AREAS DE APLICACIN

Biologa Celular: Microscopia (electrnica,

fluorescencia)

Biologa Molecular (Protenas, ARN y ADN)

Tcnicas micas (Protemica, Transcriptmica,

Genmica, Metabolmica)

Desarrollos Computacionales
 Para que sirven?

Investigacin Bsica

Diagnstico.

Produccin (ingeniera gentica)

Caracterizacin (control de calidad hasta anlisis fornsico)

Tcnicas de Estudio de Biologa Molecular: cidos Nucleicos

Clonado: aislamiento y amplificacin de fragmentos de

ADN.

Hibridacin: Deteccin, Caracterizacin y Amplificacin.

Secuenciacin: determinacin de secuencias de genes y

genomas.

Manipulacin: Tecnologa del ADN Recombinante.

ESQUEMA
CLONADO
O La clonacin molecular se refiere al
proceso de aislar una secuencia de DNA
de inters, insertarlo en un VECTOR y
obtener mltiples copias de ella
obteniendo uniformidad gentica.
O Normalmente esto se realiza en
organismos procariotas.
O Propiedad bsica del DNA que permite
el clonado: acoplamiento de cadenas
por complementariedad. La
extraordinaria especificidad del
reconocimiento entre secuencias de
bases complementarias constituye un
poderoso instrumento del manejo de los
cidos nucleicos.
 VECTORES
O Son molculas transportadoras que transfieren y replican fragmentos de ADN de inters

ESTABLE : Posee secuencias que permiten su permanencia

en una clula husped (integrado o como episoma)

MCS : (multiple cloning site) sitio para insertar el ADN a

clonar. Posee secuencias de corte para varias ER

MARCADORES DE SELECCIN: Confieren propiedades

fenotpicas a la clula husped que permite seleccionar
a aquellas que reciban el vector.
MARCADORES DE INSERCIN (SCREENING): permite
identificar aquellos vectores que recibieron el ADN de
inters
 TIPOS DE VECTORES SEGUN SU ESTRUCTRA
O PLSMIDOS: Limite de clonado 0,1 - 10 Kb.

O FAGOS o VIRUS: Derivados del bacterifago o virus eucariotas

(plantas o de insectos). Lmite de clonado 8 -25 Kb.

O CSMIDOS: Combinacin de fago y plsmido. Limite de clonado

35 - 50 Kb

O BAC: (Bacterial Artificial Chromosome) Derivados del plsmido F.

Lmite de clonado 75 - 300Kb

O YAC: (Yeast Artificial Choromosome ). Cromosoma artificial de

levadura. Lmite de clonado 100 - 1000 Kb
 TIPOS DE VECTORES SEGUN SU FUNCIN

O VECTORES DE CLONADO: Aislamiento de

fragmentos de DNA.

O VECTORES DE EXPRESIN: Expresin de genes

clonados.

O VECTORES ESPECIALES: Permiten el estudio de

promotores y secuencias regulatorias de la
expresin gnica
 HERRAMIENTA FUNDAMENTAL
O Las enzimas de restriccin :
Endonucleasas de bacterias que reconocen secuencias de DNA especficas y luego cortan
los cidos nucleicos por el esqueleto azcar-fosfato.
Proporcionan una forma de cortar el DNA en forma especficas, produciendo una poblacin
heterognea de fragmentos.

Nomenclatura
EcoRI: E. Coli
BamHI: Bacillus amyloliquefaciens
 HERRAMIENTA FUNDAMENTAL
Tipo I y III: cortan el DNA en puntos distintos al de reconocimiento (a distancia fija del
lugar de reconocimiento por ende, son secuencias al azar).
Tipo II: cortan justo en los puntos que reconocen, que son repeticiones invertidas o
palndromes
Corte plano: extremos romos
Corte escalonado: extremos pegajosos o cohesivos
 SITIO DE CLONADO MULTIPLE (MCS)

O Regin del vector que posee varias secuencias compatibles con

sitios de corte de enzimas de restriccin.
O Estos sitios son de corte nico en todo el vector.
O Normalmente esta asociado al marcador de screening.
 LIGACIN

O Representa el proceso
formacin del enlace
fosfodister que se perdi
durante el proceso de
restriccin.
O Lo realiza una enzima
especializada llamada ADN
ligasa
 TRANSFORMACIN
O Introduccin de material gentico en las bacterias en forma estable.
O Hay que generar bacterias competentes
O Dos formas:
O Mtodos qumicos: Cl2Ca Eficiencia: 107 cel/g DNA.
O Mtodos fsicos: Electroporacin Eficiencia: 1010 cel/g DNA. Es un
proceso de despolarizacin de la membrana de corta duracin y alta
intensidad que genera poros transitorios por los cuales entra el ADN
 SELECCIN

O Es el proceso que me permiten crecer SOLO aquellas clulas

que poseen el vector (seleccin positiva)
O Para lograr esto, el vector posee: MARCADORES DE
SELECCIN
O TIPOS:
O Resistencia a antibiticos: Ampicilina, tetraciclina,
Kanamicina, Zeocina
O Supresin de auxotrofa: gen que restaura alguna actividad
metablica vital Ej. Sntesis de algn aminocido.
 SCREENING
O Es el proceso de BUSCAR aquellas clulas que poseen el vector
con el inserto de ADN deseado.
O En este caso se aplican una serie de tcnicas que me permiten
una bsqueda dirigida.
O Tcnicas:
O Utilizando marcador de screening: -complementacin, GFP
(green fluorescent protein, gen ccdB (sistema suicida), el
producto del gen de inters. (Western Blot o actividad
enzimtica)
O Utilizando la secuencia del propio fragmento de inters:
(Colony PCR, Mapeo de restriccin, Hibridacin in situ ).
 MARCADOR DE SCREENING
O Es un sistema que se basa en la bsqueda del clon de inters visualizando un
cambio en la caracterstica fenotpica de la bacteria que halla recibido el
fragmento de ADN de inters en el vector.
O El MARCADOR DE SCREENING es un gen activo que esta asociado al MCS.
O El sistema de a-complementacin es el ms utilizado y se basa en el gen de la
enzima b-galactosidasa (lacZ)
SISTEMA DE a-COMPLEMENTACIN
 Hibridacin

Southern Blot

Son tcnicas que se basan en la

Northern Blot propiedad de
complementariedad de bases
del ADN, generando hbridos
PCR artificiales de cidos nucleicos.

Variantes de PCR
 Blots
O Son tcnicas que me permiten detectar la presencia de una
secuencia de cido nucleico especfica en una mezcla compleja
de estas molculas a travs de los procesos de hibridacin
O Cuando la mezcla de cidos nucleicos es ADN la tcnica se llama
Southern Blot, cuando es ARN, Northern Blot,
O Se basa en 3 pilares:
a) Generacin de una mezcla de cidos nucleicos de diferentes
tamaos. (corte con enzimas de restriccin o por mtodos
qumicos)
b) Separacin de la mezcla de los cidos nucleicos de diferentes
tamaos por tcnicas electroforticas.
c) Deteccin de secuencia especfica por hibridacin, utilizando
una sonda con una marcacin que me permite visualizarla.
 Tcnicas Electroforticas
O Se basan en la migracin diferencial de las molculas a separar en
un campo elctrico.
O Generalmente se lleva a cabo en un soporte inerte. (AGAROSA
para ADN, poliacrilamida para Protenas o ADN)
O La fuerza que provoca la migracin de las molculas es el campo
elctrico, pero el gel acta como filtro molecular, relentizando la
migracin haciendo que se muevan en funcin de su tamao
 Sondas
O Son oligonucletidos sintticos o fragmentos de DNA de simple
cadena complementarias a la regin de DNA o RNA blanco.
O Contienen alguna marca que revela su unin (hibridacin) a la
secuencia elegida, (P32 o sistemas luminiscentes).
Esquema del Southern Blot
 SOUTHERN BLOT

O Gel de agarosa 0.7% con 14 muestras O Placa radiogrfica revelado con una sonda
corridas tras digestin con EcoRI. radiactiva para un detectar un gen de
inters.
 Aplicaciones

Caracterizar la identidad de genes especficos.

Investigar la organizacin molecular de las secuencias

genmicas. (filiacin)

Detectar reorganizaciones y duplicaciones en genes

asociados a enfermedades genticas humanas y a cncer.

Deteccin marcadores genticos. Ej. restriction site

polymorphism (RSP) y de mutaciones puntuales mediante
RFLP.
PCR (reaccin en cadena de la polimerasa)

O PCR (Polymerase Chain Reaction): desarrollada en 1986 por

Kary Mullis.

O OBJETIVO: generar un gran nmero de copias de un fragmento

de ADN especfico.

O Se puede partir de una nica copia del ADN original (molde o

templado).
 Se basa en:
la propiedad de las ADN polimerasas para replicar hebras de
ADN

en la capacidad del ADN de desnaturalizarse y

renaturalizarse (por calor)

poder realizar ciclos (repeticiones) con altas y bajas

temperaturas alternadamente.

TENER UN SISTEMA TERMORESISTENTE!!!!!

 Requisitos
O Conocer las secuencias blanco.
O Disear oligonucletidos (primers) que determinan los lmites
de la regin amplificada.
O DNA polimerasa termoresistente (Thermus aquaticus, una
bacteria termoflica). Nombre del enzima es Taq polimerasa.
O Un equipo que controle la temperatura en forma cuasi
instantnea.
O Sistemas de visualizacin (geles agarosa, radiactivos,
fotomtricos, colorimtricos).
O Principalmente mucho cuidado!!!!!
 Diseo de los primers
O Los primers tienen que ser complementarios a los flancos
secuencia a amplificar.

O La longitud del primer determina la especificidad:

O 8 nucletidos: prob. 1/65536 pb. En el genoma humano hay
46000 sitios distintos.
O 18 nucletidos: prob. 1/17179869184 pb. Un solo sitio!!!.

O Lmites: longitud afecta a la velocidad de hibridacin y la

eficiencia del proceso. (no mas de 30 nucletidos).

O Hibridar el nucletido 3!!!!!!!!!

 Pasos de la reaccin:
1- Inicializacin: desnaturalizar el ADN, llevando la temperatura de 94-95C
durante 5-9 minutos. (depende del DNA blanco)

O CICLOS
2- Desnaturalizacin: calentamiento a 94-95 C durante 30
3- Annealing/Alineamiento/Unin del primer: se produce la hibridacin del
primer, es necesario bajar la temperatura a 50-65C.
4 - Extensin/Elongacin de la cadena: se sintetiza la nueva hebra de ADN
complementaria en direccin 5' 3', uniendo el grupo 5'-P de los dNTPs con
el grupo 3'-OH libre . Los pasos 2,3,4 se repiten unas 25-35 veces.

5 - Elongacin Final: cualquier ADN de cadena simple restante sea

completada. Etapa nica que se lleva a cabo a una temperatura de 72 a 74 C
durante 5-15 minutos tras el ltimo ciclo de PCR.
 Pasos de la reaccin:
A tener en cuenta:
O Para la Taq polimerasa, la temperatura ptima de actividad es 72 a
74C.
O El tiempo de extensin depende de la longitud del fragmento de
ADN que se va a amplificar. (Taq polimerasa, agrega 1000
bases/minuto)
O La temperatura ptima de annealing es especfica para cada
primer: depende de la LONGITUD y de su SECUENCIA

Problemas
O Temperaturas altas impedirn la unin del primer.
O Temperaturas bajas llevarn a una unin inespecfica.
O Hibridaciones internas de los primers o entre ellos.
O 35 ciclos= 68 billones de copias
 Temperatura de Hibridacin
O Es el factor ms determinante en la hibridacin. A temperaturas
demasiado altas, no tiene lugar. Temperaturas demasiado bajas,
tienden a favorecer hibridaciones inespecficas, alterando la
especificidad de la reaccin.
O La temperatura ptima tiene que ser lo suficientemente baja
para permitir la hibridacin especfica entre el primer y su
secuencia complementaria, pero lo suficientemente alta, como
para impedir hibridaciones no especficas.
O Esta temperatura puede calcularse en base a la temperatura de
fusin (melting temperature) o Tm del hbrido.
 Clculo de la Tm

O La Tm se puede obtener
experimentalmente, pero se puede
calcular en base a la siguiente ecuacin:
O Tm= (4x[G+C])+(2x[A+T])C
O Donde G,C,A y T es el nmero de
nucletidos de cada tipo en el primer.
Temperatura de Hibridacin

O La temperatura de hibridacin se toma

con 1-2C por debajo de la Tm del
primer con menor Tm.
O Es importante tener en cuenta que la
PCR requiere el uso de dos primers, y
que ambos deben de tener una
temperatura de hibridacin semejante.
De lo contrario, la reaccin no
proceder normalmente !
 VARIANTES DE PCR
O RT-PCR: real time PCR, nmero de copias.
O RT-PCR: transcripcin reversa ligada a PCR, deteccin de mRNA.
O PCR-RFLP: polimorfismo gentico
O RAPDs: amplificacin con random primers - polimorfismo
O PCR Nested: amplificacin de una secuencia dentro de otra
previamente amplificada
O PCR Multiplex: varios targets diferentes en forma simultnea
O Inverted PCR: para conocer secuencias flanqueadoras
O Long PCR : amplificacin de fragmentos grandes 10 -20 kb.
APLICACIONES DE PCR

O INVESTIGACION BSICA
O Diagnstico Molecular
O Monitoreo y Evaluacin de terapia
O Deteccin de cepas resistentes a antibiticos
O Deteccin de mutaciones puntuales
O Polimorfismo gentico
O Filiacin humana
O Medicina Forense
O Pedigree animal o vegetal
O Control de calidad
 SECUENCIACIN DE ADN
O En cierto sentido, la caracterizacin definitiva de un segmento de
DNA clonado es la determinacin de su secuencia de
nucletidos.
O En 1965, Robert Holley determin la secuencia de una molcula
de tRNA que contena 74 nucletidos. Se necesit un ao de
esfuerzo para realizar este trabajo.
O Actualmente..un genoma humano en menos de 1 mes!!!!!!!!
O En 1977 Frederick Sanger (galardonado con el Nobel de Qumica)
desarrolla la tcnica de secuenciacin del ADN, mediante el
mtodo de los terminadores de cadena o dideoxinucletidos
(ddNTP) que se diferencian de los deoxinucleotidos (dNTP) en que
carecen del grupo OH en el carbono 3 de la ribosa.
 SECUENCIACIN DE ADN
O Para obtener la secuencia de ADN por este
mtodo, se necesita:
O El ADN molde o segmento de ADN que se
desea secuenciar.
O Un enzima que replique el ADN, normalmente
la ADN Polimerasa I del bacteriofago T4 o Taq
pol.
O Un cebador o "primer". El "primer" utilizado
suele marcarse.
O Nucletidos dNTP (dATP, dCTP, dGTP y dTTP).
O Nucletidos ddNTP (ddATP, ddTTP, ddCTP y
ddGTP).
O En las tcnicas automatizadas..los ddNTP son
los que estn marcados con fluoroforos
 Secuenciacin automatizada del DNA
O Elementos
necesarios.
 Secuenciacin automatizada del DNA
O Procedimiento
 Secuenciacin automatizada del DNA
O Corrida
electrofortica
en capilar
 Secuenciacin automatizada del DNA
O Resultados
e informe
Manipulacin: Tecnologa del ADN Recombinante.

Uso en biotecnologa.

Aplicaciones ambientales.

Terapia Gnica.

Prximo paso..Medicina personalizada?

Tcnicas de Estudio de Biologa Molecular: Protenas

Purificacin: aislamiento de protenas de inters.

Caracterizacin: determinacin de estructura terciaria

y cuaternaria, determinacin de propiedades fsicas
como pI, pM, etc.
Secuenciacin: determinacin de estructura primaria
(reaccin de Edman, espectrometra de masa)

Conformacin: determinacin de estructura

tridimensional (Cristalografa de rayos X)
 Purificacin de Protenas : Cromatografa lquida
Esta tcnica se basa en las propiedades fsicas de las protenas
Peso molecular (filtracin en gel)

Punto isoelctrico (intercambio inico)

Hidrofobicidad (HIC, fase reversa)

Afinidad (protenas de fusion, Ag-Ab, de ligando)

Purificacin de Protenas : Cromatografa lquida
O La cromatografa es una tcnica que permite la separacin de
molculas diferentes presentes en una misma muestra.
O El mtodo est basado en la circulacin de una fase mvil (que
arrastra a la mezcla de compuestos a separar), a travs de una
fase estacionaria.
O Dependiendo de la afinidad relativa que por ambas fases tengan
los distintos compuestos presentes en la mezcla resultar su
separacin.
O Fase estacionaria (FE): organizada en forma de una columna con
gran rea superficial. Puede ser slida o lquida.
O Fase mvil (FM): fluido que pasa a travs de la fase estacionaria
y que arrastra la muestra para que interaccione con la FE. Puede
ser lquida o gaseosa.
 Cromatografa lquida: filtracin en gel

O La FE formada por
perlas que son
porosas.
O Mientras corre la
FM en una mezcla
de protenas, las
pequeas se
retienen en los
poros y migran con
menor velocidad
que las grandes
 Cromatografa lquida: intercambio inico
O La FE formada por perlas que estn cargadas
O La mezcla de protenas se encuentran en un buffer a algn
pH que deje cargadas a la mayora de la protenas.
O La mezcla se coloca sobre la columna y la FM mueve las
protenas a travs de las perlas cargadas.
O Aquellas protenas que tengan la carga opuesta de las perlas
se quedan retenidas en la columna.
O Para este caso, hay que proceder a una elucin (remocin de
las protenas retenidas) utilizando un buffer a pH que le
cambie la carga a la protena o con una solucin salina.
Cromatografa lquida: intercambio inico
 Cromatografa lquida: hidrofobicidad
O La FE formada por perlas hidrofbicas.
O La mezcla de protenas se encuentran en un buffer salino
que exponga su hidrofobicidad.
O La mezcla se coloca sobre la columna y la FM mueve las
protenas a travs de las perlas hidrofbicas.
O Las protenas interaccionan con las perlas segn su grado de
hidrofobicidad y quedan retenidas en la columna con mayor o
menor fuerza.
O Para este caso, hay que proceder a la elucin utilizando un
buffer con un gradiente inverso de solucin salina (columna
HIC o de interaccin hidrofbica) o utilizando un gradiente
creciente de solvente orgnico.
Cromatografa lquida: hidrofobicidad
 Cromatografa lquida: afinidad

O La FE formada por perlas que tienen pegado en forma

irreversible un ligando con el cual interacciona la protena de
inters.
O La mezcla se coloca sobre la columna y la FM mueve las
protenas a travs de las perlas favoreciendo la interaccin
con el ligando, quedando retenidas en forma especifica.
O Para este caso, hay que proceder a la elucin utilizando un
buffer con una solucin que cambie la afinidad de la protena
por el ligando (pH, solucin salina) o eluyendo con el propio
ligando disuelto en la FM.
O Diferentes tipos de ligandos. (anticuerpos, sustratos, tags )
Cromatografa lquida: afinidad
Tcnicas de Caracterizacin de proteinas
ELECTROFORESIS EN GEL DE SDS-POLIACRILAMIDA
(SDS-PAGE)

ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL EN GEL

WESTERN BLOT

ELECTROFORESIS CAPILAR
Tcnicas de Caracterizacin de Protenas: Electroforesis
en gel de SDS-poliacrilamida
O El SDS (detergente inico) carga las
protenas negativamente.
O En condiciones reductivas, se
disocian las estructuras 4 y se
desnaturalizan las 3.
O Los polipptidos adoptan una
estructura extendida con relaciones
similares carga/ masa. Por ende
migran de acuerdo a su tamao.
O Variante: condiciones no reductivas,
permite establecer composicin de
subunidades unidas por puente
disulfuro
Tcnicas de Caracterizacin de Protenas: Electroforesis
bidimensional en gel
O Es para separar
protenas de PM
similares

O Primero se separan por

carga elctrica
(ENFOQUE
ISOELCTRICO)

O Luego por PM (SDS-

PAGE)
Tcnicas de Caracterizacin de Protenas: Western Blot
O Permite detectar especficamente protenas y que se encuentran en
baja cantidad en la muestra a ensayar.
O Procedimiento:
O Se hace una electroforesis en SDS.
O Se transfiere la corrida a una membrana porosa.
O Se impregna la membrana con un anticuerpo (Ab1) especfico
para la protena que se busca.
O Se incuba y se lava.
O Se agrega un segundo anticuerpo (Ab2) que se une al Ab1
fijado. El Ab2 est unido a una FOSFATASA ALCALINA que
cataliza una reaccin cromgena.
O Se le agrega el sustrato a la fosfatasa y se visualiza un
precipitado prpura en la banda de la protena buscada.
Tcnicas de Caracterizacin de Protenas: Western Blot