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Mode opratoire recherche du Vibrio cholerae dans lenvironnement

Version n1 du 21072011

Mode opratoire :
Recherche de
Vibrio Cholerae dans lenvironnement hydrique

Rdacteurs :

Dr SUDRE Bertrand (Chercheur Affili lUniversit de Franche-Comt)


Mr LE GOFF Nicolas (Fondation Veolia Environnement)

Partenaires de mise en uvre :

Action Contre la Faim (DUNOYER Jessica)


Fondation Veolia Environnement (HAASER Franck LE GOFF Nicolas)
Laboratoire Farcha ()

Relecteurs externes :

Mr MOSQUERON Luc (VEOLIA Environnement Recherche et Innovation)

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Mode opratoire recherche du Vibrio cholerae dans lenvironnement

COORDONNEES DES PARTICIPANTS

Nom Prnom Institution Position adresse email tlphone


Jessica DUNOYER ACF-F PM Wash cholra cap washurgcap@td.missions- +235 62 42 61 73
acf.org
Bertrand Sudre UMR chrono MD PHD bsudre@free.fr +46 700 752 105
environement,
Besanon
DIGUIMBAYE-DJAIBE LRVZ Directrice adj. Diguimbayedjaibe.c@gmail.com +235 66 29 57 34
COLETTE
NGANDOLO BONGO NARE LRVZ Chef de Service Bongo_nov@yahoo.fr +235 66 23 05 24
BACTERIOLOGIE Recherches
et Diagnostics
ABAKAR NAMINOU LRVZ Responsable de lUnit naminoumba@yahoo.fr +235 66 99 99 41
MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE
NDILASSOUM NELOUM LRVZ Point focal ANALYSE DEAU ndilassoumlucie@yahoo.fr +235 66 83 10 91
LUCIE
HAASER FRANCK Fondation Franck.HAASER@veolia.com
Veolia
LEGOFF NICOLAS Fondation nicolas.le-goff@veolia.com +33(0)1 55 23 42 25
Veolia +33(0)6 10 37 30 17

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TABLE DES MATIERES


1. OBJECTIFS ET RESULTATS DE LETUDE........................................................................................................................ 5
1.1. CONTEXTE ............................................................................................................................................................. 5
1.2. OBJECTIFS ............................................................................................................................................................. 6
1.3. RESULTAT 1 : VALIDATION AU LABORATOIRE DUNE METHODE QUALITATIVE ET QUANTITATIVE DISOLEMENT DU VIBRION
CHOLERAE 6
1.4. RESULTATS 2 : FORMATION DU PERSONNEL ................................................................................................................. 9
1.5. RESULTATS 3 : RECHERCHE DE LA PRESENCE DU V.CHOLERAE DANS LENVIRONNEMENT ........................................................ 9
2. SCHEMA DE PRINCIPE DES DEUX METHODES .......................................................................................................... 10
3. PRELEVEMENT DE TERRAIN DE TYPE HYDRIQUE ..................................................................................................... 11
4. MODE OPERATOIRE POUR LISOLEMENT DU VIBRIO CHOLERAE DANS DES ECHANTILLONS DEAU ..................... 12
4.1. METHODE QUALITATIVE ......................................................................................................................................... 12
4.1.1. Filtration...................................................................................................................................................... 12
4.1.2. Ensemencement .......................................................................................................................................... 12
4.1.3. Lecture ........................................................................................................................................................ 12
4.1.4. Confirmation ............................................................................................................................................... 12
4.2. METHODE QUANTITATIVE ....................................................................................................................................... 13
4.2.1. Filtration...................................................................................................................................................... 13
4.2.2. Lecture ........................................................................................................................................................ 13
4.2.3. Confirmation ............................................................................................................................................... 13
4.2.4. Test au Latex ............................................................................................................................................... 14
4.2.5. Conservation des souches positives ............................................................................................................ 14
5. BIBLIOGRAPHIE ......................................................................................................................................................... 14
ANNEXES............................................................................................................................................................................. 15
A. GELOSE SELECTIVE TYPE TCBS...................................................................................................................................... 15
B. GELOSE NON SELECTIVE TYPE GNA ............................................................................................................................... 17
C. COLORATION DE GRAM .............................................................................................................................................. 18
D. TEST DOXYDASE........................................................................................................................................................ 20
E. TEST AU LATEX .......................................................................................................................................................... 21
F. ENSEMENCEMENT EN STRIE ......................................................................................................................................... 22
G. TABLEAU DES CONSOMMABLES .................................................................................................................................... 24
H. LABORATOIRE DE CONFINEMENT : SECURITE BIOLOGIQUE NIVEAU 2 .................................................................................... 25
I. LISTE DES EQUIPEMENTS ............................................................................................................................................. 26
J. CALIBRAGE DE LA METHODE QUANTITATIVE .................................................................................................................... 27
K. PLANNING HEBDOMADAIRE DU PROGRAMME DANALYSE .................................................................................................. 28

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LISTE DES TABLEAUX ET FIGURES

TABLEAU 2: DESCRIPTION DES ETAPES DE VALIDATION ........................................................................................................ 8


TABLEAU 1: PROJECTION INDICATIVE DES ANALYSES A REALISER ......................................................................................... 9
TABLEAU 3: TABLEAU DES DILUTIONS ........................................................................................................................................... 13

FIGURE 1: PLAN DE VALIDATION DES METHODES DANALYSES .............................................................................................................. 7


FIGURE 2: SCHEMA METHODOLOGIQUE ....................................................................................................................................... 10

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1. Objectifs et rsultats de ltude

1.1. Contexte

Les pidmies de cholra sont rcurrentes dans les pays du bassin du lac Tchad, en particulier depuis une
vingtaine dannes. Les sources de contamination et les modes de transmission sont encore mal compris,
malgr les hypothses proposes ds les annes soixante-dix portant sur la contamination des ressources
hydriques et le rle potentiel de la contamination interhumaine par les aliments partages/eau dans les
pidmies de cholra en zone subsahlienne.

En 2010, aprs lintervention dACF au Tchad, un rapport de capitalisation de lintervention lors de l


pidmie a soulign l importance d un cadre logique danalyse pour lidentification des voies de
transmission pour lorientation des stratgies de lutte.

En 2011, Action contre La Faim participe la rponse oprationnelle lpidmie de cholra au Tchad.
En parallle, des actions de rponses de terrain un programme de recherche oprationnelle a t mis en
place pour prolonger ce travail de capitalisation qui a dbut en janvier 2011. Un travail collaboratif est
ralis avec lUniversit de Franche Comte, pour lorientation et la rdaction de ce travail pilote en
microbiologie de lenvironnement, ainsi quun soutien oprationnel et technique est apport par la
Fondation Veolia Environnement, dans le cadre de ces travaux pour la Global Alliance Against Cholera
(http://www.choleraalliance.org/).
Le rle de la microbiologie de lenvironnement dans la lutte contre le cholra peut apporter des informations
pour la prise de dcision oprationnelle et assoir ainsi les recommandations sur la prvention du risque de
transmission auprs des populations exposes. Il est une partie intgrante dune approche transversale
pour la rponse aux questions de sant publiques.
Ce travail pilote na jamais t ralis au Tchad, et participe au dynamisme des capacits de recherche et
lchange des comptences et dau sein des laboratoires inclus dans le projet.

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1.2. Objectifs

Ce document a pour objectif de prsenter une mthode didentification et de quantification du vibrion


cholrique Vibrio Cholerae O1 dans des prlvements hydriques environnementaux. Les mthodes
proposes sont issues de la bibliographie existante et adaptes au contexte et aux objectifs de ltude.

Le protocole sera msie en deux tapes : tout dabord valid en laboratoire avec la participation de plusieurs
techniciens danalyses microbiologiques du laboratoire de Recherche vtrinaire et zoologique de Farcha
Ndjamena, et ensuite mis en application dans une phase pilote a partir de diffrents prlvements
environnementaux provenant de campagne dchantillonnage de terrain.

Le but de ce travail est de valider et doptimiser le mode de prlvement et danalyse afin de pouvoir
tablir la prsence/labsence du Vibrio Cholerae dans des prlvements provenant de diffrents milieux
hydriques tels que leau de marre, de fleuves au point de puisage, les puits utiliss pour la consommation
humaine ou des jarres de conservation de l eau au sein du domicile.

Les rsultats attendus sont les suivants :

1.3. Rsultat 1 : Validation au laboratoire dune mthode qualitative et quantitative disolement du


Vibrion cholerae

La validation de ces deux mthodes se fera en plusieurs tapes, comme dcrites dans la figure n 1 ci-
dessous. Ces diffrentes tapes permettront de valider :
la prsence de Vibrio cholerae O1 laide de la mthode qualitative (sur des solutions titres et sur
des chantillons prlevs sur le terrain, voir en annexe K).
valider la mthode quantitative aprs le calibrage laide de standard Mac Farland et de solutions
titres (voir annexe J).

La validation de la mthode quantitative se fera en quatre tapes qui permettront de vrifier :


la sensibilit et la gamme de mesure,
la variabilit du comptage,
lutilisation dune mthode densemencement par dpt de membrane sur la glose,
sa faisabilit sur des chantillons de terrain.

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Validation des mthodes

Mthode quantitative

Test QT-1 : Gamme de comptage


Evaluation de la gamme de comptage de la
mthode quantitative sur des solutions tmoins.
Test de calibration Mc Farland :
Obtenir une corrlation entre la charge en vibrio
cholerae et le nombre dUnit Formant Colonies
Mthode qualitative pour un volume donn.

Test QL-1 : Sensibilit de la mthode Test QT-2 : Variabilit du comptage


Evaluation de la sensibilit de la mthode Evaluation de la variabilit du comptage sur des
prsence/absence sur des solutions tmoins. solutions tmoins titres

Test QT-3: Dposition de la membrane


Validation de la mthode de dposition de
membrane (imprgnation versus dpt)
Test QL-2 : Sensibilit de la mthode et mesure de labattement sur des solutions
Evaluation de la sensibilit de la mthode tmoins
prsence/absence sur des chantillons terrain ;

Test QT-4 : Gamme de comptage :


Evaluation de la gamme de comptage de la
mthode quantitative sur des chantillons terrain

Figure 1: plan de validation des mthodes danalyses

Le dtail de la rpartition des diffrentes solutions titres et des chantillons terrain est donn dans le
tableau de lannexe h, rpartition des consommables.

La validation de ces deux mthodes devra galement permettre dajuster les temps et dures des
diffrentes tapes danalyse afin doptimiser le chronogramme initial dfinit au chapitre 3.

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Etapes de culture, didentification et


Test But du test Objectif Matriel :
de comptage:
Caractres macroscopiques 1 Solution titre VC
Valider la mthode Caractres microscopiques 3 filtres
de dtection Etat frais 3 milieu
Tester la
Mthode qualitative

Test QL-1 prsence / absence Gram enrichissment


sensibilit 3 TCBS
sur des solutions Test oxydase
tmoin Serotype 3 GNA
Galrie API 20 E 3 test oxydase
3 galerie API 20 E
4 chantillons
Caractres macroscopiques terrain
Valider la mthode Caractres microscopiques 20 filtres
de dtection Etat frais 4 milieu
Tester la
TEST QL-2 prsence / absence
sensibilit
Gram enrichissement
sur des Test oxydase (4*50ml)
chantillons terrain Serotype 4 TCBS
Galrie API 20 E 12 GNA
4 test oxydase
Obtenir une Raliser une gamme de solution de VC
corrlation entre de concentration croissante, effectuer 6 standards Mac
Raliser
la charge en une comparaison avec des standards Farland
une courbe
vibrio cholerae et Mac Farland aprs 24h d'incubation, 6 solutions titres
de
le nombre dUnit effectuer les filtrations et 6 menbranes
correlation
Formant Colonies enrichissements sur TCBS, vrifier les 6 TCBS
TEST QT-1
pour un volume caractres macroscopiques, puis
Evaluation de la Comptage des colonies sur filtre aprs
Mthode quantitative

Tester la dpt sur TCBS 4 Solution titre VC


gamme de
gamme de Sensibilit et gamme de la mthode 8 filtres
comptage sur des
mesure 4 solutions de concentrations dcroissantes 8 boites TCBS
solutions tmoins
(? 10-2 10-8 = concentration ++++ +)
Estimation de la
Permettra davoir un premire estimation
variabilit de la Tester la 2 Solution titre VC
de la variabilit de la mthode pour deux
TEST QT-2 mthode sur des variabilit du
concentrations connues pour un volume
8 filtres
chantillons comptage 8 boites TCBS
donne de 100ml
tmoins
Tester la Connaitre le pourcentage de recueil sur 1 Solution titre VC
Mthode de dpt filtre avec la mthode dapposition sur
mthode de 4 filtres
TEST QT-3 du substrat / %
dposition et milieu glos. 16 boites TCBS
dabattement - 4 empruntes successives (% de recueil)
l'abattement
- 1 valuation de la variation de la
Evaluation de la Comptage des colonies sur filtre aprs 4 chantillons
mthode Tester la terrain (Mare,
dpt sur TCBS
TEST QT-4 quantitative sur gamme de
Sensibilit et gamme de la mthode Puits, Point de
des chantillons mesure stockage, Rivire)
4 chantillons de provenance diffrentes
terrain 20 filtres

Tableau 1: Description des tapes de validation

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Mode opratoire recherche du Vibrio cholerae dans lenvironnement

1.4. Rsultats 2 : Formation du personnel

La validation de ces deux mthodes sera effectue dans le Laboratoire de Recherche vtrinaire et
zoologique de Farcha Ndjamena (LRVZ).
Cette tape de validation des techniciens microbiologistes du Laboratoire de Rfrence de Ndjamena
(Microbiologie humaine) et du LRVZ (Microbiologie environnementale et animale) permettra de raliser le
protocole et doptimiser sa mise en place.
La formation permettra aux techniciens (3 binmes) de tester les deux mthodes comme indiqu dans le
programme danalyse de lannexe L.

1.5. Rsultats 3 : Recherche de la prsence du V.cholerae dans lenvironnement

Les deux tapes prcdentes seront ensuite suivies dune campagne de prlvements de terrain pour la
recherche et la quantification, qui permettra dapprofondir les connaissances sur la transmission hydrique.

La ralisation de la mthode quantitative (pour les chantillons positifs par la mthode qualitative) est
base sur duplicate de chaque prlvement, pour lesquels le codage des duplicates sera important, la
conservation durant la ralisation de la mthode qualitative (temprature, ambiante/ abris de la lumire/
volume

Sur lensemble du projet, 52 chantillons seront analyss rpartis comme suit :

site nbr site N chantillons n campagne n prlvement


Marre 4 3 1 12
Fleuve / Lac 4 3 1 12
Puits 4 2 1 8
Jarres 5 2 2 20
somme ANALYSE 52
Tableau 2: projection indicative des analyses raliser

Ce tableau correspond une projection indicative des analyses raliser. Une adaptation
lpidmiologie de la maladie sur le terrain peut amener une modification du type et du nombre
de prlvements.

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2. Schma de principe des deux mthodes

Prlvement

Mthode qualitative dite de"pr-


a.Filtrer sur une ou plusieurs membranes (max 5 pour 1litre), noter les volumes exactes.
b.Les placer ensuite dans un tube d'eau peptonne alkaline de 50ml.
c.Agiter vigoureusement.

enrichissement"
Incuber 16h 30 C

Colonies mal a.Sortir les chantillons sans les agiter.


isoles b.Collecter le film blanchatre en surface l'aide d'une oeuse.
c.Effectuer un isolement sur milieu TCBS 1.

Incuber 16h 24h 37 C

Non Si colonie bien isole d'aspect plates, lisses et de couleur jaune


Oui

a.Filtrer 1 litre du deuxime chantillon sur une ou plusieurs membranes (max 5


pour 1litre), noter les volumes exactes.

Mthode quantitative dite


b.Placer ensuite chaque membrane sur des boites de gloses TCBS 1. Nota: si un trop
grand nombre de
colonies sont
Incuber 24h 37 C prsentes sur la

de"titration"
membrane,
procder des
dilutions afin
a.Les colonies supectes apparraissent jaunes et plates et dgradent la d'encadrer le
saccharose. rsultats, et
b.Dnombrer l'ensemble des colonies suspectes pour chaque boite, ensuite appliquer ensuite
additionner les rsultats afin d'obtenir la concentration pour un litre un facteur correctif
Echantillon
d'chantillon. au rsultats du
ngatif
c. Repliquer une colonie supsecte par boite de glose TCBS 1, sur une glose dnombrement
non slctive GNA 1, afin de procder l'identification de la colonie suspect.

Repliquer les colonies supects sur une


glose non slective de type GNA 1.

Incuber 16h 24h 37 C


Mthode de Confirmation

OXYDASE Raliser le test Raliser le test GRAM


ngatif d'OXYDASE1 de GRAM1 positif

OXYDASE positif GRAM ngatif

Raliser une galerie Pas


Raliser un test
d'identification d'agglutination
au LATEX1
API 20E

Agglutination
Incuber 24h 36 C

Rsultat

Figure 2: Schma mthodologique

Les modes opratoires sont prsents en annexe.

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3. Prlvement de terrain de type hydrique

Bonne pratique de prlvement :


Le prlever doit se laver les mains avant chaque prlvement et utiliser des gants jetables.
Raliser le prlvement deau en duplicate (2 fois 1 litre en bouteille PVC ou plastique strile).
Noter sur le terrain le lieu, lheure, la provenance (nom du lieu, village le plus proche et
coordonnes GPS si besoin /
Etiqueter les bouteilles avec les codages prpars au laboratoire (prlvements 1= P1 et
prlvement 2 =P2)
Un premier litre sera analys ds rception au laboratoire ou dans la journe (P1), lautre (P2) sera
stock ferm en chambre froide 4C et labri de la lumire.

Les rcipients doivent tre autoclavable, afin de pouvoir tre strilis ou usage unique. dfaut,
utilis des bouteilles deau minrale non usages.

Transport et conservation :
Les chantillons doivent tre transports dans une glacire ferme ( labri de la lumire) contenant
des pains de glace afin de maintenir une temprature infrieure 10C et arriver au laboratoire
moins de 12h aprs prlvement.

La glacire de transport doit tre lave et dsinfecte aprs chaque journe dutilisation (solution de
nettoyage 0.1% en chlore : dissoudre 1.5 gr de Hypochlorite de Calcium dans un litre deau).

Une traabilit des chantillons devra tre mise en place systmatiquement (fiche de suivi par
chantillon comportant le lieu, la date, lheure de prlvement ainsi que le nom du prleveur) et
lensemble des informations devra tre report sur un fichier regroupant lensemble des
informations.

Ces informations doivent tre consignes dans un cahier de laboratoire,


Un prlvement = une page

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4. Mode opratoire pour lisolement du Vibrio Cholerae dans des chantillons deau

4.1. Mthode qualitative

4.1.1. Filtration
Noter la date sur le cahier de paillasse, le codage, le type d chantillon et la provenance + initiale du
technicien sur la page ddie lchantillon
Noter les paramtres physico chimique (pH, Turbidit, salinit, temprature)
Filtrer un litre dchantillon sur des membranes de porosit 0.22 m. Si lchantillon est turbide, il
est possible dutiliser plusieurs membranes afin de pouvoir filtrer 1l sur au maximum de 5
membranes.
Placer les membranes enroules dans 50 ml deau pep tonne alcaline puis agiter vigoureusement.
Incuber pendant 16h 30C

4.1.2. Ensemencement

Sortir les chantillons de ltuve sans les agiter (!). En effet, les Vibrions se situent en surface le
surnageant est un film blanchtre la surface de la colonne de liquide.
Collecter le dveloppement en surface laide dune oeuse strile
procder un isolement en stries sur une boite de glose TCBS (il est prfrable davoir des boites
de 90 mm de diamtre car cela permet de meilleur isolement).

4.1.3. Lecture
,
tat frais : Aspect monomorphe, vol de moucherons du au flagelle polaire
Coloration de GRAM :=ngatif, flore monomorphe, de bacilles fins, en virgules
Sont considres comme colonies suspectes les colonies plates, lisses et de couleur jaune faisant
fermenter le saccharose1. Si les colonies ne sont pas correctement isoles, procder un nouvel
isolement sur glose slective TCBS.
Pour les tests de confirmation, il faut absolument travailler sur des souches pures.
ce moment la filtration et mise en culture pour la mthode quantitative pour les chantillons
suspects dtre positif.

4.1.4. Confirmation

Repiquer 3 colonies suspectes sur des gloses non slectives de type GNA2 pour identification
Incuber 16 24h 37C.
Aprs incubation, raliser test loxydase et la coloration de Gram3.

1
Ce caractre biochimique discriminant avec lensemble des autres vibrio ( lexception de Vibrio Mimicus) ne sera pas
test
2
Voir document en annexe
3
Voir document en annexe

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Si les tests doxydase et de coloration de Gram sont concluants, le test de mobilit et le test au latex sont
raliss .pres le test au latex Si les rsultats de sont pas concluant faire une galerie API 20E.
Test au Latex

Une fois les vibrio cholerae identifi, il convient, de vrifier leur appartenance au serogroupe (O1 ou 139)
laide du texte Latex, seul srogroupe responsable du cholra chez lhomme.

4.2. Mthode quantitative

Lanalyse quantitative sera ralise sur le deuxime chantillon (qui sera stock en chambre froide), lorsque
le premier chantillon, analys par la mthode qualitative, apportera un rsultat positif au premier
ensemencement.

4.2.1. Filtration
Filtrer un litre dchantillon sur des membranes de porosit 0.22m. Si lchantillon est turbide, il est
possible dutiliser plusieurs membranes afin de pouvoir filtrer 1 litre. Toutefois, un nombre
maximum de 5 membranes sera utilis, il est donc important de reporter sur le cahier de paillasse le
volume exact filtr afin de pouvoir exprimer ensuite le rsultat en nombre de colonies pour 100 ml.
Chaque membrane devra tre mise en culture indpendamment sur des boites de glose TCBS4 de
55mm
Incuber 37C pendant 24h.

4.2.2. Lecture
Les colonies suspectes apparaissent jaunes et plates, avec un halo.
Dnombrer les colonies suspectes sur chaque boite et additionnez les rsultats afin de connaitre la
concentration en vibrion prsent dans le volume filtr. Exprimer ensuite le rsultat en nombre de
colonies pour 100 ml (noter le comptage brutes et le nombre dUFC pour 100 ml)

Si un trop grand nombre de bactries sont prsentes sur les membranes rendant leur lecture impossible,
raliser des dilutions selon le schma ci-dessous :

Pur 1 \ 10 1 \ 100 1 \ 1000


100 mL dchantillon 10 mL 1 mL 0,1 mL
Tableau 3: Tableau des dilutions

Slectionner trois volumes en fonction de la charge bactrienne observe lors de la premire filtration.

4.2.3. Confirmation

Repiquer les colonies suspectes sur une glose non slective type GNA5.
Incuber 24h 37C.

4
Voir document en annexe
5
Voir document en annexe

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Mode opratoire recherche du Vibrio cholerae dans lenvironnement

Aprs incubation, raliser loxydase et la coloration de Gram.


Si les tests prcdents sont concluants raliser un test au latex, puis une galerie API 20E par
chantillon

4.2.4. Test au Latex

Une fois les vibrio cholerae identifi, il convient, de vrifier leur appartenance au serogroupe O1 laide du
texte Latex.

4.2.5. Conservation des souches positives

Les souches de vibrio cholerae isoles partir des chantillons environnementaux peuvent tre conserves
sur des boites de glose GNA pour des conservations court terme ou congel -80C (dans un bouillon
10% de glycrol) pour une conservation long terme.
Une alternative dans la conservation des collections de souche pure est lutilisation de glose de
conservation tubes de glose conservation (BIORAD 63683) la temprature ambiante et labri de la
lumire.

5. Bibliographie

Toxigenic Vibrio cholera in the aquatic environnement Alam. AEM. (2006).


Laboratory Methods for theDiagnosis of Epidemic Dysentery and Cholera - Centers for Disease
Control and Prevention Atlanta, Georgia (1999).
Detection, Isolation, and Identification of Vibrio cholerae from the Environment - Anwar Huq,
Christopher Grim, Rita R. Colwell, and G. Balakrish Nair - Current Protocols in Microbiology (2006)
Protocole AFSSA pour lidentification du Vibrio Cholera dans les produits de la mer (fv. 2010)
Laboratory methods for the diagnosis of V.cholerae - Centers for Disease Control and Prevention
Atlanta (1999)
Manuel de scurit biologique en laboratoire Organisation mondiale de la sant 3e dition (2005)
Vibrio cholerae in the Environment: A Simple Method for Reliable Identification of the Species- S.
Baron, S. Chevalier, and J. Lesne (2007)
Microbiologie des aliments Mthode horizontale pour la recherche des Vibrio spp. potentiellement
entropathognes - norme ISO_TS_21872-1;2007(F)
Environmental reservoirs of Vibrio cholerae and their role in cholera- Luigi Vezzulli, Carla Pruzzo,
Anwar Huq and Rita R. Colwell (2009)
Le diagnostic bactriologique du cholra - Marie-Laure Quilici Revue francophone des laboratoires
(Avril 2011)

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Mode opratoire recherche du Vibrio cholerae dans lenvironnement

Annexes

a. Glose slective type TCBS

DOMAINE DUTILISATION
La glose au Thiosulfate-Citrate-Bile-Saccharose (TCBS) constitue un milieu slectif destin lisolement de
Vibrio cholerae et des autres vibrions entropathognes (en particulier Vibrio parahaemolyticus) dans les
poissons, les produits de la mer et les autres prlvements biologiques dorigine animale.

HISTORIQUE
La formule dorigine, mise au point par Nakanishi, a t modifie ultrieurement par Kobayashy et al. pour
lisolement slectif des Vibrio pathognes.

PRINCIPES
- Les concentrations leves en thiosulfate et en citrate de sodium ainsi que la forte alcalinit du milieu
inhibent fortement la croissance des entrobactries.
- La bile de boeuf et le chlorure de sodium ralentissent la culture des entrocoques et inhibent le
dveloppement des germes Gram positif.
- Par acidification du milieu, rsultant de la fermentation du saccharose, les Vibrio provoquent le virage au
jaune de lindicateur au thymol et au bleu de bromothymol.
- partir du thiosulfate, qui constitue une source de soufre, la production de sulfure dhydrogne est
rvle en prsence de citrate ferrique. Tous les Vibrio sont H2S-ngatifs.

MODE DEMPLOI
- Refroidir et maintenir le milieu 44-47C.
- Couler en botes de Petri striles.
- Laisser solidifier sur une surface froide.
- Faire scher les botes ltuve, couvercle entrouvert.
- Ensemencer linoculum par talement en surface.
- Incuber 37C pendant 18 24 heures, labri de la lumire.
- sortir les boites en avance
LECTURE
Les colonies prsentent les aspects suivants :

Caractristiques Microorganismes

Colonies jaunes, planes, de 2 3 mm de diamtre Vibrio cholerae


Colonies jaunes, de grandes tailles Vibrio alginolyticus
Colonies jaunes ou translucides Vibrio fluvialis, Vibrio vulnificus
Colonies incolores centre vert Vibrio parahaemolyticus
Colonies bleues Pseudomonas, Aeromonas
Colonies minuscules, transparentes Entrobactriaces ou autres

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Mode opratoire recherche du Vibrio cholerae dans lenvironnement

FORMULE TYPE
(Pouvant tre ajuste de faon obtenir des performances optimales)
Pour 1 litre de milieu :
- Polypeptone ...................................................................................10,0 g
- Extrait autolytique de levure.............................................................5,0 g
- Saccharose ....................................................................................20,0 g
- Bile de boeuf bactriologique ...........................................................5,0 g
- Cholate de sodium ...........................................................................3,0 g
- Citrate de sodium...........................................................................10,0 g
- Thiosulfate de sodium....................................................................10,0 g
- Chlorure de sodium........................................................................10,0 g
- Citrate ferrique ammoniacal .............................................................1,0 g
- Bleu de bromothymol ..................................................................40,0 mg
- Bleu de thymol ............................................................................40,0 mg
- Agar agar bactriologique..............................................................14,0 g
pH du milieu prt--lemploi 25C : 8,6 0,2.

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Mode opratoire recherche du Vibrio cholerae dans lenvironnement

b. Glose non slective type GNA

NUTRITIVE (GELOSE)

Milieu dusage courant qui peut tre enrichi avec 10 % de sang ou autres liquides biologiques.

COMPOSITION (grammes/litre)
Extrait de viande de buf 1,0g
Extrait de levure 2,0g
Peptone 5,0g
Chlorure de sodium 5,0g
Agar 15,0g
pH 7,4 0,2

500 grammes permettent de prparer 17,9 litres de milieu.

PREPARATION
Verser 28 g de poudre dans un litre deau distille et porter bullition jusqu dissolution complte.
Striliser 15 minutes 121C lautoclave.

DESCRIPTION
La glose nutritive sert de milieu de culture de base pour repiquer les souches conserver, ou pour vrifier
la puret des subcultures avant deffectuer des tests biochimiques et srologiques. Ce milieu sous forme
semi-solide est utilis en tubes inclins (culot et pente) pour conserver des souches de rfrence.1
La glose nutritive contient 1,5 % dAgar et peut tre supplmente si ncessaire avec 10 % de sang ou
autres liquides biologiques. Ce milieu utilis sans additif convient la culture des germes qui ne prsentent
pas dexigence nutritive particulire.
Voir aussi la Glose de base au sang n2 (CM0271) pour un milieu plus riche en lments nutritifs.

CONSERVATION
Conserver le milieu dshydrat 1025C jusqu la date de premption indique sur le flacon. Conserver le
milieu prt lemploi 28C.

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Mode opratoire recherche du Vibrio cholerae dans lenvironnement

c. Coloration de Gram

MATERIEL
LAMES, COLORANTS, EVIERS ET BAC EN VERRE.

MODE OPERATOIRE

Raliser un frottis ou un talement


Fixer la prparation la flamme (normalement on fixe avec de lalcool et on flambe), scher
soigneusement puis laisser refroidir la lame.
Immerger les lames dans la solution de Cristal violet pendant 1mm.
Lavage l'eau en transvasant les lames
Immerger les lames dans du Lugol en les agitant
Laver nouveau l'eau
Dcolorer jusqu' disparition de la couleur violette dans l'alcool en faisant couler goutte goutte sur
la lame incline ou en immergeant les lames pendant une dizaine de secondes dans le dcolorant.
Laver l'eau.
Contre colorer avec la solution de safranine dilue pendant 20 30 secondes.
Laver l'eau et scher l'air.
Observer lobjectif X100, en immersion avec de l'huile.

RESULTAT
LES BACTERIES GRAM + SONT COLOREES EN VIOLET FONCE, LES BACTERIES GRAM - SONT COLOREES EN
ROSE, CECI ETANT DU A UNE DIFFERENCE DE COMPOSITION DE LA PAROI
LORSQUE L'ON COLORE PEU DE LAMES, PLUTOT QUE D'IMMERGER LES PREPARATIONS, ON PEU LES
RECOUVRIR DE COLORANTS. LE DECOLORANT DOIT ETRE CHANGE CHAQUE JOUR.

RISQUES D'ERREURS

FAUX GRAM (+) :

talement trop pais,


Dpt de colorant dans le flacon de violet de gentiane : filtrer le colorant pour y remdier,
Solution iode de Gram mal goutt,
dcolorant laiss trop peu de temps (globalement, mieux vaut trop que pas assez.
Solution de safranine laisse trs longtemps (plus d'une minute).

FAUX GRAM (-) :

Solution iode de Gram laisse trop peu de temps,


Dcolorant laiss trop longtemps et mal rinc,

REACTIFS

1- VIOLET DE GENTIANE - ADAPTATION DE HUCKER :

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Mode opratoire recherche du Vibrio cholerae dans lenvironnement

SOLUTION A :

Violet de gentiane 2 g
Alcool 95 20 ml

SOLUTION B :

Oxalate d'ammonium : 0,8 g


Eau distille 80 ml

MELANGER LES SOLUTIONS A ET B, LAISSER REPOSER 24 HEURES AVANT L'EMPLOI, VERSER A TRAVERS UN
PAPIER FILTRE DANS UN FLACON.

2- SOLUTION IODEE DE GRAM

Iode 1 g
Iodure de potassium 2 g
Eau distille 300 ml

DISSOUDRE D'ABORD L'IODURE DE POTASSIUM DANS ENVIRON 30 ML D'EAU DISTILLEE, AJOUTER L'IODE
ET MELANGER JUSQU'A DISSOLUTION. AJOUTER LE RESTE D'EAU DISTILLEE, MELANGER.
CONSERVER DANS UN FLACON EN VERRE BRUN OU EN PLASTIQUE OPAQUE (A L'ABRI DE LA LUMIERE).

3- SOLUTION DE SAFRANINE

SOLUTION A :

Safranine O 2,5 g
Alcool 95 qsp 100 ml

SOLUTION A BIS :

Solution A 10 ml
Eau distille 90 ml

4- DECOLORANT

MELANGER A PARTIES EGALE ALCOOL A 95 ET ACETONE. LE MELANGE EST A FAIRE EXTEMPORANEMENT.

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Mode opratoire recherche du Vibrio cholerae dans lenvironnement

d. Test doxydase

PRINCIPE
-. Il permet de mettre en vidence une enzyme : la phnylne diamine oxydase des bactries partir de leur
culture en milieu glos. Cette enzyme est capable doxyder un ractif : le N dimthyl paraphnylne
diamine.

MODE OPERATOIRE

Le ractif peut se trouver sous deux formes :


soit en solution : sur une lame de verre, dposer un carr de papier filtre et limbiber dune solution
frachement prpare de ractif,
soit sous la forme dun disque pr-imprgn par le ractif.
Dans les deux cas, craser avec une effilure de pipette Pasteur une colonie de germes tudier sur ce
papier (instrument noxydant pas le ractif).

RESULTAT

- Si la colonie prend une teinte rose, violette. Le germe possde une oxydase : le test est positif.
- Si la colonie reste incolore, le germe ne possde pas doxydase, le test est ngatif.

gauche test ngatif, droite test positif

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Mode opratoire recherche du Vibrio cholerae dans lenvironnement

e. Test au latex

REACTIFS

Antisrums polyvalents pour le srogroupe O1 et O139


lames de microscope en verre

MODE OPERATOIRE

1. Ajouter deux gouttes spares de PBS une lame de microscope.


2. Ajouter une anse de croissance frache partir d'une sous-culture de 6 16 heures de V. cholerae sur
milieu non slectif chaque goutte, et mlanger.
3. Ajouter une goutte de taille gale du groupe O1 antisrum polyvalent l'une des gouttes.
4. Mlanger la suspension antisrum-culture en inclinant la lame d'avant en arrire. Dterminer sil y a une
raction (dagglutination) en 0,5 1 min, ce qui indique un rsultat positif.
Lauto agglutination, c'est dire, une agglutination dans la solution saline sans srum, est indicative d'un
morphotype qui ne peut tre saisi par des antisrums. Pour le typage des colonies avec morphotype bruts,
voir le protocole joint au kit.
5. Test des colonies ntant pas du srogroupe O1 en utilisant lantisrum O139, et en rptant les tapes 1
4, mais son remplacement par un antisrum anti-O139 pour anti-O1 antisrum est possible

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Mode opratoire recherche du Vibrio cholerae dans lenvironnement

f. Ensemencement en strie
Source : http://www.commentfaiton.com/fiche/voir/10003/comment_ensemencer_un_milieu_solide_par_la_methode_des_stries_d_isolement)

DESINFECTEZ TOUT D'ABORD A L'ALCOOL VOTRE PLAN DE TRAVAIL. + CHLORE

ALLUMEZ LE BEC BUNSEN EN PRENANT SOIN D'OBTENIR UNE FLAMME BLEUE, AFIN DE STERILISER L'AIR
ALENTOUR DANS UN RAYON DE 10 CENTIMETRES.

VOUS NE DEVEZ PAS VOUS ECARTER AU-DELA DE CE SECTEUR, FAUTE DE QUOI VOUS RISQUERIEZ DE
CONTAMINER VOTRE BOITE DE PETRI.

RAPPELEZ-VOUS QUE VOUS AVEZ MIS DE L'ALCOOL SUR VOTRE PLAN DE TRAVAIL ...

LA BOITE DE PETRI A TEMPERATURE AMBIANTE TOUT EN LA LAISSANT FERMEE POUR LE MOMENT.

ESSAYEZ LE PLUS POSSIBLE DE NE PAS LA LAISSER OUVERTE DANS LE BUT D'EVITER TOUTE CONTAMINATION
INDESIRABLE.
INSCRIVEZ SUR LE COTE OU LE FOND DE LA BOITE A QUOI CORRESPOND LE CONTENU (NOM ECHANTILLON,
CONCENTRATION, DATE ...).

PASSEZ L'ANSE DANS LA FLAMME DU BEC BUNSEN JUSQU'A CE QU'ELLE DEVIENNE INCANDESCENTE, DANS
LE BUT DE LA STERILISER.

PATIENTEZ QUELQUES SECONDES LE TEMPS QUE LA TEMPERATURE DIMINUE, PUIS PLONGEZ L'ANSE DANS
LA SOLUTION BACTERIENNE.
FAITES EN SORTE QU'UNE GOUTTELETTE RESTE "PRISONNIERE" DE LA BOUCLE DE L'ANSE. C'EST CE VOLUME
QUE VOUS ALLEZ ENSEMENCER SUR VOTRE MILIEU.

OUVREZ LA BOITE DE PETRI, ET DIVISEZ MENTALEMENT CELLE-CI EN 3 PARTIES EGALES.

DEPOSEZ LA SOLUTION MICROBIENNE AVEC L'ANSE DANS LA 1ER TIERS DE LA BOITE EN


EFFECTUANT DES STRIES DANS UN MOUVEMENT DE VA-ET-VIENT, EN PRENANT SOIN DE NE PAS TRAVERSER,
CREUSER OU ARRACHER LE MILIEU.
VOUS DEVEZ LA DEPOSER UNIQUEMENT EN SURFACE.

REFERMEZ LA BOITE DE PETRI, ET PLONGEZ A NOUVEAU L'ANSE DANS LA FLAMME DU BEC BUNSEN JUSQU'A
L'INCANDESCENCE.
PATIENTEZ QUELQUES SECONDES, LE TEMPS QU'ELLE REFROIDISSE.

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Mode opratoire recherche du Vibrio cholerae dans lenvironnement

ROUVREZ VOTRE BOITE DE PETRI, ET EFFECTUEZ LE MEME MOUVEMENT DE STRIES DANS LE


2ND TIERS DE LA BOITE, EN PRENANT SOIN DE REPASSER SUR L'EXTREMITE DE LA DERNIERE STRIE
EFFECTUEE PRECEDEMMENT SUR LE 1ER TIERS, ET CELA DANS LE BUT DE "RECUPERER" SUR L'ANSE DE LA
SOLUTION (VOTRE ANSE ETANT STERILE A LA SUITE DE SON PASSAGE SOUS LA FLAMME, FAIRE DES STRIES
SANS RECUPERER DE LA SOLUTION DEJA PRESENTE SUR LA BOITE SERAIT INUTILE).

REFERMEZ LA BOITE DE PETRI.

PLONGEZ A NOUVEAU L'ANSE DANS LA FLAMME DU BEC JUSQU'A INCANDESCENCE. PATIENTEZ QUELQUES
SECONDES LE TEMPS QU'ELLE REFROIDISSE.

COMME PRECEDEMMENT, FAITES DES STRIES DANS LE 3E ET DERNIER TIERS DE VOTRE BOITE,
EN PRENANT GRAND SOIN DE RECUPERER DE LA SOLUTION EN REPASSANT UNE SEULE FOIS SUR
L'EXTREMITE DE LA DERNIERE STRIE EFFECTUEE DANS LE 2ND TIERS.

UNE FOIS VOUS STRIES TERMINEES, REFERMEZ LA BOITE DE PETRI. PLONGEZ L'ANSE DANS LA FLAMME DU
BEC BUNSEN JUSQU'A SON INCANDESCENCE, ET POSEZ-LA SUR LE PRISME.

VOTRE MILIEU EST AINSI ENSEMENCE AVEC LA SOLUTION BACTERIENNE.

INCUBEZ VOTRE BOITE.

LES RESULTATS DEVRAIENT MONTRER DES COLONIES MULTIPLES ET REGROUPEES SUR LE PASSAGE DES
STRIES DU 1ER TIERS DE LA BOITE. PUIS, DANS LE 2ND TIERS, ELLES DEVRAIENT ETRE PLUS ESPACEES ET
DONC MOINS NOMBREUSES. LE DERNIER TIERS DEVRAIT ENFIN LAISSER APPARAITRE DES COLONIES ISOLEES,
ET PURES (NE CONTENANT QU'UN SEUL TYPE DE BACTERIE).

CES COLONIES DE BACTERIES PURES POURRONT PAR LA SUITE ETRE REPIQUEES POUR UNE ANALYSE PLUS
POUSSEE.

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Mode opratoire recherche du Vibrio cholerae dans lenvironnement

g. Tableau des consommables

Validation mthodes Analyses environnementales


Total Mthode qualitative Mthode quantitative Analyse de terrain (prelevements)
Test
Total Test QL-1 Test QL-2 Total Test QT-1 Test QT-2 Test QT-3 Test QT-4 Total Qualitatif Quantitatif
Bouteille 1,5 litre 8 8 8 8 8 120 120
chantillon terrain 4 4 4 4 4 72 60 12
Standard Mac Farland 6
solution titre 14 3 3 11 4 4 2 1

EPA (pH 8,2 ajuster avec NaOH)


peptone (20 g)
chlorure de sodium (5g)
distille strile (striliser 20mn 120C) litres 3000
Enrichissement
Membrane (0, 22 m / 47 mm) / chantillon ou solution titre 1 5 2 1 4 4 5 5 5

Total membrane 427 23 3 20 44 8 4 8 4 20 360 300 60

Tube de coning strile (plastique)


67 7 3 4 60 60
(verre ?) avec EPHA tube 50 ml EPHA

Surnageant
boite de petri (90 mm) TCBS 67 7 3 4 60 60
Ensemensement
Boite de petri (50 mm)
avec milieu TCBS 116 56 8 4 8 16 20 60 60
(compter toutes les colonnies
caracteristiques / isolement 1)
Colonnies reprsentatives (colonnies jaunes)
3 3 3 3 3
(1.1/1.2/1.3)
441 21 9 12 60 60 360 180 180
Boite de petri (90 mm) GNA

Confirmation Prparation ltat frais


(Petits btonnets recourbs avec mobilit en flche) / 180 180
lame sous microscope
Oxydase (sur PCA uniquement) 395 15 3 12 20 20 360 180 180
Gram (petits btonnets recourbs Gram ngatif) 395 15 3 12 20 20 360 180 180
Latex 105 13 1 12 20 20 72 60 12
API 20 E 89 13 1 12 4 4 72 60 12

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Mode opratoire recherche du Vibrio cholerae dans lenvironnement

h. Laboratoire de confinement : scurit biologique niveau 2

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Mode opratoire recherche du Vibrio cholerae dans lenvironnement

i. Liste des quipements


Type Fournisseur Rfrence Conditionnement Quantit
FILTRATION
Boite ptri 90mm Grosseron 391-1505 500 2

Boite ptri 50mm VWR 391-0895 1620 1


Membrane millipore 47mm, porosit 0,45 Millipore HAWG047S6 boite de 600 x 2 1
Rampe de filtration (avec 3 puits de filtration
Millipore XX2504735 1
rutilisable et flambable en inox)
Pompe vide WP6222050 1
EQUIPEMENT LABORATOIRE
Refrgrateur 2
Bain Marie 1
Incubateur 37C 1
Incubateur 30C 1
Groupe electrogne 1
Thermomtre de contrle pour incubateur 1
Bec Bunsen 2
Gaz
Autoclave pour destruction et dsinfection 1
EQUIPEMENT TERRAIN POUR PRELEVEMENT
Turbidimtre 1
pHmtre 1
Oxymtre 1
Conductimtre WTW 1
Possibilit d'utiliser des bouteilles
Flaconnage 1 litre plastique strile usage
plastiques d'eau minrale non 100
unique ou autoclavable
usages
Kit de lavage de main ou de dsinfection de
2
main
Glacire de transport 50 ou 60 litre 2
Gant jetable 500
Pain de glace 10
ANALYSE LABORATOIRE
Pipette pasteur plastique VWR 612-1702 boite de 250 2
VWR
Pipette Pasteur verre 612-0914 Boite de 1000 1
Micropipette 20 - 200l VWR 613-5265 1 micropipette 2
Cone de 250 l VWR 613-0248 boite de 960 cones 1
Tube Corning de 50 ml stril Grosseron 500 tubes 1
Erlenmeyer 150ml VWR 214-1132 vendu par 1
Sac autoclave 500 1
BioMrieux France 20190 Catalogue
API 20 E (catalogue) 1
5, rue des Aqueducs BP 10 - analytique API 20
69290 Craponne renseignements 70100 Huile de
Huile de paraffine commerciaux et commandes paraffine 2
Tl : 0 820 22 3000 Fax : 0 820 22 1 x 125 ml
Api20E (galerie) 5000 boite de 25 galerie 4
assistance technique ractifs et
API 20E (ractifs) quipements. 4
Ractif coloration de Gram Tl : 0 820 22 9090 2
AES
Tryptone sel si besoin de diluant AEB 611494 10 (6 bouteilles de 90ml) 10
l.noel@aeschemunex.com
Eau peptone Alkaline (500g) 2
Oxoid s.a.
Glose Thiosulfate-Citrate-Bile-Saccharose
6 Route de Paisy BP13 2
(500g)
69571 Dardilly Cedex
Peptone bactriologique LP 0037b France 1
Tel: 0033 4 72 52 33 70
Glose Nutritive Agar Tel: 0033 4 72 52 33 84 commercial 500g 1
IDF
myriam.mosse@thermofisher.com
Glose glucose l'extrait de levure appele
Fax: 0033 4 78 66 03 76 2
"Plate Count Agar" PCA (500g)
Email: oxoid.fr@thermofisher.com

Biorad 57142 Vibrio


Vibrio cholerae 01 Polyvalent Antiserum, 1 Bio-Rad France Service cholera 01
Commandes flacon 1ml pour 10 test environ 10
mL + lames de microscope plyvalent
Bio-Recherche Antiserum 1ml
Tl commercial: 06 08 37 71 30
MrJoulain,
secrtariat commercial: 01 47 95 60
00 (cellule des march) 53832 Oxydase
Oxydase disque boite de 30 10
industrie environnement disque
0147956294
0810122189
fax: 01 47 95 61 35

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Mode opratoire recherche du Vibrio cholerae dans lenvironnement

j. Calibrage de la mthode quantitative

Calibrage de la mthode quantitative laide de solutions titres et de standard Mc Farland

Ralisation d'une solution mre S0 par la mise en culture d'une souche de Vibrio
Jour 1 Cholerae (fourni gracieusement par le laboratoire de N'Djamena), dans de l'eau
peptonne alkaline

Incubation 24h 30C

Mesure de la turbidit de S0 et comparaison avec standard Mac Farland


Ralisation partir de S0 , de 4 solutions filles S1,S2,S3,S4 de concentration
Jour 2 1/1000e, 1/100e, 1/10e, 1

Incubation 24h 30C

Mesure de la turbidit des 6 solutions S1,S2,S3,S4,S5,S6 et comparaison avec


standard Mac Farland
Jour 3

Ensemencement de 6 membranes 0,22m par filtration des 6 solutions et


dpose sur glose TCBS

Incubation 24h 37C

Jour 4 Lecture des boites et ralisation d'une courbe :


Mac Farland - Turbidit fx (nombre d'UFC/100ml)

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Mode opratoire recherche du Vibrio cholerae dans lenvironnement

k. Planning hebdomadaire du programme danalyse

Lundi Mardi Mercredi Jeudi Vendredi


7. Identification de trois
3. Transfert du surnageant
colonies diffrentes sur PCA
sur milieu de culture
Rception, rfrencement 5. Reprise des colonies bien par boite positive:
slectif TCBS ,
et stockage des isoles d'aspect plates,
(2 heures) Destruction des boites de petri
chantillons lisses et de couleur jaunes -GRAM
par autoclavage
sur TCBS et r-isolement sur -OXYDASE
4. Incubation 24 h 37 C
prparation des PCA -test rapide cholra
Matin Nettoyage et prparation du
quipements et des (2 heures) -sro agglutination
(si positif macroscopique laboratoire
milieux de cultures pour la -si atypique API 20 E (en
lancer un manip
semaine 6. Incubation 24 h 37 C dernier recours)
quantitative)
(3 h00)
Saisie infos suivi dans Saisie infos suivi dans Saisie infos suivi dans cahier Saisie infos suivi dans cahier Saisie infos suivi dans cahier de
cahier de paillasse cahier de paillasse de paillasse de paillasse paillasse
6 bis. Identification dune colonie
3 bis. Lecture des filtres diffrente sur PCA par boite
1 bis. Encemencement des (comptage de toutes les positive:
1. Filtration des
milieux TCBS avec 3 filtres bactries suspectes)
chantillons deau et mise -GRAM
(par chantillon) en parallle (1 heure)
en milieu -OXYDASE
pres filtration de 100 ou
denrichissement Prparation des -test rapide cholra
200, 500 ml sur lchantillon 4 bis. R-isolement de 3
Aprs- (3 heures) quipement et des milieux -sro agglutination
positif colonies reprsentatives sur
de culture pour la semaine -si atypique API 20 E (en dernier
midi 2. Incubation 16h 30 C
PCA
(2 heures) recours)
(2 heures)
2 bis. Incubation 24h 37C (2 heures)
5 bis. Incubation 24h 37C

Saisie infos suivi dans Saisie infos suivi dans Saisie infos suivi dans cahier Saisie infos suivi dans cahier Saisie infos suivi dans cahier de
cahier de paillasse cahier de paillasse de paillasse de paillasse paillasse
Mthode qualitative
Mthode quantitative
Prparation et saisie de rsultats

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