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Anticuerpos recombinantes teraputicos

Abstracto
La tecnologa de anticuerpos recombinantes ha revolucionado el desarrollo de
terapias con anticuerpos. Esta mini revisin ofrece una visin general de las
tecnologas habilitadoras y las perspectivas futuras de este campo en rpido
progreso.

Terapias basadas en anticuerpos: un comienzo lento


La historia de la ciencia muestra un comienzo muy temprano de la tecnologa
de anticuerpos en la medicina (documentado por dos premios Nobel otorgados
a Emil von Behring y Paul Ehrlich hace un siglo. El uso de sueros contra las
mordeduras de serpientes o para la profilaxis de la hepatitis (beriglobina)),
descendientes directos del primer uso de suero de Behring para tratar la
difteria y el ttanos, as floreci desde entonces, pero pronto fue muy evidente
que un tratamiento de enfermedades crnicas no era posible utilizando este
tipo de preparacin cruda de anticuerpos. Como resultado, casi 100 aos han
transcurrido desde que Ehrlich espera "ricos tesoros para la terapia" de las
conclusiones de Behring antes de anticuerpos teraputicos para el tratamiento
de los "principales asesinos" como el cncer o enfermedades autoinmunes
lleg a nuestras estanteras de farmacia en nmeros significativos. Cul fue la
razn de esta "fase de retraso" extremadamente larga?

Tecnologa de hibridomas e ingeniera gentica: clave para


nuevos frmacos
El descubrimiento fue llevado por la disponibilidad de dos tecnologas
esenciales: la primera es la tecnologa del hibridoma (1975), que permite por
primera vez obtener una fuente "inmortal" de una inmunoglobulina definida.
Sin embargo, a pesar de ser un avance en cuanto a especificidad definida y
produccin ilimitada, los anticuerpos de ratn hasta ahora no han sobrevivido
en el mercado en cantidades significativas, lo que indica la importancia de la
segunda tecnologa. sta era la capacidad para manipular secuencias de
anticuerpos en sistemas de expresin recombinantes. Tres tecnologas de
ingeniera gentica tuvieron que ser aplicadas para fabricar un anticuerpo
teraputico a partir de un hibridoma de ratn. Adems de la amplificacin por
PCR de los genes de anticuerpo ligero y pesado de los hibridomas, lo cual est
lejos de ser trivial ya que estos son hbridos de cncer tetraploides
desregulados (Toleikis et al., 2004), los genes tuvieron que expresarse en un
sistema heterlogo con un rendimiento razonable. En segundo lugar, la
manipulacin de la estructura de inmunoglobulina G (IgG) primaria (secuencia
de protenas) fue necesaria para disminuir la inmunogenicidad, por un proceso
llamado "quimerizacin" o "humanizacin". Estas tecnologas apuntaban a la
eliminacin, en la medida de lo posible, de las secuencias de ratn de la Ig
para retener an la unin al antgeno, junto con la adicin de regiones de Fc
humanas que permitan interactuar con el sistema inmune del paciente.
En tercer lugar, el propio sitio de unin al antgeno tena que ser mejorado,
mediante "maduracin por afinidad", una o varias rondas de mutacin y
cribado para mejorar las caractersticas de unin del anticuerpo. La
combinacin de estas tecnologas condujo a un aumento dramtico en el
nmero de terapias de anticuerpos aprobadas en la ltima dcada de 1 a
aproximadamente 20 hoy (Figura 1). Alrededor de 400 estudios clnicos previos
a la aprobacin estn en curso, por lo que podemos esperar que este aumento
en la aprobacin de anticuerpos teraputicos no se ralentizar en un futuro
prximo, a pesar de algunos retrocesos recientes, como los problemas
encontrados en la prueba de la DC28 Anticuerpo TGN1412
(http://www.dh.gov.uk/assetRoot/04/14/10/43/04141043.pdf). Los anticuerpos
recombinantes siguen siendo el grupo de productos biofarmacuticos de ms
rpido crecimiento, tanto en cuanto al nmero como a la cuota de mercado.

xito y desaparicin de anticuerpos teraputicos derivados de


ratn
Los anticuerpos recombinantes que representan la tecnologa de los aos
ochenta, es decir, clonados a partir de clulas de hibridoma de roedor,
mejorados por ingenieras genticas y producidos en un sistema de cultivo de
clulas heterlogas de mamferos, siguen dominando la lista actual de
teraputicos de anticuerpos aprobados (Tabla 1). Pero al mirar el desarrollo en
los ltimos aos y los estudios clnicos en curso de pre-aprobacin, queda claro
que esta imagen comienza a cambiar. La razn es que la dcada de 1990 trajo
una alternativa radicalmente novedosa para la generacin de anticuerpos
teraputicos. Los anticuerpos humanos pueden seleccionarse directamente
desde el principio utilizando repertorios de genes humanos en sistemas
heterlogos. Para conseguirlo se concibieron dos mtodos exitosos pero muy
diferentes. En la variante in vivo, se introdujeron locus gnicos de anticuerpos
humanos en ratones knockout IgG. Tras la inmunizacin, estos ratones
desarrollan IgG humana en respuesta al antgeno, que luego puede producirse
mediante tecnologa de hibridoma convencional (Brggemann y Taussig 1997).
Este mtodo proporcion la mayora de los anticuerpos teraputicos humanos
sometidos a pruebas clnicas en este momento. Una innovacin reciente de
este principio bsico son los conejos transgnicos que producen anticuerpos
humanos mediante la conversin gnica (Buelow et al., 2006), mostrando que
todava existe un desarrollo tecnolgico en este extremo. An ms radical, y
proporcionando al ganador en la carrera para la aprobacin de un anticuerpo
recombinante completamente humano (Humira), el segundo mtodo realiza la
seleccin completamente in vitro, haciendo uso de la presentacin de fagos
(Figura 2). Se construyen genotecas enormes de secuencias de anticuerpos (>
109 clones) en Escherichia coli, fusionadas genticamente con un gen de una
protena de superficie de fago. Estas bacterias se infectarn con el fago
filamentoso, cuya progenie incorpora no slo el ADN que codifica el sitio de
unin del anticuerpo sino que presenta la protena del anticuerpo
covalentemente unida a su superficie. Mediante una etapa de inmunoafinidad
en el antgeno ("panning"), un fago nico que se une especficamente a este
antgeno particular puede seleccionarse de una mezcla con miles de millones
de diferentes genes de anticuerpo, permitiendo as aislar un gen nico para el
anticuerpo especfico respectivo (Hust y Dbel 2004 ). Los genes del fragmento
de anticuerpo, entonces, tienen que ser transferidos a un sistema de
produccin de mamferos, y se produce una IgG con una secuencia
completamente humana. Adems, mtodos de seleccin in vitro adicionales
han entrado en la escena, como la presentacin de ribosomas, la visualizacin
de la superficie microbiana, o la seleccin de matrices de matrices (Fig. 3).
Estos mtodos an no estn igualando el rendimiento y la robustez de los
ratones transgnicos y de presentacin de fagos, pero pueden convertirse en
verdaderas alternativas en un futuro prximo.

Tecnologas de visualizacin: clave para mejorar rpidamente las


caractersticas de los anticuerpos
Adems, estos mtodos de presentacin recombinante permiten mejorar la
afinidad y estabilidad mediante ciclos repetidos de mutacin y seleccin de
aglutinantes mejorados en el fago.
De hecho, todos los mejores aglutinantes entre todos los anticuerpos
existentes son resultados de mtodos de seleccin recombinantes, llegando
hasta las afinidades femtomolares (Boder et al., 2000, Hoogenboom 2005).
Teniendo estas potentes tecnologas en su lugar, ahora se supone
generalmente que un anticuerpo de hibridoma sin mejora de ingeniera de
afinidad y / o humanizacin ya no es un candidato viable para el desarrollo
teraputico, convirtiendo la tecnologa de anticuerpos recombinantes como la
nica fuente de futuros teraputicos de anticuerpos. Se ha retirado ya del
mercado un gran nmero de anticuerpos de ratn, en particular, aprobados
para la obtencin de imgenes, p. CEA-Scan, Indimacis 125, OncoScint, o
Verluma. Sin embargo, el origen del ratn no es necesariamente la nica razn
de la desaparicin de estos productos, ya que un anticuerpo humano tambin
comparta su fe (Votumumab, Humaspect). Los productos de anticuerpos
radiomarcados sobre todo sobrevivieron como parte de regmenes de
tratamiento bastante complicados, como Bexxar o Zevalin.

Anticuerpos policlonales versus anticuerpos monoclonales


La terapia con sueros aislados de animales inmunizados o humanos est bien
establecida para tratamientos de dosis nica. La principal ventaja de utilizar
mezclas policlonales u oligoclonales de IgG es la mayor probabilidad de unirse
a los antgenos por su capacidad para unirse a ms de un sitio (eptopo) de un
antgeno. Dada la variacin encontrada en la superficie de muchos agentes
infecciosos, as como en las clulas cancerosas, se espera que esto aumente
las posibilidades de sealar la respuesta inmune contra esta amenaza en
particular (Bregenholt y Haurum 2004; Glassy y McKnight 2005). Se han
sugerido varios enfoques, desde la clonacin de conjuntos policlonales de
clulas plasmticas -una aproximacin basada en la inmunizacin de seres
humanos voluntarios- a la combinacin de anticuerpos recombinantes
generados in vitro con uno de los mtodos mencionados anteriormente.

Adicin de nuevas capacidades a anticuerpos: hacia la "prxima


generacin" de frmacos
Un segundo desarrollo, que se desarrolla paralelamente a la creciente
disponibilidad de anticuerpos totalmente humanos, es el uso de partes del
anticuerpo en protenas de fusin. Los dominios proteicos que no estn
conectados naturalmente a una inmunoglobulina se fusionan con una IgG o sus
fragmentos de unin al antgeno (Hudson 1999). Un segundo grupo grande
utiliza la parte Fc de IgG como un dominio efector / dimerizacin, por ejemplo,
En Enbrel, donde el dominio soluble de un receptor de factor de necrosis
tumoral (TNF) se fusiona a una parte Fc. Sin embargo, estas protenas
normalmente no se consideran como anticuerpos recombinantes tpicos, ya
que faltan la caracterstica de anticuerpo definitorio: el sitio de unin al
antgeno.
El nmero de diseos de protenas que utilizan los sitios de unin a antgenos
de anticuerpos fusionados a otra cosa es enorme y sigue aumentando, y
produjo una serie de molculas teraputicamente relevantes. La parte del
anticuerpo funciona como un "buscador", entregando una alta concentracin
de su "carga" a un tejido deseado o tipo celular. Las oportunidades resultantes
para la "terapia dirigida" han estimulado el desarrollo de un nmero incontable
de principios teraputicos completamente nuevos, en particular, para el
cncer. Esto incluye la administracin simple de una carga txica a las clulas
cancerosas (Schrama et al., 2006; Newton y Rybak 2001) hasta procesos muy
sofisticados y de mltiples etapas como la terapia con profrmacos enzimticos
dirigidos a anticuerpos (Bagshawe et al., 2004), que requiere una orientacin
previa de Un tumor con una enzima acoplada al anticuerpo, seguido por la
eliminacin del anticuerpo, a continuacin la conversin de un precursor no
txico a un frmaco citosttico en la localizacin del tumor.
En lugar de dominios efectores heterlogos, se puede fusionar un segundo
dominio de unin a antgeno al fragmento de diana, dando como resultado la
formacin de anticuerpos anti-
(Kontermann 2005). El efecto teraputico generalmente se logra mediante la
reorientacin de la propia respuesta inmune del cuerpo a las clulas
cancerosas. Los dos brazos diferentes del anticuerpo biespecfico llevan a las
molculas superficiales de proximidad cercana de una clula inmune y una
clula tumoral, haciendo as visible la clula tumoral para el sistema
inmunolgico, que entonces puede destruirla. Cientos de conceptos novedosos
estn en las tablas de dibujo de los acadmicos o ya han curado el cncer en
los ratones xenoinjertos, y algunos incluso entraron en las pruebas clnicas.
Este desarrollo se ejemplifica perfectamente mediante el desarrollo de
protenas antagonistas del TNF para la terapia de superacin de las reacciones
inmunes. Despus de estudios insatisfactorios con anticuerpos de ratn, la
segunda generacin de constructos de anticuerpos fue consecuentemente un
anticuerpo quimrico (infliximab), el tercero humanizado (CDP571), seguido de
una versin completamente humana (adalimumab) obtenida por presentacin
de fagos, y un receptor de TNF Protena de fusin de anticuerpo-Fc
(etanercept). Ahora, los ejemplos de la sexta generacin entraron en las
clnicas, ejemplificado por certolizumab pegol, un fragmento Fab humano
derivatizado con una entidad heterloga (polietilenglicol) para mejorar sus
propiedades farmacocinticas, entre una serie de otras construcciones.
Y an as, no hay fin, y las generaciones venideras pueden incluso reemplazar
el anticuerpo con uno de los muchos andamios alternativos que se han puesto
a disposicin recientemente (Hosse et al., 2006, Nygren y Skerra 2004).

Produccin de anticuerpos: nuevos conceptos deseados


Para la produccin de terapias de anticuerpos recombinantes, el cultivo de
clulas de mamferos ha sido el estndar de oro durante las dos primeras
dcadas, lo que hace que estos medicamentos sean un producto de alto precio.
Slo se usan muy pocas alternativas para la produccin de los frmacos
anticuerpos aprobados, con clulas de ovario de hmster chino transfectadas y
estables que dominan claramente. Sin embargo, hay que tener en cuenta que
la tecnologa aqu representada es de los aos 80 a principios de los noventa,
impuesta por el hecho de que el proceso de produccin de un producto
biofarmacutico no puede cambiarse realmente despus de la aprobacin y la
optimizacin de los sistemas de produccin usualmente no se hace
exhaustivamente Para este producto de alto margen donde el tiempo de salida
al mercado es el principal impulsor. Por otra parte, la glicosilacin correcta de
las cadenas polipeptdicas producidas ha demostrado ser de suma importancia
para la eficacia teraputica de bastantes frmacos anticuerpos (Jefferis 2005,
Niwa et al., 2005). Sin embargo, dado el aumento dramtico en la teraputica
de anticuerpos que se puede esperar en un futuro prximo, el costo de
fabricacin ser un problema ya que los sistemas de seguro de salud no
pueden permitirse un gran nmero de nuevos medicamentos de alto precio en
el futuro. La primera opcin sera la muy bien establecida produccin
recombinante de E. coli. Sin embargo, debido a sus dos cadenas, gran tamao
y requerimiento de formacin de enlaces disulfuro, las IgG generalmente no se
pueden producir en bacterias, a pesar de algunos informes que lograron eso
despus de una optimizacin muy extensa. El problema se ve agravado por
grandes variaciones de los rendimientos resultantes de secuencias de
anticuerpos individuales. Los fragmentos de anticuerpo ms pequeos pueden
ofrecer una solucin, p. En configuraciones teraputicas basadas en la
seleccin sin necesidad de funciones efectoras de una regin Fc, como los
conceptos de anticuerpos biespecficos o las RNasa dirigidas (Kontermann
2005; Newton y Rybak 2001). E. coli puede producir y doblar correctamente los
dominios de anticuerpos slo en su periplasma, requiriendo que se empleen
vectores de secrecin de baja eficiencia. Algunos sistemas de E. coli dependen
de la produccin de cuerpos de inclusin seguidos de replegamiento-particular
de protenas de fusin con componentes txicos- pero todava con
rendimientos muy limitados, ya que el plegado in vitro de dominios de
anticuerpos es un proceso bastante ineficiente.
Sin embargo, se puede producir suficiente material para desafiar sistemas de
cultivo celular de mamferos, y se estn desarrollando una serie de productos
respectivos. Se requieren sistemas de produccin eucariotas alternativos
cuando se necesita una molcula de IgG completa, con muchos sistemas en
consideracin, que van desde clulas de insectos, una variedad de levaduras
hasta biorreactores de pelo de raz de plantas o animales transgnicos, donde
las IgG pueden ser recuperadas de la leche. Los primeros anticuerpos
generados en las plantas han alcanzado los ensayos clnicos (Weintraub et al.,
2005), pero an slo para aplicacin oral: se pueden producir anticuerpos IgA
anti-caries en el tabaco para producir un constituyente de enjuague bucal. A
pesar de estos avances, todava hay un largo camino por recorrer -durante los
ciclos de desarrollo de la dcada de biofarmacutica- desde los sistemas de
produccin alternativos prometedores en desarrollo hasta el primer anticuerpo
aprobado producido en clulas no mamferas para aplicaciones intravenosas.
Las protenas de fragmentos de anticuerpos ms pequeos, como los
diacuerpos o las inmunotoxinas, producidas en E. coli u otros microorganismos,
como levaduras o incluso bacterias Gram-positivas, tienen una buena
oportunidad de evitar las IgG en el futuro, ya que varias de ellas ya han
entrado en pruebas clnicas. 728 Appl Microbiol Biotechnol (2007) 74: 723 -
729.
La batalla de los nmeros: los anticuerpos como herramientas
para la investigacin del proteoma
Se puede esperar un beneficio significativo de los proyectos emergentes que
buscan identificar aglutinantes para cada producto gnico humano (Taussig et
al., 2007). Grandes consorcios de laboratorios tienen como objetivo identificar
nuevas dianas teraputicas mediante el anlisis de la bioqumica de los marcos
de lectura abiertos desconocidos (ORFs) identificados por la secuenciacin del
genoma humano. Dado el hecho de que la funcin de la mayora de estos ORFs
sigue siendo enigmtica, puede esperarse que la explosin resultante de
conocimientos sobre la localizacin de protenas y el tejido y el tiempo
dependen de la produccin y la funcin de chispa desarrollos de nuevos
anticuerpos teraputicos. Muchos de estos agentes de investigacin sern
anticuerpos que se generan in vitro y forman parte de secuencias humanas de
todos modos, ofreciendo un acceso directo conveniente desde la herramienta
de investigacin a un agente teraputico.