Mtodos de Separacin

Por HPLC
Clasificacin en HPLC, segn el Modo de Interaccin

HPLC

Cromatografa Cromatografa Lquido-Lquido

Lquido- Slido Cromatografa de Reparto Fase
Enlazada (BPC)

Cromatografa de
Adsorcin (LSC)

Cromatografa
Inica (IC) Cromatografa Cromatografa
Fase Normal Fase Inversa
(NPC) (RPC)
Cromatografa de
Exclusin (SEC)

Cromatografa
Cromatografa de
Par-Inico
Afinidad
(IPC)

Cromatografa
Quiral
Cromatograf de Lquido Slido (LSC)
Cromatografa de Adsorcin

KC = Constante de Adsorcin
 Cromatograf de Lquido Slido (LSC)
Cromatografa de Adsorcin
En Cromatografa de Lquidos, cuando la fase estacionaria es
un slido y las interacciones del analito son del tipo polar y/o
puentes de hidrgeno, el termino utilizado para describir el
equilibrio que establece el analito entre ambas fases, es
denominado Cromatografa de Adsorcin.

Es la modalidad de Cromatografa ms antigua.

Sus orgenes se remontan a los trabajos del botnico Tswett

en 1903 y publicados en 1906.

Se aplica fundamentalmente a compuestos orgnicos

relativamente no polares e insolubles en agua.
 Cromatograf de Lquido Slido (LSC)
Cromatografa de Adsorcin
El mecanismo principal en este modo de cromatografa es la adsorcin y
desorcin por la interaccin de los hidrgenos libres o enlazados
(grupos hidrxilos de gel) con los grupos polares de las molculas del
soluto y las del eluente.
R
H R

O
O
H H H
O
O O
O O
O O H
Si Si Si Si

Puente de hidrgeno
Dipolo-Dipolo
 Cromatografa de Lquido Slido (LSC)
Cromatografa de Adsorcin

Los gel de slice y la almina constituyen las fases ms utilizadas en CLS.

La slice es ms utilizada debido a su mayor capacidad de carga y su

mayor diversidad de presentaciones.

Adsorbentes Empleados

Slica Gel 94% (pH 2-8)

Almina 3% (pH 2-14)
Carbn 1%
Florisil 2%
 Solubilidad de la Slica Gel en Agua

Importante: 200

Solubilidad (ppm)
Los enlaces Si-O se
hidrolizan en medio
bsico, de hecho la 100

slice se disuelve
lentamente en fase
mviles con valores
pH
elevados de PH. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 12
 Cromatografa de Lquido Slido (LSC)
Cromatografa de Adsorcin

En LSC, la nica variable que se puede utilizar para

optimizar k y es la composicin de fase mvil.

Inicialmente se puede seleccionar un eluente de

polaridad relativamente parecida al promedio de los
componentes de la muestra.

Si los valores de k son muy pequeos (los componentes

de la muestra eluyen muy rpidamente), se cambia el
eluente por uno de menor fuerza eulotrpica (menos
polar)
 Eluentes Utilizados en CLS

En la tabla se muestran los eluentes ms comunes en CLS

en orden creciente de fuerza disolvente 0.

Solvente 0 ndice Polaridad

N-Hexano 0.01 0.1
Diclorometano 0.32 3.4
THF 0.57 4.0
Metanol 0.88 6.6
Acetonitrilo 0.65 6.2
Agua grande 10.0
 Aplicacin LSC

En la Cromatografa de adsorcin tiene poca influencia la diferencia

en el peso molecular, al contrario se ve ms influenciada los grupos
funcionales.

Ideal para separar miembros de una clase particular de compuestos.

Ej: para aislar aromticos polinucleares de una muestra de petrleo,
triglicridos de un extracto lpido, etc.

La separacin por adsorcin de compuestos que difieren solamente en

el grado o tipo de sustitucin alquilo, como los miembros de series
homlogas, es pobre.

Aplicable fundamentalmente a muestras solubles en solvente no

polares o moderadamente polares, es capaz de separar mezclas de
compuestos ismeros posicinales (p>m>o).
Cromatografa de Intercambio Inico (IEC)

+ + + -
+ +-
++ +
+ -
+ -
+ -
+ -
+ -

+ -
+ -
+ -
+ - +
+ + -
+ +-
++ +
+ -

KC = Constante de Distribucin Inica

 Cromatografa de Intercambio Inico (IEC)
Es un tipo de Cromatografa de Lquidos donde la fase estacionaria es una
resina de intercambio inico para la separacin y determinacin de especies
inicas.

+NR OH-
3 Cl-

+NR Cl-
3 OH
-

+NR OH-
3

+ K +
Resina-NR3OH + NaCl Resina-NR3Cl + NaOH
 Cromatografa de Intercambio Inico (IEC)

La retencin depende de varios parmetros:

Carga
Mientras mayor es la carga, mayor es el tiempo de retencin:

tR (NO3-) < tR (SO4-2)

Para iones multivalentes va a depender del pH (Ej. Fosfato).

Tamao
Mientras mayor es el radio del in, mayor es el tiempo de retencin:

tR F- < Cl- < Br- < I-

Polaridad
Grado de solvatacin y acomplejamiento
Fuerza cida o bsica
 Cromatografa de Intercambio Inico (IEC)

La especie a analizar debe estar suficientemente ionizada:

HA H+ + A-
Keq = [H+][A-] / [HA] = 10-5
pKA = 5
Para especies dbilmente ionizadas el pKA debe ser mayor de 7.

Es funcin de pH (Principio de Le Chatelier)

A pH 6 90 % Ionizada
A pH 5 50 % Ionizada
A pH 4 10 % Ionizada
A pH 3 1 % Ionizada
 Cromatografa de Intercambio Inico (IEC)

Los rellenos ms utilizados en IC son:

Poliestireno entrecruzado (copolmeros de estireno - divilbenceno).
Copolimeros de Etilvinilbenceno / Divinilbenceno.
Resinas de polimetacrilatos.
Resinas de Polivinilicas.
 Cromatografa de Intercambio Inico (IEC)
La fase ms ampliamente utilizada son copolmeros de estireno-
divinilbenceno:
Monmero
CH CH2

CH CH2 CH CH2

Entrecruzamiento

CH CH2

Aceptan un rango de pH entre 0 y 14.

La copolimerizacin le permite mayor estabilidad mecnica a la resina.
La cantidad de Divilbenceno determina el grado de entrecruzamiento
el cual a su vez determina la porosidad de la resina.
 Cromatografa de Intercambio Inico (IEC)
Resinas de Intercambio catinico fuerte: SO3- H+
Resinas de Intercambio catinico dbil: CO2- H+
Resinas de Intercambio aninico fuerte: NR4 H+ OH-

Resinas de Intercambio aninico dbil: NR3 H+ OH-

CH CH2 CH CH2 CH

X X

CH CH2 CH CH2 CH CH2 CH

X X

CH CH2 CH CH2 CH CH2 CH

X X
Cromatografa de Intercambio Inico (IEC)

Existen:
Pelicular
Micro porosas (tipo Gel)
Macro porosas (macroreticular)
 Resina del Tipo Micro porosa
Las partculas de relleno en las resinas de intercambio inico del tipo pelicular:

Un sustrato inerte no poroso y

mecnicamente estable.
Constitucin poliestireno-divinilbenceno
de 5 a 10 m de radio.
5.0 m Alto grado de entrecruzamiento (55%).
Este tipo de empaque ofrece alta
velocidad, alta eficiencia, alta capacidad
de carga y moderada presin.

Grupo de intercambio
unido covalentemente al
polmero.
 Intercambiadores Inicos Pelicular
de Aglomerados de Latex
Particula Latex
0.1 a 0.5 m)

Sustrato
Polimerico Latex
NR3+

SO3-
5 - 25 m
Tipo de Polimero:
a) Polystyrene / Divinylbenzene
b) Polystyrene / Ethylvinylbenzene
c) Polymethacrylate

Grado de entrecruzamiento:

Sustrato: 5 - 55%
Latex: 0.5 - 40%
 Cromatografa de Intercambio Aninico
Ampliamente empleado para el anlisis de compuestos inorgnicos en
disoluciones acuosas.
Columna: IonPac AG15, AS15. Dionex
8 Eluente: 38 mmol/L NaOH
Temp.: 30C
1 Flujo: 1.2 mL/min
Vol. Inj : 25 L
2 3 Picos: 1. Floruro 2 mg/L
2. Cloruro 5
3. Nitrito 10
4
4. Sulfato 10
5 6 5. Bromuro 20
S
6. Nitrato 20
7. Ortofosfato 30
7

0 5 10 15 20 25
Cromatografa de Exclusin por Tamao (SEC)

KC = Constante de Difusin
 Cromatografa de Exclusin por Tamao (SEC)
Es una tcnica de anlisis que se aplica particularmente a especies de elevado
peso molecular.
No hay interaccin qumica entre los analitos y la fase estacionaria.
El relleno est hecho por partculas de polmeros o slice que contiene una red
de poros uniformes donde son atrapados los componentes de la muestra.
El tiempo de residencia va a depender del tamao efectivo de las molculas de
los analitos.
Molculas que son ms grandes que el tamao promedio de poro del relleno son
excluidas, no sern retenidas y por lo tanto son las primeras en ser eluidas.
Molculas que poseen dimetros significativamente menores, resultan
atrapadas por mayor tiempo.
Cromatografa de Exclusin por Tamao (SEC)
Existen dos tipos:

Cromatografa de Filtracin de Gel (GFC)

Muestra: polmeros solubles en agua
La fase mvil acuosa
Empaque: Gel hidroflico

Cromatografa de Permeacin de Gel (GPC)

Muestra: Polmeros solubles en solventes orgnicos
Fase mvil orgnica
Empaque: Poliestireno entrecruzado (hidrofbicos)

GFC y GPC emplean el mismo mecanismo de separacin.

 Cromatografa de Exclusin por Tamao (SEC)
Aplicaciones:
Separacin de polmeros:
Para la separacin de biomoleculas de alto peso molecular.
Para series homologas, el tiempo de retencin (volumen) puede ser
relacionado con el logaritmo de peso molecular,

Scanning Microscopa
Electrnica
de agarosa gel.
Aumento x 50,000.
Cromatografa de Exclusin por Tamao (SEC)

Log PM

Volumen de
Elucin
V0 VR

Exclusin Penetracin
Total Total

Volumen de Penetracin
 Cromatografa de Exclusin por Tamao (SEC)

Muestra desconocida Patrones

de
Polmeros

1M 500K 250K 100K 25K

Tiempo
Log Peso Molecular

Volumen de Retencin (VR)

Cromatografa de Afinidad
 Cromatografa de Afinidad

Se trata de un tipo especial de cromatografa de adsorcin

slido-lquido en la que la sustancia de naturaleza bioqumica
(anticuerpos, cofactores, inhibidores enzimticos, lectinas y
otras molculas) denominadas ligandos de afinidad y enlazados
qumicamente en soportes slidos adecuados, retienen a los
solutos (analitos), tambin de naturaleza bioqumica, de manera
reversible y selectiva.

Las separaciones se basan en el acoplamiento llave-

cerradura tpico de la biologa molecular.
 Cromatografa de Afinidad
Ligando de afinidad
Soporte polimrico
inerte Enlace
covalente
Muestra
Analito de
inters
Primera fase mvil

Impurezas

Segunda fase mvil

 Cromatografa de Afinidad

Existen dos tipos de ligandos:

Especficos: Paras solo una especie en particular. Eje: Antigeno
anticuerpo.
Generales: Para grupos de especies especficas.
Aplicacin:
Muestra Ligando
Enzimas Sustratos, Inhidor, Cofactor
Anticuerpos Antgeno, Virus, Clulas
Lectinas Polisacridos, Clula receptora
cido nucleico Base complementaria, Polimerasa
Hormonas Receptor, Protena
 Cromatografa de Afinidad

La cromatografa de afinidad tiene una serie de

caractersticas generales que la distinguen de otros
tipos de cromatografa lquidas:
Alta selectividad en el mecanismo de retencin
Campo de aplicacin restringido
Separacin de un solo soluto analito
Empleo de sistema de baja presin
Columnas cortas de escasa eficacia
cromatogrfica
 Ejemplo de Cromatografa de Afinidad

Muestra: Ovalbunin
Columna: Shodex AFpak ACA-894
Eluente:(A);0.02M Tris-HCl (pH7.4) +
0.5M NaCl (B);(A) + 0.05M alpha-Me-
D(+)-glucoside
Gradiente Lineal: (A) to (B), 60min
Flujo: 0.3mL/min
Detector:UV (280nm)
Temperatura:Ambiente
Ligando: Concanavalin A
Ejemplo de Cromatografa de Afinidad
 Cromatografa Quiral

Los ismeros quirales son esteoismeros, Es decir molculas que

presentan los mismos elementos y enlaces pero distinta distribucin
espacial. Molculas con un conjunto de esteroismeros quirales que
sean imgenes especulares se denominan enantimeros.

Los enantimeros poseen las mismas propiedades fsicas pero

interaccionan diferente con la luz polarizada.
La Cromatografa Quiral es de las ms comn para la separacin de
enantiomeros. Es capaz de separar mezclas racmicas de
esteroisomeros
Cromatografa Quiral
Cromatografa Quiral
Cromatografa Lquido-Lquido
Cromatografa de Reparto

KC = Constante de Particin
 Cromatografa Lquido-Lquido
Cromatografa de Reparto

En HPLC, cuando el analito reparte su concentracin entre

dos fases lquidas, el mtodo es conocido como:
Cromatografa de Reparto.

Cuando la fase estacionaria lquida est unida

qumicamente mediante un enlace covalente a un soporte
slido, le confiere mayor estabilidad y no puede ser
removida con facilidad (sangrado de la columna). En tal
caso, se le denomina:
Cromatografa de Fase Enlazada (BPC)
 Fase Enlazada
Sntesis de los Empaques

A los grupos silanoles: -Si-OH

Se le unen especies organoclorosilanos: ClSi(CH3)2R

Reaccin simplificada en la superficie de gel de slice:

CH3 CH3
Si OH + Cl Si R Si O Si R
CH3 CH3
 La Cromatografa Fase Enlazada (BPC)

La Cromatografa de Fase Enlazada puede ser de dos

tipos:

Si el grupo activo unido a la partcula de soporte es

polar, entonces de llama:
Cromatografa en Fase Normal (NPC)

Si el grupo activo unido a la partcula de soporte es

no polar, entonces de llama:
Cromatografa en Fase Inversa (RPC)
Relacin entre la polaridad y los tiempos de elusin en Cromatografa de
Fase Normal y Fase Inversa
Polaridad de A B C

Cromatografa Fase Normal

Fase mvil de baja polaridad Fase mvil de polaridad intermedia

C B A C B A
t t

Cromatografa Fase Inversa

Fase mvil de alta polaridad Fase mvil de polaridad intermedia

A B C A B C
t t
 Soportes en Cromatografa en Fase Normal
(NPC)
Utiliza fases estacionarias polares (normalmente hidroflicas).
Fases estacionarias ms comunes: Cianos (-CN) y Aminas (-NH2).

Amino
Ciano, CN, Nitrilo
R1 R1
C N NH2
Si Si
R2 R2

Diol Nitro NO2

R1 OH OH R1
O OH
Si Si
R2 R2
 Cromatografa en Fase Normal (NPC)

Normalmente se comienza una fase mvil poco polar,

como heptano, hexano, tetrahidrofurano, etc y se va
aadiendo solventes ms polares como cloruro de
metileno, cloroformo
Normalmente para compuestos polares, como aminas,
anilinas, nitrogenados aromticos, fenoles, pesticidas,
etc.

Los mtodos de Cromatografa de Reparto en Fase

Normal y Cromatografa de Adsorcin tienden a ser
complementarios y en muchos casos se superponen.
 Cromatografa en Fase Inversa (RPC)
Utiliza fases estacionarias no polares (normalmente hidrofbica)

R1 C1 R1 C2 R1 C3

Si Si Si
R2 R2 R2

R1 Fenil
R1 C4,
Butil Si
Si
R2
R2

R1 Ciclohexil

Si
R2
 Cromatografa de Fase Inversa (RPC)
Fase estacionarias ms comunes, C8 (RP-8, Octyl) y C18 (RP-18, ODS)

R1

Si C8, Octil
R2 R1
C12
Si
R2

R1
C18 = RP-18, ODS(Octadesil silano)
Si
R2

Las cadenas ms largas originan rellenos que muestran mayor

retencin, adems permiten una mayor cantidad de muestra.
 Cromatografa de Fase Inversa (RPC)

Para compuestos no polares y de moderada polaridad.

En la mayora de las aplicaciones de RPC, la elucin se lleva a

cabo comenzando con una fase de elevada polaridad, como es
el caso de una disolucin acuosa conteniendo concentraciones
diversas de un solvente de menor polaridad como metanol,
acetonitrilo, THF. Posteriormente se va aadiendo solventes
menos polares.

En el caso que la resolucin sea muy pobre, se recomienda

usar gradientes de elucin de tres o cuatro solventes.
 Cromatografa de Par-Inico (IPC)
Es un tipo de Cromatografa de Reparto en Fase Inversa que se
utiliza para la separacin de especies inicas.
La Fase Inversa se recubre dinmicamente por grupos inicos,
los cuales son aadidos a travs de la fase mvil.
En este tipo de cromatografa la fase mvil est constituida
por un buffer y un reactivo inico (Par-Inico).
El contra-in es de una cadena orgnica relativamente larga y
de carga opuesta al in del analito que se desea determinar:
R1

Fase Mvil + A+ B- Si A+B-

R2

R1
Muestra (C-)
Si A+ C -
R2
 Cromatografa de Par-Inico (IPC)
El par inico es retenido sobre la columna

COO- Na+ + N(C4H9)4 + H2PO4- COO- N(C4H9)4+

Par Inico

R1

Si
R2 N+
O-
O
C
 Separacin Cromatogrfica

Una cromatografa exitosa requiere de un equilibrio adecuado

entre los tres participantes activos: Soluto, eluente y fase
estacionaria.
Al elegir una columna, la polaridad de la fase estacionaria ha de ser
bastante similar a la de los analitos, empleando una fase mvil con
una polaridad considerablemente distinta.
En la practica la mayora de las separaciones ocurre por una
combinacin de mecanismos.
La cromatografa de Reparto, ha llegado a ser el tipo de
cromatografa de lquido mas utilizada.

Como gua general, se utiliza la cromatografa en fase normal para

la separacin de compuestos polares y de fase inversa para
compuestos de polaridad intermedia y no polares.
 Separacin Cromatogrfica
El 90 % de las separaciones analticas de bajo peso
molecular son llevadas a cabo por cromatografa en fase
inversa, debido fundamentalmente al amplio rango de
analitos que puede disolver la fase mvil, versatilidad y
amplio rango de aplicacin.
Tiene aplicacin para compuestos no inicos, inicos,
polares y no polares.

Hay que tener especial cuidado en que el valor del pH no

sea mayor de 7.5, por que si no, puede tener a lugar la
hidrlisis de los silanoles, lo cual originara la
degradacin o destruccin del relleno.
 Muestra

PM 1500 g/mol PM 1500 g/mol

Cromatografa de Exclusin por tamao

Soluble en H2O Soluble en solventes Orgnicos

Cromatografa de Cromatografa de
Filtracin de Gel Permeacin de Gel
(GFC) (GPC)

Soluble en solventes Orgnicos Soluble en solvente H2O

Cromatografa de Par Cromatografa de

Inico (IPC) Intercambio Inico (IEC)

Cromatografa de Adsorcin
Cromatografa de Reparto
Lquido Slido (LSC)
Lquido Lquido (BPC)

Cromatografa Fase Cromatografa Fase

Enlazada Enlazada
Fase Normal (NPC) Fase Inversa (RPC)
 Separacin Cromatogrfica

En el mercado de USA, hay ms de 150

proveedores de columnas para HPLC, y cada uno
de ellos, tiene ms de 100 tipos diferente. Esto
lleva a que la seleccin de la mejor columna para
un anlisis particular sea sumamente difcil

Los mejores factores a la hora de escoger son la

experiencia, recomendaciones de amigos,
capacidad de respuesta del proveedor, etc
 Separacin Cromatogrfica
La polaridad relativa del solvente es utilizado como gua para la seleccin del
eluente ms apropiado. La siguiente es gua de referencia:
Fluoroalcanos (menos polar)
Hexano
Iso-octano
Tetracloruro de carbono
Tolueno
Eter dietilico (eter)
Cloroformo
Cloruro de Metileno
Tetrahidrofurano (THF)
Acetona
Acetate de Etilo
Dioxano
Isopropanol
Etanol
Acido Acetico
Metanol
Acetonitrilo
Agua (mas polar)
 Separacin Cromatogrfica

Gua de la polaridad de los grupos funcionales:

Eter (menos polar)
Ester
Cetonas
Aldehidos
Amidas
Aminas
Alcoholes
Agua (ms polar)