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Microbiologia

Departamento de Zoologia da Universidade de


Coimbra
MICROBIOLOGIA
Antnio Verissimo
Paula Morais

Mtodo do Nmero Mais Provvel

Introduo

O mtodo do NMP permite calcular o nmero de um microorganismo


especfico numa amostra de gua, utilizando tabelas de probabilidade.
Diluies decimais da amostra so inoculadas em sries de tubos contendo
meio lquido selectivo. Os tubos so positivos quando tm crescimento e/ou
produo de gs de fermentao.
A densidade bacteriana determinada pela combinao de resultados
positivos e negativos numa tabela designada por tabela do NMP.
Este mtodo constitudo por trs testes:
- Teste Presuntivo
- Teste Confirmativo
- Teste Completo.

O Teste Presuntivo fornece uma estimativa preliminar da densidade do


grupo bacteriano baseada no enriquecimento em meio minimamente restritivo.
Os resultados deste teste no podem ser usados sem confirmao posterior.
O Teste Confirmativo a segunda fase do NMP.
Os tubos considerados positivos no teste anterior so inoculados em tubos
de meio mais selectivo e inibidor. As reaces positivas so lidas e a densidade
calculada com a ajuda da tabela NMP.
O Teste Completo a terceira etapa. utilizada apenas na determinao do
nmero de coliformes totais. Os tubos positivos do teste anterior so submetidos
a testes adicionais para isolamento e identificao dos microorganismos. Devido
morosidade deste teste, ele no normalmente utilizado.

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Microbiologia

Definio dos grupos indicadores de contaminao

Coliformes - Este grupo tambm designado por coliformes totais inclui


todas as bactrias Gram negativas, aerbias facultativas, capazes de fermentar
lactose, com produo de gs, em 24-48 h a 35 C.
A definio inclui os gneros: Escherichia, Citrobacter, Enterobacter e
Klebsiella.

Coliformes fecais - So parte do grupo dos coliformes totais e incluem


bactrias Gram negativas, facultivas e que podem fermentar lactose em 24 h a
44,5 C, com produo de gs.
Este grupo constitudo quase exclusivamente pela espcie Escherichia
coli, espcie indicativa de poluio fecal e portanto da possvel presena de
espcies entricas patognicas.

"Streptococus" fecais - Este grupo inclui os estreptococos que indicam a


qualidade sanitria da gua e incluem as seguintes espcies: S. faecalis, S.
faecium, S. bovis, S. equinus e S. avium.

Material

Amostra de gua
Tubos de LTB (Lauril Triptose Broth) (2X) com tubos invertidos
Tubos de LTB (1X) com tubos invertidos
Tubos de AD (Azida Dextrose) (2X) com tubos invertidos
Tubos de AD (1X) com tubos invertidos
Tubos de BGLB (Brilliant Green Lactose Bile Broth) com tubos
invertidos
Tubos de EC (Escherichia coli) com tubos invertidos
Caixas de BEA (Biles Esculina Agar)
Anas de inoculao
Incubadora a 37C
Banho a 44,5C
Culturas de controlo
Tubos de diluio com tampo

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Mtodo

Teste Presuntivo

- Para este teste, organizar 5 sries de 5 tubos de meio de cultura selectivo


(LTB e AD).
A primeira srie deve ser de meio concentrado 2X.
- Agitar a amostra vigorosamente.
- Fazer diluies decimais seriadas da amostra:
retirar 1ml de amostra e colocar em 9ml de tampo;
agitar;
retirar 1ml da diluio anterior e colocar em 9ml de tampo
agitar.
Repetir at atingir a diluio desejada que neste caso de 10-3.
- Inocular cada srie de 5 tubos com diluies decimais decrescentes, da
amostra:
inocular na 1 srie 10ml de amostra;
inocular na 2 srie 1ml de amostra;
inocular na 3 srie 0.1ml de amostra;
inocular na 4 srie 0.01ml de amostra;
inocular na 5 srie 0.001ml de amostra;
- Incubar os tubos 24 horas a 37C.
- Ler os resultados.
So positivos os tubos de LTB que contiverem gs.
So positivos os tubos de AD que tiverem crescimento.
Os tubos positivos devem ser imediatamente confirmados no Teste
Confirmativo.
Os tubos negativos so reincubados mais 24 horas.
- Ler os resultados aps o 2 perodo de incubao.
Se houver novos tubos positivos eles so tambm confirmados no Teste
Confirmativo.

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Teste Confirmativo

Confirmao de coliformes totais

-Inocular cada tubo positivo de LTB em meio de BGLB.


-Incubar os tubos de BGLB a 37C por um perodo de 24horas.
-Ler os resultados.
So positivos os tubos que contiverem gs.
Os tubos negativos aps este primeiro perodo de incubao so
reincubados mais 24 horas.
-Tomar nota do total de tubos positivos aps os dois perodos de
incubao.

Confirmao de coliformes fecais

- Inocular cada um dos tubos positivos de LTB em meio de EC.


- Incubar os tubos de EC 24 horas a 44.5C.
- Ler os resultados.
So positivos os tubos que contiverem gs.
- Tomar nota do total de tubos positivos.

Confirmao de Streptococcus fecais

-Inocular caixas de Petri com meio de BEA a partir de cada um dos tubos
positivos.
-Incubar 24 horas a 37C.
-Ler os resultados. So positivos sempre que houver produo de
pigmento negro.
Reincubar as caixas negativas por mais 24horas.
-No final dos dois perodos de incubao, tomar nota do total de caixas
positivas.

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Clculo do valor do NMP

-O clculo da densidade de bactrias do grupo testado baseado no


nmero de tubos positivos de cada diluio, no Teste Confirmativo ( ou
Completo).
O resultado dado com limite de 95% de confidncia.
-So necessrias 3 diluies para formular o cdigo que permite a leitura
na tabela do NMP.
-O nmero de cdigo tem 3 dgitos, sendo cada um, o nmero total de
tubos positivos em cada diluio e por ordem decrescente de volume de
inculo.
-Quando as sries de diluies decimais so diferentes de 10, 1 e 0.1ml de
amostra (diluies para as quais a tabela est elaborada), o valor do NMP
calculado pela frmula:

NMP= NMP da tabela X __________10_______


maior quantidade testada

-Se foram testados mais de trs volumes de amostra, determinam-se as


trs diluies mais significativas de acordo com as regras do NPM.

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