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Dpartement de Biologie, Facult des Sciences de la Nature et de la Vie.

Universit dOran1. Travaux dirigs de biologie cellulaire. 1 re anne


Licence SNV (2016/2017) Dr DIDA N

Culture cellulaire primaire & secondaire


Dfinition :
Culture consiste en des prlvements de cellules, tissus ou organes d'un animal ou d'une
plante et leur placement ultrieur dans un environnement artificiel conduisant leur
croissance.
Lorsque les cellules sont retires des fragments d'organe avant, ou pendant la culture,
interrompant ainsi leurs relations normales avec les cellules voisines, on appelle cela
Culture de cellules.
I/ Culture primaire
Lorsque les cellules sont prleves chirurgicalement d'un organisme et places dans un
environnement de culture appropri, elles se fixent, se divisent et prolifrent : Cest la
culture primaire. Il existe 2 mthodes pour la ralisation de ce type de culture
A- Mthode dexplants
De petits fragments de tissus sont prlevs et fixs sur un rcipient de culture (type
flacon de culture en plastique strile),
Ces petits fragments vont baigner dans un milieu de culture appropri,
Aprs quelques jours, des cellules individuelles se dplacent de l'explant de
2/ Culture secondaire est ralise grce au repiquage ou
tissus vers la surface du rcipient o elles commencent se diviser et
passage des cellules issues de la culture primaire
prolifrer.
Lorsque les cellules dans le rcipient de culture primaire ont prolifr elles
doivent tre repiques pour leurde
B- Mthode donner de la place
dissociation et avoir une croissance continue.
enzymatique
Pour
Des cela,
enzymesles mmes enzymestelles
protolytiques protolytiques (trypsine
que la trypsine oucollagnase
ou la collagnase)sont
sontajoutes
rajouts
dans le milieu de culture prcdent afin de dcoller les cellules. La suspension
des petits fragments de tissus. Ces enzymes vont dissocier (sparer) les cellules :
cellulaire libre (dcolle) sera place dans dautres flacons de culture toujours, en
obtention dune suspension de cellules individuelles
prsence dautres
Ces cellules milieux de
individuelles culture.
sont places dans des flacons de culture en plastique strile
en prsence dun milieu de Milieux de culture
culture appropri pour permettre leur division et
Le changement
prolifration. des milieux de culture est indispensable tous les 2 3 jours
partir de la mise en route de la culture cellulaire et, pour assurer convenablement
les cultures cellulaires primaire et secondaire, les cellules exigent :
Eau ions minraux sources de carbone et dnergie : glucose source dacides
amins - pH constant de 7,4.
Flacons
Les milieuxdede culture typedisponibles chez de nombreux fournisseurs soit sous forme
culture sont
de Falcon
poudre contenant un
soit sous forme liquide et contiennent un mlange dacides amins,
milieu
glucose, sels de culturevitamines etc. Ces milieux de culture doivent contenir :
minraux,
Des systmes tampon
La rgulation du pH est cruciale pour obtenir les conditions optimales de
Mise en culture et repiquage des cellules sous
croissance. Le systme tampon chimique le plus utilis est: HEPES qui possde une
une hotte flux laminaire dans des conditions
capacit tampon suprieure dans la zone de pH 7,2-7,4 .
strictement striles
Rouge de Phnol

Est un indicateur de pH qui permet de contrler constamment le pH. En effet, pH


faible, le rouge de phnol rend le milieu jaune alors qu des pH levs le milieu
tourne au violet. Pour un pH adquat de 7,4 : Le milieu est rouge vif
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Universit dOran1. Travaux dirigs de biologie cellulaire. 1 re anne
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Sels minraux
Les sels minraux dans les milieux aident maintenir lquilibre osmotique des
cellules et aident rguler le potentiel membranaire en apportant des ions sodium,
potassium et calcium
Incubateur CO2 : enceinte strile et rgl Prolifration des cellules
Acides Amins
temprature de 37c pour la mise en en culture Iaire observes au
Comme les acides amins sont les composants
culture cellulaire primaire et secondaire des protines, leur prsence dans les
microscope invers
milieux de culture est indispensable. Les acides amins essentiels doivent tre inclus
dans le milieu de culture car les cellules ne peuvent pas les synthtiser elles-mmes. La
L-glutamine, un acide amin essentiel, est particulirement importante en culture
cellulaire et doit tre ajoute au milieu juste avant son utilisation des doses bien
dfinies.
Glucose (ou galactose)
Est la source dnergie majeure pour la prolifration cellulaire
Protines et peptides
Les protines et peptiques les plus couramment utiliss sont lalbumine, la
transferrine, et la fibronectine. Elles sont particulirement importantes dans les milieux si
aucun srum (type srum de veau ftal :SVF) nest ajout au milieu de culture.
Acides gras et Lipides
Ils sont gnralement fournis par lajout de srum dans le milieu de culture.
Vitamines
Beaucoup de vitamines sont essentielles la croissance et prolifration cellulaire. Les
vitamines ne peuvent pas tre synthtises en quantit suffisante par les cellules et sont
donc des supplments importants requis en culture cellulaire. Une fois de plus, lajout du
srum est la source majeure de vitamines en culture cellulaire.
Oligo-lments
Les oligo-lments tels que le cuivre, le zinc, le slnium sont souvent ajouts aux
milieux et qui sont ncessaires en trs faibles quantits pour une croissance cellulaire
correcte et pour le bon fonctionnement des enzymes.
Mlanges dantibiotiques (pnicilline et streptomycine)
Sont ncessaires pour contrler la croissance des bactries et des levures (culture
cellulaire doit se faire dans un environnement totalement strile)
Les srums ajouts aux milieux de culture
Le srum provenant de ftus (ou de nouveaux ns) bovins (SVF) est couramment
utilis pour entretenir la croissance des cellules en culture.
Le srum ftal est une source riche en : Facteurs de croissance, lalbumine, la
transferrine, la fibronectine (qui permet ladhsion cellulaire au substrat), inhibiteurs de
protases qui protgent les cellules de la protolyse, lapport de minraux, (comme Na+,
K+, Zn2+, Fe2+).
Remarque : Lajout du srum dans les milieux de culture doit tre ralis
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extemporanment (tout juste avant le dmarrage de la mise en culture) et dans