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Applied Biosystems StepOne
Real-Time PCR System
Gua de reactivos
Applied Biosystems StepOne
Real-Time PCR System
Gua de reactivos
Copyright 2006, 2010 Applied Biosystems. All rights reserved.
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Applera, Applied Biosystems, AB (Design), MicroAmp, Primer Express, and VIC are registered trademarks, and FAM, JOE, MultiScribe, NED, ROX,
StepOne, TAMRA, and TET are trademarks of Applied Biosystems or its subsidiaries in the U.S. and/or certain other countries.
AmpErase, AmpliTaq Gold, and TaqMan are registered trademarks of Roche Molecular Systems, Inc.
SYBR is a registered trademark of Molecular Probes, Inc.
All other trademarks are the sole property of their respective owners.
Nmero de referencia 4377718 Rev. B

06/2010
Contenido Front Cover
Prlogo
Cmo utilizar esta gua . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vii
Cmo obtener ms informacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ix
Cmo obtener asistencia tcnica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xi
Captulo 1 Introduccin
Acerca del sistema StepOne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-2
Preparacin de experimentos en el sistema StepOne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-4
Seleccin del tipo de experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-5
Seleccin del tipo de reactivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-6
Seleccin del tipo de ensayo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-7
Captulo 2 Introduccin a los reactivos

Introduccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-2
Reactivos TaqMan . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-2
Reactivos SYBR Green . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-4
Seleccin del tipo de reactivo apropiado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-5
Reduccin al mnimo de los contaminantes del DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-7
Captulo 3 Experimentos de cuantificacin

Seccin 3.1: Acerca de los experimentos de cuantificacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-3
Introduccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-4
Seleccin de un mtodo de cuantificacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-5
Seleccin de una RT-PCR de 1 o 2 pasos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-8
Seleccin de PCR en singleplex o en multiplex . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-10
Seleccin del tipo de reactivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-13
Seleccin del tipo de ensayo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-13
Seccin 3.2: Directrices de diseo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-17

Ensayos en inventario/fabricados bajo pedido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-18
TaqMan Gene Expression Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-18
Custom TaqMan Gene Expression Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-20
Gua de reactivos de Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System iii

Seleccin de la mezcla de reaccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-21
Diseo del experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-22
Ensayos personalizados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-22
Diseo de cebadores y sondas con el software Primer Express . . . . . . . . . . . . 3-23
Seleccin de reactivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-26
Uso de las condiciones de termociclado recomendadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-28
Optimizacin de concentraciones de cebador . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-31
Optimizacin de la concentracin de sonda . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-35
Para obtener ms informacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-37
Captulo 4 Experimentos de genotipado

Seccin 4.1: Acerca de los experimentos de genotipado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-3
Introduccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-4
Seleccin del tipo de ensayo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-6
Seccin 4.2: Directrices de diseo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-9

Ensayos prediseados/validados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-10
TaqMan SNP Genotyping Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-10
TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-11
Pre-Developed TaqMan Assay Reagents for Allelic Discrimination . . . . . . . . . . 4-12
Custom TaqMan SNP Genotyping Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-15
Captulo 5 Experimentos de presencia/ausencia

Seccin 5.1: Acerca de los experimentos de presencia/ausencia . . . . . . . . . . . . . . 5-3
Introduccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-4
Seleccin del tipo de ensayo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-6
Seccin 5.2: Directrices de diseo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-9

Ensayos en inventario/fabricados bajo pedido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-10
TaqMan Gene Expression Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-10
Custom TaqMan Gene Expression Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-12
TaqMan Exogenous Internal Positive Control Reagents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-13
iv Gua de reactivos de Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System

Apndice A Frmula
Frmula para experimentos de CT comparativos (CT) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A-1
Apndice B Limitacin del cebador en la PCR en multiplex
Apndice C Directrices de diseo de ensayos
Bibliografa
Glosario
ndice
Gua de reactivos de Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System v

vi Gua de reactivos de Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System
Prlogo
Cmo utilizar esta gua

Finalidad de esta En esta gua, se proporciona informacin acerca de los reactivos que se pueden
gua utilizar en Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System (sistema
StepOne). Informacin de esta gua:
Introduccin a los reactivos TaqMan y SYBR Green
Descripciones y directrices de diseo para los siguientes tipos de experimentos:
Experimentos de cuantificacin
Experimentos de genotipado
Experimentos de presencia/ausencia
Pblico Esta gua est destinada al personal de laboratorio y a los principales investigadores
que realizan experimentos de curva estndar con el sistema StepOne.
Suposiciones En esta gua, se asume lo siguiente:

Tiene un conocimiento prctico del proceso de reaccin en cadena de
polimerasa (PCR).
Sabe manejar muestras de DNA y/o RNA y prepararlas para la PCR.
Convenciones del En esta gua, se utilizan las siguientes convenciones:

texto El texto en negrita indica una accin del usuario. Por ejemplo:
Escriba 0 y, a continuacin, pulse Intro en cada uno de los campos restantes.
El texto en cursiva seala palabras nuevas o importantes y tambin se utiliza
para enfatizar algo. Por ejemplo:
Antes de realizar el anlisis, prepare siempre una matriz fresca.
El smbolo de la flecha que apunta a la derecha () separa los comandos
sucesivos que se seleccionan en un men desplegable o un men de acceso
directo. Por ejemplo:
Seleccione File (Archivo)Open (Abrir).
Palabras de aviso En la documentacin de Applied Biosystems, aparecen dos palabras de aviso para el
para el usuario usuario. Cada palabra implica un nivel concreto de observacin o accin, tal y como
se describe a continuacin:
Nota: Proporciona informacin que puede ser interesante o til, pero no es esencial
para el uso del producto.
IMPORTANTE! Proporciona informacin que es necesaria para poder utilizar el
instrumento correctamente, para poder utilizar un kit de reactivos con precisin o
para poder utilizar un producto qumico de manera segura.
Gua de reactivos de Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System vii

Prlogo
A continuacin, se muestran algunos ejemplos de palabras de aviso para el usuario:

Nota: La funcin de calibracin tambin est disponible en la consola de control.
IMPORTANTE! Para comprobar la conexin del cliente, necesita un identificador de
usuario vlido.
Palabras de aviso En la documentacin del usuario de Applied Biosystems, aparecen cuatro palabras
de seguridad de aviso de seguridad en los puntos del documento en los que debe conocer la
existencia de peligros importantes. Cada palabra de aviso (IMPORTANTE,
PRECAUCIN, ADVERTENCIA, PELIGRO) implica un nivel de observacin o
accin particular, tal y como se explica a continuacin.
Definiciones
IMPORTANTE! Proporciona informacin que es necesaria para poder utilizar el
instrumento correctamente, para poder utilizar un kit de reactivos con precisin o
para poder utilizar un producto qumico de manera segura.
Indica una situacin potencialmente peligrosa que, de no evitarse,

podra causar lesiones leves o moderadas. Tambin puede utilizarse para alertar de
prcticas no seguras.
Indica una situacin potencialmente peligrosa que, de no

evitarse, podra causar lesiones graves o mortales.
Indica una situacin inminentemente peligrosa que, de no

evitarse, tendr como resultado lesiones graves o mortales. Esta palabra de aviso se
limita a las situaciones ms extremas.
A excepcin de los avisos IMPORTANTE, todas las palabras de aviso de seguridad
de un documento de Applied Biosystems aparecen con la figura de un tringulo
abierto que contiene un smbolo de peligro. Estos smbolos de peligro son idnticos a
los que se incorporan en los instrumentos de Applied Biosystems.
Ejemplos
IMPORTANTE! Debe crear una hoja de clculo de entradas de muestras diferente
para cada placa de reaccin de 96-pocillos.
PELIGRO QUMICO. TaqMan Universal PCR Master Mix

puede causar irritaciones en la piel y los ojos. Puede provocar molestias si se ingiere
o se inhala. Consulte la ficha tcnica de seguridad (MSDS) y siga las instrucciones
de manipulacin indicadas. Use protectores oculares, vestimenta protectora y
guantes apropiados.
PELIGRO DE LESIONES FSICAS. Durante el uso de los

instrumentos, la cubierta caliente y el bloque de muestras pueden alcanzar
temperaturas superiores a 100 C.
PELIGRO ELCTRICO. La continuidad del circuito de toma a

tierra es vital para la seguridad. Jams utilice el sistema con el conductor de toma de
tierra desconectado.
viii Gua de reactivos de Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System

Prlogo
Cmo obtener ms informacin

Documentacin El sistema StepOne incluye la siguiente documentacin:
relacionada
Nm.
Nm. ref.
Documento ref.
ingls
espaol
Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Getting 4376786 4377729

Started Guide for Genotyping Experiments
Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Getting

Started Guide for Presence/Absence Experiments 4376787
Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Getting 4377742

Started Guide for Relative Standard Curve and Comparative CT 4376785
Experiments
Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Getting 4376784 4377736

Started Guide for Standard Curve Experiments
Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System 4376782 4377798

Installation, Maintenance, and Networking Guide
Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System 4376783 4377792

Installation Quick Reference Card
Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Site 4376768 4378359

Preparation Guide
Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Software

Help
Gua de reactivos de Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System ix

Prlogo
Applied Biosystems puede proporcionarle la siguiente documentacin auxiliar:
Nmero de
Documento
referencia
Applied Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits 4375575

Protocol
Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Installation 4376791

Performance Verification Protocol
Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Installation 4376790

Qualification-Operation Qualification Protocol
Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Planned 4376788

Maintenance Protocol
Custom TaqMan Gene Expression Assays Protocol 4334429
Custom TaqMan Genomic Assays Protocol: Submission Guidelines 4367671
Custom TaqMan SNP Genotyping Assays Protocol 4334431
Power SYBR Green PCR Master Mix and RT-PCR Protocol 4367218
Pre-Developed TaqMan Assay Reagents Allelic Discrimination Protocol 4312214
Primer Express Software Version 3.0 Getting Started Guide 4362460
SYBR Green PCR and RT-PCR Reagents Protocol 4304965
SYBR Green PCR Master Mix and RT-PCR Reagents Protocol 4310251
TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assays Protocol 4362038
TaqMan Exogenous Internal Positive Control Reagents Protocol 4308335
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2) Protocol 4351891
TaqMan Gene Expression Assays Protocol 4333458
TaqMan SNP Genotyping Assays Protocol 4332856
TaqMan Universal PCR Master Mix Protocol 4304449
User Bulletin #2: Relative Quantitation of Gene Expression 4303859
Using TaqMan Endogenous Control Assays to Select an Endogenous 127AP08

Control for Experimental Studies Application Note
Nota: Para obtener ms documentacin, consulte Cmo obtener asistencia tcnica

en la pgina xi.
Obtencin de En Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Software (software

informacin de la StepOne ) Help, se describe cmo se utiliza cada funcin de la interfaz de usuario.
ayuda del Para acceder a la ayuda desde el software StepOne, realice una de las siguientes
software acciones:
Pulse F1.
Haga clic en en la barra de herramientas.
x Gua de reactivos de Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System

Prlogo
Seleccione Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de StepOne).

Para buscar temas de inters en la ayuda:
Consulte el ndice de contenido.
Busque un tema especfico.
Busque en un ndice alfabtico.
Envenos sus Applied Biosystems agradece sus comentarios y sugerencias para mejorar sus
comentarios documentos de usuario. Puede enviar sus comentarios a la direccin de correo
electrnico:
techpubs@appliedbiosystems.com
IMPORTANTE! Esta direccin slo sirve para enviar comentarios y sugerencias en
relacin con la documentacin. Para solicitar documentos, descargar archivos PDF u
obtener ayuda sobre una cuestin tcnica, vaya a www.appliedbiosystems.com y, a
continuacin, haga clic en el vnculo Support (Asistencia tcnica). (Consulte Cmo
obtener asistencia tcnica ms adelante.)
Cmo obtener asistencia tcnica

Para acceder a los servicios ms recientes y obtener informacin acerca de la
asistencia tcnica, vaya a www.appliedbiosystems.com y, a continuacin, haga clic
en el vnculo Support (Asistencia tcnica).
En la pgina Support (Asistencia tcnica), puede:
Buscar las preguntas ms frecuentes (FAQ)
Enviar una pregunta directamente al Servicio de asistencia tcnica
Solicitar a Applied Biosystems documentos de usuario, fichas tcnicas de
solicitud de materiales (MSDS), certificados de anlisis y otros documentos
relacionados
Descargar documentos PDF
Obtener informacin acerca de la formacin del cliente
Descargar actualizaciones y parches de software
Asimismo, en la pgina Support (Asistencia tcnica) podr acceder a los nmeros de
telfono y fax para ponerse en contacto con el Servicio de asistencia tcnica y las
instalaciones de venta de Applied Biosystems en todo el mundo.
IMPORTANTE! Cuando se le solicite que lo haga en esta gua o cuando tenga que
programar el mantenimiento del instrumento StepOne (por ejemplo, el
mantenimiento anual planificado o la verificacin/calibracin de la temperatura),
pngase en contacto con el Centro de atencin al cliente de Applied Biosystems.
Para obtener un nmero de telfono o enviar un mensaje de correo electrnico al
centro, visite http://www.appliedbiosystems.com/support/contact.
Gua de reactivos de Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System xi

Prlogo
xii Gua de reactivos de Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System

Introduccin 1 1
Este captulo cubre los siguientes temas:
Acerca del sistema StepOne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-2
Preparacin de experimentos en el sistema StepOne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-4
Seleccin del tipo de experimento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-5
Seleccin del tipo de reactivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-6
Seleccin del tipo de ensayo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-7
Gua de reactivos de Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System 1-1

Acerca del sistema StepOne

Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System (sistema StepOne) utiliza
reactivos de reaccin en cadena de polimerasa (PCR) basados en fluorescencia para
proporcionar:
Deteccin cuantitativa de las secuencias de cido nuclico de diana (dianas)
mediante anlisis en tiempo real.
Deteccin cualitativa de secuencias de cido nuclico de diana (dianas)
mediante anlisis de punto final y curva de disociacin.
Acerca de la El sistema StepOne recoge datos de fluorescencia brutos en diferentes puntos de una
recogida de PCR, dependiendo del tipo de proceso que realice:
datos
Tipo de proceso Punto de recogida de datos
Procesos en Curva estndar El instrumento recoge datos despus de cada

tiempo real paso de extensin de la PCR.
Curva estndar
relativa
CT comparativos
(CT)
Procesos de Genotipado El instrumento recoge datos antes y despus de

punto final la PCR. El instrumento tambin puede recoger
datos durante el proceso (en tiempo real), lo que
puede resultar til para solucionar los problemas.
Presencia/ausencia El instrumento recoge datos antes y despus de

la PCR.
Con independencia del tipo de proceso que se realice, un punto de recogida de datos
o una lectura constan de tres fases:
1. Excitacin: el instrumento StepOne ilumina todos los pocillos de la placa de

reaccin en el instrumento StepOne para excitar los fluorforos de cada
reaccin.
2. Emisin: la ptica del instrumento StepOne capta la fluorescencia residual que

se emite desde los pocillos de la placa de reaccin. La imagen resultante que
capta el dispositivo slo consta de luz que se corresponde con el rango de las
longitudes de onda de emisin.
3. Recogida: el instrumento StepOne crea una representacin digital de la

fluorescencia residual recogida en un intervalo de tiempo fijado. El software
StepOne almacena la imagen fluorescente bruta para analizarla.
Despus de un proceso, el software StepOne utiliza datos de calibracin (espacial,
espectral y de fondo) para determinar la ubicacin y la intensidad de las seales
fluorescentes en cada lectura, el fluorocromo asociado a cada seal fluorescente y el
significado de la seal.
1-2 Gua de reactivos de Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System

Consumibles El sistema StepOne admite los consumibles que se enumeran a continuacin. Estos
admitidos consumibles se utilizan en protocolos o reactivos estndar y rpidos.
Nmero de
Consumible
referencia
MicroAmp Fast Optical 48-Well Reaction Plates 4375816

MicroAmp Optical 48-Well Adhesive Film 4375323
MicroAmp Fast 8-Tube Strips 4358293

MicroAmp Optical 8-Cap Strips 4323032
MicroAmp Fast Reaction Tubes with Caps 4358297
MicroAmp Fast 48-Well Trays 4375282

MicroAmp 48-Well Base Adaptor 4375284
MicroAmp Splash Free 96-Well Base 4312063
D
F
G E
B B
A
A
C C
C
# Consumible
A MicroAmp Fast Optical 48-Well Reaction Plate

B MicroAmp Fast 48-Well Tray
C MicroAmp Splash Free 96-Well Base
D MicroAmp Optical 8-Cap Strip
E MicroAmp Fast 8-Tube Strip
F MicroAmp Fast Reaction Tubes with Caps
G MicroAmp Optical 48-Well Adhesive Film
Para obtener ms Para obtener ms informacin acerca de alguno de los temas que se explican en esta
informacin gua, acceda a la ayuda desde Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR
System Software pulsando F1, haciendo clic en en la barra de herramientas o
seleccionado Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de StepOne).

Preparacin de experimentos en el sistema StepOne

Flujo de trabajo Antes de realizar experimentos en el sistema StepOne, prepare el experimento de la
general siguiente forma:
1. Seleccione un tipo de experimento (pgina 1-5).
2. Seleccione el tipo de reactivo (pgina 1-6).
3. Seleccione el tipo de ensayo (pgina 1-7).
Informacin de En este captulo, se ofrece informacin general acerca de los tipos de experimentos,
esta gua los tipos de reactivos y los tipos de ensayos que se pueden utilizar en el sistema
StepOne.
En captulos posteriores se ofrece informacin especfica:
Captulo Descripcin
Captulo 2, Introduccin a los Describe y compara los reactivos TaqMan y

reactivos SYBR Green.
Proporciona informacin acerca de cmo reducir al
mnimo la contaminacin del DNA.
Captulo 3, Experimentos de Explica cmo funciona el tipo de experimento.

cuantificacin Ofrece el flujo de trabajo especfico para el tipo de
experimento.
Captulo 4, Experimentos de
genotipado Ofrece directrices de diseo para cada tipo de
ensayo.
Captulo 5, Experimentos de
presencia/ausencia

Seleccin del tipo de experimento

En el sistema StepOne, se pueden realizar los siguientes tipos de experimentos:
Cuantificacin, incluidos:
Curva estndar
Curva estndar relativa
CT comparativos (CT)
Genotipado
Presencia/ausencia
Nota: Tambin se puede realizar un anlisis de curva de disociacin en el sistema
StepOne.
Experimentos de Los tres tipos de experimentos se pueden clasificar como experimentos en tiempo
punto final y real y experimentos de punto final, tal y como se explica a continuacin.
experimentos en
tiempo real Tipo de
Categora Propiedades
experimento
Tiempo real El instrumento supervisa el progreso de la Cuantificacin

PCR a medida que se produce.
Se recogen datos durante el proceso de
PCR.
Las reacciones se caracterizan por el punto
temporal del ciclo en el que se detecta por
primera vez la amplificacin de una diana.
Punto final Los datos se recogen al final del proceso de Genotipado

PCR.
Las reacciones se caracterizan por la Presencia/ausencia
cantidad de diana acumulada al final de la
PCR.
El punto de datos es la intensidad
normalizada del fluorocromo notificador, o Rn.
Nota: Algunos experimentos de punto final
tambin incluyen puntos de datos anteriores a la
PCR. Si es as, el sistema calcula el valor delta
Rn (Rn) de acuerdo con la siguiente frmula:
Rn posterior a PCR Rn anterior a PCR = Rn
Kwok y Higuchi, 1989.

Saiki et al., 1985.

Seleccin del tipo de reactivo

En el sistema StepOne, se pueden utilizar los siguientes tipos de reactivos
(qumicos):
Reactivos TaqMan
Reactivos SYBR Green
Otros reactivos basados en fluorescencia
Reactivos Los reactivos TaqMan incluyen ensayos TaqMan (mezclas preformuladas que
TaqMan contienen conjuntos de sondas y cebadores) y mezclas de reaccin TaqMan. Los
reactivos TaqMan se pueden utilizar para los siguientes tipos de experimentos:
Curva estndar
Genotipado
Presencia/ausencia
IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo
TAMRA como notificador o apantallador con el sistema StepOne.
Reactivos SYBR Los reactivos SYBR Green incluyen cebadores y mezclas de reaccin que contienen
Green fluorocromo SYBR Green. Los reactivos SYBR Green se pueden utilizar para los
experimentos de cuantificacin de:
Curva estndar
Nota: No se puede realizar una PCR en multiplex con reactivos SYBR Green. Para
obtener ms informacin, consulte Seleccin de PCR en singleplex o en multiplex
en la pgina 3-10.
Otros reactivos Se pueden utilizar otros reactivos basados en fluorescencia en el sistema StepOne,
pero se debe tener en cuenta lo siguiente:
El software StepOne calcula automticamente los volmenes de reaccin de los
reactivos TaqMan y SYBR Green, pero no de otros reactivos.
Se debe disear el experimento con el flujo de trabajo Advanced Setup
(Configuracin avanzada), en lugar de con el flujo de trabajo del asistente de
diseo.

Seleccin del tipo de ensayo

En el software StepOne, se pueden seleccionar los siguientes tipos de ensayos para
los experimentos de cuantificacin, presencia/ ausencia y genotipado:
Tipo de experimento Tipo de ensayo Vase...
Cuantificacin En inventario y fabricado bajo ms abajo

pedido
Presencia/ausencia Personalizado
Genotipado Prediseado/validado pgina 1-8

Personalizado
Diseado por el usuario
Los experimentos de cuantificacin incluyen experimentos de curva estndar,

cuantificacin relativa.
Experimentos de Ensayos en inventario/fabricados bajo pedido (Made to Order)

cuantificacin y Para los experimentos de cuantificacin o de presencia/ausencia, seleccione el tipo
de presencia/ de ensayo Inventoried/Made to Order (En inventario/fabricado bajo pedido) en el
ausencia software StepOne si utiliza:
TaqMan Gene Expression Assays, en inventario: conjuntos de cebadores y
sondas MGB (ligando de unin al surco menor) TaqMan prediseados con el
marcaje FAM, como fluorocromo que se pueden adquirir ya preparados. La
mezcla del ensayo est disponible en un solo tubo de 20 preformulado.
TaqMan Gene Expression Assays, fabricados bajo pedido (Made to
Order): conjuntos de cebadores y sondas TaqMan MGB prediseados con el
marcaje fam, como fluorocromo que se fabrican en el momento de realizar el
pedido. La mezcla del ensayo est disponible en un solo tubo de 20
preformulado.
Custom TaqMan Gene Expression Assays: conjuntos de cebadores y sondas
TaqMan MGB con el marcaje del fluorocromo FAM que estn diseados,
sintetizados y formulados por el servicio Custom TaqMan Genomic Assays de
acuerdo con la informacin de secuencia remitida. La mezcla del ensayo est
disponible en un solo tubo de 20 o 60 preformulado.
Nota: Cuando seleccione el tipo de ensayo en el software StepOne, vaya a la pantalla
Reaction Setup (Configuracin de reaccin) en el flujo de trabajo del asistente de
diseo o Advanced Setup (Configuracin avanzada) y, a continuacin, seleccione
Inventoried/Made to Order (En inventario/fabricado bajo pedido) en el men
desplegable Assay Type (Tipo de ensayo).

Ensayos personalizados (Custom Assays)

Para los experimentos de cuantificacin y de presencia/ausencia, seleccione el tipo
de ensayo Custom (Personalizado) en el software StepOne si va a disear sus propios
ensayos (cebadores o sondas) con el software Primer Express y reactivos TaqMan o
SYBR Green. Cuando disee sus propios ensayos, siga las directrices de diseo de
ensayos de Applied Biosystems para optimizar los resultados.
Nota: Cuando seleccione el tipo de ensayo en el software StepOne, vaya a la pantalla
Reaction Setup (Configuracin de reaccin) en el flujo de trabajo del asistente de
diseo o Advanced Setup (Configuracin avanzada) y, a continuacin, seleccione
Custom (Personalizado) en el men desplegable Assay Type (Tipo de ensayo).
Experimentos de Ensayos prediseados/validados

genotipado En los experimentos de genotipado, el tipo de ensayo Pre-Designed/Validated
(Prediseado/validado) incluye:
TaqMan SNP Genotyping Assays: conjuntos de cebadores y sondas MGB
(ligando de unin al surco menor) TaqMan prediseados con el marcaje de los
fluorocromos FAM y VIC que estn disponibles en dos categoras:
TaqMan Validated & Coding SNP Genotyping Assays, que se pueden
adquirir ya preparados (en inventario). La mezcla del ensayo est disponible
en un solo tubo de 20 preformulado.
TaqMan Pre-Designed SNP Genotyping Assays, que se fabrican en el
momento de realizar el pedido (fabricados bajo pedido [Made to Order]). La
mezcla del ensayo est disponible en un solo tubo de 20 preformulado.
TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assays: conjuntos de cebadores y
sondas TaqMan MGB prediseados con el marcaje de los fluorocromos FAM y
VIC que se pueden adquirir ya preparados (en inventario). La mezcla del ensayo
est disponible en un solo tubo de 20 preformulado.
Pre-Developed TaqMan Assay Reagents for Allelic Discrimination
(TaqMan PDARs for AD): conjuntos de cebadores y sondas TaqMan MGB
prediseados con el marcaje de los fluorocromos FAM y VIC que se pueden
adquirir ya preparados (en inventario). La mezcla del ensayo est disponible en
un solo tubo de 10 preformulado.
Nota: Cuando seleccione un ensayo de SNP en el software StepOne, vaya a la
pantalla SNP Assays (Ensayos de SNP) del flujo de trabajo del asistente de diseo o
a la pantalla Plate Setup (Configuracin de placa) del flujo de trabajo Advanced
Setup (Configuracin avanzada). En la pantalla SNP Assays (Ensayos de SNP) o
Plate Setup (Configuracin de placa), se puede seleccionar un ensayo en la biblioteca
o crear uno nuevo.

Ensayos personalizados (Custom Assays)

Para los experimentos de genotipado, el tipo de ensayo Custom (Personalizado)
incluye Custom TaqMan SNP Genotyping Assays. Custom TaqMan SNP
Genotyping Assays son conjuntos de cebadores y sondas TaqMan MGB con el
marcaje de los fluorocromos FAM y VIC que estn diseados, sintetizados y
formulados por el servicio Custom TaqMan Genomic Assays de acuerdo con la
informacin de secuencia remitida. La mezcla del ensayo est disponible en un solo
tubo de 40 o 80 preformulado.
o crear uno nuevo.
Ensayos diseados por el usuario

Si desea disear sus propios cebadores y sondas para los ensayos de SNP, consulte
Primer Express Software Version 3.0 Getting Started Guide.


Introduccin a los reactivos 2 2
Introduccin. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-2
Reactivos TaqMan . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-2
Reactivos SYBR Green . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-4
Seleccin del tipo de reactivo apropiado. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-5
Reduccin al mnimo de los contaminantes del DNA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-7

Introduccin
Applied Biosystems ha desarrollado dos tipos de reactivos (qumicos) que se pueden
utilizar para detectar productos de PCR en Applied Biosystems StepOne Real-Time
PCR System:
Reactivos TaqMan (ms abajo)
Reactivos SYBR Green (pgina 2-4)
Reactivos TaqMan
Tipos de Los reactivos TaqMan incluyen ensayos TaqMan (mezclas preformuladas que
experimentos contienen conjuntos de sondas y cebadores) y mezclas de reaccin TaqMan. Los
ensayos son especficos de la diana de inters. Las mezclas de reaccin contienen los
dems componentes que son necesarios para la reaccin de PCR. Los reactivos
TaqMan se pueden utilizar para los siguientes tipos de experimentos:
Curva estndar
Genotipado
Presencia/ausencia
Desarrollo de Al principio, se utilizaban fluorocromos intercalantes para medir los productos de

reactivos TaqMan PCR en tiempo real. El principal inconveniente de este mtodo de deteccin es que
detecta la acumulacin de productos de PCR tanto especficos como no especficos.
Los sistemas en tiempo real para PCR mejoraron gracias a la introduccin de sondas
con marcajes de fluorocromos que utilizan la actividad 5 nucleasa de la Taq
polimerasa de DNA. La existencia de estas sondas fluorognicas permiti desarrollar
un mtodo en tiempo real para detectar nicamente productos de amplificacin
especficos.
Funcionamiento Los reactivos TaqMan utilizan una sonda fluorognica para detectar un producto de
de los reactivos PCR especfico a medida que se acumula durante la PCR. As es cmo funciona:
TaqMan
1. Se construye una sonda oligonucletida con un fluorocromo notificador unido
al extremo 5 y un apantallador en el extremo 3.
Mientras la sonda est intacta, la proximidad del apantallador reduce
enormemente la fluorescencia que emite el fluorocromo notificador por medio
de la transferencia de energa de resonancia de fluorescencia (FRET; resonancia
de Frster, Frster, V. T. 1948) a travs del espacio.
2. Si la diana est presente, la sonda anilla entre las localizaciones de los
cebadores y se rompe por la actividad de la 5' nucleasa de la Taq Polimerasa,
durante la extensin.

3. Esta ruptura de la sonda:

Separa el fluorocromo notificador del apantallador, lo que aumenta la seal
del fluorocromo notificador.
Quita la sonda de la cadena de la diana, lo que permite que la extensin del
cebador contine hasta el final de la cadena del molde. De esta forma, la
inclusin de la sonda no inhibe el proceso global de PCR.
4. En cada ciclo, se separan ms molculas de fluorocromo notificador de sus
respectivas sondas, lo que produce un aumento de la intensidad de la
fluorescencia que es proporcional a la cantidad de amplicn producido. Cuanto
ms alto sea el nmero inicial de copias de la diana de cido nucleico, antes se
observar un aumento significativo de la fluorescencia.
La Figura 2-1 ilustra este proceso.
POLIMERIZACIN DESPLAZAMIENTO DE CADENA PARTICIN POLIMERIZACIN COMPLETADA
R R Q
CEBADOR R = NOTIFICADOR R 3'
DIRECTO R SONDA Q Q = APANTALLADOR Q Q
5' 3' 5' 3' 5' 3' 5'
3' 5' 3' 5' 3' 5' 3' 5'
5' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3'

5' 5' 5' 5'
CEBADOR REVERSO
Paso 1: un notificador (R) y Paso 2: cuando ambos Paso 3: durante cada Paso 4: una vez separado
un apantallador (Q) se marcajes estn unidos a la ciclo de extensin, la del apantallador, el
unen a los extremos 5 y 3 sonda, se inhibe la emisin polimerasa Taq DNA fluorocromo notificador
de una sonda TaqMan. del fluorocromo notificador. separa el fluorocromo emite su fluorescencia
notificador de la sonda. caracterstica.
Figura 2-1 Funcionamiento de los reactivos TaqMan
Sondas TaqMan Applied Biosystems recomienda el uso general de sondas TaqMan MGB, sobre
MGB todo si las sondas TaqMan convencionales superan los 30 nucletidos. Las sondas
TaqMan MGB contienen:
Un fluorocromo notificador en el extremo 5: genera una seal cuando se
rompe a causa de la actividad 5 nucleasa de la Taq polimerasa de DNA.
Un apantallador no fluorescente (NFQ) en el extremo 3: permite a los
sistemas de PCR en tiempo real medir con ms precisin las contribuciones de
fluorocromo notificador, dado que el apantallador no emite fluorescencia.
Un ligando de unin al surco menor (MGB) en el extremo 3: aumenta la
temperatura de desnaturalizacin (Tm) de las sondas sin aumentar la longitud de
la sonda (Afonina et al., 1997; Kutyavin et al., 1997), por lo que permite disear
sondas ms cortas. Por consiguiente, las sondas TaqMan MGB tienen mayores
diferencias en los valores de Tm entre sondas complementarias y no
perfectamente complementarias con la diana. Estas mayores diferencias en los
valores de Tm permiten realizar el genotipado con precisin.

Applied Biosystems ofrece las siguientes sondas TaqMan MGB con NFQ para el
sistema StepOne:
Fluorocromo con marcaje Fluorocromo con Otras

en 5 marcaje en 3 funciones
Ensayos TaqMan Expresin de genes Fluorocromo FAM NFQ MGB

(sonda TaqMan MGB)
Genotipado SNP Fluorocromos FAM y VIC NFQ MGB

Ensayos TaqMan Expresin de genes Fluorocromo FAM NFQ MGB
personalizados (sonda
TaqMan MGB ) Genotipado SNP Fluorocromos FAM y VIC NFQ MGB
Sondas personalizadas Sonda TaqMan MGB Fluorocromo FAM, TET, NFQ MGB
personalizada NED o VIC


Tipos de Los reactivos SYBR Green incluyen cebadores y mezclas de reaccin que
experimentos contienen fluorocromo SYBR Green. Los reactivos SYBR Green se pueden utilizar
para los experimentos de cuantificacin de:
Curva estndar
Nota: No se puede realizar una PCR en multiplex con reactivos SYBR Green. Para
obtener ms informacin, consulte Seleccin de PCR en singleplex o en multiplex
en la pgina 3-10.
Desarrollo de Las pequeas molculas que se unen al DNA de doble cadena se pueden dividir en
reactivos SYBR dos clases: las que se intercalan en el DNA y las que se unen al surco menor del
Green DNA. Higuchi (Higuchi et al., 1992) utilizaba el agente intercalante bromuro de
etidio para la deteccin de la PCR en tiempo real. Hoechst 33258 es un ejemplo de
un fluorocromo de ligando de unin al surco menor cuya fluorescencia aumenta
cuando se une a DNA de doble cadena (Higuchi et al., 1993).
Con independencia del mtodo de unin, al menos hay dos requisitos para que un
fluorocromo de unin a DNA detecte productos de PCR en tiempo real:
Aumento de fluorescencia cuando se une a DNA de doble cadena
Sin inhibicin de la PCR
Applied Biosystems ha desarrollado condiciones que permiten el uso del
fluorocromo SYBR Green I en la PCR sin que haya inhibicin de la PCR y con
mayor sensibilidad de deteccin en comparacin con el bromuro de etidio.

Funcionamiento Los reactivos SYBR Green utilizan el fluorocromo SYBR Green I para detectar
de los reactivos productos de PCR unindose al DNA de doble cadena que se forma durante la PCR.
SYBR Green As es cmo funciona:
1. Cuando se aade SYBR Green PCR Master Mix a la muestra, el fluorocromo
SYBR Green I se une inmediatamente a todo el DNA de doble cadena.
2. Durante la PCR, AmpliTaq Gold DNA Polymerase amplifica la diana, lo que
crea el producto de PCR, o amplicn.
3. A continuacin, el fluorocromo SYBR Green I se une a cada copia nueva del
DNA de doble cadena.
4. A medida que se produce la PCR, se crea ms amplicn.
Dado que el fluorocromo SYBR Green I se une a todo el DNA de doble cadena,
el resultado es un aumento de la intensidad de la fluorescencia que es
proporcional a la cantidad de producto de PCR de doble cadena producido.
Las Figuras 2-2 ms abajo ilustran este proceso.
Paso 1: Configuracin de la reaccin

El fluorocromo SYBR Green I emite
una fluorescencia cuando se une
a DNA de doble cadena.
Paso 2: Desnaturalizacin
Cuando el DNA se desnaturaliza,
se libera el fluorocromo SYBR
Green I y la fluorescencia disminuye
considerablemente.
CEBADOR
DIRECTO Paso 3: Polimerizacin
Durante la extensin, los cebadores
se hibridan y se genera el producto
de PCR.
CEBADOR
REVERSO
Paso 4: Polimerizacin completada

El fluorocromo SYBR Green I se une
al producto de doble cadena, lo que
produce un aumento neto de
la fluorescencia que detecta
el instrumento.
Figura 2-2 Funcionamiento de los reactivos SYBR Green
Seleccin del tipo de reactivo apropiado

Los reactivos TaqMan y SYBR Green se pueden utilizar para los tipos de
experimentos que se indican a continuacin.
Tipo de experimento
Presencia/
Cuantificacin Genotipado
Tipo de reactivo ausencia
(Captulo 3) (Captulo 4)
(Captulo 5)
Reactivos SYBR Green S No recomendado No recomendado
Reactivos TaqMan S S S
Incluye experimentos de curva estndar, cuantificacin relativa.

Consideraciones Los experimentos de cuantificacin se pueden realizar con reactivos TaqMan o

sobre los SYBR Green. Tenga en cuenta lo siguiente a la hora de elegir entre dos tipos de
experimentos de reactivos:
cuantificacin
Tipo de reactivo Proceso
Reactivos o kits TaqMan PCR y deteccin de cDNA

a. Componentes del ensayo
Descripcin MGB
Sonda Cebador reverso
F
Los reactivos TaqMan utilizan una sonda Cebador directo
Q
fluorognica para permitir la deteccin de 3'

Molde de cDNA
5'
un producto de PCR especfico cuando se cDNA
acumula durante los ciclos de PCR. 3' 5'
Ventajas b. Plantilla desnaturalizada e hibridada de los componentes del ensayo Leyenda

3' 5'
Aumenta la especificidad con una Cebador reverso
RP Cebador aleatorio
sonda. La hibridacin especfica entre Sonda

MGB
F Fluorocromo
FAM
la sonda y la diana genera una seal de Cebador directo
F Q
Q Apantallador
fluorescencia.
MGB Ligando de unin
Proporciona capacidades de multiplex. 3' 5' al surco menor
Hay disponibles ensayos c. Generacin de seal AmpliTaq Gold

DNA Polymerase
3' 5'
preformulados que estn optimizados Sonda
para funcionar en condiciones de ciclos Cebador reverso
Cebador
trmicos universales. 5'
Cebador directo
F
MGB
3'
Q Molde
Se puede utilizar para la RT-PCR de 1 o 3' 5' Cebador extendido
2 pasos.
Limitaciones
Requiere la sntesis de una nica sonda
Reactivos SYBR Green Paso 1: Configuracin de la reaccin
Descripcin El fluorocromo SYBR Green I emite
una fluorescencia cuando se une
Los reactivos SYBR Green utilizan el a DNA de doble cadena.
fluorocromo SYBR Green I, que es un
fluorocromo de unin a DNA de doble Paso 2: Desnaturalizacin
cadena que sirve para detectar productos Cuando el DNA se desnaturaliza,
de PCR cuando se acumulan durante los se libera el fluorocromo SYBR
ciclos de PCR. Green I y la fluorescencia disminuye
considerablemente.
Ventajas
CEBADOR
DIRECTO Paso 3: Polimerizacin
Econmico (no se necesita una sonda). Durante la extensin, los cebadores
Permite que los anlisis de curvas de se hibridan y se genera el producto
disociacin midan la Tm de todos los de PCR.
CEBADOR
productos de PCR. REVERSO
Se puede utilizar para la RT-PCR de 1 o

2 pasos. Paso 4: Polimerizacin completada
El fluorocromo SYBR Green I se une
Limitaciones al producto de doble cadena, lo que
produce un aumento neto de
Se une de manera no especfica a todas
la fluorescencia que detecta
las secuencias de DNA de doble cadena. el instrumento.
Para evitar seales positivas falsas,
compruebe la formacin de un producto
no especfico utilizando un anlisis de gel
o de curva de disociacin.


Reduccin al mnimo de los contaminantes del DNA

La capacidad de amplificacin de DNA del proceso de PCR hace necesario el uso de
prcticas especiales de laboratorio para realizar experimentos en los que se utilizan
reactivos TaqMan o SYBR Green. Las muestras que tienen altas concentraciones de
DNA podran introducir contaminacin, ya sea por los controles de moldes de DNA
o por la contaminacin por arrastre de PCR.
Asimismo, debido a la naturaleza no especfica del fluorocromo SYBR Green I, se
detecta cualquier DNA de doble cadena. Cuando utilice reactivos SYBR Green,
compruebe si se forman productos no especficos mediante un anlisis de curva de
disociacin o de gel. Procure evitar la contaminacin con el DNA diana. Los ensayos
de expresin de genes que abarcan uniones exn-exn minimizan el efecto de los
contaminantes de gDNA (DNA genmico).
Uso de UNG para La uracil-N-glicosilasa, Amperase (UNG) es una enzima recombinante de 26-kDa
reducir al mnimo codificada por el gen de uracil-N-glicosilasa de Escherichia coli. Este gen se ha
la reamplificacin introducido en un husped de E. coli para dirigir la expresin de la forma nativa de la
de los productos enzima (Kwok y Higuchi, 1989).
de contaminacin
La UNG acta en DNA de cadena sencilla y de doble cadena que contiene dU.
por arrastre
Hidroliza las uniones uracil-glicosdicas en emplazamientos de DNA que contienen
dU. La enzima causa la liberacin de uracilo, por lo que se crea un emplazamiento
apiridmico sensible al lcali en el DNA. La enzima no tiene ninguna actividad en el
RNA o en el DNA que contiene dT (Longo et al., 1990).
Ensayos TaqMan
Para los ensayos TaqMan, el tratamiento de AmpErase UNG puede evitar la
reamplificacin de los productos de PCR de contaminacin por arrastre a partir de
reacciones de PCR anteriores. Si dUTP sustituye a dTTP en la reaccin de
amplificacin, el tratamiento de AmpErase UNG puede eliminar hasta 200.000
copias de amplicn por reaccin de 50L.
Nota: TaqMan 2 Universal PCR Master Mix est disponible con o sin AmpErase
UNG. Si utiliza TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2), No AmpErase
UNG, debe adquirir AmpErase UNG por separado.
Ensayos de fluorocromo SYBR Green I

Para los ensayos de fluorocromo SYBR Green I , el tratamiento de AmpErase UNG
puede evitar la reamplificacin de los productos de PCR de contaminacin por
arrastre a partir de reacciones de PCR anteriores. Aunque Power SYBR Green PCR
Master Mix y SYBR Green PCR Master Mix no contienen AmpErase UNG, s
contienen dUTP y, por lo tanto, son compatibles con AmpErase UNG. Si se sospecha
que hay contaminacin por arrastre de PCR, utilice AmpErase UNG para solucionar
el problema.
Nota: AmpErase UNG se puede adquirir de manera individual o como parte de
SYBR Green PCR Core Reagents Kit.

Prcticas Utilice las siguientes precauciones para reducir al mnimo la contaminacin de las
generales de muestras y la contaminacin por arrastre de productos de PCR:
PCR Lleve una bata de laboratorio limpia (que no llevara puesta mientras manejaba
productos de PCR amplificados o durante la preparacin de las muestras) y
guantes limpios cuando prepare las muestras para la reaccin de amplificacin.
Cmbiese de guantes siempre que sospeche que estn contaminados.
Mantenga reas separadas, equipo especial y suministros para:
Preparacin de las muestras.
Configuracin de la PCR. Nunca lleve productos de PCR amplificados al
rea de configuracin de la PCR.
Amplificacin de PCR.
Anlisis de productos de PCR.
Abra y cierre todos los tubos de muestras con cuidado. Procure no pulverizar ni
salpicar con muestras de PCR.
Utilice pipetas de desplazamiento de aire o desplazamiento positivo con puntas
con filtro. Cambie las puntas despus de cada uso.
Mantenga las reacciones y los componentes tapados todo el tiempo posible.
Limpie las mesas del laboratorio y el equipo peridicamente con una solucin
de leja al 10% o 70% de etanol.

Experimentos de cuantificacin 3 3
Seccin 3.1 Acerca de los experimentos de cuantificacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-3
Seccin 3.2 Directrices de diseo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-17


Seccin 3.1 Acerca de los experimentos de

cuantificacin
Esta seccin cubre los siguientes temas:

Introduccin. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-4
Seleccin de un mtodo de cuantificacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-5
Seleccin de una RT-PCR de 1 o 2 pasos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-8
Seleccin de PCR en singleplex o en multiplex . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-10
Seleccin del tipo de reactivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-13
Seleccin del tipo de ensayo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-13

Introduccin
Qu es un Un experimento de cuantificacin es un experimento en tiempo real en el que se
experimento de mide la cantidad de una secuencia de cido nucleico de una diana (diana) durante
cuantificacin? cada ciclo de amplificacin de la reaccin en cadena de polimerasa (PCR). La diana
puede ser DNA, cDNA o RNA.
En esta gua, se explican tres tipos de experimentos de cuantificacin:
Curva estndar (pgina 3-5)
Curva estndar relativa (pgina 3-5)
CT comparativos (CT) (pgina 3-6)
Funcionamiento En los experimentos de cuantificacin en tiempo real, las reacciones se caracterizan

de los por el punto temporal del ciclo en el que la amplificacin de un producto de PCR
experimentos de logra un nivel fijo de fluorescencia, en lugar de la cantidad final de producto de PCR
cuantificacin acumulado despus de un nmero de ciclos fijo. Las grficas de amplificacin
muestran la fluorescencia detectada en el nmero de ciclos que se han realizado.
En los primeros ciclos de la PCR, no hay ningn cambio significativo en la seal de
fluorescencia. Este rango predefinido de ciclos de PCR se denomina lnea basal. En
primer lugar, el software genera una grfica de amplificacin en la que se ha
sustrado la lnea basal. Para ello, calcula una tendencia matemtica de la seal del
notificador fluorescente normalizado (valores Rn correspondientes a los ciclos de la
lnea basal). A continuacin, un algoritmo busca el punto de la grfica de
amplificacin en el que la seal del notificador fluorescente normalizado con la lnea
basal corregida (valor delta Rn [Rn]) cruza el umbral. El ciclo fraccional en el que
el valor Rn cruza el umbral se define como CT.
Flujo de trabajo Antes de realizar experimentos de cuantificacin en Applied Biosystems StepOne

Real-Time PCR System, prepare el experimento de la siguiente forma:
1. Seleccione un mtodo de cuantificacin (pgina 3-5).
2. Seleccione una RT-PCR de 1 o 2 pasos (pgina 3-8)
3. Seleccione reacciones de PCR en singleplex o en multiplex (pgina 3-10).
4. Seleccione el tipo de reactivo (pgina 3-13).
5. Seleccione el tipo de ensayo (pgina 3-13).
6. Revise las directrices de diseo del tipo de ensayo que ha seleccionado
(Seccin 3.2 en la pgina 3-17).

Seleccin de un mtodo de cuantificacin

Acerca de los Los experimentos de curva estndar determinan la cantidad absoluta de una diana en
experimentos de una muestra. Para conseguir los resultados, se utiliza una curva estndar construida a
curva estndar partir de una dilucin seriada de una cantidad conocida.
Componentes
Las reacciones de PCR de los experimentos de curva estndar incluyen los siguientes
componentes:
Muestra: la muestra en la que la cantidad de la diana es desconocida.
Estndar: una muestra de una cantidad conocida.
Dilucin seriada de estndar: un conjunto de diluciones del estndar (por
ejemplo, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32) que se utilizan para construir una curva
estndar.
Rplicas: reacciones idnticas que contienen componentes y volmenes
idnticos.
Controles negativos: muestras que contienen agua o tampn en lugar de molde;
tambin se denominan NTC (sin cido nucleico molde). Los controles negativos
no se deberan amplificar.
Acerca de los Los experimentos de curva estndar relativa determinan el cambio de expresin de
experimentos de una diana en una muestra en relacin con la misma diana de una muestra de
curva estndar referencia. Para conseguir los resultados, se utiliza una curva estndar construida a
relativa partir de una dilucin seriada de una cantidad conocida.
Los experimentos de curva estndar relativa se suelen utilizar para:
Comparar niveles de expresin de un gen en diferentes tejidos.
Comparar los niveles de expresin de un gen en una muestra tratada y en una
muestra no tratada.
Comparar los niveles de expresin de alelos de tipo salvaje y alelos mutados.
Componentes
Las reacciones de PCR de los experimentos de curva estndar relativa incluyen los
siguientes componentes:
Muestra de referencia: la muestra utilizada como base para los resultados de la
comparacin. Por ejemplo, en un estudio sobre los efectos de las drogas en la
expresin de genes, un control no tratado sera una muestra de referencia
apropiada.
Estndar: una muestra de una cantidad conocida.
Dilucin seriada de estndar: un conjunto de diluciones del estndar (por
ejemplo, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32) que se utilizan para construir una curva
estndar. En todas las muestras, la cantidad de diana se determina realizando
una interpolacin a partir de la curva estndar y luego dividiendo por la cantidad
de diana de la muestra de referencia. Dado que la muestra de referencia es la

muestra 1, todas las dems cantidades se expresan como una diferencia

multiplicada por n relativa a ella. Asimismo, la unidad de la curva estndar
desaparece porque la cantidad de muestra se divide por la cantidad de muestra
de referencia. Por consiguiente, lo nico que se necesita de los estndares es
conocer sus diluciones relativas. Se puede utilizar cualquier cDNA, RNA o
DNA de solucin de partida que contenga la diana apropiada para preparar los
estndares.
Control endgeno: un gen presente en un nivel de expresin uniforme en todas
las muestras. El control endgeno sirve para normalizar posibles variaciones de
la cantidad de cDNA que se aade a cada reaccin producidas como
consecuencia de imprecisiones en el pipeteo.
idnticos.
Acerca de los Los experimentos de CT comparativos (CT) determinan el cambio de expresin de

experimentos de una diana en una muestra en relacin con la misma diana en una muestra de
CT comparativos referencia. Se utiliza una frmula aritmtica para conseguir los resultados (consulte
Frmula para experimentos de CT comparativos (CT) en la pgina A-1).
Los experimentos de CT comparativos se suelen utilizar para:
Comparar niveles de expresin de un gen en diferentes tejidos.
Comparar los niveles de expresin de un gen en una muestra tratada y en una
muestra no tratada.
Comparar los niveles de expresin de alelos de tipo salvaje y alelos mutados.
Componentes
Las reacciones de PCR de los experimentos de CT comparativos incluyen los
Muestra de referencia: la muestra utilizada como base para los resultados de la
comparacin. Por ejemplo, en un estudio sobre los efectos de las drogas en la
expresin de los genes, un control no tratado sera una muestra de referencia
apropiada.
Control endgeno: un gen presente en un nivel de expresin uniforme en todas
las muestras. El control endgeno sirve para normalizar posibles variaciones de
la cantidad de cDNA que se aade a cada reaccin producidas como
consecuencia de imprecisiones en el pipeteo.
idnticos.

Comparacin de Tenga en cuenta lo siguiente a la hora de elegir entre experimentos de curva estndar,
mtodos de experimentos de curva estndar relativa y experimentos de CT comparativos:
cuantificacin
Tipo de
Descripcin Ventaja Limitacin
experimento
Curva estndar Se utiliza una curva estndar Permite realizar Se debe crear una curva
para determinar la cantidad comparaciones con estndar para cada diana, lo
absoluta de una diana en una cantidades estndar que exige ms reactivos y ms
muestra. Se suele utilizar para conocidas. espacio en la placa de
cuantificar la carga viral. reaccin.
Curva estndar Se utiliza una curva estndar Es el experimento que requiere Se debe crear una curva
relativa para determinar el cambio de menos validacin, porque las estndar para cada diana, lo
expresin de una diana en una eficiencias de PCR de la diana que exige ms reactivos y ms
muestra en relacin con la y el control endgeno no espacio en la placa de
misma diana en una muestra tienen que ser equivalentes. reaccin.
de referencia. Es ideal para los
ensayos que tienen una
eficiencia de PCR por debajo
de la ptima.
CT Se utilizan frmulas aritmticas Los niveles relativos de Los ensayos que no son
comparativos para determinar el cambio de diana en las muestras se ptimos (con una eficiencia
(CT) expresin de una diana en una pueden determinar sin de PCR baja) pueden
muestra en relacin con la utilizar una curva estndar, producir resultados
misma diana en una muestra siempre que las eficiencias imprecisos.
de referencia. Es ideal para de PCR de la diana y el Antes de utilizar el mtodo
realizar mediciones de alto control endgeno sean de CT comparativos,
rendimiento de una expresin relativamente equivalentes. Applied Biosystems
de gen relativa en muchos Menor uso de reactivos. recomienda determinar si
genes de muchas muestras. las eficiencias de PCR del
Ms espacio disponible en
la placa de reaccin. ensayo diana y el ensayo de
control endgeno son
aproximadamente iguales.
Para obtener ms Para obtener ms informacin acerca de los mtodos de cuantificacin, consulte
informacin User Bulletin #2: Relative Quantitation of Gene Expression.

Seleccin de una RT-PCR de 1 o 2 pasos

La transcripcin reversa-reaccin en cadena de polimerasa (RT-PCR) se utiliza para
cuantificar el RNA. La RT-PCR se puede realizar en un procedimiento de 1 o 2
pasos.
Acerca de la RT- En las RT-PCR de 1 paso, se puede realizar la transcripcin reversa y la PCR en un
PCR de 1 paso solo sistema de tampn (Figura 3-1). La reaccin se realiza sin necesidad de aadir
reactivos entre los pasos de RT y PCR. La RT-PCR de 1 paso es cmoda porque slo
se necesita una preparacin de un tubo para la amplificacin de RT y PCR. Sin
embargo, con la RT-PCR de 1 paso no se puede utilizar la enzima de prevencin de
contaminacin por arrastre, AmpErase uracil-N-glicosylasa (UNG). En la RT-PCR
de 1 paso, la presencia de UNG destruira el cDNA a medida que se fuera creando.
Para obtener informacin acerca de UNG, consulte Uso de UNG para reducir al
mnimo la reamplificacin de los productos de contaminacin por arrastre en la
pgina 2-7.
Un
solo
tubo
Figura 3-1 Representacin esquemtica de la RT-PCR de 1 paso
Acerca de la RT- La RT-PCR de 2 pasos se realiza en dos reacciones distintas: una para la RT y otra
PCR de 2 pasos para la PCR (Figura 3-2). La RT-PCR de 2 pasos es til para detectar mltiples
transcripciones a partir de una sola reaccin de cDNA, o para guardar una parte del
cDNA para utilizarlo ms adelante. Si la PCR se realiza utilizando dUTP como una
de las bases, se puede utilizar la enzima AmpErase UNG para evitar la
contaminacin por arrastre. Para obtener informacin acerca de UNG, consulte Uso
de UNG para reducir al mnimo la reamplificacin de los productos de
contaminacin por arrastre en la pgina 2-7.

Tubo 1
Oligo d(T) o hexmero aleatorio
Tubo 2 Paso de PCR
Figura 3-2 Representacin esquemtica de la RT-PCR de 2 pasos
Cebadores Para la RT-PCR de 1 paso, se pueden utilizar cebadores reversos especficos de la

utilizados para la secuencia para la sntesis del cDNA.
sntesis de cDNA
Para la RT-PCR de 2 pasos, se pueden utilizar los siguientes cebadores para la
sntesis del cDNA:
Oligo d(T)16
Cebadores aleatorios
Cebadores reversos especficos de la secuencia
Es mejor realizar la eleccin de cebadores para la transcripcin reversa despus de
evaluar experimentalmente los tres sistemas de cebadores. Para secuencias de RNA
cortas que no contengan estructuras en horquilla, cualquiera de los tres sistemas
funciona bien. Para transcripciones o secuencias de RNA ms largas que contengan
estructuras en horquilla, siga estas directrices:
Cebadores Directrices de seleccin
Oligo d(T)16 Se utiliza para realizar transcripciones reversas slo de mRNA

eurocariota y retrovirus con colas de poli-A.
Evita amplicones o transcripciones de mRNA largas mayores
de 2 kilobases en sentido ascendente desde el emplazamiento
del poli-A.
Cebadores aleatorios Intente utilizarlos primero con transcripciones reversas largas

o transcripciones reversas que contengan estructuras en
horquilla.
Se utiliza para transcribir todo el RNA (rRNA, mRNA y tRNA).
Cebadores reversos Se utilizan para realizar transcripciones reversas slo de

especficos de la secuencias complementarias que contengan RNA.
secuencia Se utiliza en la RT-PCR de 1 paso.

Comparacin de
Cebadores para la sntesis de
mtodos de RT- Mtodo
cDNA
Comentarios
PCR
RT-PCR Cebador reverso especfico de la Requiere una sola mezcla de
de 1 paso secuencia reaccin.
No se puede utilizar AmpErase
UNG.
RT-PCR Hexmeros aleatorios El cDNA se puede guardar para

de 2 pasos utilizarlo posteriormente.
Oligo d(T)16
Se puede utilizar AmpErase UNG.
Cebadores reversos especficos de Requiere dos mezclas de reaccin.
la secuencia
Seleccin de PCR en singleplex o en multiplex

Se puede realizar una reaccin de PCR utilizando:
PCR en singleplex: Para experimentos de curva estndar, cuantificacin
relativa. En la PCR en singleplex, hay un solo conjunto de cebadores en el tubo
de reaccin o el pocillo. Slo se puede amplificar una diana o un control
endgeno por reaccin.
o
PCR en multiplex: Para experimentos de CT comparativos. En la PCR en
multiplex, hay dos o ms conjuntos de cebadores en el tubo de reaccin o
pocillo. Cada conjunto amplifica una diana o un control endgeno especficos.
Normalmente, una sonda marcada con fluorocromo FAM detecta la diana y
una sonda marcada con fluorocromo VIC detecta el control endgeno.
IMPORTANTE! No se pueden utilizar reactivos SYBRGreen para la PCR en
multiplex.
Conjunto de cebadores de gen diana

Conjunto de cebadores de control
endgeno
cDNA
PCR en singleplex PCR en multiplex
GR2331
PCR en mulitplex Para realizar una PCR en multiplex para los experimentos de CT comparativos, debe:
para Asegurarse de que el control endgeno que ha seleccionado es ms abundante
experimentos de (menor CT) que todas las dianas que est intentando cuantificar en todas las
CT comparativos condiciones.
Realice el ensayo del control endgeno como un ensayo con limitacin de
concentracin de cebadores. El ensayo del control endgeno (para el molde ms
abundante) en cada reaccin debe tener el cebador limitante para evitar la
competencia en la PCR y altere el CT del molde menos abundante.

Limitacin del cebador en la PCR en multiplex

Para generar un ensayo en multiplex preciso, es importante que la amplificacin de
una especie no domine a la otra. De lo contrario, la amplificacin de una especie
muy abundante puede impedir que la especie menos abundante se amplifique
eficientemente.
Si la especie menos abundante no se amplifica eficientemente, los resultados del
experimento podran ser imprecisos o, en los casos ms graves, se podra inhibir por
completo la deteccin de la especie menos abundante. Para evitar este problema,
limite las concentraciones de los cebadores que se utilizan para amplificar la especie
ms abundante, de manera que la amplificacin se desactive poco despus de
establecer el CT. Sin embargo, los ensayos con cebadores limitantes son ms
susceptibles a sufrir fluctuaciones en las condiciones de la reaccin que los ensayos
de dianas con cebadores no limitados que se normalizan. Para obtener ms
informacin, consulte el Apndice B, Limitacin del cebador en la PCR en
multiplex..
PCR en singleplex y PCR en multiplex

La limitacin de cebadores en la PCR en multiplex es cada vez ms compleja a
medida que aumenta el nmero de dianas que se desea cuantificar. Para analizar un
gran nmero de dianas, quiz sea ms eficiente utilizar la PCR en singleplex por las
siguientes razones:
En la PCR en multiplex, puede resultar difcil encontrar un control endgeno
adecuado, es decir, uno que:
Sea ms abundante que todas las dianas que se estn cuantificando.
No cambie los niveles de expresin con condiciones experimentales o entre
diferentes muestras.
En primer lugar, tendra que realizar todos los ensayos diana y todos los ensayos
de control endgeno en los formatos en multiplex y en singleplex, y luego
comparar los valores de CT de ambos formatos para determinar si la
multiplexacin ha afectado a los valores de CT.
En la PCR en singleplex, cualquier diana que no cambie los niveles de expresin
con condiciones experimentales o entre muestras puede servir de control
endgeno. Por lo tanto, cuantas ms dianas se tengan en un formato en
singleplex, ms probabilidades hay de que haya uno o varios controles
endgenos adecuados con los que normalizar las dems dianas.

Tenga en cuenta lo siguiente a la hora de elegir entre la PCR en singleplex y la PCR

en multiplex para los experimentos de CT comparativos:
PCR Descripcin Ventaja Limitacin
En singleplex Reaccin en la que se No es necesario optimizar los Se requiere una muestra para
amplifica una sola ensayos TaqMan. la diana y para el control
diana o control Cualquier diana que no cambie endgeno.
endgeno en el tubo de los niveles de expresin con
reaccin o pocillo. condiciones experimentales o
entre muestras puede servir de
control endgeno.
Flexibilidad para utilizar reactivos
TaqMan o SYBR Green.
En multiplex Reaccin en la que se Reduce los costes del proceso y El ensayo del control
amplifica ms de una la dependencia de la precisin del endgeno se debe realizar
diana o control pipeteo al separar una muestra en como un ensayo con cebador
endgeno en el tubo de dos tubos diferentes. limitante.
reaccin o pocillo. Requiere validacin y
optimizacin.
Podra no ser tan efectiva
como la PCR en singleplex
para analizar un gran nmero
de dianas.
No se pueden utilizar reactivos
SYBR Green.

Seleccin del tipo de reactivo

Reactivos En el sistema StepOne, se pueden realizar experimentos de cuantificacin con:
TaqMan y Reactivos TaqMan
reactivos SYBR
Green
Para obtener informacin acerca de la eleccin de reactivos TaqMan o reactivos
SYBR Green, consulte Consideraciones sobre los experimentos de cuantificacin
en la pgina 2-6.

Para disear experimentos con el software StepOne, puede seleccionar los siguientes
tipos de ensayos para los experimentos de cuantificacin:
En inventario/fabricados bajo pedido (pgina 3-14)
Personalizados (pgina 3-15)
En esta seccin, se enumeran los productos disponibles para cada tipo de ensayo.
Nota: Los ensayos son especficos de la diana de inters. Las mezclas de reaccin
contienen los dems componentes que son necesarios para la reaccin de PCR.

Ensayos en
Producto Atributos
inventario/
fabricados bajo TaqMan Gene Conjuntos de sondas y cebadores prediseados y
pedido Expression Assays especficos de un gen para genes humanos, de ratones,
ratas, Arabidopsis, Drosophila, C. elegans, C. familiares
(perro) y Rhesus.
Cmodo formato de un solo tubo disponible en ensayos
en inventario o fabricados bajo pedido.
TaqMan Endogenous Ensayos de control endgeno optimizados, preformulados

Control Assays y listos para ser usados.
Nota: Los TaqMan Cuantificacin rentable para la expresin de genes para
Endogenous Control humanos, ratones, ratas, Arabidopsis, Drosophila y
Assays estn incluidos en cualquier especie eurocariota.
los TaqMan Gene Posibilidad de eleccin de marcaje con fluorocromo FAM
Expression Assays en o VIC (con cebador limitante).
inventario.
Custom TaqMan Gene Cualquier especie u organismo.

Expression Assays Eleccin de la diana.
Cmodo formato de un solo tubo.
TaqMan 2 Universal Proporciona un rendimiento ptimo para los ensayos

PCR Master Mix (con o TaqMan que utilizan cDNA o DNA como molde.
sin AmpErase UNG) Contiene componentes que garantizan un rendimiento
excelente del ensayo.
El uso de un reactivo para todos los ensayos simplifica el
proceso de implementacin de los ensayos.
TaqMan Fast Universal Proporciona los mismos atributos que se han indicado
PCR Master Mix (2), No anteriormente para TaqMan 2 Universal PCR Master
AmpErase UNG Mix.
Permite realizar experimentos de cuantificacin en el
sistema StepOne en aproximadamente 35 minutos.

Para conocer las directrices de diseo de experimentos con ensayos en inventario o
fabricados bajo pedido, consulte la pgina 3-18.

Ensayos
Producto Atributos
personalizados
Sondas y cebadores Cualquier especie u organismo.
TaqMan personalizados Posibilidad de eleccin de marcajes de fluorocromos,
apantalladores y escalas de sntesis.
Para uso con el software Primer Express y las directrices
de diseo de ensayos de Applied Biosystems.
Software Primer Software que disea cebadores y sondas para PCR en

Express tiempo real.

TaqMan Fast Universal Proporciona los mismos atributos que se han indicado
PCR Master Mix (2), No anteriormente para TaqMan 2 Universal PCR Master
AmpErase UNG Mix.
Permite realizar experimentos de cuantificacin en el
sistema StepOne en aproximadamente 35 minutos.
Power SYBR Green La gran sensibilidad de la cuantificacin permite detectar

PCR Master Mix pocos nmeros de copias (hasta dos copias de un gen
diana).
Detecta DNA de doble cadena, por lo que no se necesitan
sondas especficas.
Contiene AmpliTaq Gold DNA Polymerase LD altamente
purificado para reducir al mnimo la formacin de
productos no especficos (incluido dmero de cebador).
SYBR Green PCR Detecta DNA de doble cadena, por lo que no se necesitan
Master Mix sondas especficas.
Para aplicaciones estndar cuando no se requiere una
gran sensibilidad.
Contiene AmpliTaq Gold DNA Polymerase para reducir al
mnimo la formacin de productos no especficos (incluido
dmero de cebador).

Para conocer las directrices de diseo de experimentos con ensayos personalizados,
consulte la pgina 3-22.


Seccin 3.2 Directrices de diseo

Ensayos en inventario/fabricados bajo pedido. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-18
TaqMan Gene Expression Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-18
Custom TaqMan Gene Expression Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-20
Seleccin de la mezcla de reaccin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-21
Diseo del experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-22
Ensayos personalizados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-22
Diseo de cebadores y sondas con el software Primer Express . . . . . . . . 3-23
Seleccin de reactivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-26
Uso de las condiciones de termociclado recomendadas . . . . . . . . . . . . . . . 3-28
Optimizacin de concentraciones de cebador . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-31
Optimizacin de la concentracin de sonda . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-35
Para obtener ms informacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-37

Ensayos en inventario/fabricados bajo pedido

Flujo de trabajo Si se selecciona el tipo de ensayo Inventoried/Made to Order (En
inventario/fabricado bajo pedido) en el software StepOne, Applied Biosystems
recomienda seguir el flujo de trabajo que se indica a continuacin:
1. Seleccione el ensayo:
TaqMan Gene Expression Assays (ms abajo).
Custom TaqMan Gene Expression Assays (pgina 3-20).
2. Seleccione la mezcla de reaccin (pgina 3-21).
3. Disee el experimento utilizando el software StepOne (pgina 3-22).
TaqMan Gene Expression Assays
Descripcin del TaqMan Gene Expression Assays son una coleccin completa de conjuntos de
producto sondas y cebadores en inventario y fabricados bajo pedido que sirven para realizar
experimentos de cuantificacin en genes humanos, de ratones, ratas, Arabidopsis,
Drosophila, C. elegans, C. familiares (perro) y Rhesus.
Cada ensayo est diseado con un procedimiento de diseo automatizado en el que
se ha controlado la calidad. Los ensayos en inventario ya estn fabricados y en
inventario, mientras que los ensayos fabricados bajo pedido estn prediseados y se
fabrican cuando se realiza el pedido.
Propiedades del Todos los TaqMan Gene Expression Assays:

producto Requieren tres componentes:
1 a 100 ng de muestra de cDNA (obtenido a partir de RNA) por pocillo,
teniendo todos los pocillos la misma cantidad de DNA.
20 de Gene Expression Assay Mix (especfica para cada diana). Cada
mezcla de ensayo consta de dos cebadores de PCR no marcados y una sonda
MGB (ligando de unin al surco menor) TaqMan marcada con fluorocromo
FAM en una mezcla preformulada de 20. Las concentraciones finales de
1 son de 250 nM para la sonda y de 900 nM para cada cebador.
TaqMan Universal PCR Master Mix (con o sin AmpErase UNG) o
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG.
Estn diseadas y optimizadas para funcionar con una mezcla de reaccin
TaqMan utilizando condiciones de ciclos trmicos universales.
Para obtener resultados, slo se requiere un paso de amplificacin de la PCR y
una lectura simultnea en tiempo real.
Cuando sea posible, amplifique el cDNA diana sin amplificar el DNA
genmico (sufijo m en el identificador de ensayo) diseando sondas diseadas
sobre la unin exn-exn.

Ensayos Los TaqMan Gene Expression Assays estn disponibles para los genes humanos, de
disponibles ratones, ratas, Arabidopsis, Drosophila, C. elegans, C. familiares (perros) y Rhesus.
Los nmeros de referencia son:
PN 4331182 para los ensayos en inventario
PN 4351372 para los ensayos fabricados bajo pedido
El prefijo del nombre del ensayo indica la especie para la que se ha diseado el
ensayo: Hs para Homo sapiens (humano), Mm para Mus musculus (ratn), Rn para
Rattus norvegicus (rata), At para Arabidopsis thaliana, Dm para Drosophila
melanogaster, Ce para C. elegans, Cf para C. familiares (perro) y Rh para Rhesus.
El sufijo del nombre del ensayo indica la colocacin del ensayo, tal y como se
describe en la siguiente tabla.
Sufijo Descripcin
_m La sonda del ensayo est diseada sobre la unin de dos exones; el ensayo
no detecta DNA genmico.
_s Los cebadores y las sondas del ensayo estn diseados en un solo exn; el
ensayo detecta DNA genmico.
_g Los cebadores y las sondas del ensayo pueden estar en un solo exn; el
ensayo puede detectar DNA genmico.
_mH El ensayo se ha diseado para una transcripcin que pertenece a una familia
de genes con una homologa de secuencias alta. El ensayo ofrece una
_sH diferencia de entre 10 CT y 15 CT entre el gen diana y el gen con la homologa
de secuencias ms prxima. Por lo tanto, el ensayo detecta la transcripcin
_gH de la diana con una discriminacin (sensibilidad) entre 1000 y 3000 veces
mayor que la transcripcin homloga ms prxima, si est presente en el
mismo nmero de copias de una muestra.
_u El amplicn del ensayo est diseada sobre la unin de dos exones y la

sonda se asienta por completo en uno de los exones expandidos.
TaqMan Endogenous Control Assays

Los TaqMan Endogenous Control Assays estn incluidos en los TaqMan Gene
Expression Assays (PN 4331182) en inventario. Los TaqMan Endogenous Control
Assays:
Estn disponibles como un TaqMan Gene Expression Assay con una sonda
TaqMan MGB con marcaje con fluorocromo FAM en un solo tubo
preformulado de 20.
Estn disponibles para todas las especies de humano, ratn, y rata, con sondas
TaqMan MGB con marcaje con fluorocromo VIC o FAM. Los controles
endgenos TaqMan con marcajes de fluorocromo VIC tienen los cebadores
limitantes.

Para obtener ms Para obtener ms informacin acerca de los ltimos productos disponibles y los
informacin usos especficos de los productos, consulte el sitio web de Applied Biosystems:
http://www.appliedbiosystems.com/
a. En la pgina de inicio, bajo TaqMan Products (Productos TaqMan),
seleccione TaqMan Gene Expression Assays.
b. En la pgina Gene Expression Assays & Arrays (Matrices y ensayos de
expresin de genes), bajo Individual Assays (Ensayos individuales),
Para obtener informacin acerca de Custom TaqMan Endogenous Control
Assays, consulte Using TaqMan Endogenous Control Assays to Select an
Endogenous Control for Experimental Studies Application Note.
Para obtener informacin acerca de la preparacin de reacciones de PCR con
TaqMan Gene Expression Assays, consulte TaqMan Gene Expression Assays
Protocol.
Custom TaqMan Gene Expression Assays
Descripcin del Custom TaqMan Gene Expression Assays son conjuntos de sondas y cebadores de
producto TaqMan que ha diseado, sintetizado y formulado el servicio Custom TaqMan
Genomic Assays de acuerdo con la informacin de secuencia remitida. Los Custom
TaqMan Gene Expression Assays le permiten realizar experimentos de
cuantificacin en cualquier gen o variante de splicing de cualquier organismo.
Los ensayos emplean reactivos TaqMan para amplificar y detectar la diana en
muestras de cDNA. Todos los ensayos se han desarrollado utilizando software de
diseo de ensayos propio.
Propiedades del Todos los Custom TaqMan Gene Expression Assays:

producto Requieren que se cree un archivo de envo (con el software gratuito File
Builder) con la secuencia de diana y que dicho archivo se enve al servicio
Custom TaqMan Genomic Assays.
Requieren tres componentes:
20 de Gene Expression Assay o 60 de Gene Expression Assay (especfico
para cada diana). Cada ensayo consta de dos cebadores especficos de la
diana y una sonda TaqMan MGB con marcaje del fluorocromo FAM en una
mezcla preformulada de 20 o 60. Las concentraciones finales de 1 son
de 250 nM para la sonda y de 900 nM para cada cebador.
TaqMan Universal PCR Master Mix (con o sin AmpErase UNG) o
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG.
Estn diseadas y optimizadas para funcionar con una mezcla de reaccin
TaqMan utilizando condiciones de ciclos trmicos universales.
Para obtener resultados, slo se requiere un paso de amplificacin de la PCR y
una lectura simultnea en tiempo real.

seleccione Custom TaqMan Gene Expression Assays.
Para obtener informacin acerca de cmo pedir Custom TaqMan Gene
Expression Assays, consulte Custom TaqMan Genomic Assays Protocol:
Submission Guidelines.
Custom TaqMan Gene Expression Assays, consulte Custom TaqMan Gene
Expression Assays Protocol.
Seleccin de la mezcla de reaccin
Mezclas de Los ensayos en inventario/fabricados bajo pedido de Applied Biosystems para los
reaccin experimentos de cuantificacin estn diseados para las siguientes mezclas de
disponibles reaccin TaqMan:
Nmero de
Mezcla de reaccin
referencia
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2), No AmpErase UNG, 4352042
250 reacciones
TaqMan 2 Universal PCR Master Mix, 200 reacciones 4304437
Pack de 10, TaqMan 2 Universal PCR Master Mix 4305719
TaqMan 2 Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG, 200 4324018

reacciones

reacciones
Pack de 10, TaqMan 2 Universal PCR Master Mix, No AmpErase 4324020

UNG
Para obtener ms Para obtener ms informacin acerca del uso de reactivos TaqMan, consulte:
informacin TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2) Protocol
TaqMan Universal PCR Master Mix Protocol

Diseo del experimento
Uso del software Para los ensayos en inventario/fabricados bajo pedido de Applied Biosystems, utilice
StepOne el software StepOne para disear sus experimentos de cuantificacin. El software
StepOne calcula automticamente volmenes para:
Componentes de la mezcla de la reaccin
Diluciones de muestras
(Slo experimentos de curva estndar y curva estndar relativa) Series de
dilucin estndar
Nota: Cuando seleccione el tipo de ensayo Inventoried/Made to Order (En
inventario/fabricado bajo pedido) en el software StepOne, vaya a la pantalla Reaction
Setup (Configuracin de reaccin) en el flujo de trabajo del asistente de diseo o
Advanced Setup (Configuracin avanzada) y, a continuacin, seleccione
Para obtener ms Para obtener ms informacin acerca del diseo y la realizacin de experimentos de
informacin cuantificacin en el sistema StepOne, consulte:
Gua de introduccin a Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System
para experimentos de curva estndar
Gua de introduccin a Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System
para experimentos de cuantificacin relativa
Ensayos personalizados
Flujo de trabajo Si selecciona el tipo de ensayo Custom (Personalizado) en el software StepOne
para realizar un experimento de cuantificacin (es decir, si va disear sus propios
cebadores y sondas), Applied Biosystems recomienda seguir el flujo de trabajo de las
directrices de diseo de ensayos de Applied Biosystems:
1. Disee los cebadores y las sondas con el software Primer Express (ms abajo).
2. Seleccione los reactivos adecuados (pgina 3-26).
3. Utilice las condiciones de ciclos trmicos recomendadas (pgina 3-28).

4. Comience con las concentraciones de cebadores y sondas predeterminadas. Si

es preciso, optimice las concentraciones de cebador (pgina 3-31) y las
concentraciones de sonda (pgina 3-35).
IMPORTANTE! Estos pasos son un sistema rpido y fiable para disear y optimizar
los ensayos nicamente si se siguen de principio a fin. Utilice el sistema en su
totalidad para lograr los mejores resultados. Para leer una descripcin ms detallada
de las directrices de diseo de ensayos de Applied Biosystems, consulte el
Apndice C.
Nota: Cuando seleccione el tipo de ensayo Custom (Personalizado) en el software
StepOne, vaya a la pantalla Reaction Setup (Configuracin de reaccin) en el flujo
de trabajo del asistente de diseo o Advanced Setup (Configuracin avanzada) y, a
continuacin, seleccione Custom (Personalizado) en el men desplegable Assay
Type (Tipo de ensayo).
Diseo de cebadores y sondas con el software Primer Express

El software Primer Express utiliza los parmetros recomendados cuando seleccione
cebadores y sondas basndose en la secuencia de DNA que se proporciona.
Si va a disear su propio ensayo, utilice el resumen de las directrices de diseo de
cebadores y sondas para experimentos de cuantificacin en la pgina 3-25. Para leer
una explicacin ms detallada de estas directrices, consulte Acerca de las directrices
de diseo de cebadores y sondas en la pgina 3-24.
Nota: Aunque no se necesita una sonda para detectar el fluorocromo SYBR Green
I, sigue siendo conveniente utilizar el software Primer Express cuando seleccione un
conjunto de cebadores y sondas a la hora de disear un ensayo para reactivos SYBR
Green. Aunque no se utilice ninguna sonda, los cebadores cumplen todos los
criterios necesarios; si necesita convertir el ensayo en reactivos TaqMan para obtener
una especifidad mayor, encontrar la sonda inmediatamente en el documento original
del software Primer Express.
Seleccin de un La seleccin de un buen emplazamiento de amplicones garantiza la amplificacin de

emplazamiento la diana mRNA/cDNA sin coamplificar la secuencia genmica, los pseudogenes y
de amplicones otros genes relacionados. Los reactivos SYBR Green pueden ser tiles para cribar los
para los ensayos emplazamientos de amplicones para la expresin de genes.
de cuantificacin
Directrices
El amplicn debera expandir uno o varios intrones para evitar la amplificacin
del gen diana en el DNA genmico.
La pareja de cebadores debera ser especfica al gen diana para evitar la
amplificacin de los pseudogenes u otros genes relacionados.
Para disear cebadores, utilice las directrices del software Primer Express.
Si no se encuentra ninguna secuencia buena, puede que sea necesario examinar
la secuencia y volver a disear el amplicn o simplemente realizar un cribado
para encontrar ms emplazamientos.

Si el gen que est estudiando no tiene intrones, no es posible disear un amplicn que
amplifique la secuencia de mRNA sin amplificar la secuencia genmica. En este
caso, realice un control de la muestra de RNA en la que no se haya realizado una
transcripcin reversa (controles RT menos).
Acerca de las Seleccin de pequeos amplicones

directrices de Uno de los parmetros predeterminados ms importantes del software Primer
diseo de Express es la seleccin de amplicones en el rango de 50 a 150 parejas base. Es
cebadores y preferible utilizar amplicones pequeos porque permiten que la amplificacin sea
sondas muy eficiente.
Asimismo, los ensayos de alta eficiencia permiten realizar una cuantificacin
relativa utilizando el mtodo de CT comparativos (CT) (Livak y Schmittgen,
2001). Este mtodo aumenta el rendimiento de las muestras al eliminar la necesidad
de utilizar curvas estndar para observar los niveles de expresin de una diana en
relacin con una muestra de referencia.
Contenido de G/C
Siempre que sea posible, elija cebadores y sondas de una regin que tenga un
contenido de G/C del 30 al 80%. Las regiones con un contenido de G/C >80%
podran no desnaturalizarse bien durante el termociclado, lo que se deriva en una
reaccin menos eficiente. Las secuencias ricas en G/C son susceptibles a sufrir
interacciones no especficas que pueden reducir la eficiencia de la reaccin y
producir seales no especficas en ensayos en los que se utilizan reactivos SYBR
Green. Evite las secuencias de cebadores y sondas que contengan procesos de cuatro
o ms bases G.
Temperatura de desnaturalizacin
Cuando seleccione cebadores y sondas con la temperatura de desnaturalizacin (Tm)
recomendada, puede utilizar condiciones de ciclos trmicos universales. Applied
Biosystems recomienda que la Tm de la sonda sea 10 C superior a la de los
cebadores.
Extremo 5 de sondas
El software Primer Express no selecciona sondas con una G en el extremo 5. El
efecto apantallador de una base G en esta posicin estar presente an despus de la
ruptura de la sonda, lo que puede reducir los valores de la fluorescencia (Rn) e
influir en el rendimiento del ensayo. No se ha demostrado que, el hecho de tener
bases G en posiciones prximas al extremo 5, pero no en l, afecte al rendimiento de
los ensayos.

Extremo 3 de cebadores
Para reducir la posibilidad de que se formen productos no especficos, asegrese de
que las ltimas cinco bases del extremo 3 de los cebadores no contenga ms de dos
bases C y/o G. En determinadas circunstancias (por ejemplo, en una secuencia de
molde rica en G/C), podra ser necesario saltarse esta recomendacin para mantener
el amplicn a una longitud inferior a 150 pares base. En general, evite que los
extremos 3 de los cebadores sean muy ricos en bases G y/o C.
Resumen de las
Directrices de sondas Directrices de cebadores
directrices de
diseo de Primero, seleccione la sonda y, a continuacin, disee los cebadores de la manera ms
cebadores y parecida posible a la sonda sin superponerse a la sonda (se recomiendan
sondas MGB encarecidamente amplicones de 50 a 150 pares base).
Mantenga el contenido de G/C en un rango del 30 al 80%.
Evite repeticiones de un nucletido idntico, especialmente de guanina, en los que se

deberan evitar repeticiones de cuatro o ms G.
Si se utiliza el software Primer Express, la Si se utiliza el software Primer Express, la

Tm debera ser de 68 a 70 C. Tm debera ser de 58 a 60 C.
Sin G en el extremo 5. Los cinco nucletidos del extremo 3 no

deberan tener ms de 2 bases G y/o C.
Las sondas TaqMan MGB deberan ser lo
ms cortas posible, sin llegar a tener
menos de 13 nucletidos.

Seleccin de reactivos
Hay disponibles muchos reactivos TaqMan y SYBR Green para los experimentos de
cuantificacin. Los reactivos que se utilicen dependen de la diana:
DNA o cDNA (ms abajo).
RNA con RT-PCR de 1 paso (pgina 3-27).
RNA con RT-PCR de 2 pasos (pgina 3-27).
Nota: Si utiliza reactivos SYBR Green, Applied Biosystems recomienda
encarecidamente los reactivos Power SYBR Green.
Cuantificacin de
Nmero de
DNA o cDNA Reactivo Kit
referencia
Reactivos TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2), No 4352042

TaqMan AmpErase UNG, 250 reacciones
TaqMan 2 Universal PCR Master Mix, 200 4304437

reacciones
TaqMan 2 Universal PCR Master Mix, 2000 4326708

reacciones
Pack de 10, TaqMan 2 Universal PCR Master 4305719

Mix
TaqMan 2 Universal PCR Master Mix, No 4324018

AmpErase UNG, 200 reacciones
TaqMan 2 Universal PCR Master Mix, No 4326614

AmpErase UNG, 2000 reacciones
Pack de 10, TaqMan 2 Universal PCR Master 4324020

Mix, No AmpErase UNG
TaqMan PCR Core Reagents Kit, 200 reacciones N808-0228
Reactivos SYBR Power SYBR Green PCR Master Mix (1 mL), 4368577
Green 40 reacciones
Power SYBR Green PCR Master Mix (5-mL), 4367659

200 reacciones
Power SYBR Green PCR Master Mix 4368708

(10 5-mL), 2000 reacciones
Power SYBR Green PCR Master Mix (50 mL), 4367660

2000 reacciones
SYBR Green PCR Master Mix (1-mL), 4344463

40 reacciones

200 reacciones

2000 reacciones
SYBR Green PCR Core Reagents, 200 4304886

reacciones

Cuantificacin de
Nmero de
RNA con RT-PCR Reactivo Kit
referencia
en 1 paso
Reactivos TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents 4309169
TaqMan Kit
TaqMan EZ RT-PCR Core Reagents N808-0236

Nota: Utilice TaqMan EZ RT-PCR Core
Reagents cuando se necesite un paso de RT a
alta temperatura.
Reactivos SYBR Power SYBR Green RT-PCR Reagents Kit 4368711

Green
SYBR Green RT-PCR Reagents 4310179
Cuantificacin de
Nmero de
RNA con RT-PCR Reactivo Paso Kit
referencia
en 2 pasos
Reactivos Slo paso de TaqMan 2 Universal PCR Master 4304437
TaqMan PCR Mix
TaqMan Fast Universal PCR Master 4352042

Mix (2), No AmpErase UNG
Slo paso de High-Capacity cDNA Reverse 4374966

RT Transcription Kit
TaqMan Reverse Transcription N808-234

Reagents
Pasos RT y Kit TaqMan Gold RT PCR N808-232

PCR
Reactivos Slo paso de Power SYBR Green PCR Master 4367659

SYBR Green PCR Mix
SYBR Green PCR Master Mix 4309155
Slo paso de High-Capacity cDNA Reverse 4374966

RT Transcription Kit
TaqMan Reverse Transcription N808-234

Reagents
Pasos RT y Power SYBR Green RT-PCR 4368711

PCR Reagents Kit
SYBR Green RT-PCR Reagents 4310179

Acerca de El uso de la enzima activada por calor AmpliTaq Gold DNA Polymerase es una
AmpliTaq Gold parte integral de las directrices de diseo de ensayos de Applied Biosystems para
DNA Polymerase reactivos TaqMan y SYBR Green. AmpliTaq Gold DNA Polymerase garantiza una
reaccin robusta y puede reducir enormemente la cantidad de formacin de
productos no especficos. Otro beneficio adicional es que simplifica la configuracin
del ensayo, el cual se puede realizar a temperatura ambiental.
Nota: La polimerasa de DNA que se incluye en TaqMan Fast Universal PCR Master
Mix (2), No AmpErase UNG es activada por calor de modo muy rpido. El
rendimiento es similar al de AmpliTaq Gold DNA Polymerase.
Acerca de MultiScribe Reverse Transcriptase es una transcriptasa reversa del virus de la

MultiScribe leucemia murina de Moloney (MuLV) recombinante que realiza la transcripcin
Reverse reversa del RNA en DNA complementario (cDNA).
Transcriptase
Uso de las condiciones de termociclado recomendadas

Utilice las condiciones del termociclado que se recomiendan para la muestra:
DNA o cDNA (ms abajo).
RNA con RT-PCR de 1 paso (pgina 3-29).
RNA con RT-PCR de 2 pasos (pgina 3-30).
Nota: Las condiciones del termociclado de los reactivos rpidos son diferentes a las
condiciones del termociclado de los reactivos estndar.

Cuantificacin de Para TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2), No AmpErase UNG, utilice
DNA o cDNA estas condiciones:
Tiempos y temperaturas
Pasos iniciales PCR (40 ciclos)
Activacin de Hibridacin/
Activacin Desnaturalizacin
AmpErase UNG extensin
HOLD (en espera) HOLD (en espera) CICLADO
2 min a 50 C 20 seg a 95 C 3 seg a 95 C 30 seg a 60 C
Slo es necesario si se aade AmpErase UNG a las reacciones.
Para TaqMan 2 Universal PCR Master Mix y Power SYBR Green PCR Master
Mix, utilice estas condiciones:
Activacin de
Activacin de Hibridacin/
AmpliTaq Gold Desnaturalizacin
AmpErase UNG extensin
DNA Polymerase
HOLD (en espera) HOLD (en espera) CICLADO
2 min a 50 C 10 min a 95 C 15 seg a 95 C 1 min a 60 C
Slo necesario si se aade AmpErase UNG a las reacciones o est incluida en la mezcla
de reaccin.
Cuantificacin de Para TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents Kit o Power SYBR Green
RNA con RT-PCR RT-PCR Reagents Kit, utilice estas condiciones:
de 1 paso
Activacin de
Transcripcin Hibridacin/
AmpliTaq Gold Desnaturalizacin
reversa extensin
DNA Polymerase
HOLD (en espera) HOLD (en espera) 40 CICLOS
Nota: Estas condiciones no se aplican a TaqMan EZ RT-PCR Kit. Consulte

TaqMan EZ RT-PCR Kit Protocol para conocer las condiciones adecuadas.

Cuantificacin de Para High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit, utilice estas condiciones:
RNA con RT-PCR
de 2 pasos Paso Tiempos y temperaturas
Paso 1 Paso 2
1. Paso de RT HOLD (en espera) HOLD (en espera)
10 min a 25 C 120 min a 37 C
Despus de realizar la transcripcin reversa del RNA en cDNA (paso de RT), se pueden
guardar muestras o se pueden utilizar para el siguiente paso de la PCR que se describe a
continuacin.
IMPORTANTE! Para la mayora de las aplicaciones y cuando se necesitan grandes

cantidades de cDNA, Applied Biosystems recomienda 120 minutos a 37 C para que
la transcripcin reversa logre la conversin ptima.
Para TaqMan 2 Universal PCR Master Mix (con AmpErase UNG) o Power SYBR
Green PCR Master Mix, utilice estas condiciones:
Paso Tiempos y temperaturas
Activacin de
Activacin de
2. Paso de AmpliTaq Desnaturali- Hibridacin/
AmpErase
PCR Gold DNA zacin extensin
UNG
Polymerase
HOLD (en HOLD (en CICLADO

espera) espera)
Para TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2), No AmpErase UNG, utilice
estas condiciones:
Paso Tiempos y temperaturas
Activacin de
Activacin de
2. Paso de AmpliTaq Desnaturali- Hibridacin/
AmpErase
PCR Gold DNA zacin extensin
UNG
Polymerase
HOLD (en HOLD (en CICLADO

espera) espera)
2 min a 50 C 20 seg a 95 C 3 seg a 95 C 30 seg a 60 C
Slo es necesario si se aade AmpErase UNG a las reacciones.

Optimizacin de concentraciones de cebador

Al cambiar de manera independiente las concentraciones de cebador directo y
reverso, se pueden identificar las concentraciones con las que se obtiene el
rendimiento ptimo del ensayo. Los cebadores siempre tienen un gran exceso molar
durante la fase exponencial de la reaccin de amplificacin.
A la hora de utilizar TaqMan 2 Universal PCR Master Mix, Applied Biosystems
recomienda las concentraciones de cebadores que se indican en Concentraciones de
cebador predeterminadas ms abajo. A continuacin, se ofrece una explicacin
detallada de:
Matriz de optimizacin del cebador (ms abajo)
Reactivos TaqMan (ms abajo)
Reactivos SYBR Green (pgina 3-33)
Concentraciones Las concentraciones de cebador recomendadas que se enumeran en la siguiente tabla

de cebador son para ensayos de cuantificacin de DNA y cDNA.
predeterminadas
Concentraciones (nM)
Reactivo
Cebador directo Cebador reverso
Reactivos TaqMan 900 900
Reactivos SYBR Green 50 50
Matriz de La matriz de optimizacin de cebadores le permite determinar si la concentracin

optimizacin de mnima de cebador produce el CT mnimo y el Rn mximo.
cebadores
La matriz de optimizacin de cebadores puede ayudarle a compensar la unin no
especfica del cebador, lo que puede reducir la cantidad de cebador disponible para
unirse en su emplazamiento especfico.
Reactivos Para obtener el rendimiento ptimo en los ensayos de cuantificacin en los que se
TaqMan utilizan reactivos TaqMan, hay que seleccionar concentraciones de cebador que
proporcionen el CT menor y el Rn mayor para una cantidad fija de molde diana.
Nota: Aunque los valores CT son el parmetro por el cual se asignan valores
cuantitativos en los ensayos de cuantificacin en tiempo real, los valores Rn
tambin pueden ser importantes para intentar obtener la mxima sensibilidad y
reproducibilidad.
Los resultados de un experimento tpico de matriz de optimizacin de cebadores de
reactivos TaqMan se muestran en la Figura 3-3 en la pgina 3-32:
La Figura 3-3a muestra las grficas de amplificacin de todas las
combinaciones de concentraciones de cebadores en una visin lineal.
La Figura 3-3b muestra los mismos datos en el formato de vista de logaritmos.

La combinacin de cebador directo y reverso de 50-nM (grupo C) produce el Rn

menor y el CT mayor. Todas las dems concentraciones de cebador que contienen una
concentracin de 150-nM de cebador directo o reverso (grupo B) producen un Rn
reducido. Todas las concentraciones de cebador que contienen al menos 300-nM de
cebador directo y reverso (grupo A) producen el Rn mayor y el CT menor; como
resultado, cualquier combinacin del grupo A o B proporciona un rendimiento
ptimo.
a) Visin lineal
}Grupo A
Plot Group A
}Grupo
Plot Group
B B
Rn
}Grupo
Plot Group
C C
Ciclo
Cycle
b) Visin algortmica
} Plot
GrupoGroup
A A
} Plot
GrupoGroup
B B
} Plot
Grupo C C
Group
Rn
Ciclo
Cycle
Figura 3-3 Resultados del experimento de optimizacin de cebadores en los

que se muestran grficas de amplificacin (visin lineal y algortmica) de
combinaciones de cebadores
Clave de grupos:
A: Combinaciones que contienen al menos 300 nM de cebador directo y reverso
B: Combinaciones que contienen al menos 150 nM de cebador directo y reverso
C: Combinaciones que contienen al menos 50 nM de cebador directo y reverso

Reactivos SYBR La optimizacin de las concentraciones de cebador es ligeramente ms compleja en

Green los ensayos de cuantificacin en los que se utilizan reactivos SYBR Green. Se
debera utilizar la misma matriz de optimizacin de cebador que para los reactivos
TaqMan; sin embargo, para los reactivos SYBR Green, se deben incluir controles
negativos. Las concentraciones de cebador que seleccione deberan producir un CT
bajo y un Rn alto cuando se procesan en el molde diana, pero no deberan producir
una formacin de productos no especficos con controles negativos.
Los anlisis de curvas de disociacin o gel pueden resultar enormemente tiles
cuando seleccione concentraciones de cebador ptimas para los ensayos de
cuantificacin en los que se utilizan reactivos SYBR Green. La Figura 3-4 en la
pgina 3-34 muestra los resultados de una matriz de optimizacin de cebadores en
concentraciones de cebador directo y reverso de 900-nM:
La Figura 3-4a muestra una fuerte amplificacin de los pocillos de control
negativo, lo que indica que se est produciendo una amplificacin no especfica
significativa.
La Figura 3-4b muestra que la temperatura de desnaturalizacin del producto
generado en ausencia de molde es menor que la temperatura de
desnaturalizacin del producto especfico generado con molde, lo que indica
que se est produciendo una amplificacin no especfica importante.
Los resultados que se muestran en la Figura 3-4 son tpicos de la formacin de un
dmero de cebadores. Estos resultados indican que unas concentraciones menores de
cebador pueden producir mejores resultados. Asimismo, puede volver a disear otro
conjunto de cebadores para la diana de inters.

a) Grfica de amplificacin, visin lineal
Amplificacin de diana
NC (amplificacin no
especfica)
Nmero de ciclo
b) Anlisis de curva de disociacin
NC Diana de
Derivado (fluorescencia
amplificacin
(amplificacin
no especfica)
bruta)
Temperatura (C)
Figura 3-4 Datos de amplificacin con reactivos SYBR Green

(a) Grfica de amplificacin (visin lineal) que demuestra una amplificacin no
especfica sospechosa en los pocillos de control negativo (NC).
(b) Anlisis de curva de disociacin que confirma que el producto de los pocillos
NC tiene una temperatura de desnaturalizacin diferente a la del producto
especfico.

Optimizacin de la concentracin de sonda

Para la deteccin por medio de sondas TaqMan, la concentracin de sonda
recomendada de 250 nM garantiza un rendimiento excelente del ensayo. Sin
embargo, dependiendo de los requisitos del ensayo, podra resultar til realizar un
experimento de optimizacin de sondas.
Nota: No se requiere ninguna sonda para la deteccin del fluorocromo SYBR Green I.
Concentraciones Las concentraciones de sonda recomendadas para los ensayos de cuantificacin de

de sonda DNA y cDNA en los que se utilizan reactivos TaqMan es de 250 nM. La Figura 3-5
recomendadas muestra los resultados de un experimento de optimizacin de sondas en donde la
concentracin de sonda se cambia de 50 a 250 nM:
La Figura 3-5a muestra un aumento de Rn a medida que se aumenta la
concentracin de sonda.
La Figura 3-5b muestra que el valor CT cambia con la concentracin de sonda
suficiente.
Para garantizar la mejor reproducibilidad, especialmente si se desean detectar pocas
copias de una diana, evite concentraciones de sonda limitantes. Realice el ensayo con
una concentracin de sonda de 250 nM. Con una concentracin de 250-nM, se evita
la limitacin de sonda y se garantizan valores de Rn altos. Los valores de Rn altos
indican que el ensayo es robusto y se est realizando con una gran eficiencia, lo que
se deriva en una buena produccin de producto y permite medir con precisin los
picos.

a) Visin lineal
Sonda
250 nMde 250 nM
Probe
150 nMde
Sonda Probe
150 nM
Rn 100 nMde
Sonda Probe
100 nM
Sonda de 50 nM
50 nM Probe
Nmero
Cyclede ciclos
b) Visin algortmica
250 nMde
Sonda Probe
250 nM
150 nMde
Sonda Probe
150 nM
100 nMde
Sonda Probe
100 nM
50 nM Probe
Sonda de 50 nM
Rn
Cycle
Nmero de ciclos
Figura 3-5 Grfica de amplificacin (visiones lineal y algortmica) con

concentraciones de sonda de 50 a 250 nM

Para obtener ms informacin

Para obtener ms informacin acerca de:
El uso de reactivos TaqMan, consulte:
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2) Protocol
TaqMan Universal PCR Master Mix Protocol
El uso de reactivos SYBR Green, consulte:
Power SYBR Green PCR Master Mix and RT-PCR Protocol
SYBR Green PCR Master Mix and RT-PCR Reagents Protocol
SYBR Green PCR and RT-PCR Reagents Protocol
La realizacin de experimentos de cuantificacin en el sistema StepOne,
consulte:
Gua de introduccin a Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR
System para experimentos de curva estndar
Gua de introduccin a Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR
System para experimentos de cuantificacin relativa
La realizacin de experimentos de presencia/ausencia en el sistema StepOne,
consulte Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Getting Started
Guide for Presence/Absence Experiments.


Experimentos de genotipado 4 4
Seccin 4.1 Acerca de los experimentos de genotipado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-3
Seccin 4.2 Directrices de diseo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-9



genotipado

Introduccin. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-4

Introduccin
Qu es un Los experimentos de genotipado son experimentos de punto final que se utilizan para
experimento de determinar el genotipo de muestras desconocidas. Con este tipo de experimento, se
genotipado? puede diferenciar un polimorfismo de un solo nucletido (SNP).
Los experimentos de genotipado determinan si las muestras desconocidas son:
Homocigotos (muestras que slo tienen el alelo 1)
Homocigotos (muestras que slo tienen el alelo 2)
Heterocigotos (muestras que tienen el alelo 1 y el alelo 2)
Componentes
Las reacciones de PCR de los experimentos de genotipado incluyen los siguientes
componentes:
Muestra: la muestra en la que el genotipo es desconocido.
(Opcional) Rplicas: reacciones idnticas que contienen componentes y
volmenes idnticos.
(Opcional) Controles positivos: muestras que contienen genotipos conocidos
(homocigotos para el alelo 1, homocigotos para el alelo 2 y heterocigotos para
los alelos 1 y 2).
Instrumentos Los experimentos de genotipado requieren dos pasos: una reaccin de termociclado
(amplificacin de PCR) seguido por la deteccin del punto final de las seales
fluorescentes resultantes. La reaccin de termociclado (amplificacin de PCR) se
puede realizar en Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System o en un
termociclador autnomo.
Si utiliza el sistema StepOne:
Puede analizar la PCR, lo que resulta til para solucionar problemas.
Realice la lectura de la placa de punto final por separado.
Funcionamiento En los experimentos de genotipado, la PCR incluye una sonda marcada con
de los fluorocromo especfico para cada alelo. Las sondas contienen diferentes
experimentos de fluorocromos notificadores para diferenciar cada alelo.
genotipado
En el sistema StepOne, se pueden utilizar sondas de ligando de unin al surco menor
(MGB) TaqMan. Cada sonda TaqMan MGB contiene:
Un fluorocromo notificador en el extremo 5 de cada sonda
Fluorocromo VIC que est unido al extremo 5 de la sonda del alelo 1
Fluorocromo FAM que est unido al extremo 5 de la sonda del alelo 2

Un ligando de unin al surco menor (MGB)

Esta modificacin aumenta la temperatura de desnaturalizacin (Tm) de las
sondas sin aumentar la longitud de la sonda (Afonina et al., 1997; Kutyavin
et al., 1997), por lo que permite disear sondas ms cortas. Por consiguiente, las
sondas TaqMan MGB tienen mayores diferencias en los valores de Tm entre
sondas complementarias y no perfectamente complementarias con la diana.
Estas mayores diferencias en los valores de Tm permiten realizar el genotipado
con precisin.
Un apantallador no fluorescente (NFQ) en el extremo 3 de la sonda
Dado que el apantallador no emite fluorescencia, los sistemas de PCR en tiempo
real pueden medir con ms precisin las contribuciones del fluorocromo
notificador.
Durante la PCR, cada sonda se hibrida de manera especfica para su secuencia
complementaria situada entre el cebador directo y reverso. AmpliTaq Gold DNA
Polymerase slo puede romper sondas que se hibridan con la secuencia del alelo
(complementariedad). De esta forma, el fluorocromo notificador se separa del
fluorocromo del apantallador, lo que aumenta la fluorescencia del fluorocromo
notificador. Por eso, las seales de fluorescencia generadas durante la reaccin de
amplificacin indican qu alelos hay en la muestra.
Faltas de complementariedad entre la sonda y las secuencias de alelos

La falta de complementariedad entre una sonda y un alelo (Figura 4-1) reduce la
eficiencia de la hibridacin de la sonda. Asimismo, es probable que AmpliTaq Gold
DNA Polymerase desplace a la sonda no complementaria en lugar de romperla para
liberar el fluorocromo notificador.
Alelo F
1 V Leyenda
Q Q
Fluorocromo
V VIC
Complementariedad No complementariedad Fluorocromo

F FAM
Q Apantallador
Alelo F V
2
Q Q AmpliTaq
Gold DNA
Polymerase
Complementariedad No complementariedad GR1556
Figura 4-1 Resultados de complementariedad y no complementariedad entre

secuencias de alelos y sondas en los experimentos de genotipado

La Tabla 4-1 resume los posibles resultados del experimento de genotipado de

ejemplo que se ha mostrado anteriormente.
Tabla 4-1 Resultados del experimento de genotipado
Aumento sustancial de Indica
slo fluorescencia del fluorocromo VIC homocigosidad del alelo 1.
slo fluorescencia del fluorocromo FAM homocigosidad del alelo 2.
ambas seales fluorescentes heterocigosidad.
Flujo de trabajo Antes de realizar experimentos de genotipado en el sistema StepOne, prepare el

experimento de la siguiente forma:
1. Seleccione el tipo de ensayo (ms abajo).

tipos de ensayos para los experimentos de genotipado:
Prediseados/validados (ms abajo)
Nota: Los reactivos rpidos TaqMan y los reactivos SYBR Green no se admiten
en los experimentos de genotipado.

Ensayos
Producto Atributos
prediseados/
validados TaqMan SNP Ensayos prediseados para una alta densidad elevada de
Genotyping Assays avisos a lo largo de todo el genoma
Para estudios de cribado, asociacin, regin candidata,
gen candidato y refinamiento.
TaqMan Drug Detecta polimorfismos en 220 genes que codifican

Metabolism Genotyping diversas enzimas del metabolismo de frmacos y
Assays transportadores de frmacos.
Para estudiar polimorfismos de un solo nucletido (SNP),
inserciones/eliminaciones (in/dels) y polimorfismos de
varios nucletidos (MNP).
Pre-Developed TaqMan Genotipado de muestras de DNA purificado para

Assay Reagents for mutaciones especficas; la mayora de los ensayos
Allelic Discrimination discriminan entre dos alelos de polimorfismos de un solo
nucletido (SNP).
Se aade un ligando de unin al surco menor (MGB) para
que el genotipado sea mejor.
Se ha incluido DNA de control de los alelos 1 y 2 para
poder generar cada seal de homocigoto en cada
proceso.
El sistema de tubos cerrados no requiere ninguna
manipulacin posterior a la PCR ni geles.

Para conocer las directrices de diseo de experimentos con ensayos

prediseados/validados, consulte la pgina 4-10.
Ensayos
Producto Atributos
personalizados
Custom TaqMan SNP Cualquier polimorfismo de un solo nucletido (SNP)
Genotyping Assays posible en cualquier organismo.
Detecta inserciones/eliminaciones (in/dels) de hasta seis
bases.
Detecta polimorfismos de varios nucletidos (MNP) de
hasta seis bases.





Ensayos prediseados/validados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-10
TaqMan SNP Genotyping Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-10
TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-11
Pre-Developed TaqMan Assay Reagents for Allelic Discrimination . . . . 4-12
Custom TaqMan SNP Genotyping Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-15

Ensayos prediseados/validados
Flujo de trabajo Si va a disear un experimento de genotipado utilizando ensayos
prediseados/validados de Applied Biosystems, Applied Biosystems recomienda
seguir el flujo de trabajo que se indica a continuacin:
TaqMan SNP Genotyping Assays (ms abajo).
TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assays (pgina 4-11).
TaqMan Pre-Developed Assays Reagents for Allelic Discrimination
(pgina 4-12).
TaqMan SNP Genotyping Assays
Descripcin del TaqMan SNP Genotyping Assays son una coleccin completa de conjuntos de
producto cebadores y sondas para realizar el genotipado de polimorfismos de un solo
nucletido (SNP) en estudios de humanos.
Los ensayos emplean reactivos TaqMan para amplificar y detectar alelos de SNP
especficos en muestras de DNA genmico purificado. Todos los ensayos se han
diseado con software y procesos bioinformticos de Applied Biosystems, as como
con informacin genmica de Celera Genomics y bases de datos pblicas.
Propiedades del Todos los TaqMan SNP Genotyping Assays:

1 a 20 ng de muestra de DNA genmico purificado
20, 40, o 80 de SNP Genotyping Assay Mix (especfica para cada
polimorfismo). Cada ensayo consta de cebadores reversos o directos
especficos de la secuencia para amplificar el SNP de inters y dos sondas
TaqMan MGB: Una sonda marcada con fluorocromo VIC detecta la
secuencia del alelo 1 y una sonda marcada con el fluorocromo FAM detecta
la secuencia del alelo 2.
TaqMan 2 Universal PCR Master Mix (con o sin AmpErase UNG)
Estn diseadas y optimizadas para funcionar con TaqMan 2 Universal PCR
Master Mix (con o sin AmpErase UNG), utilizando condiciones de
termociclado universales.
Para obtener resultados, se necesita la reaccin de amplificacin y una lectura
de punto final.

Ensayos Existen dos categoras de TaqMan SNP Genotyping Assays:

disponibles
Categora Descripcin
TaqMan Validated & Aproximadamente 5000 ensayos de SNP a pequea

Coding SNP Genotyping escala, de los cuales, unos 2000 son ensayos de SNP
Assays codificantes.
En inventario (es decir, se guardan en inventario para
poderlos adquirir ya preparados).
TaqMan Pre-Designed Ms de 4,5 millones de ensayos SNP prediseados,

SNP Genotyping Assays incluidos 3,5 millones de ensayos HapMap y unos 68.000
ensayos de SNP codificantes.
Disponibles a pequea, media y larga escala.
Fabricados bajo pedido (es decir, fabricados en el
momento de realizar el pedido).
seleccione TaqMan SNP Genotyping Assays.
b. En la pgina SNP Genotyping Assays (Ensayos de genotipado SNP), bajo
Pre-Designed/Validated Assays (Ensayos prediseados/validados),
TaqMan SNP Genotyping Assays, consulte TaqMan SNP Genotyping Assays
Protocol.
TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assays
Descripcin del TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assays son una coleccin completa de
producto conjuntos de cebadores y sondas en inventario para el genotipado de SNP,
inserciones y eliminaciones (in/dels) y polimorfismos de varios nucletidos (MNP)
en genes relacionados con el metabolismo de frmacos.
Los ensayos emplean reactivos TaqMan para amplificar y detectar polimorfismos
especficos en muestras de DNA genmico purificado. Todos los ensayos se han
diseado con software y procesos bioinformticos de Applied Biosystems, as como
con informacin genmica de bases de datos de SNP pblicas y ensamblajes de
genomas pblicos.
Propiedades del Todos los TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assays:

3 a 30 ng de muestra de DNA genmico purificado

20 de Drug Metabolism Genotyping Assay Mix (especfico para cada

polimorfismo). Cada ensayo consta de cebadores reversos o directos
especficos de la secuencia para amplificar la secuencia polimrfica de
inters y dos sondas TaqMan MGB: Una sonda marcada con fluorocromo
VIC detecta la secuencia del alelo 1 y una sonda marcada con el fluorocromo
FAM detecta la secuencia del alelo 2.
TaqMan 2 Universal PCR Master Mix (con o sin AmpErase UNG)
de punto final.
seleccione TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assays.
TaqMan SNP Genotyping Assays, consulte TaqMan Drug Metabolism
Genotyping Assays Protocol.
Pre-Developed TaqMan Assay Reagents for Allelic Discrimination
Descripcin del Pre-Developed TaqMan Assay Reagents for Allelic Discrimination (TaqMan
producto PDARs for AD) son ensayos en inventario optimizados para la discriminacin allica
especfica.
Propiedades del TaqMan PDARs for AD requieren tres componentes:

producto 2 a 20 ng de muestra de DNA genmico purificado.
10 de Allelic Discrimination Assay Mix (especfica para cada polimorfismo).
Cada ensayo consta de cebadores reversos o directos especficos de la secuencia
para amplificar la secuencia polimrfica de inters y dos sondas TaqMan MGB:
Una sonda marcada con fluorocromo VIC detecta la secuencia del alelo 1 y una
sonda marcada con el fluorocromo FAM detecta la secuencia del alelo 2.
TaqMan 2 Universal PCR Master Mix (con AmpErase UNG).
Nota: Se ha incluido DNA de control de los alelos 1 y 2 con cada ensayo para poder
generar cada seal de homocigoto en cada proceso.

seleccione TaqMan Pre-Developed Assay Reagents for Allelic
Discrimination (TaqMan PDARs for AD).
Para obtener informacin acerca de la preparacin de reacciones de PCR
utilizando TaqMan PDARs for Allelic Discrimination, consulte Pre-Developed
TaqMan Assay Reagents Allelic Discrimination Protocol.
Mezclas de Los ensayos prediseados/validados de Applied Biosystems para experimentos de

reaccin genotipado estn diseados para las siguientes mezclas de reaccin TaqMan:
disponibles TaqMan PDARs for AD contienen TaqMan 2 Universal PCR Master Mix
(con AmpErase UNG).
Se pueden utilizar TaqMan SNP Genotyping Assays y Custom TaqMan SNP
Genotyping Assays con:
Nmero de
Mezcla de reaccin
referencia
TaqMan 2 Universal PCR Master Mix, No AmpErase 4324018

UNG, 200 reacciones
TaqMan 2 Universal PCR Master Mix, No AmpErase 4326614

UNG, 2000 reacciones
Pack de 10, TaqMan 2 Universal PCR Master Mix, No 4324020

AmpErase UNG
Nota: No se pueden realizar experimentos de genotipado con TaqMan Fast

Universal PCR Master Mix.
Para obtener ms Para obtener informacin acerca del uso de mezclas de reaccin TaqMan, consulte
informacin TaqMan Universal PCR Master Mix Protocol.

Uso del software Para los ensayos prediseados/validados de Applied Biosystems, utilice el software
StepOne StepOne para disear sus experimentos de genotipado. El software StepOne calcula
automticamente volmenes para:
o crear uno nuevo.
Para obtener ms Para obtener informacin acerca del diseo y la realizacin de experimentos de
informacin genotipado en el sistema StepOne, consulte la Gua de introduccin de Applied
Biosystems StepOne Real-Time PCR System para experimentos de genotipado.

Flujo de trabajo Si va a disear un experimento de genotipado utilizando ensayos personalizados de
Applied Biosystems, Applied Biosystems recomienda seguir el flujo de trabajo que
se indica a continuacin:
1. Solicite el ensayo: Custom TaqMan SNP Genotyping Assays (ms abajo).
Custom TaqMan SNP Genotyping Assays
Descripcin del Custom TaqMan SNP Genotyping Assays son conjuntos de sondas y cebadores
Genomic Assays en funcin de la informacin de secuencia remitida. Los Custom
TaqMan SNP Genotyping Assays le permiten:
Accin Ejemplo
Realizar estudios de genotipado con AGTTCATCCATGGTCA -->

cualquier polimorfismo de un solo AGTTCATACATGGTCA
nucletido (SNP) posible en cualquier
Anotado como: AGTTCAT[C/A]CATGGTCA
organismo
Detectar inserciones/eliminaciones (in/dels) AGTTCATCCATGGTCA -->

de hasta seis bases para los estudios de AGTTCATGGTCA
genotipado.
Anotado como: AGTTCAT[CCAT/*]GGTCA
Detectar polimorfismos de varios AGTTCATCCGGTCA -->

nucletidos (MNP) de hasta seis bases AGTTCATATGGTCA
para los estudios de genotipado.
Anotado como: AGTTCAT[CC/AT]GGTCA
Los ensayos emplean reactivos TaqMan para amplificar y detectar polimorfismos

especficos en muestras de DNA genmico purificado (gDNA). Todos los ensayos se
han desarrollado utilizando software de diseo de ensayos propio.
Propiedades del Todos los Custom TaqMan SNP Genotyping Assays:

Builder) con la secuencia de SNP de diana y que dicho archivo se enve al
servicio Custom TaqMan Genomic Assays.
1 a 20 ng de muestra de gDNA purificado por pocillo.
Nota: Puede utilizar muestras de cDNA, sin embargo, actualmente Applied
Biosystems no ofrece recomendaciones para utilizar cDNA con Custom
TaqMan SNP Genotyping Assays.

40 de SNP Genotyping Assay o 80 de SNP Genotyping Assay

(especficos para cada polimorfismo). Cada ensayo consta de cebadores
reversos o directos especficos de la secuencia para amplificar el SNP de
inters y dos sondas TaqMan MGB: Una sonda marcada con fluorocromo
VIC detecta la secuencia del alelo 1 y una sonda marcada con el fluorocromo
FAM detecta la secuencia del alelo 2.
TaqMan Universal PCR Master Mix (con o sin AmpErase UNG).
Estn diseadas y optimizadas para funcionar con TaqMan Universal PCR
de punto final.
Custom Assays (Ensayos personalizados), seleccione TaqMan SNP
Genotyping Assays.
Para obtener informacin acerca de cmo pedir Custom TaqMan SNP
Genotyping Assays, consulte Custom TaqMan Genomic Assays Protocol:
Custom TaqMan SNP Genotyping Assays, consulte Custom TaqMan SNP
Genotyping Assays Protocol.

Mezclas de Los ensayos fabricados bajo pedido de Applied Biosystems para experimentos de
reaccin genotipado estn diseados para las siguientes mezclas de reaccin TaqMan:
disponibles
Nmero de
Mezcla de reaccin
referencia

reacciones

reacciones

UNG
Nota: No se pueden realizar experimentos de genotipado con TaqMan Fast

Para obtener ms Para obtener informacin acerca del uso de mezclas de reaccin TaqMan, consulte
informacin TaqMan Universal PCR Master Mix Protocol.
Uso del software Para los ensayos personalizados de Applied Biosystems, utilice el software StepOne
StepOne para disear los experimentos de genotipado. El software StepOne calcula
automticamente volmenes para:
o crear uno nuevo.
informacin genotipado en el sistema StepOne, consulte la Gua de introduccin de Applied
Biosystems StepOne Real-Time PCR System para experimentos de genotipado.


Experimentos de presencia/ausencia5 5
Seccin 5.1 Acerca de los experimentos de presencia/ausencia . . . . . . . . . . . . . . . 5-3
Seccin 5.2 Directrices de diseo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-9



presencia/ausencia

Introduccin. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-4

Introduccin
Qu es Un experimento de presencia/ausencia es un experimento de punto final que indica la
un experimento presencia o la ausencia de una secuencia de cido nuclico especfica (diana) en una
de presencia/ muestra. No se determina la cantidad real de diana.
ausencia?
Los experimentos de presencia/ausencia se suelen utilizar para detectar la presencia o
la ausencia de un patgeno (por ejemplo, un patgeno vrico o bacteriano). Por
ejemplo, un experimento de presencia/ausencia puede servir para determinar si la
bacteria Salmonella est presente en la carne de una hamburguesa. Los resultados
muestran si la bacteria Salmonella est presente o no; no se determina la cantidad de
bacterias.
Componentes
Las reacciones de PCR de los experimentos de presencia/ausencia incluyen los
Muestra: la muestra en la que la presencia de una diana es desconocida.
idnticos.
Control positivo interno (IPC): molde de DNA sinttico corto que se aade a
las reacciones de PCR. Se puede utilizar el IPC para distinguir los resultados
falsos negativos en las reacciones afectadas por los apantalladores de PCR, una
configuracin incorrecta del ensayo o un fallo del reactivo o del instrumento.
Pocillos de control negativo-IPC bloqueado: pocillos que contienen un
inhibidor de IPC en lugar de muestra en la reaccin de PCR. No se debera
producir ninguna amplificacin en los pocillos de control negativo-IPC
bloqueado, porque la reaccin no contiene ninguna muestra y la amplificacin
del IPC est bloqueada.
Pocillos de control negativo-IPC: pocillos que contienen un molde de IPC y
tampn o agua en lugar de muestra en la reaccin de PCR. El molde de IPC es
lo nico que se debera amplificar en los pocillos de control negativo- IPC,
porque la reaccin no contiene ninguna muestra.
Nota: Los experimentos de presencia/ausencia se pueden realizar sin IPC; sin
embargo, el IPC garantiza que una PCR fallida no se tome por error por un resultado
negativo en la prueba.
Deteccin del Los experimentos de presencia/ausencia son experimentos de punto final, en los que
punto final y se recogen datos de fluorescencia despus de completarse la PCR.
lectura de placas
Para ayudar a solucionar los problemas de los experimentos de presencia/ausencia,
posterior a la
puede utilizar Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System para realizar
PCR
una PCR en tiempo real. Si utiliza el sistema StepOne para la reaccin de
amplificacin, realice los procesos de lectura previa y posterior a la PCR por
separado.

Funcionamiento Durante la PCR, las sondas fluorognicas se hibridan de manera especfica con la
de los diana complementaria entre los emplazamientos de ambos iniciadores en el DNA
experimentos de molde. Luego, durante la extensin, AmpliTaq Gold DNA Polymerase separa las
presencia/ sondas hibridadas de cada muestra que contiene la diana. La ruptura de cada sonda
ausencia complementaria separa el fluorocromo notificador del fluorocromo del apantallador,
lo que aumenta la fluorescencia del notificador.
Despus la reaccin de termociclado, el instrumento StepOne lee la fluorescencia
generada durante la reaccin de amplificacin. Las seales fluorescentes se utilizan
para determinar la presencia o la ausencia de la diana en cada muestra. Las seales
del notificador se normalizan con respecto a la emisin de una referencia pasiva, de
la siguiente manera:
Rn (TT) = Intensidad de emisin de secuencia de molde diana
Intensidad de emisin de referencia pasiva
Rn (IPC) = Intensidad de emisin de control positivo interno

Intensidad de emisin de referencia pasiva
Incorporacin de un IPC
Un IPC es un segundo conjunto de sondas y cebadores TaqMan que se aade a la
placa de reaccin para detectar un cido nuclico presente constitutivamente con
bajo nmero de copias. El IPC y la diana se amplifican simultneamente en el mismo
pocillo de reaccin. Si un pocillo no tiene amplificacin, el software StepOne
utiliza la seal positiva del IPC para confirmar que el pocillo no se ha amplificado
por falta de un molde diana, y no por un error de pipeteo o inhibicin.
embargo, el IPC garantiza que una PCR fallida no se tome por error por un resultado
negativo en la prueba.
Flujo de trabajo Antes de realizar experimentos de presencia/ausencia en el sistema StepOne, prepare

el experimento de la siguiente forma:
1. Seleccione el tipo de ensayo (ms abajo).


tipos de ensayos para los experimentos de presencia/ausencia:
En inventario/fabricados bajo pedido (pgina 5-6)
Nota: Los reactivos rpidos TaqMan y los reactivos SYBR Green no se admiten
en los experimentos de presencia/ausencia.
Ensayos en
Producto Atributos
inventario/fabrica
dos bajo pedido TaqMan Gene Conjuntos de sondas y cebadores prediseados y
Expression Assays especficos de un gen para genes humanos, de ratones,
ratas, Arabidopsis, Drosophila, C. elegans, C. familiares
(perro) y Rhesus.
Cmodo formato de un solo tubo disponible en ensayos
en inventario o fabricados bajo pedido.
TaqMan Endogenous Ensayos de control endgeno optimizados, preformulados

Control Assays y listos para ser usados.
Nota: Los TaqMan Cuantificacin de expresin de genes econmica para
Endogenous Control humanos, ratones, ratas, Arabidopsis, Drosophila y
Assays estn incluidos en cualquier especie eurocariota.
los TaqMan Gene Posibilidad de eleccin de marcaje con fluorocromo FAM
Expression Assays en o VIC (con cebador limitante).
inventario.
Custom TaqMan Gene Cualquier especie u organismo.

Expression Assays Eleccin de la diana.


Para conocer las directrices de diseo de experimentos con ensayos en inventario o
fabricados bajo pedido, consulte la pgina 5-10.

Ensayos
Producto Atributos
personalizados
Sondas y cebadores Cualquier especie u organismo.
TaqMan personalizados Posibilidad de eleccin de marcajes de fluorocromos,
apantalladores y escalas de sntesis.
Software Primer Software que disea cebadores y sondas para PCR en

Express tiempo real.





Ensayos en inventario/fabricados bajo pedido. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-10
TaqMan Gene Expression Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-10
Custom TaqMan Gene Expression Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-12
TaqMan Exogenous Internal Positive Control Reagents . . . . . . . . . . . . . . 5-13

Ensayos en inventario/fabricados bajo pedido

Flujo de trabajo Si se selecciona el tipo de ensayo Inventoried/Made to Order (En
inventario/fabricado bajo pedido) en el software StepOne, Applied Biosystems
recomienda seguir el flujo de trabajo que se indica a continuacin:
TaqMan Gene Expression Assays (ms abajo).
Custom TaqMan Gene Expression Assays (pgina 5-12).
2. Utilice TaqMan Exogenous Internal Positive Control Reagents (pgina 5-13).
embargo, el IPC garantiza que una PCR fallida no se tome por error por un
resultado negativo en la prueba.
TaqMan Gene Expression Assays
Descripcin del TaqMan Gene Expression Assays son una coleccin completa de conjuntos de
producto sondas y cebadores en inventario y fabricados bajo pedido que sirven para realizar
experimentos de presencia/ausencia en genes humanos, de ratn, rata, Arabidopsis,
Drosophila, C. elegans, C. familiares (perro) y Rhesus.
Cada ensayo est diseado con un procedimiento de diseo automatizado en el que
se ha controlado la calidad. Los ensayos en inventario ya estn fabricados y en
inventario, mientras que los ensayos fabricados bajo pedido estn prediseados y se
fabrican cuando se realiza el pedido.
Propiedades del Todos los TaqMan Gene Expression Assays:

20 de Gene Expression Assay Mix (especfica para cada diana). Cada
mezcla de ensayo consta de dos cebadores de PCR no marcados y una sonda
MGB (ligando de unin al surco menor) TaqMan marcada con fluorocromo
FAM en una mezcla preformulada de 20. Las concentraciones finales de
1 son de 250 nM para la sonda y de 900 nM para cada cebador.
Cuando sea posible, amplifique el cDNA diana sin amplificar el DNA
genmico (sufijo m en el identificador de ensayo) diseando sondas diseadas
sobre la unin exn-exn.

Ensayos Los TaqMan Gene Expression Assays estn disponibles para los genes humanos, de
disponibles ratones, ratas, Arabidopsis, Drosophila, C. elegans, C. familiares (perros) y Rhesus.
Los nmeros de referencia son:
PN 4331182 para los ensayos en inventario
PN 4351372 para los ensayos fabricados bajo pedido
El prefijo del nombre del ensayo indica la especie para la que se ha diseado el
ensayo: Hs para Homo sapiens (humano), Mm para Mus musculus (ratn), Rn para
Rattus norvegicus (rata), At para Arabidopsis thaliana, Dm para Drosophila
melanogaster, Ce para C. elegans, Cf para C. familiares (perro) y Rh para Rhesus.
El sufijo del nombre del ensayo indica la colocacin del ensayo, tal y como se
describe en la siguiente tabla.
Sufijo Descripcin
_m La sonda del ensayo est diseada sobre la unin de dos exones; el ensayo
no detecta DNA genmico.
_s Los cebadores y las sondas del ensayo estn diseados en un solo exn; el
ensayo detecta DNA genmico.
_g Los cebadores y las sondas del ensayo pueden estar en un solo exn; el
ensayo puede detectar DNA genmico.
_mH El ensayo se ha diseado para una transcripcin que pertenece a una familia
de genes con una homologa de secuencias alta. El ensayo ofrece una
_sH diferencia de entre 10 CT y 15 CT entre el gen diana y el gen con la homologa
de secuencias ms prxima. Por lo tanto, el ensayo detecta la transcripcin
_gH de la diana con una discriminacin (sensibilidad) entre 1000 y 3000 veces
mayor que la transcripcin homloga ms prxima, si est presente en el
mismo nmero de copias de una muestra.
_u El amplicn del ensayo est diseada sobre la unin de dos exones y la

sonda se asienta por completo en uno de los exones expandidos.
TaqMan Endogenous Control Assays

Los TaqMan Endogenous Control Assays estn incluidos en los TaqMan Gene
Expression Assays (PN 4331182) en inventario. Los TaqMan Endogenous Control
Assays:
Estn disponibles como un TaqMan Gene Expression Assay con una sonda
TaqMan MGB con marcaje con fluorocromo FAM en un solo tubo
preformulado de 20.
Estn disponibles para todas las especies de humano, ratn, y rata, con sondas
TaqMan MGB con marcaje con fluorocromo VIC o FAM. Los controles
endgenos TaqMan con marcajes de fluorocromo VIC tienen los cebadores
limitantes.

Para obtener informacin acerca de Custom TaqMan Endogenous Control
Assays, consulte Using TaqMan Endogenous Control Assays to Select an
Endogenous Control for Experimental Studies Application Note.
TaqMan Gene Expression Assays, consulte TaqMan Gene Expression Assays
Protocol.
Custom TaqMan Gene Expression Assays
Descripcin del Custom TaqMan Gene Expression Assays son conjuntos de sondas y cebadores de
Genomic Assays de acuerdo con la informacin de secuencia remitida. Los Custom
TaqMan Gene Expression Assays le permiten realizar experimentos de
presencia/ausencia en cualquier gen o variante de splicing de cualquier organismo.
Los ensayos emplean reactivos TaqMan para amplificar y detectar la diana en
muestras de cDNA. Todos los ensayos se han desarrollado utilizando software de
diseo de ensayos propio.
Propiedades del Todos los Custom TaqMan Gene Expression Assays:

Builder) con la secuencia de diana y que dicho archivo se enve al servicio
Custom TaqMan Genomic Assays.
20 de Gene Expression Assay o 60 de Gene Expression Assay (especfico
para cada diana). Cada ensayo consta de dos cebadores especficos de la
diana y una sonda TaqMan MGB con marcaje del fluorocromo FAM en una
mezcla preformulada de 20 o 60. Las concentraciones finales de 1 son
de 250 nM para la sonda y de 900 nM para cada cebador.

seleccione Custom TaqMan Gene Expression Assays.
Para obtener informacin acerca de cmo pedir Custom TaqMan Gene
Expression Assays, consulte Custom TaqMan Genomic Assays Protocol:
Custom TaqMan Gene Expression Assays, consulte Custom TaqMan Gene
Expression Assays Protocol.
TaqMan Exogenous Internal Positive Control Reagents
Descripcin del Los Applied Biosystems TaqMan Exogenous Internal Positive Control Reagents
producto contienen:
Un control positivo interno (IPC) con cebadores y sonda prediseados
Molde de DNA de IPC
Control de bloqueo del IPC
Los reactivos estn diseados para:
Distinguir tipos de resultados negativos:
Una llamada negativa para la diana y una positiva para el IPC indica que no
hay ninguna diana.
Una llamada negativa para la diana y una llamada negativa para el IPC
sugieren una inhibicin de la PCR.
Evitar la amplificacin de los controles endgenos.
Permitir la coamplificacin del IPC y la diana sin comprometer la amplificacin
de la diana.
Detectar el IPC con una sonda marcada con fluorocromo VIC.
Detectar la diana con una sonda marcada con fluorocromo FAM.
Propiedades del Los kits TaqMan Exogenous Internal Positive Control Reagents:
producto Requieren los siguientes componentes:
Muestra de DNA
Ensayo TaqMan para la diana de inters
TaqMan 2 Universal PCR Master Mix
Master Mix utilizando condiciones de termociclado universales.

Kits disponibles Applied Biosystems dispone de los siguientes kits de TaqMan Exogenous Internal
Positive Control Reagents:
Nmero de
Kits
referencia
TaqMan Exogenous Internal Positive Control Reagents con 4308320

TaqMan 2 Universal PCR Master Mix (con fluorocromo VIC)
TaqMan Exogenous Internal Positive Control Reagents 4308323

Nota: Si utiliza este kit, deber adquirir uno de los siguientes reactivos
TaqMan por separado:
TaqMan 2 Universal PCR Master Mix (PN 4304437)
TaqMan PCR Core Reagents Kit (PN N808-0228)
Para obtener ms Para obtener informacin acerca de la preparacin de reacciones de PCR con
informacin TaqMan Exogenous Internal Positive Control Reagents, consulte TaqMan
Exogenous Internal Positive Control Reagents Protocol.
Mezclas de Los ensayos en inventario/fabricados bajo pedido de Applied Biosystems para

reaccin experimentos de presencia/ausencia estn diseados para las siguientes mezclas de
disponibles reaccin TaqMan:
Nmero de
Mezcla de reaccin
referencia

reacciones

reacciones

UNG
TaqMan PCR Core Reagents Kit N808-0228
Nota: Si adquiere TaqMan Exogenous Internal Positive Control Reagents con el kit
TaqMan 2 Universal PCR Master Mix (PN 4308320), no es necesario que
adquiera la mezcla de reaccin por separado.
Nota: No se pueden realizar experimentos de presencia/ausencia con TaqMan Fast

Para obtener ms Para obtener informacin acerca del uso de reactivos TaqMan, consulte TaqMan
informacin Universal PCR Master Mix Protocol.
Uso del software Para los ensayos en inventario/fabricados bajo pedido de Applied Biosystems, utilice
StepOne el software StepOne para disear sus experimentos de presencia/ausencia. El
software StepOne calcula automticamente volmenes para:
Controles y muestras
Nota: Cuando seleccione el tipo de ensayo Inventoried/Made to Order (En
inventario/fabricado bajo pedido) en el software StepOne, vaya a la pantalla Reaction
Setup (Configuracin de reaccin) en el flujo de trabajo del asistente de diseo o
Advanced Setup (Configuracin avanzada) y, a continuacin, seleccione
informacin presencia/ausencia en el sistema StepOne, consulte Applied Biosystems StepOne
Real-Time PCR System Getting Started Guide for Presence/Absence Experiments.
Flujo de trabajo Si selecciona el tipo de ensayo Custom (Personalizado) en el software StepOne
para realizar un experimento de presencia/ausencia (es decir, si va disear sus
propios cebadores y sondas), Applied Biosystems recomienda seguir el flujo de
trabajo de las directrices de diseo de ensayos de Applied Biosystems:
1. Disee los cebadores y las sondas con el software Primer Express
(pgina 3-23).
2. Seleccione los reactivos adecuados (pgina 3-26).
Nota: Los reactivos rpidos TaqMan y los reactivos SYBR Green no se
admiten en los experimentos de presencia/ausencia.
3. Utilice las condiciones de ciclos trmicos recomendadas (pgina 3-28).

4. Comience con las concentraciones de cebadores y sondas predeterminadas. Si

es preciso, optimice las concentraciones de cebador (pgina 3-31) y las
concentraciones de sonda (pgina 3-35).
totalidad para lograr los mejores resultados. Para leer una descripcin ms detallada
de las directrices de diseo de ensayos de Applied Biosystems, consulte el
Apndice C.
Nota: Cuando seleccione el tipo de ensayo Custom (Personalizado) en el software
StepOne, vaya a la pantalla Reaction Setup (Configuracin de reaccin) en el flujo
de trabajo del asistente de diseo o Advanced Setup (Configuracin avanzada) y, a
continuacin, seleccione Custom (Personalizado) en el men desplegable Assay
Type (Tipo de ensayo).

Frmula A A
Frmula para experimentos de CT comparativos (CT)
Frmula La cantidad de diana, normalizada para un control endgeno y relativa a una muestra
de referencia, se calcula mediante:
2CT
Derivacin de la La ecuacin que describe la amplificacin exponencial de la PCR es:

frmula
Xn = Xo ( 1 + EX )n
donde:
xn = nmero de molculas de diana en el ciclo n
xo = nmero inicial de molculas de diana
Ex = eficiencia de la amplificacin de la diana
n = nmero de ciclos
Xo =nmero inicial de molculas de diana
El ciclo umbral (CT) indica el nmero de ciclo fraccional en el cual la cantidad de
diana amplificada alcanza un umbral especfico. De esta forma,
X T = X o ( 1 + E X ) C T, X = K X
donde:
xT = nmero umbral de molculas de diana
CT, X = ciclo umbral para la amplificacin de diana
KX = constante
Una ecuacin similar para la reaccin del control endgeno es:
R T = R o ( 1 + E R ) CT, R = K R
donde:
RT = nmero umbral de molculas de referencia
Ro = nmero inicial de molculas de referencia
ER = eficiencia de la amplificacin de la referencia
CT, R = ciclo umbral para la amplificacin de la referencia
KR = constante
Gua de reactivos de Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System A-1

Apndice A Frmula
Si se divide XT entre RT, se obtiene la siguiente expresin:
C
XT X o ( 1 + E X ) T, X K X
------ = ---------------------------------------- = ------ = K
R o ( 1 + E R ) T, R K R
C
RT
Los valores exactos de XT y RT dependen de una serie de factores, incluidos:

Fluorocromo notificador utilizado en la sonda
Efectos del contexto de la secuencia en las propiedades de fluorescencia de la
sonda
Eficiencia de la ruptura de la sonda
Pureza de la sonda
Ajuste del umbral de fluorescencia
Por lo tanto, la constante K no tiene que ser igual a 1.
Suponiendo que las eficiencias de la diana y la referencia sean las mismas:
E X = ER = E
X C C
-----o ( 1 + E ) T, X T, R= K
Ro
C T
XN ( 1 + E ) =K
donde:
XN = XO/RO, la cantidad normalizada de diana
CT = CT, X CT, R, la diferencia en ciclos umbral de la diana y la referencia
Al reorganizar, se obtiene la siguiente expresin:
C T
XN = K ( 1 + E )
El ltimo paso es dividir XN de cualquier muestra (q) por XN de la muestra de

referencia (cb):
X N, q C
K ( 1 + E ) T, q C T
------------ = ------------------------------------------ == ( 1 + E )
X N, cb K (1 + E )
C T , cb
A-2 Gua de reactivos de Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System

Apndice A Frmula
donde:
CT = CT, q CT, cb
Para los amplicones diseados y optimizados de acuerdo con las directrices de diseo
de ensayos de Applied Biosystems (tamao de amplicn <150 bp), la eficiencia se
aproxima a 1. Por lo tanto, la cantidad de diana, normalizada para un control
endgeno y relativa a una muestra de referencia, se obtiene mediante:
2CT
Gua de reactivos de Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System A-3

Apndice A Frmula
A-4 Gua de reactivos de Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System

Limitacin del cebador en la PCR en multiplex B
B
Para generar un ensayo en multiplex preciso, es importante que la amplificacin de
una especie no domine a la otra. De lo contrario, la amplificacin de una especie
muy abundante puede impedir que la especie menos abundante se amplifique
eficientemente. Si la especie menos abundante no se amplifica eficientemente, el
experimento puede dar lugar a resultados imprecisos. O, en los casos ms graves, se
puede inhibir por completo la deteccin de la especie menos abundante. Para evitar
este problema, limite las concentraciones de los cebadores que se utilizan para
amplificar la especie ms abundante, de manera que la amplificacin se desactive
poco despus de establecer el CT.
La limitacin del cebador hace que los componentes de la reaccin comunes a ambos
ensayos no se agoten, lo que permite que la amplificacin de la especie menos
abundante se realice con una gran eficiencia. Si no se conoce cul es la especie ms
abundante, debera determinarla antes de realizar la PCR en multiplex procesando
ambas dianas en tubos separados. Las dos amplificaciones deberan tener el cebador
limitante si ninguna de las especies abunda ms que la otra.
Consideracin de Hay que tener en cuenta la abundancia relativa del gen diana y del control endgeno
la abundancia al limitar la cantidad de cebadores de estas dos especies a amplificar, hay que tener
relativa de la en cuenta la abundancia relativa de las dos especies. Para los experimentos de
diana y la cuantificacin, es posible utilizar rRNA como control endgeno. La concentracin
referencia de rRNA en el RNA total siempre es mayor que la concentracin de cualquier mRNA
de diana. Por lo tanto, en las reacciones en multiplex en las que se amplifica la diana
y el rRNA, slo hay que limitar las concentraciones de los cebadores del rRNA.
Gua de reactivos de Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System B-1

Limitacin de la Para definir concentraciones de cebador limitante, procese una matriz de

matriz de los concentraciones de cebador reverso y directo utilizando el valor de molde mnimo. El
cebadores objetivo es identificar las concentraciones de cebador que reducen el valor Rn del
ensayo sin afectar al valor CT. La siguiente tabla ilustra una matriz recomendada de
cebadores directos y reversos cuya concentracin vara entre 20 y 100 nM.
Nota: Aunque si se siguen todos los criterios de diseo, es ms fcil identificar
concentraciones de cebador limitante, puede que no sea posible para todos los
ensayos. Si un experimento de matriz de cebador limitante no permite identificar las
concentraciones de cebador limitante, ser necesario volver a disear al menos un
cebador o procesar las reacciones en tubos diferentes.
Directo: 100 nM 100 nM 100 nM 100 nM 100 nM

Reverso: 100 nM 80 nM 60 nM 40 nM 20 nM
Ejemplo Los resultados de un experimento de matriz de cebador limitante se muestran en la

Figura B-1 en la pgina B-3:
La Figura B-1a muestra que slo cuando las concentraciones de cebador se
reducen por debajo de aproximadamente 50 nM, el valor CT sufre efectos
importantes. El rea llana muestra la regin en la que se encuentran las
concentraciones de cebador limitante adecuadas. En esta rea, el CT (y, por lo
tanto, el valor de cuantificacin correspondiente) no cambia, mientras que el
valor Rn y el producto resultante correspondiente se reducen
significativamente.
La Figura B-1b muestra la relacin correspondiente entre las concentraciones de
cebador y Rn. La figura demuestra que se puede lograr menos producto
disminuyendo las concentraciones de cebador directo y reverso.
En este ejemplo, la seleccin apropiada de concentraciones de cebador limitante
seran al menos de 50 nM de cebador directo y reverso. La concentracin de sonda se
debera mantener a un nivel ptimo cuando el cebador est en cantidades limitantes
para garantizar que la seal producida sea lo suficientemente grande para que el
software realice un anlisis preciso de multicomponente.
B-2 Gua de reactivos de Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System

Figura B-1 Resultados del experimento de la matriz de cebador limitante

(a) Muestra cmo al valor CT le afecta la variacin de concentraciones de
cebador directo y reverso. La regin llana indicada muestra el rea en la que el
valor CT permanece constante.
(b) Muestra una reduccin de los Rn valores a medida que la concentracin de
cebador disminuye.
Gua de reactivos de Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System B-3

B-4 Gua de reactivos de Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System

Directrices de diseo de ensayos C C
Acerca de las Si va disear sus propios ensayos (cebadores y sondas), Applied Biosystems
directrices de recomienda seguir las directrices de diseo de ensayos de Applied Biosystems. Las
diseo de directrices de diseo de ensayos especifican que:
ensayos
1. Los cebadores y las sondas se deben disear con el software Primer
Express: el software Primer Express utiliza un conjunto de parmetros
predeterminados cuando seleccione automticamente conjuntos de cebadores y
sondas.
2. Se deben seleccionar los reactivos apropiados: hay disponibles muchos
reactivos TaqMan y SYBR Green. Los reactivos que se utilizan dependen del
tipo de ensayo.
3. Se deben utilizar las condiciones de termociclado recomendadas: utilice las
condiciones de termociclado recomendadas para la muestra (DNA/cDNA, RNA
para PCR de 1 paso y RNA para PCR de 2 pasos).
Nota: Las condiciones del termociclado de los reactivos rpidos son diferentes
a las condiciones del termociclado de los reactivos estndar.
4. Se deben utilizar las concentraciones de cebadores y sondas
predeterminadas u optimizar dichas concentraciones: si sigue las directrices
de diseo de ensayos de Applied Biosystems, puede utilizar las concentraciones
de cebadores y sondas predeterminadas para ensayos no en multiplex y
optimizados, o bien puede optimizar dichas concentraciones.
totalidad para lograr los mejores resultados.
Nota: Las directrices de diseo de ensayos de Applied Biosystems no garantizan el
mismo nivel de rendimiento y sensibilidad en todos los ensayos. Incluso los
parmetros de diseo ms escrupulosos son incapaces de tener en cuenta todas las
variaciones posibles entre dos sistemas de ensayo diferentes.
Conclusiones de En general, se pueden extraer las siguientes conclusiones a la hora de utilizar las
los experimentos directrices de diseo de ensayos para los experimentos de cuantificacin:
de cuantificacin Para la mayora de los ensayos TaqMan, una concentracin de cebadores de
900-nM y de sondas de 250-nM produce un ensayo altamente reproducible y
sensible si se utiliza DNA o cDNA como molde.
Dada la naturaleza no especfica de su deteccin, la optimizacin del cebador de
fluorocromo SYBR Green I slo se debera omitir con precaucin. Sin
embargo, si se siguen todas las directrices, las concentraciones de 50-nM de
cebadores directos y reversos suelen proporcionar una amplificacin robusta
con un buen nivel de especifidad cuando se utiliza DNA o cDNA como molde.
Para verificar esta afirmacin, compruebe si se forma un producto no especfico
con un anlisis de curva de disociacin o de gel.
Gua de reactivos de Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System C-1

Apndice C Directrices de diseo de ensayos
La mayora de los ensayos TaqMan deberan permitir detectar y cuantificar con

precisin hasta <50 copias de una diana, con la mayor sensibilidad posible.
Los ensayos SYBR Green son capaces de ofrecer un rendimiento similar; sin
embargo, la formacin de productos no especficos puede aumentar el lmite de
deteccin mnimo.
Conclusiones En general, se pueden extraer las siguientes conclusiones a la hora de utilizar las
de los directrices de diseo de ensayos para los experimentos de genotipado:
experimentos de
Se puede utilizar 900-nM de cebadores, una sonda de 200-nM y entre 1 y 20 ng de
genotipado
DNA genmico para lograr unos resultados reproducibles y sensibles en el ensayo.
C-2 Gua de reactivos de Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System

Bibliografa
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Physics (Leipzig) 2:5575.
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Kutyavin, I.V., Lukhtanov, E.A., Gamper, H.B., and Meyer, R.B. 1997.
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glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene
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Science 230:13501354.
Gua de reactivos de Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Bibliography-1

Bibliografa
Bibliography-2 Gua de reactivos de Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System

Glosario
AIF Abreviatura de archivo de informacin de ensayo (Assay Information File).
alelo Para una diana determinada, cualquiera de las variantes de secuencias que se
encuentran en la poblacin.
amplicn Segmento de DNA amplificado durante la PCR.
amplificacin Etapa del protocolo de termociclado, durante el cual se produce la generacin del
amplicn. En los experimentos de cuantificacin, los datos de fluorescencia recogidos
durante la amplificacin se muestran en una grfica de amplificacin y se utilizan
para calcular los resultados. Si la amplificacin est incluida en el proceso del
instrumento StepOne para experimentos de genotipado o presencia/ausencia, los
datos de fluorescencia recogidos durante la amplificacin se muestran en una grfica
de amplificacin y se pueden utilizar para solucionar problemas.
apantallador Molcula unida al extremo 3 de las sondas TaqMan que evita que el notificador
emita fluorescencia mientras la sonda est intacta. Con los reactivos TaqMan, se
puede utilizar un apantallador no fluorescente ligando de surco menor (NFQ-MGB)
como apantallador. Con reactivos SYBR Green, no se utiliza ningn apantallador.
apantallador no Molculas que estn unidas al extremo 3 de las sondas TaqMan. Si la sonda est
fluorescente- intacta, el apantallador no fluorescente (NFQ) evita que el fluorocromo notificador
ligando de unin al emita fluorescencia. Dado que el NFQ no emite ninguna fluorescencia, produce
surco menor (NFQ- seales de fondo ms bajas, lo que se deriva en una mayor precisin en la
MGB) cuantificacin. El ligando de unin al surco menor (MGB) aumenta la temperatura de
desnaturalizacin (Tm) sin aumentar la longitud de la sonda. Tambin permite el
diseo de sondas ms cortas.
archivo de Archivo de datos del CD que se incluye con cada pedido de ensayo. El nombre de
informacin de archivo incluye el nmero del cdigo de barras de la placa de reaccin. La
ensayo (AIF) informacin del AIF se incluye en un formato de texto delimitado por tabuladores.
asistente de diseo Funcin del software StepOne que le ayuda a configurar el experimento guindole
a travs de los procedimientos ptimos para comenzar el diseo del experimento.
Auto Opcin para aumentar o reducir la temperatura y/o el tiempo en los ciclos
subsiguientes de la reaccin de PCR. Cuando Auto est habilitado, las opciones se
indican por medio de un icono en el perfil trmico:
Auto activado:
Auto desactivado:
Gua de reactivos de Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Glosario-1

Glosario
biblioteca de Recogida de dianas en el software StepOne.

dianas
biblioteca de Recogida de ensayos SNP en el software StepOne.

ensayos SNP
biblioteca de Recogida de muestras en el software StepOne. La biblioteca de muestras contiene el

muestras nombre de la muestra y el color de la muestra.
calibracin Tipo de calibracin del sistema StepOne en el que el sistema asigna las posiciones
espacial de los pocillos en el bloque de muestras. Los datos de la calibracin espacial se
utilizan para que el software pueda asociar aumentos de la fluorescencia durante un
proceso con pocillos especficos de la placa de reaccin.
calibrador Vase muestra de referencia.
cantidad En los experimentos de cuantificacin, la cantidad de diana en las muestras. La

cantidad absoluta puede referirse al nmero de copias, la masa, la molaridad o la carga
viral. La cantidad relativa se refiere a la diferencia entre la cantidad de diana
normalizada en la muestra y la cantidad de diana normalizada en la muestra de
referencia.
cantidad estndar Cantidad conocida de la reaccin de PCR.

En los experimentos de curva estndar, la cantidad conocida de diana. Las
unidades de la cantidad estndar pueden ser la masa, el nmero de copias, la
carga viral u otras unidades para medir la cantidad de la diana.
En los experimentos de curvas estndar relativas, cantidad conocida en el
estndar. Por ejemplo, la cantidad estndar puede referirse a la cantidad de
cDNA o la cantidad mayor o menor de solucin de partida. Las unidades no son
relevantes en los experimentos de curvas estndar relativas, porque se
compensan en los clculos.
cantidad inicial Cuando se define una curva estndar o una dilucin seriada de estndar, se
corresponde con la cantidad mayor o menor.
cantidad Cantidad de diana dividida por la cantidad de control endgeno.

normalizada
cebador directo Oligonucletido que flanquea el extremo 5 de la diana. El cebador reverso y el

cebador directo se utilizan juntos en las reacciones de PCR para amplificar la diana.
cebador reverso Oligonucletido que flanquea el extremo 3 de la diana. El cebador reverso y el

cebador directo se utilizan juntos en las reacciones de PCR para amplificar la diana.
ciclo umbral (CT) Nmero del ciclo de la PCR en el que Rn corta el umbral en la grfica de
amplificacin.
Glosario-2 Gua de reactivos de Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System

Glosario
coeficientes de Valores calculados a partir de la lnea de regresin de las curvas estndar, incluido el
regresin valor R2, la pendiente y el punto de interseccin y. Los valores del coeficiente de
regresin se pueden utilizar para evaluar la calidad de los resultados a partir de los
estndares. Vase tambin curva estndar.
color de diana Color asignado a una diana para identificarla en la disposicin de la placa y las
grficas de anlisis.
Concentracin de Campo del software que aparece en la ficha Sample Dilution Calculations (Clculos
muestra diluida de dilucin de muestras) de la pantalla Reaction Setup (Configuracin de reaccin).
(10X para la mezcla En este campo, escriba la concentracin de la muestra que desea utilizar para aadirla
de reaccin) a la mezcla de reaccin de todas las muestras del experimento. "10for Reaction Mix"
(10X para la mezcla de reaccin) significa que el software asume que la muestra o el
componente estndar de la mezcla de reaccin tiene una concentracin del 10. Por
ejemplo, si la concentracin de las muestras diluidas es 50,0 ng/L (10), la
concentracin de la muestra final de la reaccin es 5 ng/L (1).
configuracin Funcin del software StepOne que permite configurar el experimento de acuerdo
avanzada con el diseo de dicho experimento.
control endgeno Diana que debera existir a niveles similares en todas las muestras que se estn
probando. Se utiliza en experimentos de cuantificacin relativa (CT) para
normalizar las seales de fluorescencia de la diana que se est cuantificando. Tambin
se conoce como gen de mantenimiento.
control interno En los experimentos de presencia/ausencia, un molde de DNA sinttico corto que se
positivo (IPC) aade a las reacciones de PCR. Se puede utilizar el IPC para distinguir los resultados
falsos negativos en las reacciones afectadas por los apantalladores de PCR, una
configuracin incorrecta del ensayo o un fallo del reactivo o el instrumento.
control negativo En los experimentos del sistema StepOne, tarea asignada a las dianas o los ensayos
(NC) de SNP en los pocillos que contienen agua o tampones en lugar de una muestra. En
los pocillos de control negativo, no se debera producir ninguna amplificacin de la
diana.
control positivo En los experimentos de genotipado, la tarea del ensayo de SNP en pocillos que
contienen una muestra con un genotipo conocido.
control sin Vase tambin pocillos de IPC de control negativo bloqueado.

amplificacin
(NAC)
CT Abreviatura de ciclo umbral (Threshold Cycle).
CT automtico Opcin de anlisis en la que el software calcula de manera automtica el umbral y la

lnea basal de la grfica de amplificacin. El software utiliza la lnea basal y el umbral
para calcular el ciclo umbral (CT).
CT manual Opcin de anlisis en la que se introduce el valor del umbral y se selecciona si se

desean utilizar clculos de lnea basal automticos o manuales. El software utiliza el
valor del umbral que se introduce y la lnea basal para calcular el ciclo umbral (CT).

Glosario
curva de Visualizacin de los datos recogidos durante la fase de la curva de disociacin. Los
disociacin picos de la curva de disociacin pueden indicar la temperatura de desnaturalizacin
(Tm) de la diana o pueden identificar la presencia de amplificaciones no especficas.
La curva de disociacin se puede ver como fluorescencia del notificador normalizado
(Rn) frente a la temperatura o como la derivada de la fluorescencia del notificador
normalizada (Rn) frente a la temperatura.
curva estndar En los experimentos de curva estndar y curva estndar relativa:

La lnea con un ajuste ptimo que resulta al representar los valores CT a partir
de las reacciones estndar frente a las cantidades conocidas del estndar. Vase
tambin lnea de regresin.
Conjunto de estndares que contiene una serie de cantidades conocidas. Los
datos de las reacciones de la curva estndar se utilizan para generar la curva
estndar. La curva estndar se define por el nmero de puntos de la serie, el
nmero de rplicas de estndar, la cantidad inicial y el factor de dilucin. Vase
tambin dilucin seriada de estndar.
delta Rn (Rn) Abreviatura de notificador normalizado con lnea basal corregida (baseline-corrected
normalized reporter).
desconocidos En los experimentos de cuantificacin, la tarea de la diana en pocillos que contienen

una muestra con cantidades de diana desconocidas.
En los experimentos de genotipado, la tarea del ensayo de SNP en pocillos que
contienen una muestra con un genotipo desconocido.
En los experimentos de presencia/ausencia, la tarea de la diana en pocillos que
contienen una muestra en la que no se conoce la presencia de la diana.
diana La secuencia de cido nucleico que se desea amplificar y detectar.
dilucin seriada de En los experimentos de curvas estndar y curvas estndar relativas, conjunto de
estndar normas que contienen una serie de cantidades conocidas. La dilucin seriada de
estndar se prepara por medio de estndares de dilucin de dilucin. Por ejemplo, la
solucin de partida de estndar se utiliza para preparar el primer punto de dilucin, el
primer punto de dilucin se utiliza para preparar el segundo punto de dilucin, etc. Los
volmenes necesarios para preparar una dilucin seriada de estndar se calculan
mediante el nmero de puntos de dilucin, el nmero de rplicas de estndar, la
cantidad inicial, el factor de dilucin y la concentracin estndar en la solucin de
partida. Vase tambin curva estndar.
diluyente Reactivo utilizado para diluir una muestra o estndar antes de aadirlo a la reaccin
de PCR. El diluyente puede ser agua o un tampn.
disposicin Disposicin del sistema en la que el instrumento StepOneno est conectado a un

autnoma ordenador por medio del cable amarillo del sistema StepOne . En su lugar, se utiliza
una unidad USB ( ) para transferir datos entre los componentes del sistema
StepOne. En esta disposicin, el instrumento StepOne se controla por medio de la
pantalla tctil del instrumento.

Glosario
disposicin Disposicin del sistema en la que el instrumento StepOne est conectado

conectada directamente a un ordenador conectado por medio del cable del sistema StepOne
amarillo. En esta disposicin, el instrumento StepOne est controlado por medio del
software StepOne del ordenador conectado.
disposicin de Ilustracin de la rejilla de 6 8 pocillos y contenido asignado a la placa de reaccin.

placa En el software, puede utilizar la disposicin de la placa como una herramienta de
seleccin para asignar el contenido de los pocillos, ver las asignaciones de los pocillos
y ver los resultados. La disposicin de la placa se muestra en las pantallas Design
Wizard (Asistente de diseo), Advanced Setup (Configuracin avanzada), de proceso
y de anlisis. La disposicin de la placa se puede imprimir, incluir en un informe,
exportar y guardar como una diapositiva para una presentacin.
DNA de la muestra Componente de reaccin que se muestra en la pantalla Reaction Setup (Configuracin
(10) de la reaccin). El software asume que el DNA de la muestra que se aade a la mezcla
de la reaccin est en una concentracin del 10. Por ejemplo, si el volumen de la
reaccin es de 20 L, el volumen calculado de la muestra de la reaccin 1 es 2 L.
EFF% Vase eficiencia de amplificacin (EFF%).
eficiencia de Clculo de la eficiencia de la amplificacin de la PCR. La eficiencia de la

amplificacin amplificacin se calcula utilizando la pendiente de la lnea de regresin en la curva
(EFF%) estndar. Una pendiente prxima a
3,3 indica una eficiencia de amplificacin de la PCR ptima del 100%. Factores que
afectan a la eficiencia de la amplificacin:
Rango de cantidades estndar: para obtener medidas de la eficiencia ms
exactas y precisas, utilice un amplio rango de cantidades estndar, de 5 a 6
registros (multiplicado por 105 a 106).
Nmero de rplicas de estndar: para obtener mediciones de la eficiencia ms
precisas, incluya rplicas para reducir los efectos de las imprecisiones del
pipeteo.
Apantalladores de la PCR: los apantalladores de la PCR en la reaccin pueden
reducir la eficiencia de la amplificacin.
ensayo En el sistema StepOne, reaccin de PCR que contiene cebadores para amplificar una
diana y una sonda para detectar la diana amplificada.
ensayo SNP Se utiliza en los experimentos de genotipado. Es una reaccin de PCR que contiene
cebadores para amplificar el SNP y dos sondas para detectar diferentes alelos.
ensayos bajo Los ensayos TaqMan que se fabrican cuando se solicitan. Slo se envan los ensayos
pedido que cumplen las especificaciones de control de calidad tras la fabricacin.
ensayos Ensayos TaqMan fabricados previamente, que cumplen las especificaciones de

inventoriados control de calidad y que se guardan en inventario.
estndar Muestra que contiene cantidades estndar conocidas. Las reacciones estndar se
utilizan en experimentos de cuantificacin para generar curvas estndar. Vase
tambin curva estndar y dilucin seriada de estndar.

Glosario
experimento Se refiere al proceso completo de realizacin de un proceso con el sistema StepOne,

incluida la configuracin, el proceso y el anlisis. Tipos de experimentos que se
pueden realizar con el sistema StepOne :
Cuantificacin : curva estndar
Cuantificacin : curva estndar relativa
Cuantificacin: CT comparativos (CT)
Curva de disociacin
Genotipado
Presencia/ausencia
experimento de Experimento en el que los datos de fluorescencia que se recogen en una lectura
punto final posterior a la PCR se utilizan para calcular resultados para experimentos de
genotipado o presencia/ausencia.
factor de dilucin Valor numrico que define la secuencia de cantidades en la curva estndar. El factor
de dilucin y la cantidad inicial sirven para calcular la cantidad estndar de cada punto
de la curva estndar. Por ejemplo, si la curva estndar se define con un factor de
dilucin de 1:10 o 10, la diferencia entre 2 puntos adyacentes cualquiera en la curva
se multiplica por 10.
fase Componente del perfil trmico. Una fase consta de uno o varios pasos.
fase cclica Fase del perfil trmico que se repite. Si la fase cclica se utiliza para realizar la PCR,
se denomina fase de amplificacin.
fase de curva de Fase del perfil trmico con un incremento de temperatura para generar una curva de
disociacin disociacin.
fase de espera Fase del perfil trmico que incluye uno o varios pasos. Por ejemplo, puede aadir una
fase de espera al perfil trmico para activar enzimas, para desactivar enzimas o para
incubar una reaccin.
fluorocromo del Fluorocromo fabricado por Applied Biosystems y precalibrado en el sistema

sistema StepOne. Fluorocromos del sistema:
Fluorocromo FAM
Fluorocromo JOE
Fluorocromo ROX
Fluorocromo SYBR Green
Fluorocromo VIC

Glosario
fluorocromo Fluorocromo que no fabrica Applied Biosystems. Puede utilizar fluorocromos

personalizado personalizados para realizar experimentos de PCR en tiempo real en el sistema
StepOne. Antes de utilizar fluorocromos personalizados, realice una calibracin
espectral de los mismos.
fluorocromo puro Reactivo que contiene el fluorocromo. Los fluorocromos puros se utilizan para
realizar una calibracin espectral en el sistema StepOne. Vase tambin
fluorocromo del sistema.
gen de Vase control endgeno.

mantenimiento
grfica de Visualizacin de los datos recogidos durante la fase cclica de la amplificacin de la

amplificacin PCR. Se puede ver como:
Notificador normalizado con lnea basal corregida (Rn) frente al ciclo
Notificador normalizado (Rn) frente al ciclo
Ciclo umbral (CT) frente al pocillo
grfica de datos Visualizacin del incremento de la fluorescencia de los pocillos seleccionados de

brutos todos los filtros. Muestra el incremento de la fluorescencia de todos los puntos de
recogida de datos del proceso.
grfica de Visualizacin de los datos recogidos durante la lectura posterior a la PCR. La grfica
discriminacin de discriminacin allica es una grfica de la fluorescencia normalizada del
allica notificador de la sonda del alelo 1 frente a la fluorescencia normalizada del
notificador de la sonda del alelo 2.
grfica de Visualizacin de temperaturas de la muestra, la cubierta del instrumento y el bloque

temperatura de instrumento durante el proceso del instrumento.
grfica Visualizacin de los datos recogidos durante la fase cclica de la PCR en tiempo real.
multicomponente La grfica multicomponente muestra la fluorescencia de todos los ciclos del proceso.
grupo de rplicas Conjunto de reacciones idnticas de un experimento.
identificador de Valor asignado por Applied Biosystems a los TaqMan Gene Expression Assays y los
ensayo TaqMan SNP Genotyping Assays.
identificador Nmero de identifiacin del SNP (refSNP). Lo genera dbSNP (Single Nucleotide
refSNP Polymorphism Database of Nucleotide Sequence Variation o Base de datos de
polimorfismos nucletidos nicos de variacin de secuencia nucletida). Se puede
utilizar para buscar en el almacn de Applied Biosystems un Applied Biosystems SNP
Genotyping Assay. Tambin se denomina nmero rs.
inhibidor del IPC Reactivo aadido a las reacciones de PCR para bloquear la amplificacin del control
positivo interno (IPC).

Glosario
interseccin y Coeficiente de regresin calculado a partir de la lnea de regresin en la curva

estndar. La interseccin y de esta lnea es el valor de y en el punto en el que la lnea
cruza el eje y.
IPC Abreviatura de control positivo interno (Internal Positive Control). Adems, en los
experimentos de presencia/ausencia, es la tarea de la diana de IPC en pocillos que
contienen el molde del IPC.
IPC bloqueado En los experimentos de presencia/ausencia, tarea asignada a la diana de IPC en los
pocillos que contienen un inhibidor de IPC en lugar de una muestra. Vase tambin
pocillos de IPC bloqueados por control negativo.
IPC+ Llamada de presencia/ausencia cuando el control interno positivo (IPC) es correcto.
lectura de punto Vase lectura posterior a la PCR.

final
lectura posterior a Se utiliza en los experimentos de genotipado y presencia/ausencia. Es la parte del

la PCR proceso del instrumento que se produce despus de la amplificacin. En los
experimentos de genotipado, los datos de fluorescencia que se recogen durante la
lectura posterior a la PCR se muestran en la grfica de discriminacin allica y se
utilizan para asignacin de alelos. En los experimentos de presencia/ausencia, los
datos de fluorescencia que se recogen durante la lectura posterior a la PCR se
muestran en la grfica de presencia/ausencia, y se utilizan para la deteccin. Tambin
se denomina lectura de punto final.
lectura previa a la Se utiliza en los experimentos de genotipado y presencia/ausencia. Es la parte del

PCR proceso del instrumento que se produce antes de la amplificacin. Los datos de
fluorescencia que se recogen durante la lectura previa a la PCR se utilizan para
normalizar los datos de fluorescencia posteriores a la lectura.
lnea basal En la grfica de amplificacin, lnea ajustada a los niveles de fluorescencia de un

rango de ciclos definido. Si se utiliza una opcin de anlisis de lnea basal manual,
Applied Biosystems recomienda seleccionar los primeros ciclos de la PCR para
determinar la lnea basal.
lnea basal Opcin de anlisis en la que el software calcula los valores de inicio y fin de la lnea
automtica basal para la grfica de amplificacin. El software utiliza la lnea basal y el umbral
para calcular el ciclo umbral (CT).
lnea basal manual Opcin de anlisis en la que se introducen los valores de inicio y fin de la lnea basal
para la grfica de amplificacin. El software utiliza la lnea basal y el umbral para
calcular valores CT.
lnea de regresin En los experimentos de curva estndar y curva estndar relativa, la lnea que mejor se
ajusta a partir de la curva estndar. Frmula de la lnea de regresin:
CT = m [registro (Cant)] + b
donde m es la pendiente, b es el punto de interseccin y, y Cant es la cantidad estndar.
Vase tambin coeficientes de regresin.

Glosario
mtodo CT Mtodo de cuantificacin para experimentos de cuantificacin. Con el mtodo CT

comparativos comparativos (CT), se utilizan los resultados de una muestra de referencia y un
(CT) control endgeno para determinar cantidades relativas de una diana en las muestras.
mtodo de En los experimentos de cuantificacin, el mtodo que se utiliza para determinar la

cuantificacin cantidad de diana en las muestras. En los experimentos de cuantificacin, hay tres
tipos de mtodos de cuantificacin disponibles: curva estndar, CT comparativos
(CT) y curva estndar relativa.
mtodo de curva Mtodo de cuantificacin para experimentos de cuantificacin. Con el mtodo de

estndar curva estndar, los resultados de los estndares se utilizan para determinar cantidades
absolutas de una diana en las muestras.
mtodo de la curva Mtodo de cuantificacin para experimentos de cuantificacin. Con el mtodo de la

estndar relativa curva estndar relativa, se utilizan los resultados de los estndares, una muestra de
referencia y un control endgeno para determinar las cantidades relativas de una diana
en las muestras.
mtodo de proceso Definicin del volumen de reaccin y el perfil trmico del proceso del instrumento.
mezcla de cebador Componente de reaccin de PCR que contiene el cebador directo y el cebador reverso
diseados para amplificar la diana.
mezcla de Componente de reaccin de PCR que consta de cebadores diseados para amplificar
cebador/sonda la diana y una sonda TaqMan diseada para detectar la amplificacin de la diana.
mezcla de ensayos Componente de reaccin de PCR de los Applied Biosystems TaqMan Gene
Expression Assays y los TaqMan SNP Genotyping Assays que consta de cebadores
diseados para amplificar una diana y una sonda TaqMan diseada para detectar la
amplificacin de la diana.
mezcla de la sonda Componente de reaccin de PCR que contiene una sonda TaqMan diseada para
detectar la amplificacin de la diana.
mezcla de reaccin Solucin que contiene todos los componentes necesarios para procesar la reaccin de
PCR, excepto el molde (de muestra, de estndar o de control).
molde Tipo de cido nucleico que se aade a la reaccin de PCR. El tipo de molde
recomendado vara en funcin del tipo de experimento.
monitorizacin Funcin del software que permite ver el estado de un instrumento en red, enviar
remota experimentos al instrumento y descargar experimentos de procesos en el ordenador.
muestra El molde a ensayar.
muestra de En experimentos de cuantificacin relativa (CT), la muestra que se utiliza como

referencia base de los resultados cuantitativos relativos. Tambin se denomina calibrador.

Glosario
Muestra o estndar Componente de reaccin que se muestra en la ficha Reaction Mix Calculations
(10) (Clculos de la muestra de reaccin) de la pantalla Reaction Setup (Configuracin de
la reaccin). El software asume que la muestra o el estndar que se aade a la mezcla
de la reaccin est en una concentracin del 10. Por ejemplo, si el volumen de la
reaccin es de 20 L, el volumen calculado de la muestra o estndar de la reaccin 1
es 2 L.
nombre de Introducido durante la configuracin del experimento, es el nombre que se utiliza para
experimento identificarlo. Los nombres de los experimentos no pueden superar los 100 caracteres
y no pueden incluir ninguno de los siguientes caracteres: barra inclinada hacia delante
(/), barra inclinada hacia atrs (\), signo mayor que (>), signo menor que (<), asterisco
(*), signo de interrogacin (?), comillas ("), lnea vertical (|), dos puntos (:) o punto y
coma (;).
notificador Fluorocromo que se utiliza para detectar la amplificacin. Si se utilizan reactivos

TaqMan, el notificador se une al extremo 5. Si se utilizan reactivos SYBR Green,
el notificador es SYBR Green.
notificador Se muestra en el eje y de la curva de disociacin. La seal del notificador derivado es

derivado (Rn) el opuesto de la primera derivada de la fluorescencia normalizada del notificador.
notificador Seal de fluorescencia que emite el notificador normalizado con la seal de

normalizado (Rn) fluorescencia de la referencia pasiva.
notificador La magnitud de la seal de fluorescencia normalizada que genera el notificador

normalizado con durante la amplificacin de la PCR.
lnea basal
Rn = Rn (punto final) Rn (lnea basal), donde Rn = notificador normalizado.
corregida (Rn)
nmero rs Vase identificador refSNP.
omitir pocillo Accin que se realiza despus del anlisis para omitir uno o varios pocillos de todos
los anlisis antes de volver a analizar los datos.
pantalla tctil Visor del instrumento que se toca para controlarlo.
paso Componente del perfil trmico. Los pasos se definen por la temperatura, el tiempo, la
rampa y el estado de recogida de datos. En las fases cclicas, los pasos tambin se
definen por medio del estado Auto.
PCR en tiempo real Proceso de recogida de datos de fluorescencia durante la amplificacin de la PCR. Los
datos de la PCR en tiempo real sirven para calcular los resultados de los experimentos
de cuantificacin o para solucionar los problemas de los resultados de los
experimentos de genotipado o presencia/ausencia.
pendiente Coeficiente de regresin calculado a partir de la lnea de regresin en la curva

estndar. La pendiente indica la eficiencia de la amplificacin de la PCR para el
ensayo. Una pendiente de 3,3 indica una eficiencia de amplificacin del 100%.
Vase tambin eficiencia de amplificacin (EFF%).

Glosario
perfil trmico Parte de un mtodo de proceso que especifica la temperatura, el tiempo, la rampa y
los puntos de recogida de datos de todos los pasos y fases del proceso del instrumento.
pocillos de IPC de En los experimentos de presencia/ausencia, pocillos que contienen un molde de IPC
control negativo y un tampn o agua en lugar de una muestra en la reaccin de PCR. El molde IPC es
lo nico que se debera amplificar en los pocillos de IPC de control negativo, porque
la reaccin no contiene ninguna muestra. Vase tambin IPC+.
pocillos de IPC de En los experimentos de presencia/ausencia, pocillos que contienen un inhibidor del
control negativo IPC en lugar de una muestra en la reaccin DE PCR. No se debera producir ninguna
bloqueado amplificacin en los pocillos de IPC de control negativo bloqueado, porque la
reaccin no contiene ninguna muestra y la amplificacin del IPC est bloqueada.
Tambin se denomina "control sin amplificacin (NAC).
punto Un estndar en una curva estndar. La cantidad estndar de cada punto de la curva
estndar se calcula en base a la cantidad inicial y el factor de dilucin.
QuickStart (Inicio Funcin del sistema StepOne que permite realizar el experimento sin introducir la
rpido) informacin de configuracin de la placa.
qumica Vase reactivos.
rampa La velocidad a la que cambia la temperatura durante el proceso del instrumento.

Excepto en el el caso de la curva de disociacin, la rampa se define como un
porcentaje. En el caso del paso de la curva de disociacin, la rampa se define como
un incremento de la temperatura. En el grfico del perfil trmico, la rampa se indica
por medio de una lnea diagonal.
reaccin de la Combinacin de la muestra y el ensayo diana en una reaccin de PCR. En el asistente

muestra/diana de diseo, cada reaccin de PCR slo puede contener una muestra y un ensayo diana.
reaccin del Combinacin de la muestra y el ensayo SNP en una reaccin de PCR. Cada reaccin
ensayo de PCR slo puede contener una muestra y un ensayo SNP.
SNP/muestra
reactivos Los componentes de la reaccin de PCR que se est utilizando para amplificar la diana
y detectar la amplificacin. Tipos de reactivos utilizados en el sistema StepOne:
Reactivos TaqMan
Otros reactivos
reactivos SYBR Componente de reaccin de PCR que consta de dos cebadores que estn diseados
Green para amplificar la diana y el SYBR Green para detectar DNA de doble cadena.
reactivos TaqMan Componentes de reaccin de PCR que constan de cebadores diseados para
amplificar la diana y una sonda TaqMan diseada para detectar la amplificacin de
la diana.
rechazar pocillo Accin que realiza el software durante el anlisis para quitar uno o varios pocillos de
un anlisis posterior si se aplica un aviso especfico al pocillo.

Glosario
recogida de datos Proceso durante la utilizacin del instrumento en el que un componente del
instrumento detecta datos de fluorescencia en cada pocillo de la placa de reaccin. El
instrumento transforma la seal en datos electrnicos y los datos se guardan en el
archivo del experimento. Los puntos de recogida de datos se indican por medio de un
icono en el perfil trmico:
Recogida de datos activada:
Recogida de datos desactivada:
referencia pasiva Fluorocromo que produce una seal de fluorescencia. Dado que la seal de referencia
pasiva debera ser uniforme en todos los posillos, se utiliza para normalizar la seal
del fluorocromo notificador para justificar las fluctuaciones de fluorescencia
causadas por diferencias menores entre pocillos en concentraciones o en volumen. La
normalizacin de la seal de referencia pasiva permite obtener datos de gran
precisin.
rplicas Nmero total de reacciones idnticas que contienen componentes idnticos y

volmenes idnticos.
Rn Abreviatura de notificador normalizado (Normalized Reporter).
serie Vase dilucin seriada de estndar.
sin cido nucleico Vase control negativo (NC).

molde (NTC)
SNP Abreviatura de polimorfismo nucletido nico (Single Nucleotide Polymorphism). El

SNP puede constar de una diferencia de una base o una indel (insercin/delecin).
tarea Tipo de reaccin realizada en el pocillo para la diana o el ensayo SNP. Tareas
disponibles en los experimentos del sistema StepOne:
Desconocida
Control negativo
Estndar (experimentos de curvas estndar y curvas estndar relativas)
Control positivo (experimentos de genotipado)
IPC (experimentos de presencia/ausencia)
IPC bloqueado (experimentos de presencia/ausencia)
temperatura de Punto en la curva de disociacin en el que se produce un pico en los niveles de

desnaturalizacin fluorescencia que sirve para indicar que el DNA de doble cadena amplificado se
(Tm) disocia en DNA de cadena sencilla.

Glosario
tipo de El tipo de experimento que se realiza con el sistema StepOne:

experimento
Curva estndar
Curva de disociacin (no disponible en el asistente de diseo)
Genotipado
Presencia/ausencia
El tipo de experimento que seleccione afecta a las pantallas de configuracin, proceso
y anlisis.
Tm Abreviatura de temperatura de desnaturalizacin (Tm o Melting Temperature).
transcriptasa Componente de reaccin de PCR que convierte el RNA en cDNA. La transcriptasa

reversa reversa se aade a la reaccin de PCR para realizar un RT-PCR de 1 paso.
umbral Nivel de fluorescencia por encima de la lnea basal y dentro de la regin de

crecimiento exponencial de la grfica de amplificacin. El umbral se puede
determinar automticamente (vase CT automtico) o se puede ajustar manualmente
(vase CT manual).
umbral del ciclo Vase ciclo umbral (CT).
valor atpico Para un conjunto de datos, un punto que es significativamente ms pequeo o grande
que los dems.
valor R2 Coeficiente de regresin calculado a partir de la lnea de regresin en la curva

estndar. El valor R2 indica la proximidad del ajuste entre la lnea de regresin de la
curva estndar y los datos de CT individuales de las reacciones estndar. El valor 1,00
indica un ajuste perfecto entre la lnea de regresin y los puntos de datos.
velocidad de la Velocidad a la que se produce la rampa de temperatura durante el proceso del

rampa instrumento. Las velocidades de rampa disponibles son rpida y estndar.

Glosario

ndice
A seleccionar reactivos 3-26

disear experimentos
amplicones, seleccionar pequeos 3-24
cuantificacin 3-22
arrastre, UNG para reducir al mnimo 2-7 genotipificacin 4-14, 4-17
presencia/ausencia 5-15
C
cebadores E
concentraciones predeterminadas 3-31 emplazamientos de amplicones
estructuras en horquilla 3-9 contenido de G/C 3-24
resumen de directrices de diseo 3-25 cribar 3-23
RT-PCR de 1 paso 3-9 entremo de 3 de cebadores 3-25
RT-PCR de 2 pasos 3-9 entremo de 5 de sondas 3-24
condiciones de ciclo trmico seleccin 3-23
cuantificacin de DNA/cDNA 3-29 temperatura de fusin 3-24
cuantificacin de RNA 3-29 estndares 3-5
RT-PCR de 1 pasos 3-29
RT-PCR de 2 pasos 3-30 estructuras en horquilla, y eleccin de cebador 3-9
experimentos de CT comparativo
consumibles, admitidos 1-3
acerca de 3-6
contaminacin de DNA, reduccin al mnimo 2-7 componentes 3-6
contenido de G/C, y emplazamientos de amplicones 3-24 Vase tambin experimentos de cuantificacin 3-6
control endgeno 3-6 experimentos de cuantificacin
controles negativos 3-5, 3-6, 4-4, 5-4 comparar 3-7
controles positivos 4-4 conclusiones para las directrices de diseo de
cuantificacin de DNA/cDNA, condiciones de ciclo ensayos C-1
trmico 3-29 CT comparativo 3-6
curva estndar 3-5
cuantificacin de RNA curva estndar relativa 3-5
condiciones de ciclo trmico 3-29, 3-30
directrices de diseo de ensayos para tipos de ensayos
RT-PCR de 1 paso 3-27 personalizados 3-22
RT-PCR de 2 pasos 3-27 disear 3-22
Custom TaqMan Gene Expression Assays 3-20, 5-12 explicados 3-4
Custom TaqMan SNP Genotyping Assays 4-15 PCR en tiempo real 3-4
reactivos SYBR Green 2-4, 3-33
D reactivos TaqMan 2-2
seleccionar mezcla maestra 3-21
dilucin seriada de estndar 3-5 seleccionar reactivos para tipo de ensayo
Directrices de diseo de ensayos personalizado 3-26
acerca de C-1 seleccionar tipo de reactivo 3-13
experimentos de cuantificacin C-1 seleccionar un mtodo de cuantificacin 3-5
experimentos de genotipificacin C-2 tipos de ensayos 3-13
experimentos de presencia/ausencia 5-15 experimentos de curva estndar
optimizar concentracin de sonda 3-35 acerca de 3-5
directrices de diseo de ensayos componentes 3-5
cebador y sonda 3-23, 3-25 Vase tambin experimentos de cuantificacin 3-5
condiciones de ciclo trmico 3-28 experimentos de curva estndar relativa
experimentos de cuantificacin 3-22 acerca de 3-5
optimizar concentraciones de cebador 3-31 componentes 3-5
Gua de reactivos de Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System ndice-1

ndice
Vase tambin experimentos de cuantificacin 3-5 muestra de referencia 3-5, 3-6

experimentos de genotipificacin MultiScribe reverse transcriptase, definicin 3-28
componentes 4-4
conclusiones para las directrices de diseo de
ensayos C-2
N
descritos 4-4 no coincidencia, en experimentos de genotipificacin 4-5
disear 4-14, 4-17
funcionamiento 4-4 O
instrumentos 4-4
no coincidencias 4-5 optimizacin 3-35
reactivos TaqMan 2-2 otros reactivos basados en fluorescencia 1-6
seleccionar mezcla maestra 4-13, 4-17
tipos de ensayos 4-6
P
experimentos de presencia/ausencia
componentes 5-4 PCR en tiempo real
definidos 5-4 experimentos de cuantificacin 3-4
Directrices de diseo de ensayos para tipos de ensayos proceso de deteccin de TaqMan 2-2
personalizados 5-15 PCR multiplexada
disear 5-15 cebadores de rRNA B-1
funcionamiento 5-5 comparacin con uniplexada 3-10
incorporar un IPC 5-5 descrita 3-10
reactivos TaqMan 2-2 limitacin de cebador 3-10
realizacin sin un IPC 5-4 PCR, prcticas generales 2-8
seleccionar mezcla maestra 5-14 pequeos amplicones, seleccionar 3-24
seleccionar reactivos para tipo de ensayo
producto no especfico, contaminacin con colorante
personalizado 3-26
SYBR Green 2-7
experimentos de punto final
genotipificacin 4-4 R
presencia/ausencia 5-4 reactivos
consideraciones 2-6
F otros basados en fluorescencia 1-6
reactivos SYBR Green 1-6
flujo de trabajo Advanced Setup (Configuracin reactivos TaqMan 1-6, 2-2
avanzada) 1-6, 1-7, 1-8 seleccionar 1-6, 2-5
flujo de trabajo del asistente de diseo 1-6, 1-7, 1-8 seleccionar para tipo de ensayo personalizado 3-26
reactivos SYBR Green
I consideraciones para seleccionar 2-6
desarrollo 2-4
IPC 5-4, 5-5 funcionamiento 2-5
optimizar experimentos de cuantificacin 3-33
L reactivos TaqMan
limitacin de cebador, ensayos multiplexados 3-10 consideraciones para seleccionar 2-6
desarrollo 2-2
funcionamiento 2-2
M tipos de experimentos 2-2
matriz de cebadores reactivos Universal Master Mix
cmo utilizar 3-31 ventaja de la polimerasa 3-28
definir lmites B-2 recopilacin de datos 1-2
ejemplo de limitador B-2 rplicas 3-5, 3-6, 4-4, 5-4
mezcla maestra RT-PCR
seleccionar para experimentos de cuantificacin 3-21 1 paso 3-8
seleccionar para experimentos de 2 pasos 3-8
genotipificacin 4-13, 4-17 comparacin de mtodos 3-7, 3-10
seleccionar para experimentos de
RT-PCR de 1 paso
presencia/ausencia 5-14
acerca de 3-8
muestra 3-5, 3-6, 4-4, 5-4 cebadores utilizados 3-9
ndice-2 Gua de reactivos de Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System

ndice
cuantificacin de RNA 3-27

RT-PCR de 2 pasos
acerca de 3-8
cebadores utilizados 3-9
cuantificacin de RNA 3-27
S
sistema StepOne
consumibles 1-3
recopilacin de datos 1-2
tipos de experimentos 1-5
tipos de reactivos 1-6
software Primer Express
amplicones pequeos 3-24
ensayos de SNP 1-9
experimentos de cuantificacin 3-22
experimentos de presencia/ausencia 5-15
sondas
optimizar concentracin de sonda 3-35
resumen de directrices de diseo 3-25
sondas MGB TaqMan disponibles 2-4
Sondas MGB TaqMan 2-3
T
TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assays 4-11
TaqMan Endogenous Control Assays 3-19
TaqMan Exogenous Internal Positive Control
Reagents 5-13
TaqMan Gene Expression Assays 3-18, 5-10
TaqMan PDARs for AD 4-12
TaqMan SNP Genotyping Assays 4-10
temperatura de fusin, y emplazamientos de
amplicones 3-24
tipo de ensayo en inventario 1-7
tipo de ensayo fabricado bajo pedido 1-7
tipo de ensayo personalizado 1-8, 1-9
tipo de ensayo prediseado/validado 1-8
tipos de ensayos
ensayos en inventario/fabricados bajo pedido 1-7
ensayos personalizados 1-8, 1-9
ensayos prediseados/validados 1-8
experimentos de genotipificacin 4-6
seleccionar 1-7
U
UNG, y reduccin al mnimo de arrastre 2-7
unin de colorante, mtodos de 2-4
Gua de reactivos de Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System ndice-3

ndice
ndice-4 Gua de reactivos de Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System

Worldwide Sales and Support
Applied Biosystems vast distribution and

service network, composed of highly trained
support and applications personnel,
reaches 150 countries on six continents.
For sales office locations and technical support,
please call our local office or refer to our
Web site at www.appliedbiosystems.com.
Applied Biosystems is committed to

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Headquarters
850 Lincoln Centre Drive
Foster City, CA 94404 USA
Phone: +1 650.638.5800
Toll Free (In North America): +1 800.345.5224
Fax: +1 650.638.5884
06/2010
www.appliedbiosystems.com Nmero de referencia 4377718 Rev. B

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Applied Biosystems StepOne

Real-Time PCR System

Nmero de referencia 4377718 Rev. B

Captulo 2 Introduccin a los reactivos

Captulo 3 Experimentos de cuantificacin

Seccin 3.2: Directrices de diseo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-17

Gua de reactivos de Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System iii

Captulo 4 Experimentos de genotipado

Seccin 4.2: Directrices de diseo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-9

Captulo 5 Experimentos de presencia/ausencia

Seccin 5.2: Directrices de diseo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-9

iv Gua de reactivos de Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System

Apndice B Limitacin del cebador en la PCR en multiplex

Apndice C Directrices de diseo de ensayos

Gua de reactivos de Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System v

Cmo utilizar esta gua

Suposiciones En esta gua, se asume lo siguiente:

Convenciones del En esta gua, se utilizan las siguientes convenciones:

Gua de reactivos de Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System vii

A continuacin, se muestran algunos ejemplos de palabras de aviso para el usuario:

Indica una situacin potencialmente peligrosa que, de no evitarse,

Indica una situacin potencialmente peligrosa que, de no

Indica una situacin inminentemente peligrosa que, de no

PELIGRO QUMICO. TaqMan Universal PCR Master Mix

PELIGRO DE LESIONES FSICAS. Durante el uso de los

PELIGRO ELCTRICO. La continuidad del circuito de toma a

viii Gua de reactivos de Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System

Cmo obtener ms informacin

Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Getting 4376786 4377729

Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Getting

Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Getting 4377742

Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Getting 4376784 4377736

Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System 4376782 4377798

Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System 4376783 4377792

Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Site 4376768 4378359

Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Software

Gua de reactivos de Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System ix

Applied Biosystems puede proporcionarle la siguiente documentacin auxiliar:

Applied Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits 4375575

Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Installation 4376791

Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Installation 4376790

Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Planned 4376788

Custom TaqMan Gene Expression Assays Protocol 4334429

Custom TaqMan Genomic Assays Protocol: Submission Guidelines 4367671

Custom TaqMan SNP Genotyping Assays Protocol 4334431

Pre-Developed TaqMan Assay Reagents Allelic Discrimination Protocol 4312214

Primer Express Software Version 3.0 Getting Started Guide 4362460

SYBR Green PCR and RT-PCR Reagents Protocol 4304965

TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assays Protocol 4362038

TaqMan Exogenous Internal Positive Control Reagents Protocol 4308335

TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2) Protocol 4351891

TaqMan Gene Expression Assays Protocol 4333458

TaqMan SNP Genotyping Assays Protocol 4332856

TaqMan Universal PCR Master Mix Protocol 4304449

User Bulletin #2: Relative Quantitation of Gene Expression 4303859

Using TaqMan Endogenous Control Assays to Select an Endogenous 127AP08

Nota: Para obtener ms documentacin, consulte Cmo obtener asistencia tcnica

Obtencin de En Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Software (software

x Gua de reactivos de Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System

Seleccione Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de StepOne).

Cmo obtener asistencia tcnica

Gua de reactivos de Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System xi

xii Gua de reactivos de Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System

Gua de reactivos de Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System 1-1

Seleccione Help (Ayuda)StepOne Help (Ayuda de StepOne).