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CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES

El cultivo de tejidos vegetales se desarroll a partir de la investigacin de botnica y fisiologa


vegetal en el ao 1950. Actualmente es una herramienta internacional importante en la seleccin,
cruzamiento, control de enfermedades y produccin en masa de cultivo de plantas. Es muy til en la
horticultura, floristera, frutal, forestal.

El cultivo de tejidos debe su origen a la investigacin sobre hormonas que controlen el crecimiento
y desarrollo vegetal. Este conocimiento se combin con las tcnicas bsicas de micropropagacin e
identificacin.

Desde estas dos herramientas proviene la Biotecnologa, es la tcnica por la cual la planta u rgano
de planta de puede multiplicar (propagar, reproducir) y controlar su crecimiento individual,
utilizando para ello cualquier parte dela planta (semilla, esqueje, raz, hoja, meristemos Etc.), sobre
un medio artificial de crecimiento que contenga los nutrientes bsicos de un suelo artificial en un
reciente estril.

Qu es el cultivo de tejidos vegetales?

Como un concepto general se puede definir como un conjunto de tcnicas de laboratorio en el que
se obtienen plantas completas a partir de un explante (Parte separada de la planta) que se cultiva
aspticamente en un medio artificial de composicin qumica definida y se incuba bajo condiciones
controladas.

El cultivo de tejidos es una tcnica de un enorme potencial, tanto en investigacin como en el


desarrollo y en la produccin de cosecha. En muchos sentidos an est operando en manera muy
cruda, y cada ao encuentra nueva sofisticacin y conocimiento aplicado. La principal limitacin es
nuestro pobre entendimiento de cmo funcionan las hormonas vegetales, las cuales tienen un rol
central en esta tecnologa, y el alto costo de los procesos que requieren adems una cuidadosa y
entrenada mano de obra. Estas limitaciones podrn hallar salida en la respuesta que puedan brindar
tanto los fisilogos vegetales que trabajan en el campo hormonal como los ingenieros que trabajan
en la mecanizacin de los procesos.

Totipotencia

Potencialidad inherente de las clulas vegetales de regenerar una planta completa, bajo los
estmulos adecuados - Haberlandt (1900s)

Ventajas y desventajas del cultivo "in vitro"

Ventajas:
Permite sanear plantas con virus, mediante el cultivo de meristemos.
Facilita la realizacin de una propagacin clonal masiva de plantas idnticas en un corto tiempo.
Permite la ampliacin de la base gentica de una especie.
Los clones pueden ser propagados en cualquier poca del ao
El costo de mantenimiento de un banco de germoplasma, en condiciones de laboratorio, es menor
en comparacin al mantenimiento en condiciones de campo, evitando el riesgo de prdidas por
factores climticos (presencia de heladas, sequas prolongadas, granizadas o temperaturas elevadas)
o sanitarios.
Las plntulas se mantienen libres de plagas y enfermedades, por ser una tcnica que requiere de
mucha aspcia.
Permite someter a una poblacin de plntulas a pruebas de resistencia a factores de salinidad,
temperaturas bajas (heladas) o altas (en condiciones tropicales). (MEJIA A., R., 1988).

Desventajas:

El material qumico empleado en la preparacin de los medios de cultivos son costosos y poco
disponibles en muestro medio. Requie.re de la implementacin de una infraestructura y equipos
costosos, como la cmara de flujo laminar.
No es posible instalar laboratorios "in vitro" donde no se cuenta con fluido elctrico o se presentan
interrupciones peridicas.
Escasa literatura relacionada al cultivo "in vitro" de especies forestales.
Se requiere de personal de laboratorio especializado: bilogos, qumicos fisilogos,
fitomejoradores, agrnomos y forestales. (VITTORELLI, C., 1988).

Fases del cultivo de tejidos Base


- Fase I. Etapa de iniciacin o establecimiento i n vitro
- Fase II. Etapa de multiplicacin.
- Fase III. Etapa de acondicionamiento para el transplante a tierra.
- Transplante.

FASE I. Para el establecimiento del explante:


La asepsia es una condicin relevante y del todo imprescindible para el xito e induccin
morfognica del material bajo condiciones in vitro. Una premisa es que cualquier tipo de explante
utilizado debe estar adems libre de patgenos endgenos, normalmente presentes en la planta
madre. Dado que se utilizan fragmentos de rganos o parte de tejidos, stos deben ser extrados del
tejido madre. En muchos casos existen patgenos externos y el hecho de manipulacin crea nuevos
focos potenciales de contaminacin. Se han descrito varios protocolos vinculados con la
esterilizacin y posesterilizacin de diferentes rganos vegetales que son universalmente utilizados
en diferentes laboratorios (Yeoman, 1973; Bonga, 1982a). El lavado de los explantes con productos
desinfectantes bajo condiciones aspticas, elimina patgenos superficiales, pero puede ocasionar
daos en las clulas, produciendo pardea miento o necrosis y afectando eventualmente a las
respuestas morfognicas. En general, de acuerdo a la superficie de contacto y naturaleza del
explante, existen tratamientos que vinculan concentraciones ptimas de usar para cada desinfectante
versus tiempo de exposicin. Concentraciones muy bajas
y tiempos de exposicin cortos, producen desinfeccin incompleta del material y posible
contaminacin durante el cultivo. Tiempos largos y concentraciones mayores, impiden el desarrollo
de patgenos, pero pueden afectar la viabilidad y/o respuestas morfognicas inducibles en las
clulas del explante.
Agentes desinfectantes empleados en la asepsia de explantes.

Agente desinfectante Concentracin (%) Tiempo (minutos)

Alcohol etlico 75-95 0,5 -1


Cloruro de mercurio 0,1-1,0 1-5
Hipoclorito de calcio 7-10 5-20
Hipoclorito de sodio 2,5 9 5-20
Perxido de hidrgeno 2-10 5-12

Otros compuestos que apoyan tratamientos para eliminacin de patgenos son diversos antibiticos,
los cuales deben ser manipulados cuidadosamente por su toxicidad y/o especificidad. Entre ellos se
puede citar para contaminacin bacteriana: Carbenicilina, Cefotaxima, Geneticina, Kanamicina,
Higromicina y Rifampicina y sus mezclas (soluciones de Guillard y Provasoli). Los niveles de
concentracin empleados son del orden de 5-100 g/ mL. Una especial precaucin debe ser tomada
al usar Kanamicina, pues inhibe la morfognesis en algunas especies (Mihaljevic et al., 2001;
Obando y Jordan, 2001). Entre los antimicticos, Amfotericina B, Captafol, Carbendazi- ma,
Fenbendazole, Imazalil y Nistatina, son los ms frecuentemente usados. En la prctica, tratndose
de rganos de mayor volumen obtenidos en terreno y de los cuales se va a aislar un explante,
desinfecciones previas con Captan y Benomyl durante algunas horas, y el uso posterior de algunos
de los antimicticos indicados ms arriba, son eficientes en la remocin de patgenos.

-Fase II. Etapa de multiplicacin.


a) Morfognesis, Organognesis, Embriognesis
La generacin de nuevas formas y estruc- turas, como ser rganos o embriones originados de
algunos tipos de explantes donde no los haba, se denomina morfognesis o ms especficamente,
organognesis o embriognesis, siendo todas de carcter adventicio. Para poder generar una
morfognesis, los diferentes tipos de explantes (clulas, tejidos y rganos cultivados in vitro), deben
poseer la informacin y las condiciones endgenas y del medio, conducentes a expresar las
diferentes respuestas morfognicas, posibles. stas son organognesis caulinar (brotes de novo),
organognesis radicular o rizognesis (races) y embriognesis (formacin de embriones).
La respuesta posible a inducir est determinada, por el potencial de totipotencia celular; o
capacidad inherente de cualquier clula vegetal viable, de recapitular toda la informacin existente
en el genoma y de expresar sta a travs de la diferenciacin y desarrollo, hacia la formacin de
plantas completas de igual caracterstica gentica. En este proceso se debe definir la condicin ce-
lular o de rgano y el origen del material, de carcter juvenil y/o adulto. Es bien sabido que
explantes de carcter adulto poseen bajo o nulo potencial morfognico in vivo o in vitro, versus
material de condicin juvenil, de manera que ste debe ser preferido. El Material juvenil, ms
morfognico o embriognico, evidencia un grado de metilacin menor del DNA como tambin una
mayor proporcin de conjugados de poliaminas libres que material adulto, pudiendo causar efectos
sobre la activacin/desactivacin de genes (Fraga et al., 2002; Joyce y Cassells, 2002; Santos y
Fevereiro, 2002). La primera respuesta inductora de cualquier explante, consiste en la
desdiferenciacin de una clula diferenciada. En todas las plantas conformantes del Reino Vegetal
existe solamente un nmero reducido de clulas, cada una con una diferente caracterstica de
diferenciacin segn la funcin a desarrollar, todas derivadas de una clula embrionaria
conformante de la cigota. En todos los vegetales del planeta, toda la anatoma y arquitectura posible
a generar se basa en el ordenamiento de este reducido nmero de clulas estables o permanentes,
entre algunas de ellas: clula meristemtica, parenquimtica (varios tipos), fibra esclerenquimtica /
colnquima, trquea / traqueida, tubo criboso; clula de guarda y clula epidrmica. Dichas clulas
conforman a su vez tejidos especializados. La desdiferenciacin consiste en el potencial de
cualquiera de stas de volver a su condicin de origen de tipo meristemtico. Las nicas clulas no
totipotentes y que tampoco pueden cambiar su patrn de expresin, son las que carecen de ncleo,
como las traqueidas, las trqueas del floema o los tubos cribosos correspondientes al floema.
Durante la diferenciacin se pueden reconocer cuatro eventos fundamentales: a) seal inductiva y
de percepcin donde se le atribuye un especial rol a la auxina (AIA); b) expresin de genes que
especifican la identidad celular; c) expresin de genes para conformar las estructuras especficas y
actividades de la clula diferenciada y d) actividad de productos gnicos y sus cambios en la es-
tructura celular para hacer efectiva la funcin de la clula diferenciada. La resultante de un conjunto
de clulas con actividad meristemtica bajo condiciones in vitro es, inicialmente, la formacin de
nuevas clulas del tipo parenquimtico que conforman un agregado celular. De acuerdo a ciertas
condiciones inductivas, dadas por niveles endgenos/exgenos de auxina versus citoquininas y en
algunos casos de sacarosa, algunas de estas clulas se diferencian en elementos floemticos como
tambin del tipo trqueas, crendose una cierta polaridad en el sistema. En otros, casos clulas
desdiferenciadas se diferencian nuevamente para formar un primordio; de all derivan nuevos bro-
tes o nuevas races. El arreglo longitudinal de estas clulas constituye posteriormente la raz
funcional.
Cabe indicar que la mxima expresin de totipotencia se puede citar en dos ejemplos: 1)
protoplastos, que corresponden a clulas aisladas carentes de pared celular. En este caso, estos pue-
den, junto con recapitular a plantas, generar y resintetizar su pared celular, provistos los elementos
en el medio de cultivo (por ejemplo diversas pentosas) y 2) microsporas (polen); cuyo programa on-
tognico, determinado y establecido filognicamente, consistente en la formacin de gametos,
puede ser alterado y transformado en otro programa embriognico (nunca realizado antes, ni esta-
blecido por filogenia), conducente a la generacin de plantas; en este caso, de nuevas plantas
haploides. De ac puede establecerse el hecho de que el total de la informacin conducente a la
regeneracin de plantas (totipotencia), an se mantena presente en el genoma de esta clula. La
morfognesis finalmente puede ocurrir de dos maneras diferentes: a) a partir de clulas
diferenciadas sin la proliferacin de tejido indiferenciado o b) a partir de clulas no especializadas,
no organizadas y desdiferenciadas de callo o suspensiones celulares.

ORGANOGNESIS CAULINAR Y RADICULAR


La induccin de brotes o de races puede ser derivada de acuerdo a los niveles hormonales presentes
en un explante. Si se considera un explante in vitro con adicin de hormonas del tipo auxina (AIA y
anlogos sintticos) y citoquinina (varias formas), ambas en concentraciones relativamente altas, las
clulas desdiferenciadas generarn simplemente tejido parenquimtico con algunos elementos de
vasos presentes. Si las mismas hormonas se encuentran en proporciones diferentes; un bajo nivel
relativo de la citoquinina, sin alterar la auxina, el conjunto tisular ser menor, pero generar
exclusivamente races. Si en cambio se incrementa el nivel de la citoquinina, reduciendo el de
auxina, se generarn exclusivamente brotes (Skoog y Mi- ller, 1957). Este patrn de respuesta, que
se hall antes de los aos 60 especfica- mente para tabaco, se ha generalizado en el tiempo para un
gran nmero de especies de carcter herbceo y leoso.
Los azcares, en cuanto a su tipo y concentracin, tambin influyen en las respuestas morfognicas.
Normalmente, se indica una asociacin de sacarosa a la formacin de xilema, vinculado a procesos
de diferenciacin muy tempranos de la nueva raz. La sacarosa es el azcar ms comnmente usado
en trabajos in vitro, aunque tambin han sido usados otros azcares en menor frecuencia. La
glucosa y la fructosa son menos comunes, posiblemente por representar a azcares reductores (se
asume que por este motivo son tambin muy escasos en la composicin de la savia de las plantas
con apenas el 1% o menos con respecto al contenido de sacarosa). Sin embargo, para el cultivo de la
confera Sequoia sp., la fructosa aparece como el azcar ms adecuado, como asimismo las pectinas
y el almidn (Koblitz, 1972). En el caso de la zanahoria, despus de la sacarosa, la glucosa y la
maltosa tambin sirven en forma satisfactoria (Koblitz, 1972); la maltosa promueve tambin el
contenido de clorofila apoyando los fenmenos vinculados con la organognesis en babaco (Carica
x pentagona) (Jordan y Piwanski, 1997). Mientras la glucosa produce en general bajas respuestas o
gran pardeamiento en tejidos de Prunus avium, este efecto puede ser superado mediante el sorbitol
(Jordan, 1975). En presencia de sorbitol (aunque no ante sacarosa), bajo iguales niveles hormonales,
se facilita la induccin brotes en Annona cherimola (Jordan et al., 1991). Finalmente, manitol
promueve la regeneracin de brotes en hojas en menta (Mentha x piperita y M. spicata).

-Fase III. Etapa de acondicionamiento para el transplante a tierra.


El enraizamiento in vitro depende del potencial de la especie, del tipo de explante y de las
condiciones de cultivo y del tipo y niveles de reguladores que son usados. Muchas especies tien-
den a enraizar fcilmente; otras, como algunas trepadoras, lo realizan con mucha dificultad o
manifiestan escasa frecuencia. El pardeamiento del material puede provocar tambin falta de res-
puestas. En general, la norma es que in vitro, el grado de facilidad de induccin es semejante al de
las plantas bajo condiciones de campo. A veces, el material denota intensa proliferacin de brotes
pero no de races o viceversa. En la prctica, se procede a usar mayormente el cido indolbutrico
(AIB) como nico regulador, aunque tambin se ha citado de usarse junto con AIA u otros regula-
dores, como ANA. Varias condiciones del medio tambin aparecen como idneas; entre ellas, el uso
de soluciones nutritivas de baja tonicidad, la reduccin del contenido de azcar (sacarosa) de 2% a
1%, aumento de pantotenato de calcio (5 mg/L), tiamina y la adicin de otros compuestos pueden
ser tiles. Por ejemplo el carbn activado, que junto con prevenir un excesivo crecimiento de callo
puede condicionar la promocin de races.

ACLIMATIZACIN

Las plntulas que se desarrollan bajo condiciones in vitro, lo hacen con altos contenidos de
humedad tanto en el medio como en su microambiente. Las adaptaciones endgenas no consideran
entonces, en fases tempranas, la formacin de cutcula en las hojas ni los mecanismos regulatorios
del control estomtico, vinculados a la retencin de agua e intercambio gaseoso. Por un lado,
aunque el nmero de estomas puede variar en las hojas de las plantas in vitro comparado con
plantas en condiciones de crecimiento externas, ms relevante es el hecho que su forma sea
diferente y estn situados en zonas superficiales de la hoja, en vez de encontrarse ms bien
sumergidos bajo la capa epidrmica, aparte de su incapacidad en el funcionamiento de cierre en
respuesta de estrs hdrico.

En mayor medida, el efecto ms perjudicial en la deshidratacin de una hoja es la falta de


produccin de cera epicuticular. Su carencia implica que el total de la superficie de las hojas permi-
ta la libre entrega de agua de la planta al ambiente, efecto causado por diferencia de potenciales
hdricos en el sistema. El resto de la planta recin desarrollada es tambin un material muy deli-
cado, que recin est generando las estructuras con sus sistemas enzimticos que le permiten su
vida. Especficamente, las plntulas, de condicin mixotrfica o heterotrfica, recin estn comen-
zando a entrar a la fase de autotrofa. Ello implica la generacin de pigmentos y organelos, pasando
de una fase de consumo de nutrientes orgnicos del medio (por ejemplo sacarosa como fuente de
carbono) a su sntesis a travs de la fotosntesis. Al respecto, se han estudiado estas primeras fases
de aclimatacin y se ha visto que, aunque durante la primera semana la fotosntesis neta bajaba al
detectarse alta fluorescencia, exista recuperacin posterior.

MEDIO DE CULTIVO

Un medio de cultivo es definido como una formulacin de sales inorgnicas y compuestos


orgnicos requeridos para la nutricin y manipulacin de los cultivos in vitro. Existen numerosas
formulaciones, cada una de las cuales comprende entre seis y 40 compuestos. Existen en reportes
cerca de dos mil medios de cultivo, de los cuales los ms usados son 16, adems de considerar que
algunos de ellos presentan particularidades en la induccin de una va especfica en la morfognesis
vegetal. El medio de cultivo es una solucin acuosa que est formada por compuestos inorgnicos,
compuestos orgnicos, complejos naturales y agentes de soporte y gelificacin.

Los medios de cultivo se encuentran constituidos por los siguientes componentes:

I.- Sales inorgnicas

a) Macronutrientes: los tejidos en cultivo requieren de una fuente continua de compuestos


inorgnicos; adems de carbono, hidrgeno y oxgeno. Los elementos ms utilizados son
principalmente N, P, K, Ca, Mg y S.

El nitrgeno se adiciona en grandes cantidades y se encuentra en el medio en forma de nitrato o


iones de amonio, o la combinacin de ambos iones.
El fsforo se puede adicionar en cualquiera de las formas NaH2PO4.H2O o KH2PO4.
El potasio se encuentra en grandes cantidades en la naturaleza; es un catin que se agrega en forma
de KCl, KNO3, KH2PO4.
El calcio se adiciona con CaCl2.2H2O o Ca (NO3)2.4H2O o en la forma anhidra de cualquier sal.
El magnesio y azufre satisfacen sus requerimientos con MgSO4.7H2O.
El sodio no es requerido en grandes cantidades por las plantas superiores; sin embargo, puede ser un
elemento esencial para cultivos de halfitas y plantas C4.
El cloro est presente en forma de KCl o CaCl2.
b) Micronutrientes: Para una adecuada actividad metablica, las clulas vegetales requieren de
micro- nutrimentos, los ms esenciales son Fe, Mn, Zn, B, Cu, Co y Mo. Los ltimos cinco
elementos son fundamentales para la sntesis de clorofila y la funcin de cloroplastos. El (Fe) es
requerido para la formacin de precursores de la clorofila.

El (Mn) es necesario para el mantenimiento de la ultraestructura y el proceso fotosinttico (la


actividad del fotosistema II es proporcional al contenido de este catin).
El (Cu y Zn) son requeridos para la oxidacin e hidroxilacin de compuestos fenlicos.
El (Mo y Fe) forman parte de las enzimas nitratoreductasa y nitrogenasa.
El boro es necesario para el mantenimiento de la actividad meristemtica, est involucrado en la
sntesis de bases nitrogenadas, en particular de uracilo.
Agentes quelatos: son compuestos cuyas molculas son capaces de detener unin de un metal con
varias uniones qumicas formando un anillo complejo (quelato-EDTA cido etilendinitrotetracetato)
en bajas concentraciones estimulan el crecimiento haciendo que el Fe est disponible en bajas
concentraciones.
Las concentraciones tradicionalmente se expresaban en mg.l-1, es preferente en mM, meq.l-1 y
mol.l-1

II.- Vitaminas
Son necesarias para llevar a cabo una serie de reacciones catalticas del metabolismo y son
requeridas en pequeas cantidades.
Las ms empleadas son las siguientes:
Tiamina (Vit. B1): se aade como tiamina-HCl. Es considerada como la nica, imprescindible o
esencial para el crecimiento de las clulas vegetales.
cido nicotnico (Niacina).
Piridoxina (Vit. B6): se aada como piridixina-HCl.
Mio-inositol: no es propiamente una vitamina, es una azcar-alcohol que tiene un efecto estimulante
sobre la morfognesis, participando quiz en la va biosinttica del cido galacturnico.
cido pantotnico: ayuda al crecimiento de ciertos tejidos.

III.- Hormonas del desarrollo vegetal


Existen tres grupos principales:
a) Auxinas: vinculadas al alargamiento celular, induccin de callo, neoformacin de meristemos
radicales. (AIA, AIB, 2,4D y ANA).
b) Citocininas: promueven la divisin celular y organizacin y diferenciacin de callos, estimulan la
proliferacin. Las ms utilizadas con BA, Kin, 2ip, Zeatina, Thidiazurn).
c) Giberelinas: promueven el alargamiento celular, adems de utilizar cido abscsico, poliaminas,
entre otros.

IV.- Aminocidos
Son una fuente adicional e inmediata de nitrgeno, su asimilacin puede ser ms rpida que el
nitrgeno inorgnico aportado el medio, pueden actuar como agentes quelantes. La L-glutamina y
la L-asparagina son transportadores de nitrgeno, L-arginina estimula las races y L-cistena es un
agente reductor.
V.- Carbohidratos
Son utilizados como fuente de energa y osmo-reguladores. La sacarosa es el azcar empleado
universalmente, la siguen en importancia la glucosa, fructosa, maltosa, rafinosa, galactosa, manosa,
lactosa. La concentracin a la que se emplea la sacarosa es de 20 a 45 g.l-1.

VI.- Agua
El agua para preparar medios de cultivo deber ser destilada, bidestilada, tridestilada,
desionizada o desminarizada, el agua potable contiene sales en solucin que pueden modificar la
respuesta de los tejidos en cultivo.

VII.- Agentes gelificantes o solidificantes


Se emplean en el caso de medios semislidos, se ha utilizado el agar como un sistema de
soporte para la preparacin de medios slidos o semislidos. Las ventajas que representa el agar
es que con el agua forma geles que se derriten a 100 C, se solidifican a 45C, por lo que es estable
a las temperaturas de incubacin, adems no es alterado por enzimas vegetales, ni reacciona con los
constituyentes del medio y no interfiere con la movilizacin de los componentes del medio de
cultivo.

VIII.- Otros compuestos.


Muchos compuestos o suplementos no definidos de composicin qumica variable como albumen
de coco, endospermo de maz, extracto de levadura, jugos y extractos de frutas (pltano, tomate,
papaya), casena hidrolizada (como fuente protenica), antioxidantes (cido ascrbico, ctrico) y
adsorbentes como el carbn activado.

BIBLIOGRAFIA

Capitulo 2 del libro "Cultivo de Tejidos en la Agricultura: Fundamentos y


Aplicaciones. William M. Roca , Luis A. Mroginski (eds.) Centro Internacional de
Agricultura Tropical (1991).

Link: http://exa.unne.edu.ar/biologia/fisiologia.vegetal/cultivo_de tejidos.htm

Biotecnologia y Mejoramiento Vegetal II. Levitus G., Echenique V., Rubinstein C.,
Hopp E., Mroginski L. (Eds.) INTA ediciones (2010).

Link http://intainforma.inta.gov.ar/wp-content/uploads/2010/09/bio WEB.pdf De


este libro, los capitulos mas generales son I1, I2, I4, IV1, IV2, IV3 y V9