UNIDAD 6.

Nutricin microbiana y
UNIDAD 7. Requerimientos de oxgeno

INTRODUCCIN

La nutricin es el proceso por el cual los seres vivos toman del medio donde habitan, los
compuestos qumicos que necesitan para llevar a cabo sus procesos energticos y
biosintticos que les permiten crecer y reproducirse.

Los requerimientos nutricionales de cada grupo microbiano estn dados por la composicin
qumica de las clulas que los constituyen y por sus caractersticas genticas las que
determinan sus propiedades fisiolgicas y su capacidad para utilizar y transformar los
compuestos que se encuentran en el ambiente en que se desarrollan.

En general los requerimientos nutricionales de los microorganismos reflejan el ambiente

natural en que viven; este conocimiento y el uso de medios de cultivo de composicin
qumica definida, son de primordial importancia en el estudio de la nutricin microbiana cuyas
caractersticas varan ampliamente entre los microorganismos. Algunos tienen
requerimientos nutricionales muy simples, obtienen su energa de compuestos inorgnicos y
utilizan CO2 o carbonatos como fuente de carbono, en tanto que otros requieren de
compuestos orgnicos con diferentes grados de complejidad. La fuente de nitrgeno, la
obtienen a partir de aminocidos o nitrgeno inorgnico en diferentes estados de oxidacin
incluyendo el nitrgeno molecular. Respecto a los requerimientos de oxgeno, los
microorganismos pueden vivir con diferentes concentraciones de este elemento.

En el siguiente experimento se pondrn de manifiesto el tipo de nutricin y necesidades de

oxgeno de diferentes microorganismos, para ello, estos se inocularn en dos medios de
cultivo, en el primero se variarn las fuentes de carbono y de nitrgeno y en el segundo la
tensin de oxgeno y se relacionarn sus caractersticas nutricionales con el desarrollo y las
transformaciones qumicas microbianas obtenidas en los diferentes medios de cultivo.

OBJETIVOS

Mediante este ejercicio se lograr:

Reconocer y describir las necesidades nutricionales de los microorganismos.
Relacionar la composicin de los medios de cultivo con las caractersticas
nutricionales especficas de los microorganismos.
Relacionar los productos detectados con los procesos energticos y asimilatorios
efectuados por los microorganismos.
Relacionar las caractersticas de desarrollo con las necesidades de oxgeno molecular.
Clasificar nutricionalmente a los microorganismos de acuerdo con sus fuentes de
energa y requerimientos de carbono, nitrgeno y oxgeno.
GENERALIDADES

Algunos nutrientes constituyen los bloques a partir de los cuales la clula elabora
macromolculas estructurales y funcionales, mientras que otros sirven como donadores de
electrones (fuente de energa) y algunos ms como aceptores finales de electrones sin ser
incorporados directamente al material celular. A veces un mismo nutriente puede
desempear todas las funciones, lo que depender del tipo de microorganismo y de las
condiciones ambientales.

La forma qumica especfica bajo la cual los microorganismos adquieren el carbono,

nitrgeno, azufre, fsforo y oxgeno, as como su energa, es muy variable, lo que determina
que los microorganismos presenten mltiples tipos nutricionales. Una clasificacin nutricional
sencilla es aquella que se basa en dos variables: la naturaleza de las fuentes de energa y de
carbono.

Con relacin a la fuente de energa los microorganismos se clasifican en dos grupos:

Fottrofos, estos utilizan la energa electromagntica (luz) para su desarrollo.
Quimitrofos, que obtienen su energa a partir de la oxidacin de compuestos
qumicos, y que a su vez se subdividen en:
o Quimiolittrofos (oxidacin de compuestos inorgnicos)
o Quimiorgantrofos (oxidacin de compuestos orgnicos)

Con respecto a la fuente de carbono, se clasifican como:

Auttrofos, microorganismos que usan CO2 y carbonatos.
Hetertrofos, aquellos que utilizan compuestos orgnicos.

De acuerdo con estos criterios, los microorganismos se ubican en cuatro clases nutricionales
las que se describen en el cuadro 1. No obstante, la versatilidad fisiolgica de los
microorganismos determina que la clasificacin expuesta no sea de ninguna manera estricta,
como lo demuestran los siguientes ejemplos: algunos microorganismos fotoauttrofos crecen
tambin en la oscuridad comportndose como quimiohetertrofos. Esta versatilidad se
conoce con el trmino de facultativo. Asimismo, algunas bacterias y algas fotoautotrficas
son incapaces de sintetizar alguno de sus constituyentes celulares a partir de CO2, por lo que
generalmente viven asociadas con otros microorganismos que le proporcionan este
componente y cuando se les cultiva en medios artificiales es necesario suministrar ese
compuesto orgnico.

Es importante recalcar que aun cuando el grupo bacteriano es, desde el punto de vista
estructural, el ms simple de los microorganismos (procariotes); fisiolgicamente es el ms
complejo y el nico en el que se encuentran todos los tipos nutricionales descritos.
Cuadro1. Clasificacin nutricional de los microorganismos.

Ejemplos de
Clases Fuente de Fuente de
grupos
nutricionales energa carbono
microbianos
Algas y algunas
Fotoauttrofas Luz CO2, Carbonatos
bacterias
Compuestos Bacterias verdes y
Fotohetertrofas Luz
orgnicos rojas
Oxidacin de Bacterias
compuestos oxidantes del
*Quimioauttrofas inorgnicos como CO2 nitrgeno,
NH3, NO2- H2, H2S. hidrgeno, azufre
So, S2O3, Fe++ y hierro
Protozoarios,
Oxidacin de
Sustratos hongos y la
**Quimiohetertrofas compuestos
orgnicos mayora de las
orgnicos
bacterias
*Debido a la capacidad distintiva de crecer en medios estrictamente minerales, tambin se les denomina
quimiolittrofos (de la palabra griega lithos, roca).
**Estos microorganismos utilizan al mismo nutriente como fuente de carbono y de energa

A los compuestos orgnicos que actan como precursores o como constituyentes de material
celular y que no pueden ser sintetizados a partir de compuestos de carbono ms sencillos se
les llama colectivamente factores de crecimiento; stos, por su estructura qumica y accin
metablica, se dividen en tres clases:
Aminocidos, requeridos como constituyentes de protenas.
Purinas y pirimidinas, requeridos como constituyentes de los cidos nucleicos.
Vitaminas, representadas por diversos compuestos orgnicos que forman parte de
grupos prostticos o centros activos de numerosas enzimas.

Con base en las necesidades de factores de crecimiento, se emplean otros dos trminos:
Prottrofos, microorganismos capaces de cubrir todas sus necesidades a partir de la
fuente principal de carbono, por lo tanto no requieren factores de crecimiento.
Auxtrofos, son aquellos que requieren, de uno o ms nutrientes orgnicos adems
de la principal fuente de carbono.

El nitrgeno y el azufre se encuentran en los compuestos orgnicos de la clula,

principalmente en forma reducida como grupos amino y sulfhidrilo. Los microorganismos
toman dichos elementos en diferentes estados de oxidorreduccin y pueden tener las
siguientes funciones:
Fuente de nitrgeno y azufre, en cuyo caso son asimilados e incorporados al material
celular.
La mayora de los microorganismos fotosintticos, muchas bacterias no fotosintticas
y los hongos, asimilan estos dos elementos en estado inorgnico como NO3- y SO4=, y
su utilizacin implica una reduccin preliminar; de nitratos a amonaco y de sulfatos a
sulfuro para su incorporacin al material celular, este proceso se conoce como
reduccin asimiladora de nitratos o de sulfatos.
Otros microorganismos son incapaces de efectuar esta reduccin, por lo que estos
elementos deben ser proporcionados como sales de amonio, o como sulfuros, o como
compuestos orgnicos que los contengan como la cistena. En este caso, el
aminocido puede ser adems fuente de carbono y de energa.
Existen algunas bacterias que son capaces de utilizar el N2 atmosfrico, para ello lo
reducen a amonaco a travs de un proceso tambin asimiIatorio denominado fijacin
de nitrgeno.

Donadores de electrones, en las bacterias quimiolittrofas, la energa se obtiene por

oxidacin de amonaco a nitritos y stos a nitratos, como ocurre con las nitrificantes; o bien
por la oxidacin de sulfuros, azufre o tiosulfatos a sulfatos como lo hace Thiobacillus
thioxidans.

Aceptores de electrones, en este caso los nitratos se reducen a nitritos, xidos de nitrgeno
y nitrgeno elemental a travs de un proceso desasimilatorio conocido como desnitrificacin.
Del mismo modo los sulfatos pueden ser reducidos a sulfuros. Ambos procesos se llevan a
cabo en condiciones de anaerobiosis.

El fsforo es asimilado como fosfatos de origen inorgnico u orgnico y forma parte de las
membranas celulares, del material gentico y del ATP. Concentraciones elevadas de fosfatos
inorgnicos determinan la inhibicin en el crecimiento de muchos microorganismos, aunque
algunos son tolerantes.

El oxgeno, como constituyente universal de las clulas, es un nutrimento proporcionado en

cantidades abundantes por el agua; sin embargo, la mayora de los microorganismos
requieren adems oxgeno molecular. Respecto a la necesidad o tolerancia de esta
molcula, se tiene que los microorganismos se clasifican en cinco grupos:

Aerobios estrictos, aqullos que crecen de manera obligada en condiciones xicas o

aerobias con presencia de tensiones normales de oxigeno, el que utilizan como
aceptor final de electrones para cubrir sus necesidades energticas.
Microaeroflicos, los que crecen en tensiones de O2 menores a las del aire o
condiciones microxicas.
Facultativos, emplean alternativamente oxgeno molecular u otros compuestos
inorgnicos u orgnicos como aceptores finales de electrones por lo que crecen de
acuerdo a las condiciones que prevalecen en su hbitat, aerobias o anaerobias.
 Anaerobios estrictos, aqullos que no requieren de este elemento para su desarrollo,
y la presencia de O2 inhibe su desarrollo o incluso provoca su muerte. Tal es el caso
de las bacterias reductoras de sulfatos y de las bacterias metanognicas que utilizan
el CO2 como aceptor de electrones y lo reducen a metano.
Aerotolerantes, son organismos anaerobios, pero que a diferencia de los estrictos,
estos toleran el O2 y crecen en su presencia aunque no puedan utilizarlo.

MATERIAL

Marcador o etiquetas
Mechero
Asa
Gradilla
Pipeta automtica (100 L) con puntas estriles
Tubos de 13 x 100 con 5.0 mL de solucin salina isotnica (SSI) estril
Tubos de 16 x 150 con tapn de rosca con 10 mL de los medios indicados en el cuadro 2.
(1 tubo con los medios 1, 2 y 3 y dos con los medios 4, 5 y 6.
Tubos de ensaye de 15 x 120 con tapn de rosca con 7 mL de medio fluido de tioglicolato
Portaobjetos
Pipetas de 1.0 mL estriles o Pasteur con bulbos de goma
Frasco gotero con solucin A del reactivo de Griess (cido sulfanlico)
Frasco gotero con solucin B del reactivo de Griess ( naftil amina)
Frasco gotero con reactivo de Nessler
Zinc en polvo
Incubadora a 37 C
Incubadora a 28 C
Cultivos de los siguientes microorganismos: Algas, nitrificantes, Azotobacter sp.,
Escherichia coli y Saccharomyces sp. Cepas de referencia (para determinar necesidades
de oxgeno molecular) en medios de cultivo lquido: Clostridium sp., Enterobacter sp.,
Micrococcus luteus, Pseudomonas aeruginosa y Streptococcus sp.

MTODO

1. Rotular todo el material:

a) Los tubos con diferentes fuentes de carbono y energa de acuerdo a las indicaciones
del cuadro 2.
b) Los tubos con tioglicolato con el nombre de las cepas correspondientes (v. figura1).
2. Someter a ebullicin los tubos con caldo tioglicolato hasta la completa reduccin del
indicador (resarzurina).
3. Colocar los tubos en una gradilla y dejar enfriar, teniendo cuidado de no agitarlos.
4. Inocular cada uno de los tubos de acuerdo con las instrucciones de la figura 1.
5. Incubar los tubos con tioglicolato fluido a 37C durante 48 horas y los otros tubos a 28 C
en las condiciones indicadas en el cuadro 3.
Cuadro 2. Formulacin de los medios de cultivo para establecer necesidades de
energa, carbono y nitrgeno en los microorganismos en estudio.

Clave de medios de cultivo

Ingredientes 1 2 3 4 5 6
g/L
MgSO4.7H2O 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
K2HPO4 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Na2CO3
KNO3 1.0 1.0
NH4Cl 1.0 1.0
Peptona 1.0
Glucosa 10.0 10.0 10.0 10.0

Microorganismo A B C D,E D,E D,E

A=Alga, B=Nitrificante, C=Azotobacter, D=Bacteria, E=Hongo

NOTAS:
Evitar tocar los diferentes medios de cultivo con la punta de la pipeta.
Para inocular Clostridium sp. ser necesario obtener la muestra del fondo del tubo, y evitar
agitar el cultivo; del mismo modo depositar la muestra en el fondo del tubo a inocular. Este
procedimiento deber realizarse rpidamente.

4 5 6 4 5 6

Figura 1. Procedimiento para la inoculacin de microorganismos en los diferentes

medios de cultivo.
Cuadro 3. Condiciones de incubacin.

Clave de medio de Tiempo

Cultivo microbiano Otros
cultivo (das)
1 Algas Luz
21
2 Nitrificantes
3 Azotobacter 2a7
4 Escherichia coli
4 Saccharomyces sp
Aerobiosis
5 Escherichia coli
2
5 Saccharomyces sp
6 Escherichia coli
6 Saccharomyces sp

6. Observar a los 2 das el desarrollo en los medios 3 a 6 y a los 21 das en los medios 1 y
2. Registrar los resultados en el cuadro 4.
7. Revelar, a los dos das, la presencia de amonio, nitritos y nitratos en los tubos 3 a 6, y a
los 21 das en los tubos 1 y 2. Para ello con una pipeta estril tomar una alcuota de cada
tubo y transferirla a dos portaobjetos:

a) Amonio. En uno de ellos agregar una gota del reactivo de Nessler. La formacin de un
precipitado de color amarillo-naranja o rojo ladrillo indica la presencia de amonio. El
color depende de la concentracin del ion.

El amonio reacciona en condiciones alcalinas con el Reactivo de Nessler(1) (yoduro mercrico

dipotsico) o para formar un precipitado anaranjado(2).

b) Nitritos y nitratos. En el segundo agregar los reactivos de Griess en el siguiente

orden: una gota del reactivo A (cido sulfanlico) y una gota del reactivo B ( naftil
amina). El desarrollo de un color rojo indica la presencia de nitritos.
En caso de no obtener color, agregar una pizca de polvo de zinc. La aparicin de un
color rojo demostrar la presencia de nitratos.

El nitrito reacciona con el cido sulfanlico y dimetil--naftilamina, lo que origina la formacin

de un compuesto diazonio, -sulfobenceno-azo--naftilamina de color rojo.
8. Registrar los resultados en el cuadro 5.
9. Revisar el crecimiento en cada uno de los tubos con tioglicolato a las 48 horas de
incubacin. Registrar los resultados en el cuadro 6.

RESULTADOS

Cuadro 4. Crecimiento microbiano en medios de cultivo con diferentes fuentes de

energa y carbono.

Tiempo de incubacin Clasificacin con base

Clave del
(das) en fuentes de
medio de Microorganismo
2 21 Energa Carbono
cultivo
* Desarrollo
1 Algas ND
2 Nitrificantes ND
3 Azotobacter ND
4 Escherichia coli ND
4 Saccharomyces ND
5 Escherichia coli ND
5 Saccharomyces ND
6 Escherichia coli ND
6 Saccharomyces ND
ND = No determinado
*+++ = abundante, ++ = medio, + = escaso, - = sin desarrollo.
Cuadro 5. Transformaciones de las diferentes fuentes de nitrgeno.

Tiempo de incubacin
Clave del
(das)
medio de Microorganismo
2 21
cultivo
NH4+ NO2- NO3- NH4+ NO2- NO3-
1 Algas ND ND ND
2 Nitrificantes ND ND ND
3 Azotobacter ND ND ND
4 Escherichia coli ND ND ND
4 Saccharomyces ND ND ND
5 Escherichia coli ND ND ND
5 Saccharomyces ND ND ND
6 Escherichia coli ND ND ND
6 Saccharomyces ND ND ND
ND = No determinado, NH4+ (Amonio) + o , NO2- (Nitritos) + o , NO3- (Nitratos) + o

Cuadro 6. Desarrollo microbiano de las cepas de referencia inoculadas en tioglicolato

fluido.

Microorganismo Zona de desarrollo en el tubo Clasificacin

Pseudomonas aeruginosa
Enterobacter sp
Microccus luteus
Streptococcus sp
Clostridium sp
Problema

GUA DE OBSERVACIN

Con base en los resultados obtenidos y la informacin previamente consultada:

Indicar si hay relacin entre el tipo de microorganismos y las fuentes de carbono y

energa de los medios de cultivo empleados.
Indicar los iones que aparecieron en cada medio de cultivo.
Indicar las transformaciones qumicas (con reacciones) de nitrgeno que se llevan a
cabo en los siguientes medios de cultivo y completar el cuadro 7:
o Sin nitrgeno
o Con cloruro de amonio
o Con nitrato de potasio
o Con protenas
Explicar la funcin (fuente de nitrgeno, donador o aceptor de electrones) de cada uno
de los compuestos anteriores en cada medio de cultivo.
Con base en los resultados obtenidos en el tioglicolato fluido y la informacin previamente
consultada. Indicar si hay relacin entre el patrn de desarrollo a lo largo del tubo y los
microorganismos empleados.
 Explicar el papel que desempea el oxgeno en el metabolismo microbiano.
Consultar otra bibliografa e indicar si los microorganismos en estudio requieren de
factores de crecimiento y cmo se clasifican con relacin a sus necesidades de
oxgeno molecular.

Cuadro 7. Funcin del nitrgeno, tipo de transformaciones y grupo fisiolgico con

base en las transformaciones de nitrgeno.
Microorganismo
Clave del medio

Transformacin
Funcin del N

despus de la
adicionado al

incubacin

fisiolgico
Presencia

Grupo
medio
NH4+
1 Algas NO2-
NO3=
NH4+
2 Nitrificantes NO2-
NO3=
NH4+
3 Azotobacter NO2-
NO3=
NH4+
4 Escherichia coli NO2-
NO3=
NH4+
4 Saccharomyces NO2-
NO3=
NH4+
5 Escherichia coli NO2-
NO3=
NH4+
5 Saccharomyces NO2-
NO3=
NH4+
6 Escherichia coli NO2-
NO3=
NH4+
6 Saccharomyces NO2-
NO3=
DISPOSICIN DE DESECHOS

1. Esterilizar los tubos en autoclave, para ello:

Retirar las etiquetas, marcas de plumn o masking-tape empleados para
identificar el material.
Colocar los tubos en botes metlicos
Esterilizar.
2. Lavar el material de vidrio.
3. Depositar el papel de envoltura en el bote de basura correspondiente.

BIBLIOGRAFA

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