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HPLC
High Performance (pressure) Liquid Chromatography
nas colunas de enchimemto o fluxo baixo mesmo para granulometrias elevadas (150-200 m)
< granulometria < HEPT - exige presses muito elevadas
mistura de nucleosidos - 1967 - 60 min / 10-20 psig
1969 - 24 min / 400 psig
1 psig = 108 kPa
1970 - 1,25 min / 5000 psig
Condies actuais:
colunas de 5 a 25 cm com enchimento de 3 a 10 m
5000 - 10 000 psig / 40 000 - 100 000 pratos / m
HPLC - tipo de cromatoografia que emprega uma fase mvel lquida e uma fase estacionria finamente dividida e que,
para ter um fluxo razovel, opera a presses elevadas
Constituntes
Sistema de Aquisio e
Bombas Injector Coluna Detector
solventes trat. de dados
Qumica Analtica / JCM
A maioria dos alunos retirou a soluo a 20% que neste caso no seria preciso
A rea foi mudada de 3500 para 3120
Sistema de solventes
desgaseificao / vcuo - hlio (sparging)
Bombas
bombas de duplo pisto
vlvulas proporcionais
cmara de mistura
eluio isocrtica - composio da FM constante
eluio de gradiente - composio da FM varia ao longo
do cromatograma
Bombas isocrticas
Bombas binrias
Bombas quaternrias
Bombas
Bombas
presso elevada (> 6000 psig) - riscos de fugas
sada contnua (sem pulsao) / pisto
fluxos de 0,1 a 10 ml/min
reproductibilidade de fluxo de 0,5% !!
Injector
Injector
o uso de septum limitado a cerca de 1500 psig
injeco em loop de volume fixo ( 5 - 500 l)
tpico 20 l
Autoinjector
Capacidade de preparao de amostras
HPLC - colunas
colunas
colunasde
deao
aocom
com1010aa30
30cmcmde
decomprimento
comprimentoee44aa10 10mm
mmdededimetro
dimetrointerno
interno
enchimento de 5 a 10 m / 5000 - 6 000 psig / 40 000 - 60 000 pratos /
enchimento de 5 a 10 m / 5000 - 6 000 psig / 40 000 - 60 000 pratos / m m
Micro: 3 a 7,5 cm de comprimento / DI = 1 a 4,6 mm / <10 000 psig / 3 ou 5 m / at 100 000 pratos / m
Vantagens: velocidade elevada e baixo consumo de solventes
Enchimento
slica (aglomerao de partculas altamente regulares
eventualm. cobertas por filme orgnico
alumina / polmeros porosos / resinas permutadoras de ies
Pr-colunas
aumento da vida das colunas
mesma (similar) composio da fase estacionria / maior granulometria
remoo de partculas e contaminantes dos solventes
saturao da fase mvel com a fase estacionria
Forno de colunas
TA - 150 C (temperatura ambiente - ou ligeiramente acima - na maioria das
aplicaes)
Maior a temperatura menores os tempos de reteno
Maiores temperaturas causam maior degradao da coluna
para a quantificao a termostatizao essencial ( 0,1 C)
A identificao essencialmente feita com base nos tempos de reteno
HPLC
, cm
R - Relaxao vibracional
A - Absoro
F - Fluorescncia (mesmo spin)
P - Fosforescncia (spins dif.)
IC - Converso Interna (mesmo spin)
ISC - converso intersistema (spins
dif.)
Critrios de escolha
uma boa separao representa sempre um balano entre as foras intramoleculares que se
estabelecem entre amostra e fases estacionria e mvel
usar uma fase estacionria com polaridade semelhante amostra e uma fase mvel de
polaridade muito diferente
o contrrio possvel mas menos eficaz (tr geralmente muito curtos)
polaridades idnticas (amostra e fase estacionria) pode levar a tr muito longos
alterar a polaridade do solvente (mistura) de forma a melhorar a separao
Aspectos experimentais
temperatura estvel para trr reproductveis
desgaseificao dos solventes
2-3 rplicas e solues padro
limite de deteco - menor concentrao detectvel (3x acima do rudo de fundo)
limite de quantificao - menor concentrao determinada sem ambiguidade (10x vezes o rudo de
fundo)
Tailing - arrastamento do pico (coeficientes de partilha no lineares)
Cs Cs Cs
Cm Cm Cm
Trabalho
Amostras puras
apenas necessitam do solvente apropriado (solubilizao seguida de filtrao)
o solvente dever ser semelhante ou mais fraco que o usado na fase mvel
usar THF ou metanol em fase reversa (gua) pode provocar perdas de resoluo
a escolha do solvente pode ser condicionada pelo detector utilizado
Amostras compostas
a presena de impurezas no dissolvidas exige, no mnimo, uma filtrao
extrao da matriz (excipientes)
necessidade de determinar a % de recuperao
uso de solventes diferentes do usado na injeco exige reconstituio da amostra
extrao / concentrao / reconstituio
pr-colunas / separao de componentes de diferentes polaridades (Sep-Pak)
Amostras biolgicas
caracterizadas por concentraes muito baixas
precipitao das protenas (acetonitrilo + centrifugao) / concentrao / reconstituio
SPE
Aminocidos
Reagente:6-aminoquinolyl-N-hydrozysuccinimidyl
carbamate
Liberta: N-hydroxysuccinimide (NHS)
Reaco completa num minuto
Derivados estveis (+ de 1 semana)
Fluorescem a 395 nm
Automao
o uso de computadores veio aumentar a capacidade de utilizao dos aparelhos
preparao da amostra / injeco / controlo / aquisio / tratamento de dados
sistemas de optimizao de separaes cromatogrficas
Aquisio de dados
20 - 200 Hz ( > 8 pontos por pico)
para definir um pico so precisos pelo menos
3 pontos a subir e 3 a descer
armazenagem (identificao)
Tratamento de dados
acumulao / smoothing / integrao / derivatizao
determinao de tempos (tr) e intensidades (reas / alturas)
integrao - definio do princpio e fim do pico
picos mal definidos (falta de resoluo e tailing)
correo da linha de base
tratamento posteriori
utilizando novos parmetros (threshold / integrao)
no melhora a separao!!