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Centre dexpertise

en analyse environnementale
du Qubec

MA. 700 Sal-tm 1.0


dition : 1999-04-29
Rvision : 2003-11-26 (1)

Mthode danalyse
Dnombrement des salmonelles :
mthode par tubes multiples
Exemple de numrotation :

MA. 203 - As 1.1

Numro de l'dition

Numro de la mthode

Identification du paramtre

00 - Gnral
01 - Air ambiant
02 - Rejets atmosphriques
03 - Eau potable, eaux naturelles, etc.
04, 14, 15 - Eaux uses (municipales, industrielles, etc.)
05, 10, 16 - Sols ou sdiments
06 - Tissus vgtaux
07 - Tissus animaux
08, 09, 13 - Rsidus (dchets, huiles, boues, etc.)
17 - Prcipitations acides
Mthode
d'analyse
approuve

100 - Proprits
200 - Mtaux
300 - Matires inorganiques non-mtalliques
400 - Matires organiques
500 - Toxicologie
700 - Microbiologie
800 - Biologie
900 - Terrain
1000 - Agricole
DITION APPROUVE LE : 29 avril 1999

Historique de la mthode

Cette mthode a t labore et implante dans le laboratoire de microbiologie du Centre


d'expertise en analyse environnementale du Qubec (CEAEQ) pour effectuer la recherche et le
dnombrement des salmonelles dans les chantillons solides et liquides. Elle utilise le milieu de
culture DSE pour lenrichissement avec la technique des tubes multiples, le milieu glos XLT4
pour isoler les colonies probables de salmonelles partir des tubes denrichissement et des
galeries biochimiques didentification pour confirmer lappartenance des colonies isoles au
genre Salmonella. Llaboration de cette mthode a t initie pour appuyer les Critres
provisoires pour la valorisation des matires rsiduelles fertilisantes (MENV, 2002).

L'approche employe dans cette mthode est similaire l'approche prsente dans le document
Control of Pathogens and Vector Attraction in Sewage Sludge (USEPA, 1999) dans la section
Appendix F Sample Preparation for Fecal Coliform Tests and Salmonella sp. Analysis. Dans
ce document, l'USEPA reproduit une mthode de Kenner et Clark (1972) qui utilise le milieu de
culture DSE pour lenrichissement, le milieu XLD pour lisolement des colonies probables des
salmonelles et divers tests biochimiques pour la confirmation des salmonelles.

La technique employe dans cette mthode pour la dtermination de la siccit (pourcentage de


matires sches) sappuie sur la mthode 2540B du manuel de rfrence Standard Methods for
the Examination of Water and Wastewater (APHA, AWWA et WEF, 1998).

Cette dition rvise de la mthode ne contient pas de modification dans la procdure analytique;
les modifications apportes lhistorique et la bibliographie constituent les seuls changements
effectus ldition originale du 29 avril 1999.

Reproduction et traduction, mme partielles, interdites sans l'autorisation du Centre


d'expertise en analyse environnementale du Qubec, ministre de l'Environnement du Qubec.

Ce document doit tre cit de la faon suivante :

CENTRE DEXPERTISE EN ANALYSE ENVIRONNEMENTALE DU QUBEC,


Dnombrement des salmonelles ; mthode par tubes multiples. MA. 700 Sal-tm 1.0,
Ministre de lEnvironnement du Qubec, 2003, 19 p.

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TABLE DES MATIRES

INTRODUCTION 7

1. DOMAINE DAPPLICATION 7

2. PRINCIPE ET THORIE 7

3. FIABILIT 8
3.1. Interfrences 8
3.2. Limite infrieure de quantification 8
3.3. Limite suprieure de quantification 8
3.4. Fidlit 8
3.5. Pourcentage de rcupration 9

4. PRLVEMENT ET CONSERVATION 10

5. APPAREILLAGE 10

6. MILIEUX DE CULTURE ET RACTIFS 11

7. PROTOCOLE DANALYSE 14
7.1. Prparation de lchantillon 14
7.2. Analyse de lchantillon 14
7.3. Observation des rsultats 15
7.4. Confirmations biochimiques 16
7.5. Dtermination du pourcentage de matires sches 16

8. CALCUL ET EXPRESSION DES RSULTATS 16

9. CRITRES DACCEPTABILIT 18

10. BIBLIOGRAPHIE 19

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INTRODUCTION

En avril 1997, le document Critres provisoires pour la valorisation des matires rsiduelles
fertilisantes (pandage, entreposage temporaire, compostage, fabrication et utilisation de
terreaux) a t produit par le Service de lassainissement agricole et des activits de
compostage de la Direction des politiques des secteurs agricole et naturel du ministre de
lEnvironnement et de la Faune. Ce document dfinit, entre autres, des critres de rfrence
microbiologiques pour lutilisation des matires rsiduelles fertilisantes. Un de ces critres est
bas sur le dnombrement des salmonelles, un groupe de microorganismes pathognes.

Les salmonelles appartiennent au groupe des Entrobactries; elles sont en forme de btonnets
Gram ngatifs et sont anarobies facultatives. Les salmonelles sont pathognes pour lhumain et
peuvent causer des fivres entriques, des gastroentrites et des septicmies.

Habituellement, dans une matrice comme leau de consommation, un dnombrement nest pas
ncessaire dans le cas des microorganismes pathognes; seul un test prsence-absence suffit.
Dans le document intitul Critres provisoires pour la valorisation des matires rsiduelles
fertilisantes (pandage, entreposage temporaire, compostage, fabrication et utilisation de
terreaux) , la norme pour les salmonelles est de < 3 NPP/4 g de matire sche, et donc une
mthode de dnombrement est ncessaire. La mthode dcrite dans ce document utilise le
principe de croissance en tubes multiples et est inspire du document publi par lUSEPA
Control of pathogens and vector attraction in sewage sludge .

1. DOMAINE DAPPLICATION

Cette mthode consiste dnombrer les salmonelles par croissance en tubes multiples.
Elle sapplique aux rsidus des fabriques de ptes et papiers, aux composts domestiques ainsi
qu toutes les matrices solides ou liquides.

Cette mthode peut tre utilise galement comme test prsence-absence dans les cas o
seulement un dpistage est requis. Habituellement, 25 g dchantillon sont alors incubs dans
225 ml du bouillon denrichissement. Il est repiqu par la suite sur la glose slective. Sil y a
des colonies caractristiques, les confirmations biochimiques sont effectues et nous pouvons
ainsi dterminer sil y a prsence de salmonelles dans 25 g dchantillon.

2. PRINCIPE ET THORIE

Le principe de la mthode NPP (NPP signifie nombre le plus probable) consiste ensemencer de
nombreux volumes ou des dilutions dun mme chantillon dans des tubes de bouillon
denrichissement et par la suite confirmer la prsence de salmonelles par repiquage des tubes
sur glose slective.

Chacune des gloses slectives positives correspond un tube denrichissement particulier.


Le nombre le plus probable de salmonelles peut alors tre estim dans une quantit spcifie
dchantillon partir du nombre et de la rpartition des tubes positifs.

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3. FIABILIT

3.1. INTERFRENCES

Les chantillons doivent tre en suspension dans leau tamponne strile (suspension de dpart)
le moins longtemps possible, de prfrence moins de 20 minutes, car il peut en rsulter un
changement de la population bactrienne initiale.

Une bonne agitation de la suspension de dpart et des tubes contenant lchantillon est
importante pour viter une sous-valuation du rsultat final.

Dans le cas dchantillons liquides, les bouteilles dchantillonnage de 250 ml remplies pleine
capacit doivent tre rejetes, car elles ne permettent pas dagiter lchantillon de faon
disperser uniformment les bactries prsentes dans tout le volume initial. Le rejet dune
portion aliquote de lchantillon au laboratoire risquerait de modifier la concentration initiale des
bactries par unit de volume dchantillon et de fausser le rsultat. Lanalyse de tels
chantillons doit faire lobjet dune remarque cet effet sur le rapport danalyse.

Pour chaque chantillon, un tube de chacune des dilutions de lchantillon est inocul avec des
concentrations variant entre 10 et 100 UFC viables dune souche de rfrence de salmonelles
afin de vrifier la prsence de substances inhibitrices (contrle positif).

3.2. LIMITE INFRIEURE DE QUANTIFICATION

La limite infrieure de quantification est de 1 NPP/4 g dchantillon humide. Cependant, les


rsultats tant exprims en NPP/4 g dchantillon sec, cette limite peut varier. Par exemple,
un chantillon ayant un pourcentage de matires sches de 30 % a une limite infrieure
de quantification de 3 NPP/4 g dchantillon sec.

Pour les chantillons ayant un pourcentage de matires sches infrieur 23 %, il faut augmenter
la quantit dchantillon et de milieu de culture afin de pouvoir respecter le critre de
< 3 NPP/4 g dchantillon sec en cas dabsence de salmonelles.

3.3. LIMITE SUPRIEURE DE QUANTIFICATION

La limite suprieure de quantification est de 640 NPP/4 g dchantillon humide. Cependant, les
rsultats tant exprims en NPP/4 g dchantillon sec, cette limite peut varier. Par exemple, un
chantillon ayant un pourcentage de matires sches de 30 % a une limite suprieure de
quantification de 21 000 NPP/4 g dchantillon sec.

3.4. FIDLIT

3.4.1. Rplicabilit

Les valeurs de la rplicabilit se trouvent dans le tableau suivant.

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Nombre de
Matrice Rplicabilit
donnes
33 NPP/ml une concentration de
Lisier de porc (liquide) n=6
70 NPP/ml
5 NPP/g humide une concentration
Compost (solide) n = 11
de 22 NPP/g humide
42 NPP/g humide une
Boue municipale (solide) n=9
concentration de 116 NPP/g humide
Boue de fabrique de ptes et papiers 5 NPP/g humide une concentration
n = 10
(solide) de 21 NPP/g humide

3.4.2 Rptabilit
Les valeurs de la rptabilit se trouvent dans le tableau suivant.

Nombre de
Matrice Rptabilit
donnes
7 NPP/ml une concentration de
Lisier de porc (liquide) n = 10
28 NPP/ml
9 NPP/g humide une concentration
Compost (solide) n = 10
de 24 NPP/g humide
3 NPP/g humide une concentration
Boue municipale (solide) n = 10
de 8 NPP/g humide
Boue de fabrique de ptes et papiers 3 NPP/g humide une concentration
n = 10
(solide) de 9 NPP/g humide

3.5. POURCENTAGE DE RCUPRATION

Le pourcentage de rcupration a t tabli partir dune souche de rfrence de Salmonella


typhimurium. Les valeurs se trouvent dans le tableau suivant.

Nombre de
Matrice Pourcentage de rcupration
donnes
Lisier de porc (liquide) n=6 92,9 %
Compost (solide) n = 11 100 %
Boue municipale (solide) n=9 91 %
Boue de fabrique de ptes et papiers
n = 10 100 %
(solide)

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4. PRLVEMENT ET CONSERVATION

Prlever un chantillon reprsentatif dans un contenant de polypropylne strile. Pour les


chantillons liquides, il est important de laisser un espace denviron 3 cm entre lchantillon et le
bouchon du contenant de prlvement afin de permettre une bonne agitation. Conserver
lchantillon environ 4 C. Le dlai de conservation entre le prlvement et lanalyse ne doit
pas excder 48 heures. Si possible, transmettre les chantillons au laboratoire dans un dlai de
24 heures aprs le prlvement. Lors de la rception au laboratoire, les chantillons qui ne
peuvent tre analyss dans les 4 heures suivant leur arrive doivent tre placs au rfrigrateur
jusquau moment de lanalyse.

5. APPAREILLAGE

Les marques de commerce apparaissant ci-dessous ne sont mentionnes qu titre de


renseignement.

5.1. Pipettes striles de 10,0 ml et 1,0 ml de type TD

5.2. Autoclave

5.3. Incubateur dont la temprature est ajuste 37 C 0,5 C

5.4. Incubateur dont la temprature est ajuste 35 C 0,5 C

5.5. Balance analytique avec une prcision de 0,01 g

5.6. pH-mtre

5.7. Agitateur Vortex

5.8. Plaque chauffante agitatrice avec barre magntique

5.9. Bain-marie ajust 40 C 0,2 C

5.10. Botes de Ptri 100 x 15 mm

5.11. Fil boucle

5.12. Tubes de borosilicate 16 x 150 mm striles

5.13. Tubes de borosilicate 18 x 150 mm striles

5.14. Rfrigrateur maintenant une temprature entre 1 C et 4 C

5.15. Rcipient en aluminium

5.16. tuve rgle 105 C 2 C

5.17. Dessiccateur

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6. MILIEUX DE CULTURE ET RACTIFS

Tous les ractifs commerciaux utiliss sont de qualit A.C.S. moins dindication contraire.
Leau utilise pour la prparation des milieux de culture et des ractifs est de leau distille,
dminralise ou ultra-pure. Les marques de commerce apparaissant ci-dessous ne sont
mentionnes qu titre de renseignement.

6.1. Phosphate de potassium dibasique, KH2PO4 (CAS no 7778-77-0)

6.2. Hydroxyde de sodium, NaOH (CAS no 1310-73-2)

6.3. Protose peptone (CAS no 73049-73-7)

6.4. Extrait de levure (CAS no 8013-01-2)

6.5. Dulcitol, C6H14O6 (CAS no 608-66-2)

6.6. Phosphate de sodium dibasique anhydre, Na2HPO4 (CAS no 7558-79-4)

6.7. Slnite de sodium, Na2SeO3 (CAS no 10102-18-8)

6.8. Sulfate de calcium anhydre ( Drierite ), comme dessiccant

6.9. Souche de Salmonella typhimurium

6.10. Solution dhydroxyde de sodium 1,0 N

Dissoudre 40,0 g de NaOH (cf. 6.2) dans environ 800 ml deau, laisser refroidir et complter
1 000 ml avec de leau. Cette solution se conserve la temprature de la pice.

6.11. Solution tampon phosphate

Dissoudre 34,0 g de KH2PO4 anhydre (cf. 6.1) dans environ 500 ml deau, ajuster le pH
7,2 avec une solution de NaOH 1 N (cf. 6.10) et complter 1 000 ml avec de leau. Cette
solution se conserve 4 C.

6.12. Eau tamponne de dilution

Ajouter 1,25 ml de la solution tampon phosphate (cf. 6.11) par litre deau. Rpartir en
volumes suffisants pour avoir 99 ml 2 ml, 90 ml 2 ml et 450 ml 5 ml aprs
strilisation. Leau tamponne de dilution se conserve deux mois 4 C.

6.13. Bandelettes pour la dtection de lactivit cytochrome-oxydase Pathotec cytochrome


oxidase, Remel Lenexa, KS

6.14. Galerie didentification biochimique Microscan Gram ngative

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6.15. Bouillon dulcitol slnite :

Protose peptone 4,0 g


Extrait de levure 1,5 g
Dulcitol 4,0 g
Slnite de sodium 5,0 g
Na2HPO4 1,25 g
KH2PO4 1,25 g
Eau 1 000 ml

Dissoudre les ingrdients dans leau par agitation sans chauffer. Ajuster le pH 7,0 0,2.
Porter bullition, ne pas autoclaver. Rpartir en volumes de 10 ml dans des tubes
borosilicate 18 x 150 mm striles. Ce bouillon se conserve une semaine 4 C. Ce produit
nest pas disponible dans le commerce.

6.16. Bouillon dulcitol slnite (double force) :

Protose peptone 8,0 g


Extrait de levure 3,0 g
Dulcitol 8,0 g
Slnite de sodium 10,0 g
Na2HPO4 2,5 g
KH2PO4 2,5 g
Eau 1 000 ml

Dissoudre les ingrdients dans leau par agitation sans chauffer. Ajuster le pH 7,0 0,2.
Porter bullition, ne pas autoclaver. Rpartir en volumes de 10 ml dans des tubes de
borosilicate 18 x 150 mm striles. Ce bouillon se conserve une semaine 4 C. Ce produit
nest pas disponible dans le commerce.

6.17. Glose XLT4 :

Peptone no 3 1,6 g
Extrait de levure 3g
L-Lysine 5g
Xylose 3,75 g
Lactose 7,5 g
Saccharose 7,5 g
Citrate dammonium ferrique 0,8 g
Thiosulfate de sodium 6,8 g
Chlorure de sodium 5g
Agar 18 g
Phnol rouge 0,08 g

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Suspendre 59,0 g de milieu dshydrat dans 1 000 ml deau, ajouter 4,6 ml de supplment
pour agar XLT4 et chauffer jusqu bullition pour dissoudre compltement. viter de
surchauffer. Ne pas autoclaver. Le pH final doit tre 7,4 0,2. Rpartir dans des botes
de Ptri de 100 x 15 mm et laisser solidifier. Les botes de Ptri se conservent
deux semaines 4 C. Le milieu de base XLT4 et le supplment sont disponibles dans le
commerce.

6.18. Glose infusion coeur-cervelle :

Infusion de cervelle de veau 200 g


Infusion de coeur de boeuf 250 g
Peptone 10 g
Dextrose 2g
Chlorure de sodium 5g
Phosphate disodique 2.5 g
Agar 15 g

Peser 52,0 g de milieu dshydrat dans un erlenmeyer de 2 000 ml et le dissoudre dans


1 000 ml deau. Chauffer le milieu au point dbullition sur une plaque chauffante jusqu
dissolution complte en remuant avec un agitateur magntique. Rpartir en volumes de
7,5 ml dans des tubes de 16 x 125 mm. Striliser 121 C pendant 15 minutes et refroidir
les tubes de faon avoir des gloses inclines. Le pH doit tre de 7,4 0,2 25 C.
Les tubes se conservent un mois 4 C. Ce milieu est disponible dans le commerce.

6.19. Bouillon infusion coeur-cervelle :

Infusion de cervelle de veau 200 g


Infusion de coeur de boeuf 250 g
Peptone 10 g
Dextrose 2g
Chlorure de sodium 5g
Phosphate disodique 2,5 g

Peser 37,0 g de milieu dshydrat dans un erlenmeyer de 2 000 ml et dissoudre dans


1 000 ml deau. Chauffer le milieu sur une plaque chauffante en remuant avec un agitateur
magntique jusqu dissolution complte. Rpartir en volumes de 50 ml dans des bouteilles
de verre. Striliser 121 C pendant 15 minutes. Le pH doit tre de 7,4 0,2 25 C.
Le bouillon se conserve un mois 4 C. Ce bouillon est disponible dans le commerce.

6.20. Glose R2A :

Extrait de levure 0,5 g


Protose peptone no 3 0,5 g
Acides casamino 0,5 g
Dextrose 0,5 g
Fcule soluble 0,5 g

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Pyruvate de sodium 0,3 g
Phosphate de potassium dibasique 0,3 g
Sulfate de magnsium 0,05 g
Agar 15 g

Dans un erlenmeyer de 2 000 ml, peser 18,2 g de milieu dshydrat et dissoudre dans
1 000 ml deau. Chauffer le milieu au point dbullition sur une plaque chauffante jusqu
dissolution complte en remuant avec un agitateur magntique. Refroidir et rpartir dans
des bouteilles de verre. Striliser 121 C pendant 15 minutes. Le pH doit tre de 7,2 0,2
25 C. Les bouteilles de milieu se conservent pendant un mois 4 C. Ce milieu de
culture est disponible dans le commerce.

6.21. Suspension de salmonelles :

Inoculer un volume de 50 ml de bouillon infusion coeur-cervelle avec une souche de


Salmonella typhimurium (cf. 6.9) et incuber 35 C pendant 18-24 heures.

Diluer la culture obtenue 10-7 dans de leau tamponne strile (cf. 6.12). Utiliser 0,1 ml de
cette dilution pour ensemencer les tubes de bouillon denrichissement contenant
lchantillon (contrles positifs).

On peut effectuer un dnombrement en triplicata par incorporation dans la glose R2A de


0,1 ml de la culture dilue 10-7 pour sassurer quelle contient entre 10 et 100 UFC
viables de salmonelles. Incuber les gloses 35 C pendant 24 heures.

7. PROTOCOLE DANALYSE

7.1. PRPARATION DE LCHANTILLON

Bien homogniser lchantillon, peser 50 g et incorporer dans 450 ml deau tamponne


strile (cf. 6.12). Agiter trs vigoureusement de faon homogniser le plus possible
lchantillon. Cette concentration correspond la dilution 10-1. Suivre la mme procdure
dans le cas dun chantillon liquide.

Pipetter 10 ml de la dilution 10-1 dans 90 ml deau tamponne strile. Cette prparation


correspond la dilution 10-2. On peut galement faire dautres dilutions pour inoculer
dautres sries de tubes si nous voulons augmenter la limite suprieure de quantification.

7.2. ANALYSE DE LCHANTILLON

Pipetter 10 ml de la dilution 10-1 dans 6 tubes contenant 10 ml de bouillon dulcitol


slnite double force (cf. 6.16) et agiter au Vortex. Chacun des 6 tubes de cette premire
srie contient 1,0 g dchantillon.

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Pipetter 1,0 ml de la dilution 10-1 dans 6 tubes contenant 10 ml de bouillon dulcitol
slnite (cf. 6.15) et agiter au Vortex. Chacun des 6 tubes de cette deuxime srie contient
0,1 g dchantillon.

Pipetter 1,0 ml de la dilution 10-2 dans 6 tubes contenant 10 ml de bouillon dulcitol


slnite et agiter au Vortex. Chacun des 6 tubes de cette troisime srie contient 0,01 g
dchantillon.

Inoculer 1 tube de chacune des 3 sries avec la suspension dilue de salmonelles (cf. 6.21)
et agiter au Vortex. Ce sont les contrles positifs.

Incuber les tubes dans un bain-marie 40 C 0,2 C pendant 24 heures 2 heures.

Incuber galement un tube de bouillon dulcitol slnite sans chantillon. Ceci est le
contrle ngatif.

Aprs lincubation, faire un prlvement avec un fil boucle dans chacun des tubes de
bouillon dulcitol slnite et inoculer pour chacun des tubes une glose XLT4 (cf. 6.17).
Faire les inoculations de faon obtenir des colonies isoles. Bien identifier chacune des
gloses avec le numro dchantillon, lidentification du tube ainsi que la dilution.

Inoculer galement des gloses XLT4 avec les tubes de contrle positifs et ngatifs.

Incuber les gloses dans un incubateur 37 C 0,5 C pendant 24 heures 2 heures.

7.3. OBSERVATION DES RSULTATS

Aprs la priode dincubation, sortir et ranger les gloses par ordre de numro
dchantillon, de tubes et de dilutions.

Examiner les gloses. Les colonies caractristiques des salmonelles sont noires, roses
avec ou sans centre noir ou jaunes avec centre noir sur la glose XLT4, alors que les
autres bactries forment des colonies jaunes sans centre noir. Les rares espces de
salmonelles qui ne produisent pas de sulfure dhydrogne (H2S ngative) formeront des
colonies roses rose-jaune. Ceci est une identification prsomptive.

Observer les contrles positif et ngatif. Il doit y avoir prsence de colonies


caractristiques sur la glose du contrle positif et absence de colonie sur la glose du
contrle ngatif. Labsence de colonies caractristiques provenant des tmoins positifs
signifie qu cette concentration lchantillon inhibe la croissance des salmonelles dans le
bouillon denrichissement. Il faut donc prendre un autre chantillonnage et refaire
lanalyse en augmentant le ratio volume de bouillon denrichissement/gramme
dchantillon. Par exemple, on pourrait incuber 5 x 1,0 g dchantillon dans 5 x 100 ml
de bouillon denrichissement, 5 x 0,1 g dchantillon dans 5 x 50 ml de bouillon
denrichissement, etc.

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7.4. CONFIRMATIONS BIOCHIMIQUES

Repiquer sur glose infusion coeur-cervelle incline (cf. 6.18) les colonies typiques des
salmonelles trouves sur la glose XLT4.

Incuber les gloses infusion coeur-cervelle dans un incubateur 35 C 0,5 C pendant


18-24 heures.

Effectuer la dtection de lactivit de la cytochrome-oxydase en faisant un frottis de


chaque colonie sur une bandelette pour la dtection de lactivit cytochrome-oxydase (cf.
6.13). Comme toutes les Entrobactries, les salmonelles ne possdent pas denzyme
appel cytochrome oxydase (raction ngative). Pour lutilisation des bandelettes, voir les
instructions du fabricant.

Faire une galerie didentifications Microscan Gram ngatives (cf. 6.14) pour chacune des
colonies oxydase ngatives. Pour lutilisation des galeries didentifications Microscan,
voir les instructions du fabricant.

On peut galement obtenir le srotypage des salmonelles lorsque cela est ncessaire dans
un laboratoire de rfrence.

7.5. DTERMINATION DU POURCENTAGE DE MATIRES SCHES

Peser 10 g ou plus dchantillon humide dans un rcipient en aluminium ou dans tout


autre contenant appropri. Noter le poids.

Scher lchantillon ltuve 105 C et laisser refroidir au dessiccateur. Peser le


contenant jusqu lobtention dun poids constant en rptant le cycle schage-
refroidissement-pesage.

Les rsultats sont exprims daprs lquation suivante :

A
P= 100
B

o
P : pourcentage de matires sches contenues dans lchantillon (%);
A : poids de lchantillon sec (g);
B : poids de lchantillon humide (g).

8. CALCUL ET EXPRESSION DES RSULTATS

Noter le nombre de tubes positifs de chaque srie dans lesquels il y a prsence de salmonelles.
Consulter la table NPP (tableau 1) afin dobtenir le nombre le plus probable.

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NOTE - Les rsultats du tableau 1 sappliquent lorsque 3 sries de 5 tubes contenant
0,1, 0,01 et 0,001 g dchantillon sont utilises. Cette mthode utilisant plutt des sries
de tubes de 1,0, 0,1 et 0,01 g dchantillon, il faut donc diviser par 10 le rsultat obtenu
dans le tableau 1.

Tableau 1 - Indices NPP par gramme ou millilitre dchantillon et limites de confiance 95 %


(avec 3 sries de 5 tubes contenant 0,1, 0,01 et 0,001 g dchantillon)

Combinaison Limite de confiance Combinaison de Limite de confiance


NPP/g NPP/g
de 95 % tubes positifs 95 %
tubes positifs infrieure suprieure infrieure suprieure
0-0-0 <2 - - 4-3-0 27 12 67
0-0-1 2 1,0 10 4-3-1 33 15 77
0-1-0 2 1,0 10 4-4-0 34 16 80
0-2-0 4 1,0 13
5-0-0 23 9,0 86
1-0-0 2 1,0 11 5-0-1 30 10 110
1-0-1 4 1,0 15 5-0-2 40 20 140
1-1-0 4 1,0 15 5-1-0 30 10 120
1-1-1 6 2,0 18 5-1-1 50 20 150
1-2-0 6 2,0 18 5-1-2 60 30 180

2-0-0 4 1,0 17 5-2-0 50 20 170


2-0-1 7 2,0 20 5-2-1 70 30 210
2-1-0 7 2,0 21 5-2-2 90 40 250
2-1-1 9 3,0 24 5-3-0 80 30 250
2-2-0 9 3,0 25 5-3-1 110 40 300
2-3-0 12 5,0 29 5-3-2 140 60 360
5-3-3 170 80 410
3-0-0 8 3,0 24
3-0-1 11 4,0 29 5-4-0 130 50 390
3-1-0 11 4,0 29 5-4-1 170 70 480
3-1-1 14 6,0 35 5-4-2 220 100 580
3-2-0 14 6,0 35 5-4-3 280 120 690
3-2-1 17 7,0 40 5-4-4 350 160 820

4-0-0 13 5,0 38 5-5-0 240 100 940


4-0-1 17 7,0 45 5-5-1 300 100 1 300
4-1-0 17 7,0 46 5-5-2 500 200 2 000
4-1-1 21 9,0 55 5-5-3 900 300 2 900
4-1-2 26 12 63 5-5-4 1 600 600 5 300
4-2-0 22 9,0 56 5-5-5 1 600 - -
4-2-1 26 12 65

Lorsquon a utilis plus de trois sries de tubes, choisir la plus petite quantit dchantillon
donnant un certain nombre de rsultats positifs ainsi que les deux sries de tubes prcdents (voir
exemples A et B, tableau 2). Multiplier lindice lu dans la table NPP par le facteur de dilution
utilis pour obtenir lestimation du nombre dorganismes prsents dans le volume de rfrence.

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Lorsque cela est possible, utiliser des sries de tubes pour lesquelles les rsultats sont ni tous
positifs et ni tous ngatifs. Dans le cas contraire, choisir les sries de tubes comportant des
rsultats positifs plutt que des rsultats ngatifs (exemple C, tableau 2).

Si moins de trois sries de tubes donnent des rsultats positifs, utiliser la srie comportant la plus
forte concentration en chantillon et les deux suivantes (exemple D, tableau 2). Situation
identique si aucune srie de tubes nest positive.

Si une seule des sries de tubes donne un rsultat positif, utiliser cette dilution et celle
immdiatement suprieure et infrieure (exemple E, tableau 2).

Tableau 2 - Exemples de dduction du NPP partir du nombre de rsultats positifs dans des
sries de 5 tubes en utilisant le tableau 1

Exemple Quantit dchantillon dans la srie de tubes


dans le texte 1,0 g 0,1 g 0,01 g 0,001 g 0,0001 g NPP/g
A 5* 3* 2* 0 14
B 5 5* 3* 2* 0 140
C 5* 5* 2* 0 0 50
D 3* 1* 0* 0 1
E 0* 1* 0* 0 <1
* Rsultats servant dterminer les indices NPP.

Puisque les rsultats des tableaux 1 et 2 sont exprims en NPP/g humide, faire le calcul pour
avoir un rsultat final en NPP/4 g sec selon la formule suivante :

Rsultat en NPP/4 g sec :

Rsultat en NPP / g humide


100 4
% de matires sches

Exemple : un chantillon qui a 32 % de matires sches a un dnombrement de salmonelles de


140 NPP/g humide.

140
100 4 = 1750 NPP / 4 g sec
32

9. CRITRES DACCEPTABILIT

Les contrles positifs et ngatifs doivent donner les rsultats attendus.

La temprature du bain-marie doit tre maintenue 40 C 0,2 C pendant toute la dure de


lincubation.

La temprature de lincubateur doit tre maintenue 37 C 0,5 C pendant toute la dure de


lincubation.

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Les prescriptions applicables trouves dans le document DR-12-SCA-02, intitul Lignes
directrices concernant lapplication des contrles de la qualit en microbiologie , devront tre
ralises et conformes.

10. BIBLIOGRAPHIE

AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION, AMERICAN WATER WORKS


ASSOCIATION AND WATER POLLUTION CONTROL FEDERATION, Standard
Methods for the Examination of Water and Wastewater, 20th Edition, 1998.

CENTRE DEXPERTISE EN ANALYSE ENVIRONNEMENTALE DU QUBEC, Lignes


directrices concernant lapplication des contrles de la qualit en microbiologie,
DR-12-SCA-02, Ministre de lEnvironnement du Qubec, dition courante.

MINISTRE DE LENVIRONNEMENT, Critres provisoires pour la valorisation des matires


rsiduelles fertilisantes, Service de lassainissement agricole et des activits de
compostage, novembre 2002.

USEPA, Control of Pathogens and Vector Attraction in Sewage Sludge, EPA/625/R-92/013, rev.
October 1999.

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