para Glucosa 0.000
Absorbancia para Lactosa 0.000
Absorbancia para Ribosa 0.000
Absorbancia para Sacarosa 0.000
Absorbancia para Xilosa 0.000
Recolecte las lecturas obtenidas por cada equipo del grupo para los otros azcares.
Elabore las curvas de calibracin para cada azcar en un mismo grfico de absorbancia vs concentracin y comente los
resultados.

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Determinacin de Pentosas Totales con Orcinol [Ashwell, 1957]
Cada equipo har una curva de calibracin para ribosa y otro azcar asignado.
Para cada curva, prepare soluciones de 0, 5, 10, 15, 20 y 25 g/mL del azcar a analizar de acuerdo al siguiente
procedimiento.
Identifique seis tubos de ensayo de 16100 mm con los nmeros 0, 5, 10, 15, 20 y 25 y colquelos en una gradilla para
tubos de ensayo.
NOTA: Use un marcador indeleble resistente al agua en ebullicin.
NOTA: Estos nmeros corresponden a la concentracin, en g/mL, de la disolucin del azcar a probar, que se medir para
confeccionar la curva de calibracin.
Prepare 50 mL de Solucin Patrn de 25 g/mL del azcar siguiendo lo indicado a continuacin. Con una pipeta graduada
de 10.00 mL, tome una alcuota de 6.25 mL de Solucin Patrn de 200 g/mL del azcar y dispnselos en un baln aforado
de 50 mL. Afore a la marca con agua destilada.
Dispense en dichos tubos los volmenes de Solucin Patrn de 25 g/mL del azcar, y de agua destilada, indicados en el
Cuadro 3 a continuacin.
CUADRO 3. PREPARACIN DE CURVA DE CALIBRACIN PARA PENTOSAS CON ORCINOL
Identificar los tubos por contenido del azcar en g/mL 0 5 10 15 20 25

Agregue a cada tubo los mililitros indicados de Solucin Patrn de 25

0.00 0.60 1.20 1.80 2.40 3.00
g/mL del azcar.
Agregue a cada tubo los mililitros indicados de agua destilada y mezcle
3.00 2.40 1.80 1.20 0.60 0.00
bien en el Vortex.
Agregue a cada tubo 3.00 mL del Reactivo de Cloruro Frrico y mezcle bien en el Vortex.
Agregue a cada tubo 0.30 mL del Reactivo de Orcinol y mezcle bien en el Vortex
Coloque una bola de vidrio en la boca de cada tubo.
Coloque la gradilla con los tubos tapados en un bao hirviendo por 40 minutos.
Remueva la gradilla con los tubos del bao de agua hirviendo.
Deje los tubos enfriar hasta alcanzar temperatura ambiente.
Lea la absorbancia a 670 nm, usando el tubo marcado 0 como blanco de reactivo, y anote en el Cuadro 4, en la fila
correspondiente al azcar utilizado.
CUADRO 4. CURVAS DE CALIBRACIN PARA PENTOSAS CON ORCINOL
Concentracin del azcar en g/mL 0 5 10 15 20 25

Absorbancia para Arabinosa 0.000

Absorbancia para 2-Desoxirribosa 0.000
Absorbancia para Fructosa 0.000
Absorbancia para Galactosa 0.000
Absorbancia para Glucosa 0.000
Absorbancia para Lactosa 0.000
Absorbancia para Ribosa 0.000
Absorbancia para Sacarosa 0.000
Absorbancia para Xilosa 0.000
Recolecte las lecturas obtenidas por cada equipo del grupo para los otros azcares.
Elabore las curvas de calibracin para cada azcar en un mismo grfico de absorbancia vs concentracin y comente los
resultados.

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Determinacin de Azcares Reductores con DNS [Ghose, 1987]
Cada equipo har una curva de calibracin para glucosa y otro azcar asignado.
Para cada curva, prepare soluciones de 0, 40, 80, 120, 160 y 200 g/mL del azcar a analizar de acuerdo al siguiente
procedimiento.
Identifique seis tubos de ensayo de 16100 mm con los nmeros 0, 40, 80, 120, 160 y 200 y colquelos en una gradilla para
tubos de ensayo.
NOTA: Use un marcador indeleble resistente al agua en ebullicin.
NOTA: Estos nmeros corresponden a la concentracin, en g/mL, de la disolucin del azcar a probar, que se medir para
confeccionar la curva de calibracin.
Dispense en dichos tubos los volmenes de Solucin Patrn de 200 g/mL del azcar, y de agua destilada, indicados en el
Cuadro 5 a continuacin.
CUADRO 5. PREPARACIN DE CURVA DE CALIBRACIN PARA AZCARES TOTALES CON DNS
Identificar los tubos por contenido del azcar en g/mL 0 40 80 120 160 200

Agregue a cada tubo los mililitros indicados de patrn Solucin Patrn

0.00 0.30 0.60 0.90 1.20 1.50
de 200 g/mL del azcar.
Agregue a cada tubo los mililitros indicados de agua destilada y mezcle
1.50 1.20 0.90 0.60 0.30 0.00
bien en el Vortex.
Agregue a cada tubo de ensayo 25 L (0.025 mL) de la Solucin Madre de 2.00 mg/mL de Glucosa como patrn interno.
Agregue a cada tubo 4.50 mL de Reactivo de DNS y mezcle bien en el Vortex.
Coloque una bola de vidrio en la boca del tubo.
Coloque la gradilla con los tubos tapados en un bao de agua hirviendo por 5 minutos.
Remueva los tubos del bao de agua hirviendo y colquelos en el bao de agua con hielo por 3 minutos para enfriar.
Remueva los tubos del bao de agua con hielo y djelos que alcancen la temperatura ambiente.
Lea la absorbancia a 550 nm, usando el tubo marcado 0 como blanco de reactivo, y anote en el Cuadro 6, en la fila
correspondiente al azcar utilizado.
CUADRO 6. CURVAS DE CALIBRACIN PARA AZUCARES REDUCTORES CON DNS
Concentracin del azcar en g/mL 0 5 10 15 20 25

Absorbancia para Arabinosa 0.000

Absorbancia para Fructosa 0.000
Absorbancia para Galactosa 0.000
Absorbancia para Glucosa 0.000
Absorbancia para Lactosa 0.000
Absorbancia para Ribosa 0.000
Absorbancia para Sacarosa 0.000
Absorbancia para Xilosa 0.000
Recolecte las lecturas obtenidas por cada equipo del grupo para los otros azcares.
Elabore las curvas de calibracin para cada azcar en un mismo grfico de absorbancia vs concentracin y comente los
resultados.

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Determinacin de Azcares Totales con Fenol-Sulfrico [Ashwell, 1966]
Cada equipo har una curva de calibracin para glucosa y otro azcar asignado.
Para cada curva, prepare soluciones de 0, 20, 40, 60, 80 y 100 g/mL del azcar a analizar de acuerdo al siguiente
procedimiento.
Identifique seis tubos de ensayo de 16100 mm con los nmeros 0, 20, 40, 60, 80 y 100 y colquelos en una gradilla para
tubos de ensayo.
NOTA: Use un marcador indeleble resistente al agua en ebullicin.
NOTA: Estos nmeros corresponden a la concentracin, en g/mL, de la disolucin del azcar a probar, que se medir para
confeccionar la curva de calibracin.
Dispense en dichos tubos los volmenes de Solucin Patrn de 200 g/mL del azcar, y de agua destilada, indicados en el
Cuadro 7 a continuacin.
CUADRO 7. PREPARACIN DE CURVA DE CALIBRACIN PARA AZCARES TOTALES CON FENOL-SULFRICO
Identificar los tubos por contenido de azcar en g/mL 0 20 40 60 80 100

Agregue a cada tubo los mililitros indicados de Solucin Patrn de 200

0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00
g/mL del azcar.
Agregue a cada tubo los mililitros indicados de agua destilada y mezcle
2.00 1.80 1.60 1.40 1.20 1.00
bien en el Vortex.

Agregue a cada tubo 50 L (0.050 mL) de Reactivo de Fenol al 80% p/p y mezcle bien en el Vortex.
Rpidamente, agregue a cada tubo 5.00 mL de cido Sulfrico Concentrado y mezcle rpido y bien en el Vortex.
NOTA: Es muy importante que el cido sulfrico concentrado se agregue muy rpidamente (4 -6 segundos) y se
agite de inmediato pues se debe asegurar el calentamiento de la mezcla por el calor de dilucin del cido.
Deje los tubos en reposo por 30 minutos.
NOTA: El color es estable por varias horas.
Lea la absorbancia a 485 nm, usando el tubo marcado 0 como blanco de reactivo, y anote en el Cuadro 8, en la fila
correspondiente al azcar utilizado.
CUADRO 8. CURVAS DE CALIBRACIN PARA AZCARES TOTALES CON FENOL-SULFRICO
Concentracin del azcar en g/mL 0 5 10 15 20 25

Absorbancia para Arabinosa 0.000

Absorbancia para Fructosa 0.000
Absorbancia para Galactosa 0.000
Absorbancia para Glucosa 0.000
Absorbancia para Lactosa 0.000
Absorbancia para Ribosa 0.000
Absorbancia para Sacarosa 0.000
Absorbancia para Xilosa 0.000
Recolecte las lecturas obtenidas por cada equipo del grupo para los otros azcares.
Elabore las curvas de calibracin para cada azcar en un mismo grfico de absorbancia vs concentracin y comente los
resultados.

BIBLIOGRAFIA
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