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Cours de microbiologie et gnie fermentaire BTS Biotechnologies

GENIE FERMENTAIRE
Ne pas confondre fermentation et fermentation !
Ne pas confondre fermenteur et fermenteur !!
En anglais on parle de Bioreactor et fermentor

Expliquer ces ambiguts. Dfinir correctement chaque terme

B
A
Sketch of apparatus used to perform measurements of k La. Some internal structures of the reactor. 1. Impeller; 2.
(1 mass flowmeter; 2 pressure gauge; 3 motor; 4 Bioflo III Agitating shaft; 3. Air sparger; 4. Cooling coil; 5.
signal processor; 5 condenser; 6 impeller; 7 air sparger; 8 Sampling pipe.
dissolved O2 electrode; 9 signal converter; 10 chart
recorder; 11 exhaust gas drying column; 12 CO 2 analyser;
13 O2 analyser).

C D

Document 1 : Exemples de bioracteur

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I. INGENIERIE DE LA FERMENTATION OU MICROBIOLOGICAL INGEENIRING

I.1 Les diffrents lments d'un bioracteur

I.1.1 La cuve

Les cuves sont en verre jusqu' 20 L, en acier inoxydable au-del. Leur fond est gnralement rond. Les
cuves doivent rsister:
aux sollicitations thermiques, lors de la strilisation,
aux vibrations, rsultant de l'agitation,
aux surpressions de gaz, lors de la strilisation et de la vidange,
la corrosion.
Les cuves doivent tre tanches aux contaminations extrieures, et supporter les additions d'acides, de
bases, d'anti-mousses.
Le volume utile (volume de milieu) est gnralement = du volume de la cuve, pour tenir compte de
l'augmentation de volume due l'injection d'air et la formation de mousse.

Sur la figure D du document 1, indiquer le volume maximal de remplissage


I.1.2 Le systme d'aration

Le bioracteur doit possder un systme d'injection d'air qui doit tre dispers dans l'ensemble du milieu.
L'arrive d'air a lieu sous le mobile d'agitation. L'air doit tre :
comprim (compresseur),
strile donc filtr (cad dpourvu de particules). On utilise un filtre hydrophobe qui conserve ses
proprits strilisantes l'humidit atmosphrique. Ne pas autoclaver n'y faire entrer de l'air
humide car risque d'occlusion
sec (pour ne pas mouiller le filtre),
dshuil
Le systme de distribution et de rpartition de lair peut tre un simple tube d'arrive d'air, un tube
mtallique perfor (sparger linaire), un plateau d'aration ou disque de porcelaine poreux qui disperse
bien le gaz.

Le document 1 prsente 2 diffrents systmes daration : les colorier en rouge sur les documents et annoter
l'ensemble du systme d'aration des figures du document 1.
I.1.3 Le systme d'agitation

L'agitation est l'opration qui cre ou acclre le contact entre 2 ou plusieurs phases.
Le bioracteur doit assurer une homognisation du milieu, des cellules, de l'air, de la T Il doit pour cela
permettre de mettre en contact les diffrents lments d'un systme polyphasique pour quil ny ait pas de
zones stagnantes.

Dfinir le terme polyphasique et justifier son emploi dans le cas d'un bioracteur
Annoter compltement la figure D l'aide des indications donnes figures A, B et C

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a) agitation par air:

L'agitation peut tre due la seule injection de gaz d'oxygnation comprim, qui cre au sein de la
suspension microbienne, une turbulence variable selon le dbit, la pression et le mode d'introduction.

b) agitation mcanique:

Il existe un type de bioracteur quip d'un mcanisme d'agitation par vibration (vibro-bioracteur).
La plupart des bioracteurs sont quips d'un agitateur rotatif. L'agitation est provoque par le mobile
d'agitation, entran dans un mouvement de rotation par un arbre, lui-mme reli une source d'nergie
mcanique.
Ce systme d'agitation comporte diffrents organes:
L'arbre d'agitation massif ou creux, sur lequel est fix le mobile (turbine ou hlice) entraner,
La turbine ou lhlice : il en existe diffrents modles prsents document 2. Chaque modle
produit une agitation diffrente.
Flat blade disk turbine:rushton type 45 Flat blade disk turbine

Marine propeller 3 segment blade impeller

Document 2 : Exemples de systmes dagitation dun bioracteur

Un systme d'tanchit, l'endroit o l'arbre traverse la paroi du bioracteur


Un systme de guidage de l'arbre
Un systme d'assemblage de l'arbre au moteur (situ au sommet ou la base du bioracteur)
qui va l'entraner.
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L'agitation peut tre renforce par des contre-pales. Elles sont destines limiter l'effet vortex d aux
pales, en augmentant la turbulence du milieu dont la surface reste horizontale malgr l'agitation.

L'agitation mcanique, en plus de raliser les oprations de mlange et de mise en suspension, amliore
l'mulsion et donc l'aration en divisant les bulles de gaz introduit et en les faisant circuler dans le
bioracteur.

Traduire les diffrentes indications portes en document 1


I.1.4 Les systmes de mesure des variables physico-chimiques

Les variations des paramtres de la fermentation (pH, T) sont mesures l'aide d'un capteur, sensible
ces variations. Un bon capteur doit tre: fidle, rapide, juste, fiable, prcis et robuste.

a) les capteurs de mesures physiques

Ils sont tous utiliss in situ.

Dfinir "in situ"

temprature: les capteurs les plus utiliss sont les thermomtres rsistance en platine
vitesse d'agitation: Actuellement, les capteurs les plus fiables fonctionnent par comptage
d'impulsions grce la prsence d'un repre sur l'arbre (comptage du nombre de tours par minute).
pression: C'est la pression de couverture qu'il s'agit de mesurer, c'est--dire la pression que l'on
maintient dans le bioracteur, au-dessus du liquide en fermentation. On utilise des membranes
jauge de contraintes: fines membranes renfermant des lments dont la rsistance varie avec la
dformation. Ces capteurs se prtent bien aux conditions d'asepsie requises en fermentation.
dbit: On effectue gnralement la mesure de dbits gazeux, indispensables lorsqu'on veut
effectuer la dtermination du "KL.a" par la mthode des bilans gazeux. Les dbits de gaz peuvent
tre valus par dbimtre flotteur par exemple.
niveaux: La mesure du niveau peut remplacer celle du volume. Elle intervient lors du remplissage et
de la vidange du bioracteur, mais aussi pour valuer la formation de mousse. On utilise:
- Des sondes rsistives: elles donnent une indication par tout ou rien
- Des sondes capacitives: elles fournissent un signal en continu
Formation de mousse : sonde rsistance lectrique.

b) les capteurs de mesures physico-chimiques

pH: La mesure du pH en fermentation est couramment pratique l'aide de sondes: lectrodes


combines (mesure rfrence) en verre, pressurisables et strilisables.

oxygne dissous: C'est un paramtre trs important dans tous les processus microbiologiques
arobies. Il permet d'valuer les capacits de transfert d'O 2 du bioracteur, et de fournir la culture
la quantit d'O2 dont elle a besoin grce une boucle de rgulation.

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substrats et mtabolites: La mesure de ces paramtres permet de suivre avec prcision le


droulement de la fermentation: volution de la concentration en substrat par exemple. On a recourt
:
- Des dosages chimiques effectus sur des prlvements priodiques (mthode astreignante +
risque de contamination au point de prlvement)
- Des dterminations automatiques et en continu: colorimtrie, CPG, HPLC, spectrophotomtrie
de masse

Dfinir analyse en ligne et analyse hors ligne . Donner un exemple dans chaque cas.

I.2 Les systmes de rgulation

La rgulation permet de maintenir, pour un paramtre donn, un cart minimal et si possible nul, entre sa
valeur mesure ( l'aide d'un capteur) et celle que l'on veut qu'il prenne, appele consigne.

I.2.1 Principe de la boucle de rgulation

Le document 3 prsente une boucle de


rgulation. Expliquez en le principe.

Document 3 : Fonctionnement dune boucle de rgulation

I.2.2 Les diffrents types d'actionneurs

Le type d'actionneur contrl par le rgulateur est fonction du paramtre rguler. Ce peut tre:
Une vanne pour commander l'admission et / ou rgler le dbit d'un fluide dans une canalisation.
Une pompe pour l'addition de ractifs et de milieu de culture en cours de fermentation, notamment
pour les petites installations permettant l'emploi des pompes pristaltiques.
Un moteur vitesse variable.

Proposer un exemple de paramtre contrl dans chaque cas


I.2.3 La rgulation du pH

La rgulation du pH en cours de fermentation est indispensable, car les organismes en croissance


produisent des dchets qui modifient le pH du milieu de culture. Dans la plupart des cas, il s'agit de
processus acidognes: la rgulation du pH est obtenue par addition d'une base, sous forme liquide ou
gazeuse (NH3). Un exemple de rgulateur est prsent document 4.

Quels boutons doit-on actionner pour rgler la valeur de pH consigne. (Rpondre par lettres)
Si le bouton D est positionn sur 20, le bouton E sur 50%, le bouton F sur 40%, et la consigne pH 7,
pendant combien de temps le rgulateur verse de la soude si le pH tombe brusquement 6, quels sont alors les
temps de pause entre 2 ajouts ? Mme question quand le pH est remont 6,9.

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Document 4 : Rglage de la consigne pH

I.2.4 La rgulation de la [O2]

La rgulation de la [O2dissous] est complexe du fait des nombreux paramtres susceptibles de la faire varier:
vitesse de l'agitateur, dbit de gaz d'oxygnation, composition de ce gaz et pression de couverture
(pression linterface eau/air).
De plus, des facteurs comme la T, le pH, les substances antimousses jouent un rle indirect sur la
solubilit de l'oxygne. Il sagit lorsquelle est mesure de la maintenir un niveau lev pour viter
lasphyxie du fermenteur. Elle nest pas vrifie pour les fermenteurs anarobies.
Le contrle de la [O2] se fait en cascade, compte tenu des paramtres mesurs. Cette boucle de contrle
en cascade est hirarchise:
1. augmentation de la vitesse d'agitation: jusqu'au max tolrable
2. augmentation du dbit d'air:
3. modification de la composition du gaz de couverture: de %O2 dans l'air

Quels problmes peut-on rencontrer pour les points 1 et 2


I.2.5 La rgulation de la temprature

Les bioracteurs peuvent tre quips soit :


d'une double paroi dans laquelle on peut faire circuler de l'eau ou de l'air la temprature
souhaite
d'une couverture chauffante enroule autours du bioracteur + gants de refroidissement
dans le bioracteur avec circulation d'eau froide.

I.2.6 La rgulation de la formation de mousse

La formation de mousse est un problme rcurrent des fermentations, d'autant que certaines fermentations
s'accompagnent d'une forte formation de mousse. Elle se forme lors de l'agitation et de l'aration des

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suspensions. Elle entrane une surpression qui peut occasionner des fuites de milieu l'extrieur du
bioracteur et une obturation des filtres qui se mouillent son contact et se colmatent
Les antimousses : ce sont des substances chimiques qui doivent avoir un pouvoir inhibiteur minimal
ou nul sur le microorganisme en culture (non toxique), tre efficaces en faible quantit, strilisables.
Ils ont une action globale sur la tension superficielle et dstabilisent lmulsion air/eau emprisonne
dans la mousse.
Les principaux produits sont base de silicone, de copolymres d'oxyde de propylne et
d'thylne, d'esters organiques longues chanes, des dtergents, des alcools longue chane
carbone ou encore des huiles naturelles animales ou vgtales.
lger pouvoir inhibiteur, diminuent les capacits de transfert d'O2, empoisonnent les membranes (interfaces d'changes
gaz liquide des sondes, enveloppes des cellules provoquant une perturbation des changes cellulaires), provoquent une
augmentation de la taille des bulles de gaz
ils sont responsables d'une baisse de productivit en gnral.
Les "dmoussants" ou brise-mousse, permettent de dtruire mcaniquement la mousse au fur et
mesure de sa formation: un mobile spcial peut tre install sur l'arbre d'agitation au dessus du
niveau du milieu de culture pour casser la mousse lorsqu'elle a atteint la hauteur maximale
tolrable.
On trouve aussi des appareils s'installant la partie suprieure du bioracteur, composs
d'assiettes coniques qui brisent la mousse par action de la force centrifuge.

Sur quel document dj prsente peut-on voir un brise mousse ?

Document 5 : Schma gnral dun bioracteur agitation mcanique

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I.3 Le transfert d'O2 en fermentation

Quel est le rle principal de lO2 dans le mtabolisme bactrien ?


I.3.1 Dfinitions

Au cours de laration des cultures microbiennes, certains produits du mtabolisme tels que le gaz
carbonique, vont tre limins de la culture grce un phnomne dentranement.
LO2 est souvent le facteur limitant lors des fermentations du fait de sa faible solubilit dans leau :
[O2]max = 10 mg dO2 / L deau P atmosphrique.

Le besoin en O2 des cultures microbiennes est ingalement rparti dans le temps tout au long du
droulement de la fermentation. On le dfinit par QO2 qui exprime la quantit dO2 consomm en volume,
en poids ou en moles, par unit de temps et par unit de biomasse microbienne. Il peut avoisiner par
exemple 30 10-12 mg dO2/Cellule/h.
Le QO2 varie dun microorganisme lautre, et pour un microorganisme donn, en fonction de son ge et de
son tat physiologique.
Le document 6 dcrit lvolution de la
consommation en O2 dans un racteur pendant la
croissance

Sur le document 6 reprer les diffrentes phases de


croissance.

Document 6 : Consommation dO2 et croissance


(Les valeurs prcises en ordonne sont celles
correspondant lnX avec X en g/L)

La demande en O2 : se calcule par :


rO2 .= X . QO2
X est la concentration cellulaire ou masse de bactries en g / unit de volume en fonction de lunit de rO2

Prciser comment volue la consommation en O2 et la demande en O2 pendant les diffrentes phases de la


croissance.

Quel est lintrt de dterminer la demande en O2 ?


Dterminer la productivit volumique globale et maximale en biomasse (g biomasse par litre et par heure) de la
fermentation prsente document 6

Cette demande en O2 de la culture microbienne doit tre satisfaite par le transfert de la phase gazeuse
introduite dans la culture, vers les sites dutilisation dans les cellules.
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I.3.2 Les modalits du transfert dO2

Le transfert de lO2 de la bulle gazeuse vers les


sites de son utilisation dans les cellules, comporte
plusieurs tapes reportes dans le document 7.

Prciser quelles sont ces tapes.

Document 7 : Les tapes du transfert doxygne


(Tsao et Lee, 1977. academic Press N.Y.)
La capacit transfrer de l'O2 dans un milieu de culture en bioracteur dpend d'un grand nombre de
paramtres de fonctionnement, notamment le dbit d'aration, la gomtrie du racteur, la structure du
systme d'agitation (et sa vitesse de rotation), la temprature et la nature du milieu de culture...
La capacit transfrer de l'O2 dans un milieu de culture en bioracteur (en quantit d'O2 de par unit de
volume et par unit de temps) va souvent se comporter en point critique limitant pour un process arobie.

On suppose un bioracteur aliment par un apport de bulles d'un gaz contenant du dioxygne. On suppose que les
2 phases "bulles de gaz" et milieu liquide de culture sont parfaitement homognes l'intrieur du bioracteur. On
suppose que le racteur est suffisamment peu profond pour ngliger les diffrences de pression entre le fond et la
surface !
a) en absence de microorganisme

La vitesse de variation de la concentration en oxygne dissous est gale la quantit doxygne transfre
par unit de temps :
dC/dt = KL.a (C* - CL)
C* : la concentration en oxygne du milieu satur en air
CL : la concentration en oxygne au temps t dans la phase liquide
KL, le coefficient d'change global pour O2 en m.s-1 en milieu liquide
a, aire d'change spcifique ramene l'unit de volume de phase liquide de milieu de culture, en m2 par
m3 de milieu de culture
KL et a ne pouvant pas tre dtermins sparment le coefficient devient kLa
KLa est appel coefficient de transfert volumtrique ramen l'unit de volume de milieu (en temps-1, s-1)
Le KLa permet de chiffrer la capacit qu'on a oxygner un milieu de culture en bioracteur dans des
conditions donnes.

Lintgration de l'quation donne :

C * CL
ln KL a t
C * C0
Avec C0 : la concentration en oxygne dissous au moment de la reprise de l'aration (soit C0=0%).

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Le coefficient KLa est donc l'oppos de la pente de la droite :

C * C L
ln f (t )
C *
En absence de microorganismes, le transfert dO2 sarrte lorsque le milieu est satur : C* = CL

b) En prsence de microorganismes

On peut alors crire les relations fondamentales :


vitesse de transfert de l'O2 dans le racteur (OTR (oxygen transfert rate)) = KLa(C*-CL) (1)
vitesse de consommation du dioxygne par la biomasse (OUR (oxygen uptake rate)) = rO2 = QO2 X (2)

(1) et (2) conduisent la relation fondamentale :


dC/dt = OTR - OUR = KLa(C*-CL) - rO2 (a)
La vitesse de transfert de l'O2 dans le racteur est exprime en quantit d'O2 par unit de volume et par
unit de temps (mol.m-3s-1). Mme dimension videmment pour la vitesse de consommation de l'O 2 par la
biomasse.

Lorsque CL devient infrieure la concentration critique, la croissance microbienne est ralentie et la


demande infrieure ce quelle devrait tre. CL doit donc rester au moins gale la concentration critique
de la culture pour que la croissance seffectue dans les meilleures conditions.

I.3.3 Mesure du KL.a

La mesure du KL.a dun bioracteur permet dvaluer ses capacits transfrer lO2. Les sondes oxygne
permettent denregistrer en continu, la concentration en O2 dissous.
Chaque sonde possde un temps de rponse propre quil est ncessaire de dterminer avant deffectuer la
mesure du KLa. En effet si le temps de rponse de la sonde est plus long que le transfert dO 2 dans le
racteur, les cintiques dtermines nauront aucun sens. Le temps de rponse de la sonde est dtermin
en la transfrant dun milieu dpourvu dO2 dissous, dans un milieu satur. Si la vitesse de raction de la
sonde devient le facteur limitant, elle ne peut pas tre utilise pour la dtermination de KL.a levs.

Document 8 : Evolution de CL au cours de la Document 9 : Evolution de CL au cours de la dtermination


dtermination du KLa statique du KLa dynamique

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a) mthode statique (Corrieu 1975): milieu strile

Cette mthode est conduite dans le milieu de culture en absence de cellules. Elle permet de dterminer la
valeur du KL.a dans les conditions o se droulera la fermentation (document 8).

Dcrire lexprience mene document 8.

Comment varie CL en fonction de la capacit de transfert de la cuve ?

Quel graphique doit-on tracer pour dterminer le KL a statique ? Avec quelles valeurs sur la courbe du
document 8?

Exercice:
Voici les rsultats d'une manipulation conduite par des tudiants de BTS biotechnologies. Avec un fermenteur de
laboratoire contenant 1L de milieu de culture LB 35C. La vitesse de rotation de la turbine rushton est de 200
rpm, le dbit d'aration est de 1 VVM (60 L/h, 0,3 bar). Le temps de rponse de la sonde ampromtrique
dioxygne utilise a t mesur : pour un passage de 0 100%, on obtient 98 % en moins de 20 s. On verra ainsi
par la suite que ce temps est suffisamment faible pour valider les mesures pendant la phase de reprise d'aration.
Voici les rsultats obtenus :

temps 0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 195 210 240 270 300 330 360
s
[O2] 0 7,5 19,4 30,9 40,4 50,0 56,5 62,2 67,4 71 74,7 77,5 81 82,1 84 86,8 88,8 90,4 91,5 92,3
C en %
Ln(C*- 0
C/C*)
On considre que C* = 100%

Dterminer le Kla dans les conditions ci-dessus

b) mthode dynamique (Taguchi et Humphrey 1966):

Cette mthode permet de dterminer le KL.a pendant le droulement de la fermentation. La dure totale de
l'exprience doit tre suffisamment brve pour que l'accroissement de biomasse soit nul (ngligeable)
pendant le temps de l'exprience. Ainsi "l'quilibre dynamique" est le mme en fin et dbut d'exprience
(comme indiqu sur le document 9).

A quel moment de la croissance cela est-il plus facile raliser ?


Dcrire lexprience mene document 9.

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L'quation de roxygnation du milieu est, on l'a vu :

dC/dt = KLa(C*-CL) - rO2 (a)

C'est une quation diffrentielle C(t) trs simple rsoudre. Et c'est ce qu'on va faire, mais il serait bien de
connaitre rO2 et de l'injecter dans l'quation diffrentielle avant de la rsoudre. Et c'est l o a peut paratre
surprenant, mais on ne va pas utiliser la phase d'arrt d'aration pour connatre r O2 mais les 2 phases
brves initiales d' "quilibre dynamique".

Comme on l'a dit prcdemment, on suppose que la croissance microbienne est nulle pendant la dure
(brve) de la manipulation. Les tats initiaux et finaux sur le graphique correspondent un tat dynamique
stationnaire du bioracteur pour lequel
[O2]milieu culture constante = CLeq.
On peut donc crire
dC/dt = 0 = KLa(C* - CLeq) - rO2
soit
rO2 = KLa(C* - CLeq)
On peut alors reprendre l'quation diffrentielle de la phase de reprise d'aration (a) et y rinjecter la valeur
de rO2
On obtient :
dC/dt = KLa(C* - CL) - KLa(C* - CLeq)
En factorisant KLa, on peut crire :
dC/dt = KLa[(C*-CL) - (C* - CLeq)]
Qui donne :
dC/dt = KLa(CLeq - CL)
On se retrouve ainsi confront une quation diffrentielle trs simple qui s'intgre facilement en :

C CL
ln Leq KL a t
CLeq C0
Avec C0 = concentration en dioxygne dissous l'instant t=0 en dbut de la phase de reprise d'aration. Ici
C0 0% car sinon il y aurait mort cellulaire.

Une droite qui passe par l'origine et dont la pente est ngative avec KLa pour valeur !!

Note : Les capteurs O2 fournissent des donnes exprimes en %d'O2 directement exploitables. Il est
videmment inutile de chercher des expressions d'O2 en mmol/L ...

Exercice:
Voici les rsultats d'une manipulation conduite par des tudiants de BTS biotechnologies. Un fermenteur de
laboratoire contenant 1L de milieu de culture LB 37C est ensemenc avec une souche E. Coli de 18 heures sur
milieu LB. La vitesse de rotation de la turbine rushton est de 200 rpm, le dbit d'aration est de 1 VVM (60 L/h, 0,3
bar). Les mesures ont t conduites environ 40 minutes aprs l'inoculation. Le temps de rponse de la sonde

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ampromtrique dioxygne utilise a t mesur : pour un passage de 0 100%, on obtient 98 % en moins de 20


s. On verra ainsi par la suite que ce temps est suffisamment faible pour valider les mesures pendant la phase de
reprise d'aration.
Voici les rsultats obtenus :
temps 0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 195 210 225 240 255 270 285 300 330
s

[O2] 40,5 40,6 40,4 36,5 30,9 23 15,4 7,5 11,9 16,5 19,6 24,4 26,3 29,5 32,5 34,4 35,6 36,9 37,7 39,3 40,5 40,4
C en
%
Etat
dynamique L'aration est arrte On
L'aration a t reprise et permettra de calculer KLa
de la attend C=f(t) droite affine
culture

Dterminer le Kla et rO2 dans les conditions ci-dessus.


I.4 Strilisation et oprations aseptiques

Les cultures microbiennes requirent diffrents niveaux d'asepsie:


- les cultures en milieux riches et un pH voisin de la neutralit ncessitent une strilisation pralable et un
maintien stricte de l'asepsie pour les protger des contaminations
- les productions de certains mtabolites (vaccins, toxines) impliquent la production de microorganismes
pathognes. Il faut viter les contaminations mais aussi la propagation du microorganisme l'extrieur du
bioracteur (protection du personnel et de l'environnement) installations rduites dpassant rarement
3000 L.
- les cultures en vue de fermentations actiques et alcooliques ne sont pas ncessairement aseptiques: le
milieu de culture, de part sa composition, est trs dfavorable au dveloppement de microorganismes
contaminants (lors de la fermentation alcoolique, le dveloppement de bactries lactiques ou de certaines
espces de Clostridium est cependant possible).
La prsence de contaminants peut donc tre tolre si:
Il est inoffensif
Il n'affecte par les qualits organoleptiques du produit (got, odeur)
Il n'affecte pas trop le rendement de production

La mise en place d'installations de strilisation ayant un cot important, elles ne sont prvues que lorsque
les pertes occasionnes par la baisse de rendement deviennent suprieures au cot d'amortissement de
l'installation de strilisation.

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I.4.1 Strilisation par la chaleur humide = vapeur d'eau

On utilise un autoclave pour les bioracteurs de laboratoire, les milieux


La circulation de vapeur d'eau est pratique dans les installations industrielles: le bioracteur est strilis in
situ (injection de vapeur) en prsence ou non du milieu de culture

a) autoclave de laboratoire:

Le principe de fonctionnement dun autoclave classique fait l'objet d'un autre chapitre.
Rgles d'utilisation:
lors de la strilisation, la cuve de l'autoclave et les rcipients doivent tre vides d'air (l'air est vacu
en laissant ouvertes les soupapes de scurit et de vidange en dbut de chauffage)
le temps ncessaire pour atteindre la temprature voulue est aussi fonction de la composition des
milieux: ne pas mlanger des milieux de viscosit trs diffrente (bouillon et glose)
les rcipients ne doivent pas tre ferms hermtiquement (pntration de la vapeur d'eau, sortie de
l'air chaud)
ne pas ouvrir l'autoclave encore en surpression (entre d'air contenant des germes dans l'autoclave
et dans les rcipients). A la sortie de l'autoclave, fermer soigneusement les rcipients.
Effectuer un contrle de strilisation: ruban d'autoclave, tube de Browne, bioindicateurs (spores de
Bacillus stearothermophilus imprgnes sur papier filtre ou en ampoule)

b) Strilisation du milieu de culture

b.1) Strilisation in situ


La strilisation peut avoir lieu dans le bioracteur avant le dbut de la fermentation. C'est l'changeur de
chaleur prvu pour rguler la temprature en cours de fermentation qui est utilis pour le chauffage.
L'agitation permet d'amliorer l'allure du transfert de chaleur. Le milieu est chauff et maintenu la
temprature de strilisation, puis refroidi.
On peut galement pour les petits bioracteurs les striliser avec le milieu dans un autoclave.
traitement thermique long immobilisation du bioracteur. La strilisation peut tre effectue dans une cuve part.
Le transfert dans le bioracteur strile devra alors tre asetique.
certains composs des milieux de culture supportent mal un tel traitement thermique:
- dnaturation des protines
- caramlisation des sucres (raction de Maillard)
- inactivation des vitamines (surtout thiamine, riboflavine)
- destruction des acides amins (surtout Trp, Asn et Gln)
- polymrisation des aldhydes non saturs
- variation du pH de dpart aprs strilisation
- dcomposition des sels d'ammonium pH basique et volatilisation
- prcipitation des sels (Mg, K, NH4+, PO42-)

b.2) Strilisation en continu


Les qualits du milieu pouvant tre altres lors de la strilisation en autoclave, il est parfois prfrable de
traiter brivement les milieux des tempratures leves. Les techniques de strilisation en continu
permettent d'atteindre trs rapidement une temprature leve et assurent un refroidissement rapide.
meilleure qualit du milieu
Gnie fermentaire Lyce J.Monod 26/08/2015 14
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facilit pour traiter de gros volumes


contrle automatique
dure brve
utilisation plus efficace de la vapeur et moindre cot
utilisation facile avec des milieux contenant des particules en suspension
formation possible de mousse
ncessit d'une vapeur sans additif corrosif
investissement au dbut de l'installation

c) Strilisation des priphriques (circuits de distribution d'air, d'vacuation des gaz)

c.1) utilisation de la vapeur produite par la strilisation du milieu de culture


Lorsque la strilisation du milieu de culture a lieu dans le bioracteur, on peut utiliser la vapeur produite
pour la strilisation des priphriques.
inapplicables aux grandes installations car il est souvent souhaitable de pouvoir isoler un circuit pour:
- maintenir l'asepsie en cas de panne sur un circuit
- pouvoir striliser un circuit en cours de fermentation si le besoin s'en fait sentir

c.2) strilisation des priphriques et du bioracteur indpendamment par un jeu de vannes


Le circuit de vapeur peut tre interrompu grce un jeu de vannes permettant de striliser une partie de
l'installation de faon indpendante.

I.4.2 Strilisation de l'air

a) Filtration strilisante de l'air entrant dans le bioracteur

L'air comprim est susceptible de renfermer des


particules (micro-goutelettes d'huile et d'eau,
microorganismes). Leur limination se fait en
plaant des filtres sur les tuyaux darrive dair. Les
filtres utiliss sont trs divers, on distingue
Document 10 : Deux types de filtres. notamment (document 10) :
A = de profondeur
B= membranaire

les filtres en profondeurs qui sont assez poreux mais dont la capacit de rtention des particules est
augmente par leur paisseur et par des phnomnes dabsorption.
les filtres membranaires qui sont trs peu poreux (0,2 m) et trs fins.

b) Strilisation des gaz sortant du bioracteur

Les microorganismes contaminants ne doivent pas pntrer par la canalisation de sortie des gaz. On
maintient donc une surpression lintrieur du racteur et on strilise la canalisation de sortie des gaz. Il
est peu adapt dutiliser des filtres qui se mouillent et se colmatent facilement.
Le document 11 prsente un bioracteur avec les systmes de maintient de laseptie.

Quel type de cellules sont cultives dans ce bioracteur ?


En quelle matire est la cuve ?
Tracer en la flchant la circulation de l'air
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Prciser le rle de llment 8. Comment traduire ce terme ?


Combien de filtre sont utiliss pour lentre dair et la sortie dair ?
Prciser le rle de llment 11.
Prciser le rle de llment 17.

Quel volume dair doit-on au minimum introduire par minute pour un racteur de 5L rempli au .
Quelle est la composition des tubes vhiculant les gaz ou les liquides, quelles sont leurs proprits ?

Document 11 : Exemple de bioracteur et son systme de maintient de laseptie


The reactor vessel (1) is a presterilized, disposable plastic film, generally V shaped, airlift bubble reactor. It contains
an inplace, disposable sparger (4) to produce gas bubbles. The reactor is charged with medium and plant material
through a large inoculation port (2) located near the top of the vessel. A multiple use threaded cap (3), containing
either 2 or 4 ports, closes and seals the filling port.
Air is sparged from the disposable sparger (4), which is held in place by a sparger clamp (5) and is connected to an air
inlet port (6) in the wall of the vessel. Air is typically supplied to the LifeReactor at 0.8-1.5 vvm (air volume / medium
volume/ min.). All connections through which gas or liquid flow to ports, filters or traps are made with flexible, 6mm
inner diameter, autoclavable tubing, for example, silicone tubing.
The compressed air source (7) is connected to a carbon filter (8) to remove any airborne phytotoxic compounds. The
outlet of the carbon filter is connected to two 0.2m sterilizing filters (9 & 10), which are connected in series as a safety
precaution.
The outlet of the second sterilizing filter (10) is connected through a one way check valve (11) to a humidifier vessel
(12). The humidifier reduces evaporation of medium from the reactor, and the check valve prevents back flow from the
humidifier to the filters if the air supply is interrupted.
Overpressure in the LifeReactor (1) is exhausted through the air outlet (16), which is one of the ports located in the
threaded cap (3). The air outlet (16) is connected to a drying unit (17), which is in turn connected to two 0.2m
sterilizing filters (18 & 19). These are again connected in series to prevent contaminated air from entering the reactor
vessel in the event that the air supply to the sparger is interrupted. The drying unit (17) removes excess moisture from
the air exhausted from the reactor vessel to prevent water droplets from reaching the filters (18 & 19).
The two port model, cap (3) also contains an access port for medium addition (20). The four port model cap contains
an additional two ports for whatever special purpose is required (sampling medium, special adds, etc.), which are
supplied connected by a silicone tube to maintain a sealed condition. This tube may be opened and used to access
the reactor.

I.4.3 Maintien de l'asepsie

a) lors de l'inoculation:

Expliquer comment vous procderiez pour ensemencer un bioracteur de faon strile

Gnie fermentaire Lyce J.Monod 26/08/2015 16


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b) lors de la prise d'chantillons:

Le document 12 prsente un exemple de module permettant le soutirage dun


chantillon du contenu du fermenteur. Lanalyse de cet chantillon permettra de
suivre certains paramtres de culture comme la concentration en nutriment, la
densit bactrienne ou la concentration en mtabolite dintrt produit par la
culture.

Prciser droite du document les diffrents lments composant ce module

Document 14 : Module de
prlvement dun
cytoculteur
c) aux autres points de communication du bioracteur avec l'extrieur:

vanne de vidange (facultative, en bas de cuve)


pntration des arbres tournants (agitateur, brise-mousse mcanique) dans la cuve: installer des
garnitures mcaniques avec barrire de vapeur
circuits de transfert d'une cuve dans une autre: viter les profils compliqus, les points bas (sinon
les munir de purge), vrifier que les raccords et les vannes ne provoquent pas de rduction de
diamtre (prolifrations microbiennes difficiles liminer), prfrer les soudures de qualit, prvoir
des joints toriques rsistants aux T de strilisation sur les accessoires dmontables

Quappelle-t-on barrire de vapeur.


II. CONDUITE D'UNE FERMENTATION EN BIOREACTEUR

Ltude de la cintique de la croissance et de la synthse de mtabolites constitue ltape indispensable


pour le contrle et loptimisation du procd de fermentation. Les critres retenus seront alors des critres
de :
production,
productivit
cot

Dfinir production et productivit. Prsenter linterconnexion entre les 3 termes.

II.1 Caractristiques communes aux diffrents systmes

II.1.1 Quantification de la biomasse microbienne

Cf Chapitre la croissance

Gnie fermentaire Lyce J.Monod 26/08/2015 17


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II.2 Fermentation discontinue (batch)

II.2.1 Dfinition

On remplit le bioracteur de milieu de culture favorable la croissance et on le strilise (ou on strilise le


bioracteur et le milieu que lon introduit strilement aprs), puis on introduit linoculum et on laisse se
drouler la fermentation dans des conditions environnementales favorables aux microorganismes.
Un mme volume de milieu sert raliser les phases de croissance, de production et daccumulation du
produit.
Normalement il ny a aucune addition dlments du milieu et la culture se dveloppe jusqu ce quil y ait
carence dun nutriment essentiel ou jusqu ce quune modification environnementale importante (variation
de pH, accumulation dun produit toxique) bloque la croissance. Tout le milieu est ensuite retir du
bioracteur et trait. Le volume dans la cuve est donc constant.
Il sagit dun systme clos.

II.2.2 Les diffrentes phases de la croissance en milieu clos, non renouvel et la production des
mtabolites

Phases de croissance : cf cours la croissance


Les produits du mtabolisme cellulaire peuvent tre diviss en 3 groupes (document 13) :
produits associs la croissance = mtabolites primaires
produits partiellement associs la croissance = mtabolites intermdiaires
produits non associs la croissance = mtabolites secondaires

associ partiellement Non associ


Document 13 : Les diffrents types de mtabolites
II.2.3 Mise en oeuvre

Le volume de prculture est gal Vbioracteur/20 (ou /10) soit 5% (10%).


Linoculum est introduit dans le bioracteur grce une pompe pristaltique et les tuyaux sont rincs
par du milieu strile (= pousse culture).

II.2.4 Remarques

On peut ventuellement ajouter un ractif de neutralisation du pH en faible quantit, ou encore un produit


antimousse.
On effectue une fermentation discontinue dans le cas de faibles volumes.
En pratique, la productivit est assez faible. Pour augmenter la productivit, il faut ensemencer le
bioracteur avec un inoculum important afin de rduire la phase de latence et de dmarrage.

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II.2.5 Les paramtres de la fermentation

a) Paramtres dtat

Ce sont les paramtres relatifs aux proprits gntiques, biochimiques et physiologique du


microorganisme, dont on doit tenir compte et sur lesquels on ne peut pas agir (sauf en changeant de
souche).
a.1) Paramtres de croissance

Rappeler quels sont les paramtres de croissance dune souche et comment on les dtermine.

a.2) Paramtres de production


vitesse volumique de consommation de S :
-d[S]/dt en g/L/h

Dfinition :
vitesse volumique de formation de P :
d[P]/dt en g/L/h

Dfinition :

vitesse spcifique de consommation de S :


QS = -1/[X]. d[S]/dt en h-1

Dfinition :

vitesse spcifique de formation de P :


QP = 1/[X]. d[P]/dt en h-1

Dfinition :

rendement (taux) de conversion (Y = yield factor) des substrats en biomasse :


YX/S = -d[X]/d[S],

Dfinition :

rendement de conversion des substrats en produit :


YP/S = -d[P]/d[S],

Dfinition :

productivit volumique horaire globale :


Pg = ([P]f-[P]0)/(tf-t0) en g/L/h

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Dfinition :

productivit horaire globale :


Ph = Pg x V en g/h

Dfinition :

productivit volumique horaire maximale :


Pm = ([P]max-[P]0)/(tmin pour [P] max-t0)

Dfinition :

Comment peut-on dterminer graphiquement les productivits volumiques horaires globale et maximale ? Prciser
le type de graphe utilis.

productivit relle
Elle tient compte du temps ncessaire pour obtenir la concentration maximale en produit, auquel sajoute le
temps ncessaire pour prparer le bioracteur (vidange, nettoyage, remplissage et strilisation).

b) Influence des facteurs extrieurs sur la croissance microbienne = variables daction

Ce sont les paramtres qui influencent les cintiques et qui font varier les paramtres dtat de ces
cintiques. Ce sont des paramtres matrisables sur lesquels on peut agir pour amliorer le rsultat.

b.1) Concentration des composs ncessaires la croissance :


Au cours de la phase exponentielle de croissance, le taux de croissance est maximal et indpendant de la
concentration en S, si et seulement si [S] >= [S]seuil.
Remarque : une augmentation importante de la concentration en sucre ou en NaCl peut provoquer une
diminution du taux de croissance, voire bloquer la croissance de la plupart des microorganismes. Cest ce
principe qui est utilis pour la conservation des fruits (confiture) et de la viande (salaison).

Comment expliquer ce phnomne ?

b.2) Nature de la source de C prsente dans le milieu de culture :


Influence de la source de C sur la productivit :
La source de carbone (glucide facilement ou lentement assimilable) permettant une croissance optimale ne
permettra pas forcement une production optimale du mtabolite souhait.
Le choix de la source de carbone est empirique. Elle ncessite de tester plusieurs substrats diffrents et de
dterminer pour chacun le rendement en biomasse et en mtabolites produits.

Gnie fermentaire Lyce J.Monod 26/08/2015 20


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A partir du document 14, dterminer la source de C permettant dobtenir la biomasse la plus importante, la
quantit de lactamine la plus importante et/ou la meilleure productivit.

Document 14 : Source de carbone croissance, production et productivit


Quest ce quune -lactamine ?
Phnomne de diauxie :
Cf cours la croissance

b.3) Temprature :
b.4) pH :
b.5) pO2 :

II.3 Fermentation discontinue alimente (fed batch)

II.3.1 Dfinition

Ces techniques obissent aux mmes lois que le batch, mais au cours de la fermentation, certains
composants du milieu ou certains prcurseurs sont additionns de faon contrle.
Ces procds sont pratiquement les seuls tre utiliss lchelle industrielle pour la production de
mtabolites par les microorganismes.
La fermentation commence dans un petit volume de milieu de culture : le pied de cuve. Si on utilise le
mme volume dinoculum, la fermentation dmarre plus vite.

Quelle est la dilution de linoculum dans ce cas ? Commenter

Cette phase de dmarrage correspond la fermentation discontinue voque prcdemment. Lorsque les
microorganismes sont en phase exponentielle de croissance, on introduit le milieu de culture strile dans la
cuve. Le dbit dalimentation est rgl de faon ce que la concentration en substrat soit constante.
Dans ces conditions, le volume de milieu en fermentation dans la cuve augmente.

Reprsenter trs schmatiquement une installation de ce type cot du document 15.


Sur le document 15 prciser les conditions qui amnent aux rsultats obtenus dans les cas 1-3 et dans le cas de
la courbe en pointill.
Dans le cas dune croissance en fed-batch, quand sarrte la manipulation?

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Document 15 : Culture en batch aliment discontinu


1:
2:
3:
Trait pointill :

I.3.2 Intrt dune culture en batch aliment

Gain de temps et donc amlioration de la productivit de la cuve.


La composition du milieu dalimentation peut tre modifie au cours de la fermentation.
la concentration en substrat peut tre augmente progressivement. Donc pour un mme
volume de cuve, la quantit de substrat apporte au final est beaucoup plus importante. Il en
rsulte une augmentation de la concentration cellulaire, dans des proportions inaccessibles
en batch. En effet, les concentrations initiales en substrats correspondantes seraient telles,
quelles seraient inhibitrices pour la croissance cellulaire.
la modification de la composition du milieu de culture permet dorienter le mtabolisme de la
souche, et aprs avoir favoris la croissance, de stimuler la production de mtabolites.

II.4 Fermentation continue

II.4.1 Dfinition

Une croissance continue et constante est assure par une addition rgulire de nutriments et par
une limination parallle dune partie des cellules, des dchets et des produits forms. La culture continue
est un systme ouvert dans lequel la culture est maintenue constamment dans un tat de croissance
quilibr. En maintenant le rgime daddition du substrat limitatif constant, la culture peut tre maintenue
dans un tat dfini thoriquement de faon illimite.
Il existe 2 types principaux de culture continue : le chmostat et le turbidostat.

II.4.2 Mode de fonctionnement (rappels cours croissance)

Pour que la culture soit maintenue indfiniment en phase exponentielle, lalimentation et le


soutirage de milieu en continu doivent tre fait aux mmes dbits, quand une certaine concentration
cellulaire est atteinte dans la cuve.
Il faut donc commencer par ensemencer la cuve renfermant un volume V de milieu qui restera
constant. La premire tape consiste donc en une croissance discontinue pralable la croissance
continue.

Gnie fermentaire Lyce J.Monod 26/08/2015 22


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Lintroduction en continu de milieu de culture strile induit une dilution au sein du bioracteur. Le taux de
dilution (D) doit tre suffisant pour assurer le renouvellement du milieu de culture et apporter suffisamment
de substrat.

Dfinir le taux de dilution.


Prciser les consquences sur la culture quand D=max, D>max, D<max.

II.4.3 Les 2 principaux types de culture continue

a) chmostat

Faire un schma lgend dun chmostat ci dessous (doc 16).


Par quel paramtre contrle-t-on la vitesse spcifique de croissance dans la cuve ? La densit cellulaire ?
b) turbidostat

Rappeler le principe dun turbidostat, annoter le schma du document 17 (remplir les cases vides)
Pompe
pristaltique

~e
r

Pompe
pristaltique

Document 17: Schma dun chemostat Document 17: Schma dun turbidostat

II.4.4 Avantages et inconvnients des cultures en continu

a) avantages :

la vitesse de croissance peut tre contrle et indfiniment maintenue la valeur souhaite


leffet de la variation des paramtres chimiques, physiques ou biologiques sur la croissance et la
biosynthse dun mtabolite peut tre examin une vitesse de croissance constante,
la production de mtabolites secondaires peut souvent tre maintenue simultanment la
croissance, et linfluence de la vitesse de croissance sur la productivit peut tre dtermine
les rsultats sont souvent plus reproductibles quen cultures discontinues

Gnie fermentaire Lyce J.Monod 26/08/2015 23


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le systme est plus conomique (pas de temps morts) et les productivits peuvent tre maintenues
des taux maximum
on peut faire varier facilement les paramtres physico-chimiques et ainsi optimiser le systme

b) inconvnients :

la production de certains mtabolites secondaires ne peut pas toujours tre obtenue


lagrgation des cellules ou la croissance le long des parois du bioracteur peut empcher une
croissance quilibre relle, et mme provoquer une limination des cellules du systme ( wash-
out )
une culture continue pendant une longue priode peut entraner la perte de la souche initiale en
slectionnant une souche croissance plus rapide
une culture continue pendant une longue priode peut poser des problmes de contamination
la croissance des organismes filamenteux est souvent difficile (viscosit, nature htrogne des
cultures), empchant datteindre un stade de croissance quilibre

II.4.5 Chmostats en srie

Ce systme permet une plus grande flexibilit puisque le premier chmostat sert inoculer en continu le
second. Cela permet doprer dans le 2 chmostat un taux de dilution diffrent. On peut galement
utiliser 2 milieux de culture diffrents : un pour la croissance et un pour la production de mtabolites.

Rfrentiel :
Section 8 : Microbiologie industrielle et gnie fermentaire
INTITULE DU
PROGRAMME
Cintiques microbiennes. Culture en milieu non renouvel : cintique de croissance, dutilisation des
substrats, de formation des produits- Calculs des rendements, des
productivits - Energtique de la croissance. Culture en milieu renouvel :
cintiques, taux de dilution, bilan biomasse, bilan substrat, bilan produit.
Culture en milieu aliment : cintiques Conduite et contrle dalimentation.
Transferts de matire. Diffusion, convection, interfaces. On appliquera ces notions ltude du
transfert de dioxygne dans le milieu de culture en bioracteur.
On dfinira les notions de milieux newtoniens, peu visqueux, et de milieux
non-newtoniens, forte viscosit
Ingnierie des bioracteurs Diffrents types de bioracteurs. Agitation. Aration. Strilisations.
de laboratoire.
Rgulation des paramtres Les diffrents paramtres de la culture et leurs capteurs (temprature, pH,
de culture. pO2, pCO2, prsence de mousses, )
Suivi de fermentations. Analyses en ligne et hors ligne.

Si je sais mon cours sur la fermentation, je sais :


prrequis : le cours sur la croissance.
1- Prciser les caractristiques fondamentales d'une cuve de bioracteur
2- Le volume maximal de remplissage d'une cuve de bioracteur
3- Prciser les caractristiques fondamentales du systme d'aration d'une cuve de bioracteur
4- Les diffrents types de systme d'aration d'une cuve de bioracteur
5- Prciser les lments constituant un systme d'agitation mcanique classique de bioracteur.

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6- Reprsenter les flux liquides obtenu en utilisant une turbine rushton et une hlice marine. Expliquer
l'importance du choix de la turbine d'agitation.
7- Dfinir "capteur in situ"
8- Citer les paramtres qui se mesurent toujours in situ dans un bioracteur.
9- Dessiner et annoter correctement et compltement un bioracteur
pour cela je procde avec mthode tape par tape : cuve, systme de remplissage et de soutirage
du milieu, systme d'agitation, systme d'aration puis pour chaque paramtre rgul :
une sonde, des lments permettant la rgulation (TC : chauffage/refroidissement; pH : acide/base,
pO2 : dbitmtre, moteur, ...)
10- Dfinir boucle de rgulation, expliquer le principe et faire un schma
11- Employer les termes appropris : actionneur, vanne, pompe,...
12- Dfinir pO2 et savoir quels actionneurs sont important pour son contrle.
13- Dfinir "antimousse" et "dmoussant"
14- Reprsenter et reprer un brise mousse sur une installation
15- Dcrire l'volution des besoins en O2 au cours de la croissance
16- Refaire le document prsentant les tapes du transfert d'O2.
17- Dfinir KLa et prciser la signification de son augmentation ou de sa diminution.
18- Prciser les 2 conditions de mesure du KLa et comment on procde pratiquement cette mesure
19- Dterminer graphiquement Kla, et la droite qu'il faut tracer pour cette dtermination
20- Dfinir strilisation in situ et ex situ
21- Comment les entres et sorties d'air peuvent tre maintenues striles.
22- Dfinir "fermentation discontinue" ou "fermentation en batch".
23- Calculer les paramtres d'une fermentation
24- Analyser des courbes de croissance dans diffrentes conditions et en dduire les conditions
optimales de culture.
25- Dfinir "fermentation discontinue alimente" ou "fed batch"
26- Dfinir "fermentation continue"
27- Dfinir taux de dilution
28- Quelles sont les consquences de la variation de D en fonction de expo
29- Donner le principe de fonctionnement d'un chemostat et d'un turbidostat
30- Quels sont les avantages et inconvnients d'une culture en continue.

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GENIE FERMENTAIRE
I. INGENIERIE DE LA FERMENTATION OU MICROBIOLOGICAL INGEENIRING
I.1 Les diffrents lments d'un bioracteur
I.1.1 La cuve
I.1.2 Le systme d'aration
I.1.3 Le systme d'agitation
a) agitation par air:
b) agitation mcanique:
I.1.4 Les systmes de mesure des variables physico-chimiques
a) les capteurs de mesures physiques
b) les capteurs de mesures physico-chimiques
I.2 Les systmes de rgulation
I.2.1 Principe de la boucle de rgulation
I.2.2 Les diffrents types d'actionneurs
I.2.3 La rgulation du pH
I.2.4 La rgulation de la [O2]
I.2.5 La rgulation de la temprature
I.2.6 La rgulation de la formation de mousse
I.3 Le transfert d'O2 en fermentation
I.3.1 Dfinitions
I.3.2 Les modalits du transfert dO2
a) en absence de microorganisme
b) En prsence de microorganismes
I.3.3 Mesure du KL.a
a) mthode statique (Corrieu 1975): milieu strile
b) mthode dynamique (Taguchi et Humphrey 1966):
I.4 Strilisation et oprations aseptiques
I.4.1 Strilisation par la chaleur humide = vapeur d'eau
a) autoclave de laboratoire:
b) Strilisation du milieu de culture
c) Strilisation des priphriques (circuits de distribution d'air, d'vacuation des gaz)
I.4.2 Strilisation de l'air
a) Filtration strilisante de l'air entrant dans le bioracteur
b) Strilisation des gaz sortant du bioracteur
I.4.3 Maintien de l'asepsie
a) lors de l'inoculation:
b) lors de la prise d'chantillons:
c) aux autres points de communication du bioracteur avec l'extrieur:
II. CONDUITE D'UNE FERMENTATION EN BIOREACTEUR
II.1 Caractristiques communes aux diffrents systmes
II.1.1 Quantification de la biomasse microbienne
II.2 Fermentation discontinue (batch)
II.2.1 Dfinition
II.2.2 Les diffrentes phases de la croissance en milieu clos, non renouvel et la production des
mtabolites
II.2.3 Mise en oeuvre
II.2.4 Remarques
II.2.5 Les paramtres de la fermentation
a) Paramtres dtat
Gnie fermentaire Lyce J.Monod 26/08/2015 26
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b) Influence des facteurs extrieurs sur la croissance microbienne = variables daction


II.3 Fermentation discontinue alimente (fed batch)
II.3.1 Dfinition
I.3.2 Intrt dune culture en batch aliment
II.4 Fermentation continue
II.4.1 Dfinition
II.4.2 Mode de fonctionnement (rappels cours croissance)
II.4.3 Les 2 principaux types de culture continue
a) chmostat
b) turbidostat
II.4.4 Avantages et inconvnients des cultures en continu
a) avantages :
b) inconvnients :
II.4.5 Chmostats en srie

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