Electroforesis de protenas

y de cidos nucleicos
Definicin
La mayora de las biomolculas poseen una carga elctrica, cuya magnitud depende del pH del medio en
el que se encuentran. Como consecuencia, se desplazan cuando se ven sometidas a un campo elctrico.

Se denomina electroforesis a la tcnica mediante la cual se separan las biomolculas en disolucin

cuando se ven sometidas a un campo elctrico. Se trata de una tcnica fundamentalmente analtica,
aunque tambin se puede realizar con fines preparativos.

Cada molcula se desplaza por efecto del campo, alcanzando rpidamente una velocidad constante al
equilibrarse la fuerza impulsora (fuerza del campo elctrico) con la resistencia al avance (fuerza de friccin
o rozamiento) impuesta por el medio en el que se desplaza.

Fuerza del campo elctrico = Fuerza de friccin

qEqE == fvfv
qq = carga (C) ff = coeficiente de friccin (CVs / m 2
= kg/s)
EE = intensidad del campo (V/m = N/C) vv = velocidad de la molcula (m/s)
El coeficiente de friccin mide la resistencia intrnseca debida a las caractersticas de cada molcula,
siendo stas esencialmente su forma y su tamao. As, por ejemplo, las molculas grandes y de forma
irregular poseen un mayor coeficiente de friccin que las pequeas y compactas.

La velocidad por unidad de campo recibe el nombre de movilidad electrofortica,

 v/E==q/f=Ze/f
(ZZ = nmero entero; ee = carga del electrn)

En unas condiciones determinadas de electroforesis, la diferente movilidad de cada molcula definir su

separacin en el espacio; al ir transcurriendo el tiempo, se van separando progresivamente unas de otras.

Al ser el medio de soporte a su vez un polielectrolito, est constituido por iones, que son atrados y as
recubren los iones de la muestra, lo que altera el comportamiento de stos en el campo. Todo ello hace
que el tratamiento terico cuantitativo de la electroforesis sea muy difcil y que esta tcnica resulte poco
til para obtener informacin precisa sobre la estructura de las molculas. Sin embargo, es enormemente
til como tcnica analtica y preparativa.

Se suele hablar de 3 tipos de electroforesis:

1. De frente mvil: los componentes de la muestra estn presentes en toda la disolucin y se

determina pticamente la posicin del frente de avance o frontera con el disolvente.

2. Zonal: la muestra se aplica como una mancha o banda y sus componentes migran a travs de un
disolvente, utilizando adems un medio que da soporte a ste. En este caso no se determina la
movilidad, sino que el nico objetivo de la tcnica es separar los componentes de la muestra.

3. Continua: la muestra se aplica tambin en una zona, pero se suministra continuamente a lo largo
del proceso (para ms informacin, vanse las pp.250-2 de Freifelder, 1999).

Estudiaremos nicamente la electroforesis zonal, de uso ms extendido.

Finalmente, debe sealarse que, aunque es menos frecuente, tambin se puede aplicar la electroforesis
para la separacin de clulas.
Medios de soporte para realizar la electroforesis
La muestra debe situarse en o sobre un medio soporte, principalmente para evitar perturbaciones
mecnicas y corrientes de conveccin durante la separacin. En algunos soportes (papel o similares) la
muestra queda sobre la superficie y avanza a lo largo de ella, con escasa friccin, por lo que el mecanismo
principal de separacin es la magnitud de la carga de cada componente de la muestra. Otros medios de
soporte (geles, medios semislidos o gelatinosos) estn formados por polmeros que forman una malla,
matriz o red tridimensional a travs de la cual deben avanzar las molculas de la muestra, que queda
embebida en el medio de soporte electrofortico. Como consecuencia, la friccin es notable y los factores
de forma y tamao adquieren una alta relevancia en la separacin.

Medios de baja friccin Medios de elevada friccin

papel gel de almidn gel de poliacrilamida

acetato de celulosa gel de agarosa gel de agarosa+poliacrilamida

separacin principalmente por carga separacin por carga, tamao y forma

Papel: sencillo, pero con elevada adsorcin debido a los grupos hidroxilo de la celulosa.

Acetato de celulosa: los grupos OH estn acetilados, lo que reduce la adsorcin; baja tincin de fondo;
es posible transparentarla o disolverla para detectar y recuperar, respectivamente, los componentes
separados.

Almidn: pasta de almidn cuyos granos se han disgregado en un tampn caliente (se hinchan).
Actualmente se utiliza poco, ha sido sustituido por la poliacrilamida.

Agarosa: polisacrido, producto purificado de algas (composicin similar al agar-agar). Se disuelve en

caliente (50-60C) y al enfriar solidifica formando un gel, de alta porosidad.
Poliacrilamida: el gel es el resultado de la polimerizacin qumica de una mezcla de acrilamida y
bisacrilamida. Regulando la concentracin de ambas y su proporcin se consiguen distintas porosidades,
siempre menores que la de los geles de agarosa.

acrilamida: (forma polmeros lineales)

N,N-metileno- (introduce uniones cruzadas entre cadenas de

bis(acrilamida): poliacrilamida)
 poliacrilamida:
(vista parcial)

Agarosa+poliacrilamida: se consigue una porosidad intermedia.

Poliacrilamida con SDS: el dodecilsulfato sdico (Sodium Dodecyl Sulphate; sinnimo: laurilsulfato
sdico) es un detergente aninico que se une a las protenas, desnaturalizndolas en una conformacin
extendida recubierta de molculas de SDS. Como consecuencia, el tamao de la molcula de protena es
directamente proporcional a su longitud en aminocidos y su carga queda enmascarada por la mayor
carga del SDS que la recubre, que es tambin proporcional a la longitud. Por lo tanto, la movilidad
electrofortica de la protena depende exclusivamente de su masa molecular.

H-(CH2)12-SO4
Modos de disposicin del soporte

Horizontal
En papel, para aminocidos u otras molculas pequeas; en soportes similares (especialmente, acetato de
celulosa), para protenas.

En gel de almidn o de agarosa, para protenas y especialmente para cidos nucleicos. Casi siempre el
tampn cubre el gel (para evitar que se seque debido al calentamiento sufrido al pasar la corriente),
denominndose por ello electroforesis submarina.

El soporte se impregna por capilaridad de disolucin tampn, que disuelve la muestra y mantiene el
contacto elctrico.

Se aplica la muestra depositndola (con pipeta o un aplicador especfico) como una gota sobre el soporte
(papel, acetato de celulosa) o dentro de un pocillo creado en el gel.
Vertical
Se usa casi exclusivamente con gel de poliacrilamida (ms resistente fsicamente, no se desliza), para
protenas o para cidos nucleicos de pequeo tamao.

El gel puede rellenar tubos de vidrio (este formato ya apenas se usa) o estar contenido entre 2 placas
rectangulares.

Contacto elctrico y disolvente gracias al tampn que embebe el gel y llena las cubetas o compartimentos
del nodo y ctodo.

La muestra se deposita con micropipeta llenando un pocillo creado al polimerizar el gel.

En cuanto a la composicin del gel hay dos variantes: electroforesis continua (un solo tipo de gel)
y electroforesis discontinua (2 tramos de gel de composicin ligeramente diferente).
Ejemplos de separacin electrofortica

Separacin de protenas por SDS-PAGE discontinua vertical

SDS-PAGE = SDS-PolyAcrylamide Gel
Electrophoresis, electroforesis en gel
de poliacrilamida en presencia de
dodecilsulfato sdico.

Gel de poliacrilamida, en placa,

vertical.

Separacin de acuerdo con la masa

molecular (estrictamente, con la
longitud de la cadena polipeptdica).

La muestra se trata con SDS (a mayor

concentracin que en la composicin
del gel) y se calienta brevemente a
90-100C, para provocar la
desnaturalizacin. Se suele aadir
tambin -mercaptoetanol para
reducir los puentes disulfuro,
separando as las subunidades de la
protena y permitiendo que se
extiendan por efecto del SDS.

En la preparacin del gel se mezclan:

un tampn de pH (comnmente
Tris-HCl)
 acrilamida y bisacrilamida

un agente iniciador de la
polimerizacin, como el
persulfato amnico (genera
radicales libres)

un agente catalizador de la
polimerizacin, como el TEMED
(N,N,N,N-
tetrametiletilenodiamina)

SDS

Permite obtener una estimacin de la

masa molecular de las protenas
separadas. Para ello es preciso
analizar en la misma electroforesis
unas protenas patrn, de tamao
conocido, con las que se construye
una curva de calibrado, representando
movilidad frente a logaritmo de masa
molecular.
Para controlar el avance del frente de
electroforesis (posicin de mxima
movilidad) se aade a la muestra un
colorante marcador (tracking dye),
molcula cargada y de pequeo tamao
que avanza ms que cualquier
componente de la muestra; el ms
habitual es el azul de bromofenol.

Para mejorar la resolucin

(obteniendo bandas ms compactas)
se suele emplear
electroforesis discontinua:

En la parte superior, un gel

acumulador o
concentrador (stacking gel), que
tiene como efecto concentrar la
muestra en una banda estrecha.

Ocupando la mayor parte de la

placa, un gel
separador (resolving gel) en el
que tiene lugar la separacin de
los componentes.

El efecto concentrador se debe a una

mayor porosidad del gel acumulador
combinada con una diferente
 composicin de los tampones de cubeta
(Tris-glicina) y de gel (Tris-HCl) y
distinto pH para ambos geles.

Nota: Tris es
tris(hidroximetil)aminometano, una
sustancia habitual para preparar
disoluciones tampn de pH prximo a
7.

Separacin de DNA en geles de agarosa, electroforesis horizontal submarina

Las molculas de DNA de las clulas

son excesivamente grandes para
avanzar a travs de un gel de
electroforesis normal, pero pueden
analizarse si previamente se han
fragmentado de forma controlada. Se
suelen emplear geles de agarosa
(concentracin entre 0,3% y 2%),
ms porosos que los de poliacrilamida.
Las caractersticas mecnicas de estos
geles hacen aconsejable la realizacin
de la electroforesis en horizontal,
habitualmente submarina. Las
muestras se aplican en pocillos
practicados dentro del gel.

Una de las formas ms comunes de

fragmentar el DNA es el empleo de
endonucleasas de

La carga elctrica de una molcula de DNA depende de sus grupos fosfato, y el nmero de stos es igual
al doble del nmero de pares de bases. La forma de todas las molculas de DNA es esencialmente la
misma. En consecuencia, resulta que la movilidad en electroforesis depende exclusivamente de la longitud
de la molcula (medida habitualmente como nmero de pares de bases, pb): la electroforesis separa
los fragmentos de DNA de acuerdo con su longitud en pb. De forma similar al caso de protenas en
SDS-PAGE, se suelen aplicar patrones en uno de los pocillos para hacer una curva de calibrado de
tamaos.
El avance del frente de electroforesis se observa gracias a colorantes como azul de bromofenol y xileno
cianol, aadidos a la muestra.

Cuando los fragmentos de cido nucleico analizados son de tamao muy pequeo se utilizan geles de
poliacrilamida, o de mezclas de agarosa y poliacrilamida cuando el tamao es intermedio.

Revelado o deteccin

Tincin de protenas y de cidos nucleicos

Se pueden emplear sustancias coloreadas o fluorescentes que se unan a las protenas o los cidos
nucleicos.

En el primer caso suelen ser colorantes orgnicos que interaccionan con las protenas de forma poco
selectiva, principalmente electrosttica. Ejemplos: azul brillante de Coomassie, negro amido, rojo
Ponceau.

Para los cidos nucleicos se usa el azul de metileno o, ms frecuentemente, compuestos fluorescentes e
intercalantes, como el bromuro de etidio (vase figura). Un compuesto intercalante es aqul que se
introduce entre los pares de bases apilados del DNA.

Tras la electroforesis, el gel se sumerge en un recipiente con una disolucin del colorante y se espera a
que aqul se impregne y as el colorante se una a las molculas separadas en el gel. Tras lavar el gel para
eliminar el exceso de tincin no unida especficamente, se observa, fotografa o cuantifica
mediante densitometra.
Bromuro de etidio: Agente intercalante, se introduce entre las bases apiladas del DNA, abre un poco la
doble hlice, provoca un desenrollamiento local. Su fluorescencia (color naranja al iluminar con UV)
aumenta mucho cuando se une al DNA: mtodo de tincin o revelado del DNA, especialmente usado en
electroforesis y en centrifugacin.

deteccin por tincin con un agente

fluorescente y observacin bajo luz
ultravioleta
Ensayo enzimtico
Si entre las molculas separadas hay una enzima, se puede detectar aadiendo sus sustratos (naturales o
sintticos) y sus cofactores, y detectando la aparicin del producto, generalmente coloreado.

Autorradiografa
Tanto protenas como cidos nucleicos pueden marcarse isotpicamente previamente a la electroforesis,
en cuyo caso la deteccin se hace mediante autorradiografa del gel (vase figura).

Inmunoensayo (Western)
En caso de disponer de ellos, los anticuerpos permiten la deteccin selectiva del componente de inters
(protena o grupo marcador unido qumicamente a la protena o al cido nucleico antes de la
electroforesis). La permeabilidad de los geles para el acceso del anticuerpo es limitada, por lo que se hace
una transferencia de las molculas separadas en el gel hacia una membrana de nitrocelulosa o de nailon,
la cual se somete luego a la disolucin que contiene el anticuerpo. Los detalles de esta tcnica
de inmunotransferencia o ensayo Western blot se tratarn en un tema posterior.

Deteccin de cidos nucleicos con sondas (Southern y Northern)

Las molculas con una secuencia determinada de nucletidos se pueden detectar mediante hibridacin con
sondas especficas, pequeas molculas de cido nucleico monocatenario (oligonucletidos) con la
secuencia complementaria a la buscada y marcadas con un istopo radiactivo, un grupo fluorescente, etc.
Para llevar a cabo con xito la hibridacin se requiere tambin la transferencia desde el gel a una
membrana de nitrocelulosa o nailon. Los detalles de estos ensayos (Southern blot para DNA y Northern
blot para RNA) se estudian en un tema posterior.
Tcnicas especiales

Isoelectroenfoque
(Tambin se llama enfoque isoelctrico o IEF, de isoelectrofocusing). Se trata de una variante de
electroforesis en la que el gel (poliacrilamida) posee un gradiente de pH fijado en su estructura. Esto se
consigue incluyendo en su preparacin molculas ionizables con valores de pK diferentes. Como
consecuencia, al avanzar los componentes de la muestra a lo largo del gel se encuentran en entornos de
pH diferente, y eventualmente alcanzan una regin en la cual el pH local es igual al punto isoelctrico de
la molcula muestra y, en consecuencia, sta detiene su avance. Se alcanza, pues, un equilibrio y se
consigue la separacin de los componentes de la muestra de acuerdo con su punto isoelctrico, que
adems se puede medir, pues se conoce la geometra del gradiente de pH fijado al gel.

Electroforesis bidimensional
Tras realizar una primera separacin su resultado se somete a otra de diferente mecanismo en direccin
perpendicular. Generalmente la primera es un isoelectroenfoque en un gel cilndrico estrecho que luego se
coloca como muestra para una SDS-PAGE. Se obtienen as mapas complejos de bandas, muy
caractersticos de cada muestra, cuya utilidad principal es la comparacin con el obtenido de otra muestra
similar pero conocida.
Electroforesis de campo pulsante
Las molculas o fragmentos de DNA de longitud superior a 20-40 kb no se pueden resolver (separar)
empleando la electroforesis convencional en gel de agarosa. Esto se debe, en primer lugar, a la dificultad
de manejo de los geles preparados con las bajas concentraciones de agarosa que requeriran (inferior al
0,4%). Adems, las molculas de DNA, que adoptan una conformacin ms o menos globular, poseen un
tamao excesivamente grande para atravesar los poros del gel y no se separan en funcin de su tamao.
Para solventar este problema se ha ideado una modificacin de la tcnica, conocida como electroforesis
de campo pulsante (o pulsado, pulsed-field gel electrophoresis , PFGE). Se emplean geles de agarosa al
1%, pero se altera peridicamente la orientacin del campo elctrico aplicado, activando alternativamente
dos pares de electrodos. El frecuente cambio de direccin del campo elctrico consigue que las molculas
se desplieguen y avancen a travs de los poros en conformacin extendida. A mayor tamao, se
reorientan con ms dificultad, por lo que avanzan ms despacio.
As se consigue separar fragmentos de DNA de hasta varias megabases, lo que
supone un avance significativo pero an no sirve para estudiar los
cromosomas humanos enteros (de 50 a 250 Mb cada uno). S se han podido
analizar as los cromosomas de levadura (figura derecha).

Las muestras han de contener el DNA sin fragmentar, por lo se requiere una
preparacin especial (al purificar el DNA por los mtodos habituales se
fragmenta por debajo de 100 kb). Para obtener preparaciones con los
cromosomas intactos se mezclan las clulas con agarosa caliente (37C) y se
vierte en pequeos moldes de unos milmetros, de forma que al solidificarse la
agarosa (4C) forma bloques (insertos) que incluyen las clulas intactas. En
stos se realiza la lisis celular y la digestin de las protenas (p.ej., con EDTA,
SDS y proteinasa K, que difunden a travs de los poros del gel) sin que se
alteren las grandes molculas de DNA. Tras una dilisis para eliminar los restos
de la digestin, se consigue un bloque de agarosa con el DNA intacto en su
interior, y se deposita el bloque entero en un pocillo del gel de electroforesis.
Electroforesis preparativa
Se han desarrollado variantes preparativas, es decir, que permiten la obtencin de cantidades
significativas de los componentes de la muestra por separado. No se detallarn aqu (vase Freifelder
1991, pp.256-7)

Inmunoelectroforesis
Combina una separacin electrofortica con una deteccin por inmunodifusin.

Aplicaciones

Determinacin de la masa molecular

Como se ha indicado, se puede obtener una estimacin de la masa molecular (en kDa) de protenas
empleando SDS-PAGE, y de fragmentos de DNA (en pb) empleando electroforesis en agarosa. En ambos
casos, en uno de los pocillos del gel se carga una mezcla de molculas patrn de tamao conocido, con el
fin de poder trazar la curva de calibrado. Para las protenas, la validez del dato obtenido depende de que
la desnaturalizacin con SDS haya sido completa y de que se hayan separado las subunidades gracias a la
reduccin con mercaptoetanol; adems, la presencia de oligosacridos en las glicoprotenas altera la
movilidad, que ya no proporciona valores de masa molecular fiables.
Ejemplo 1:
Se aplica en uno de los pocillos del gel una
mezcla de fragmentos de DNA de tamao
conocido, denominados patrones,
marcadores de masa molecular o escalera
de DNA (DNA ladder). Tras su separacin en
la electroforesis, se revelan y se representa
para todas las bandas la movilidad (distancia
avanzada o, mejor, cociente entre sta y el
avance del frente de electroforesis) frente al
logaritmo del tamao (longitud en pb).
Sobre la lnea de regresin se interpolan las
distancias de avance de las muestras
problema, calculando as su tamao en pb.
En este ejemplo, los patrones empleados
son fragmentos bien conocidos, aquellos
obtenidos a partir del DNA del virus por la
accin de las endonucleasas de
restriccin EcoRI e HindIII.
 Ejemplo 2:
Se aplica en uno de los pocillos de un gel SDS-PAGE
una mezcla de protenas de una sola subunidad, de
tamao conocido, denominadas patrones o
marcadores de masa molecular. Tras su separacin
en la electroforesis, se revelan y se representa para
todas las bandas la movilidad (distancia avanzada o,
mejor, cociente entre sta y el avance del frente de
electroforesis) frente al logaritmo del tamao (masa
molecular relativa, Mr). Sobre la lnea de regresin se
interpolan las distancias de avance de las muestras
problema, calculando as su masa molecular
aparente.

Determinacin del punto isoelctrico

Como se ha indicado, mediante isoelectroenfoque [] se obtiene una medida del punto isoelctrico de las
protenas (pHI o pI).
Isoenzimas
Las variantes de una enzima, con pequeas diferencias en su estructura y en su actividad enzimtica, se
analizan rutinariamente mediante electroforesis o, en especial, mediante isoelectroenfoque. De hecho, los
nombres de las isoenzimas derivan a veces de su movilidad electrofortica. Se puede aplicar
anlogamente a las isoformas de protenas no enzimticas.

Mapas de restriccin
Una de las formas de estudiar la secuencia de los cidos nucleicos, en especial el DNA, consiste en tratarlo
con distintas enzimas de restriccin, analizar mediante electroforesis en gel de agarosa los fragmentos
resultantes e intentar reconstruir la secuencia de la molcula original formando su mapa de restriccin,
uno de los tipos de mapa fsico.

Secuenciacin de cidos nucleicos

La obtencin de la secuencia completa, nucletido a nucletido, tambin depende del anlisis
electrofortico de fragmentos de DNA, tanto en el mtodo qumico de Maxam y Gilbert como en el mtodo
enzimtico de Sanger. Se utilizan en este caso geles de poliacrilamida, debido al tamao pequeo de los
fragmentos, pudindose resolver fragmentos que se diferencian en un solo nucletido.