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MTODOS
Pacientes
Los pacientes eran un subgrupo de todos los pacientes que fueron
sometidos a toracotoma para reseccin de un cncer primario de
pulmn en el Lee Moffitt Cancer Center y el Instituto de Investigacin H.
entre 1991 y 2001. Los pacientes fueron elegibles para su inclusin en el
estudio si tenan un adenocarcinoma, escamoso- carcinoma de clulas, o
carcinoma de clulas grandes; se haban sometido a una reseccin
completa del tumor (reseccin R0); y tenan la enfermedad en estadio I
de la estadificacin patolgica. Los pacientes con un cncer nonlung
anterior se incluyeron si la enfermedad se consider curado. Los criterios
de exclusin eran un cncer de pulmn anterior, la quimioterapia
preoperatoria o radioterapia, y cualquier radioterapia anterior en el
pecho. Estudios de estadificacin tenan que incluir un examen fsico y
una tomografa computarizada del trax y el abdomen superior. Ninguno
de los pacientes se someti a 18 F-fluorodesoxiglucosa la tomografa por
emisin de positrones para la estadificacin, y ninguno recibido
cualquier forma de terapia adyuvante. Cantidades suficientes de tejido
de tumor primario tenan que estar disponibles para la construccin de
microarrays de tejidos. Se identificaron 187 pacientes que cumplan
estos criterios.
Los datos de seguimiento para la supervivencia global, la supervivencia
libre de enfermedad, y los sitios de la recidiva del tumor se obtuvieron a
intervalos regulares. Hemos recomendado que los pacientes tienen las
visitas de seguimiento cada 3 meses durante 2 aos y luego las visitas
cada 6 meses durante 3 aos, y luego las visitas anuales. Los resultados
de seguimiento desde consultas externas se obtuvieron por correo y por
telfono los contactos regulares. Para los datos sobre la supervivencia
general, el tiempo desde el diagnstico hasta la muerte se registr. El
estado vital de los pacientes se verific con el uso de los registros de
estadsticas vitales. Para la supervivencia libre de enfermedad, el
momento de la reseccin quirrgica de la recurrencia o la muerte se
registr. Los datos correspondientes a los pacientes sin recurrencia del
tumor fueron censurados en el momento de la ltima visita de
seguimiento.
El estudio fue aprobado por la junta de revisin institucional de la
Universidad del Sur de Florida.
La deteccin in situ y cuantificacin de la expresin de protenas
Se construy un microarray tisular. Se utiliz inmunofluorescencia
combinado con el anlisis cuantitativo automatizado (AQUA) para
evaluar la expresin in situ de las molculas diana. 22 Los antgenos
fueron recuperados mediante la incubacin del tejido en un horno de
microondas. 23 Las concentraciones ptimas de muestras de antisuero y
los anticuerpos se utilizaron para detectar RRM1, PTEN, ERCC1, y
citoqueratina. Se generaron muestras de antisuero a fragmentos RRM1
de conejos y purificado por afinidad. Anticuerpos comerciales se
utilizaron para el anlisis de ERCC1 (Ab-2 clon 8F1, MS-671-R7,
Laboratorio Visin), PTEN (A2B1, sc-7974, Santa Cruz Biotech), y
citoqueratina (pancytokeratin antihumano AE1/AE3, M3515, y Z0622,
Dako Cytomation). Ellos se visualizaron con el uso de muestras de
antisuero marcados con fluorocromos. Las diapositivas finales fueron
escaneados con SpotGrabber (HistoRx), y los datos de imagen se
analizaron con AQUA (PM-2000, HistoRx). Las puntuaciones finales AQUA
van desde 0 (sin expresin) a 255 (la mxima expresin) (vase el anexo
complementario , disponible con el texto completo de este artculo en
www.nejm.org).
Aislamiento de ARN y anlisis de expresin gnica
Fresco congelado y fijado con formalina, las muestras de tumor incluidas
en parafina se obtuvieron de 44 pacientes. Los especmenes frescos
congelados fueron procesadas para el aislamiento de ARN, y, en tiempo
real, la reaccin en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa
cuantitativa anlisis de la expresin (RT-PCR) a base de para los RRM1,
PTEN, y ERCC1 y los genes para el ARN ribosmico 18S-como
anteriormente descrito. 11,24
Anlisis estadstico
Se calcularon los valores medios de las puntuaciones AQUA de lecturas
por triplicado para cada gen y se tratan como variables continuas
independientes. El anlisis de la expresin de genes basados en RNA fue
tratado igualmente como una variable continua independiente. Los
coeficientes de correlacin entre las variables de expresin de genes y
entre los genes se calcularon como variables continuas segn el
coeficiente de rango de correlacin de Spearman (rho), y se calcularon
los niveles de significacin de dos colas. Hicimos una decisin a priori
una de clasificar los valores de expresin gnica como altas o bajas,
utilizando la mediana de la muestra para el anlisis de la supervivencia;
esta clasificacin se realiz con el uso de estimaciones de Kaplan-Meier
y la prueba de log-rank. El objetivo primario fue determinar la asociacin
entre la expresin RRM1 en el tumor y la supervivencia. Los objetivos
secundarios fueron evaluar la asociacin entre la expresin de RRM1 y
ERCC1, entre RRM1 y PTEN, y entre el mRNA y los niveles de protena de
RRM1. Las asociaciones entre la expresin gnica y de los valores
clnicos discretos fueron analizados con el uso de la prueba de suma de
rangos de Wilcoxon para variables con dos categoras y la prueba de
Kruskal-Wallis para las variables con ms de dos categoras. Se realiz
un anlisis de regresin de Cox para evaluar el efecto de la expresin
gnica, con el ajuste de la etapa del tumor, el Eastern Cooperative
Oncology Group (ECOG) estado funcional, el sexo y la condicin de
fumador.
RESULTADOS
FUENTE DE INFORMACIN
Desde la Divisin de Oncologa Torcica del Centro del Cncer H. Lee
Moffitt y el Instituto de Investigacin, Tampa, FL.
Dirigir las solicitudes de reimpresin al Dr. Bepler del Centro Oncolgico
H. Lee Moffitt y el Instituto de Investigacin, MRC-4W, Rm. 4046, 12902
Magnolia Drive, Tampa, FL 33.612 a 9497, o al beplerg@moffitt.usf.edu .