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Notions DE BIOLOGIE

MOLECULAIRE:
dfinitions, historique
et techniques
--------------------------
COURS DU Prof. YAPO A. Francis
1
OBJECTIFS

- Donner lhistorique de la
biologie Molculaire pour mieux
comprendre le vivant

- Montrer limportance de la
complmentarit entre les disciplines
scientifiques (gntique, biochimie,
physique)
2
1- DEFINITION

La Biologie Molculaire est une discipline


scientifique au croisement de la Gntique,
de la Biochimie et de la Physique, dont
l'objet est la comprhension des
mcanismes de fonctionnement de la
cellule au niveau molculaire.
3
La Biochimie est l'tude des substances
chimiques et des processus vitaux qui se
produisent dans les organismes vivants.

4
La Gntique est la science qui tudie
l'hrdit et les gnes.

Cest-dire la science du vivant qui tudie la


transmission des caractres hrditaires.

5
-1938: Invention du terme Bio Mol par
Warren Weaver,

(1894-1978)

6
- La biologie molculaire est une
science qui se consacre l'tude des
molcules entrant dans le message
hrditaire, en particulier les acides
nucliques (ADN, ARN).

- La biologie molculaire dsigne


galement les techniques d'tude des
gnes = Gnie gntique
7
1.1- Dfinition du gne

8
Gne = lment constitutif du
chromosome

Gne = ADN

Gne = responsable de la
transmission et de lexpression du
Caractre hrditaire. 9
au XXe Sicle,
dcouverte du Chromosome

identification de l'ADN comme


support chimique de l'information
gntique
10
1.2- dfinition du chromosome
Le chromosome est une structure en forme
de btonnet situe l'intrieur du noyau
de chaque cellule. Il sert de support aux
gnes qui contiennent l'information
hrditaire.
23 paires de chromosomes dans chaque
cellule humaine = 22 paires communes + 1
paire de chromosomes sexuels (XX chez la
femme et XY Chez l'homme).
11
centromre

chromatides

tlomres

Fig 1: Le Chromosome 12
2- HISTOIRE DE LA BIOLOGIE
MOLECULAIRE

Relation avec les autres


sciences biologiques

13
2.1- MENDEL: LEMERGENCE DE
LA GENETIQUE FORMELLE
A. J. Gregor
Mendel
1822-1884

La gntique moderne remonte aux


travaux de Augustin Johann
Gregor Mendel , qui le premier
tablit les lois de l'hrdit en 1866.

14
2.2- MORGAN: CHROMOSOME
SUPPORT DE LHRDIT en 1910
Thomas
Hunt
-Les gnes sont localiss sur les
Morgan
(1866-1945) chromosomes,

-Alfred Henry Sturtevant a


montr les premires cartes
gntiques en 1913 (les gnes
A. H. sont ordonns sur les
Sturtevant
(1891-1970 chromosomes) 15
2.3- GARROD : LA CONVERGENCE DE
LA BIOCHIMIE ET DE LA
GENETIQUE
Sir Archibald
Edward Garrod
(1857-1936)

En 1902 Archibald E. GARROD a tablie la


premire relation entre un gne et un
enzyme partir d'une observation portant
sur une maladie gntique humaine
(Alkaptonuria).
16
BEADLE et TATUM approfondissent
cette relation sur un systme
accessible l'exprimentation, le
champignon Neurospora crassa.

17
1866 1941 Beadle - Tatum
Modle dtude: George Wells Beadle
le champignon (1903-1989)
Neurospora crassa Prix Nobel de Physiologie
L'analyse gntique des et de Mdecine
mutants de Neurospora 1958
crassa montre que chacune Edward Lawrie
des dficiences sgrge de Tatum
faon mendlienne
(1909-1975)

Les gnes contrlent la synthse des enzymes. Un gne une enzyme


18
CONCLUSION :
les gnes contrlent la synthse
des enzymes,
chaque protine est code par
un gne bien donn.

19
2.4- GRIFFITH ET AVERY: LADN, SUPPORT
DE LINFORMATION GNTIQUE

Le 1er phnomne qui allait permettre


de progresser dans l'identification du
support de l'hrdit est celui de la
transformation bactrienne, rapport
en 1928 par l'anglais Griffith. Cette
dcouverte est toutefois accueillie
avec beaucoup de scepticisme.
20
1866 1928 Frederick Griffith

F. Griffith dcrit la prsence


dun principe transformant
Responsable dun changement Frederick
Griffith
(1877-1941)
de phnotype des pneumocoques
R (rough = Rugueux) non
pathognes en S (smooth = lisse)
pathogne. 21
1866 1928 Frederick Griffith

La souche S (smooth) possde une


capsule que n'a pas la souche R (rough)

Les bactries de la varit R sont


dpourvues d'une enveloppe de
polysaccharides qui recouvre les bactries
normales de la varit S. Cette enveloppe,
appele capsule, protge la bactries
contre les attaques du systme
immunitaire.
Souche S Souche R
(l'absence de la capsule est due une
mutation causant une anomalie dans une
des enzymes ncessaires la synthse de
cette capsule) 22
1866 1928 Frederick Griffith

Fig2: Experience de Griffith 23


1866 1928 Frederick Griffith

Prsence dun principe


transformant Responsable dun
changement de phnotype des
pneumocoques R (rough) non
pathognes en S (smooth)
pathogne 24
Ce phnomne est un test d'activit
biologique, pouvant dterminer la
nature du matriel gntique. Ce test
ne sera pas mis profit par Griffith lui
mme, mais par Avery qui l'utilise
pour lucider la nature biochimique du
matriel gntique : il s'agit de l'ADN.
L'lucidation de la structure de l'ADN
par Watson et Crick (1953)
25
1866 1944 Oswald Avery

Expriences de Oswald
Purification du facteur
transformant partir de
1935
Toutes les expriences
conduisent au mme
rsultat, le principe
transformant nest pas une
protine mais un acide Oswald Avery
nuclique de type (1877-1955)
dsoxyribonuclique. 26
1866 1944 Oswald Avery

Les arguments de Oswald Avery


Le facteur transformant rsiste aux
tempratures de dnaturation des protines.
Les tests colorimtriques prouvent quil ny a
pas dans le matriel transformant purifi, ni
protines, ni ARN mais seulement de lADN.
Les tests enzymatiques montrent que le
principe transformant est insensible aux
enzymes qui dgradent les protines et les ARN.
27
1866 1950 Erwin Chargaff

En 1950, les travaux de


Erwin Chargaff ont montr
que dans une squence
dADN, le nombre de
Erwin Chargaff
molcules d'adnine est
(1905 - 1992) gal au nombre de
molcules de thymine, et
que celui de cytosine est
gal celui de guanine
28
Les relations de Chargaff.
29
1866 1951 Rosalind Franklin

Caractristiques
de lADN

Maurice Wilkins Rosalind Franklin


1916-2004 1920-1958
Fournissent des prcisions sur la structure
hlicodale de lADN, le diamtre de la
molcule, la distance entre les bases. 30
Les clichs de diffraction aux rayons X
dADN cristallis, montrs par Rosalind
Franklin et Maurice Wilkins du King's
College. Ces clichs montrent une figure
en croix, caractristique des structures
en hlice.
31
1866 1951 Rosalind Franklin

Fig 3: image des diffraction des rayons X dun


cristal dADN 32
1866 1951 Rosalind Franklin

Forme A Forme B
Fig 4: Structures hlicoidales de lADN 33
34
les analyses en microscopie lectronique, ont
montr que le diamtre de la molcule
d'ADN est 20, ce qui suggrait que cette
molcule comporte deux chanes de
dsoxyribose-phosphate

35
1866 1953 Watson et Crick

- Chercheurs au Cavendish de Cambridge

Francis Harry Compton James Dewey


Crick (1916-2004) Watson (1928- )

Quont-ils fait ?

36
1866 1953 Watson et Crick

Les deux chercheurs disposent


alors des lments suivants :
la composition chimique de l'ADN
(dsoxyribose, bases azotes et
groupements phosphate)
LADN est en double brin et sous
forme dhlice 37
Adnine

Guanine
Fig 5 :Structure des bases puriques 38
Thymine

Cytosine
Fig 6 :Structure des bases pyrimidiques
39
Uracile 2,4dihygroxypyrimine

Fig 6 :Structure des bases pyrimidiques


40
STRUCTURES DU SUCRE DES
ACIDES NUCLEIQUES

41
Fig 7: Structure du sucre 42
LES NUCLEOSIDES

Nucloside (ADN) = Base + Sucre (dsoxyribose)

Nucloside (ARN) = Base + Sucre (ribose)

43
STRUCTURE DES NUCLEOTIDES

Nuclotide = Base + sucre + phosphate

44
Fig 8: Structure des nuclotides 45
EXEMPLE DUN NUCLEOTIDE

46
Fig 9: Structure de lAMP 47
Fig 10: Structure de la cytidine 48
DENOMINATION DES
NUCLEOSIDES ET DES
NUCLEOTIDES

49
50
LIAISON ENTRE LES
NUCLEOTIDES

51
Fig 11: mcanisme dlongation dun brin dADN
52
1866 1953 Watson et Crick

Caractristiques de la Double Hlice

- LADN est une hlice double brin


- Positions des bases et des sucres dans la
double hlice

53
1866 1953 Watson et Crick

Fig 12: Structures hlicoidales et primaire de lADN


54
- Dimensions de la double hlice ADN B
* 10 paires de base = Pas dhlice (34)
avec 1 10-10 m
* 0,34 nm entre deux paires de base
- Assemblage des deux chanes de la
double hlice par des liaisons
hydrognes
- Les diffrentes bases peuvent tre
agences dans nimporte quel ordre
55
Fig 13: APPARIEMENT DES BASES AZOTES 56
20
-

3,4nm

Fig 14: La structure en double-hlice 57


Modle de lADN selon Watson et Crick en
1953 (1)
Le Modle de lADN repose sur:
- La composition chimique de lADN dont quatre (4)
bases azotes [Adnine (A), Thymine (T), Cytosine
(C) et guanine (G)], un sucre (dsoxyribose) et
lacide phosphorique (H3PO4). Lassociation de ces
composs forme le nuclotide.
-

- Les nuclotides sont aligns sur deux cordons ou


brins qui tournent autour de leur axe.
58
Modle de lADN selon Watson et
Crick en 1953 (2)

- Les liens transversaux de ces deux cordons ou


brins sont tablis par la formation de paires: A et T,
G et C travers des liaisons hydrognes.

- en conclusion, l'ADN ressemble un escalier en


colimaon en double hlice.

59
1866 1962 Watson - Crick - Wilkins

The Nobel Prize in Physiology or Medicine


1962
"for their discoveries concerning the
molecular structure of nucleic acids and
its significance for information transfer in
living material"

60
1866 1960 Jacob et Monod

Dcouverte de lARN messager


Dmonstration de
lexistence dun
intermdiaire
entre lADN et les
protines.
Jacob, Monod et Lwoff

Jacob, Monod et Lwoff, prix Nobel de Mdecine


et de Physiologie en 1965
61
1866 1961 Nirenberg
Dcryptage du code gntique

Marshall
Heinrich Matthaei
Nirenberg
(1927-)

Nirenberg, prix Nobel de Mdecine


et de Physiologie en 1968 62
Fig 15: Le code gntique 63
LES CARACTERISTQUES DU CODE
GENETIQUE

20 acides amins
43 = 64 Possibilits
Le code gntique est:
Spcifique, car constitu de codons
qui sont des triplets de nuclotides et
ils codent pour un acide amin.
64
- Ponctu : Le codon dinitiation est le
codon AUG (GUG pour la mitochondrie)
et les codons de terminaison sont les
codons UAA (ocre), UAG (ambre) et UGA
(opale). Le codon UGA (opale) nest pas
prsent au niveau de la mitochondrie
- dgnr ou redondant: c'est--dire
que plusieurs codons peuvent coder le mme
acide amin

65
- - Universel: le code gntique est le mme
pour tous les organismes vivants
procaryote et eucaryote.

- - Le code gntique est non-chevauchant:.


Les nuclotides dun codon ne codent que
pour un seul acide amin, ainsi le prochain
acide-amin sera cod par le prochain
codon prsent sur lARNm. On parle du
cadre de lecture (ou reading frame).
66
3- Techniques de biologie
molculaire

67
Ces techniques ont permis de caractriser, isoler
et manipuler les composants molculaires des
cellules et des organismes:

l'ADN, support de l'information gntique,


l'ARN, proche de l'ADN et qui est une partie
fonctionnelle et structurelle de l'appareil
traductionnel,
les protines, molcules structurelles et
enzymatiques les plus importantes des cellules.
68
3.1- Clonage d'expressions (1)
Cest lune des techniques les plus
lmentaires en biologie molculaire pour
tudier le rle des protines. Dans cette
technique, l'ADN codant la protine qui nous
intresse est clon en utilisant :
la raction en chane par polymrase (PCR
en anglais pour Polymerase Chain
Reaction) et/ou
69
Clonage d'expressions (suite)
et/ou
des enzymes de restriction dans un plasmide
(qu'on appelle vecteur d'expression). Ce
plasmide peut avoir des lments de squences
promotrices spciales pour diriger la
production de la protine en question et peut
aussi avoir des marqueurs de rsistance
antibiotique pour aider suivre le plasmide.

70
Fig 16: Structure dun plasmide
Clonage d'expressions (suite)
Ce plasmide peut tre insr dans des cellules, soit
de bactrie, soit d'animal. Introduction de l'ADN
dans des cellules bactriennes est appele
transformation et dans une cellule animale est
appele transfection.
Plusieurs techniques diffrentes de transfection
sont disponibles : transfection calcium phosphate,
transfection de liposomes ou lipofection,
lectroporation ou encore par ractifs de
transfection
72
3.2- Raction en chane par polymrase
ou Polymerase chain reaction (PCR) (1)

Cest une technique extrmement flexible de


copie d'ADN. En gros, la PCR permet une simple
squence d'ADN d'tre copie des millions de fois,
ou d'tre altre par des moyens prdtermins.
Par exemple, la PCR peut tre utilise pour
introduire des sites d'enzymes de restriction, ou
pour muter (changer) des bases particulires de
l'ADN.
73
PCR (suite)
La PCR peut aussi tre utilise pour dterminer si
un fragment particulier d'ADN se trouve dans une
bibliothque dADN complmentaires. La PCR a de
nombreuses variations, comme la PCR
transcription inverse (RT-PCR en anglais pour
Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)
pour l'amplification de l'ARN, et, plus rcemment,
la PCR temps rel (qPCR) qui permet des mesures
quantitatives de molcules d'ADN et d'ARN.

74
Fig.17: photo dun thermocycleur 75
Fig 18: Le cycle de raction de la PCR
Fig 19: Amplification de lADN par la PCR
3.3- lectrophorse
Elle permet la sparation de l'ADN, l'ARN et les
protines par des champs lectriques.
Dans l'lectrophorse en gel dagarose, l'ADN et
l'ARN peuvent tre spars en fonction de leur
taille.
Les protines peuvent tre spares en fonction de
leur taille en utilisant un gel SDS-PAGE ou en
fonction de leur charge lectrique en utilisant un
gel isolectrique.
78
3.4- Southern blot
Deriv du nom du biologiste Edwin Southern, le
Southern blot est une mthode pour sonder la
prsence d'une squence prcise d'ADN l'intrieur
d'un chantillon d'ADN.

Des chantillons d'ADN avant ou aprs digestion


par une enzyme de restriction sont spars par
lectrophorse et transfrs sur une membrane par
marquage via action capillaire en utilisant une
sonde ADN marque.
79
3.5- Northern blot
Le northern blot est utilis pour tudier les modles
d'expression d'un type spcifique de molcule d'ARN
en comparaison relative avec un ensemble de
diffrents chantillons d'ARN.
C'est essentiellement une combinaison d'une
dnaturation d'lectrophorse d'ARN, et d'un blot.
Dans ce processus, l'ARN est spar en fonction de la
taille, puis est transfr sur une membrane qui est
alors sonde avec un complment marqu pour la
squence indique.
80
3.6- Western blot (1)
Sparation des protines par lectrophorse SDS-
PAGE uniquement en fonction de leur taille (le SDS,
ou sodium dodcylsulfate, dnature les structures
tertiaire et quaternaire des protines et les charge
toutes ngativement), puis transfert des protines
spares sur membrane pour les rendre accessibles
divers marquages immunologiques ou autres.

81
Western blot (suite)
Les anticorps pour la plupart des protines
peuvent tre crs par injection de petites
quantits de protine cible dans les animaux
tels que la souris, le lapin, le mouton ou l'ne
(anticorps polyclonaux) ou produits dans une
culture de cellules (anticorps monoclonaux).
Ces anticorps peuvent tre utiliss dans une
varit de techniques analytiques et
prparatives.
82
Western blot (suite)

Les termes Western et Northern sont des


jeux de mots : les premiers blots taient sur
l'ADN, et comme ils ont t faits par Edwin
Southern, ils ont pris le nom de Southern
(southern veut dire du sud en anglais ;
tandis que western signifie de l'ouest et
northern, du nord ).

83
3.7- Puce ADN (1)
Une puce ADN ou microarray, est une collection
de milliers de puits microscopiques sur un support
solide tel qu'une lame de microscope; chaque
puits contient un grand nombre de fragments
d'ADN identiques qui permet de mesurer
l'expression d'un gne particulier par
complmentarit de squence avec lARN
correspondant.

84
Puce ADN (suite)

Les puces permettent ainsi de connaitre le


transcriptome, c'est--dire l'ensemble des
gnes transcrit un moment donn dans un
groupe de cellules donnes.

85
Puce ADN (suite)
Il existe diffrentes manires de fabriquer des
puces ADN ; les plus courantes sont les
puces silicium, lames de microscope dont
les taches ont 100 microns de diamtre, les
puces qu'on peut adapter ses besoins, et
celles avec des taches plus grosses sur des
membranes poreuses (macropuces).

86
Fig 20: Puce ADN 87
3.8- Technologie abandonne
Au fur et mesure que de nouvelles
procdures et de nouvelles technologies
sont devenues disponibles, les anciennes
sont rapidement abandonnes. Des
exemples typiques sont les mthodes
pour dterminer la taille des molcules
d'ADN.

88
Technologie abandonne
Avant l'lectrophorse, avec agarose et
polyacrylamide, on calculait la taille de l'ADN par
sdimentation dans des gradients sucrs, une
technologie lente et laborieuse ncessitant une
instrumentation coteuse ; et avant les gradients
sucrs, on utilisait la viscomtrie.
Indpendamment de leur intrt historique, il est
intressant de connatre les anciennes techniques
car cela peut tre utile pour rsoudre des
problmes particuliers.
89
CONCLUSION GENERALE

Figure 21 : Relation schmatique entre la


biochimie, la gntique et la biologie
molculaire 90