Académique Documents
Professionnel Documents
Culture Documents
Introducere :
Scopul principal al acestui studiu a fost de a evalua biocompatibilitatea i
bioactivitatea unui nou material endodontic pe baza de trioxid mineral agregat ( MTA ) MTA
Fillapex ( MTA - F , Angelus , Londrina , Brazilia ) asupra culturilor de celule umane .
Metode :
Celule osteoblast-like umane ( Saos - 2 ) au fost expuse timp de 1 , 2 , 3 , i 7 zile la
MTA - F , Epiphany SE ( EP - SE , SybronEndo , Orange , CA ) , i Oxid de Zinc - Eugenol
sealer ( ZOE ) . Culturile neexpuse au reprezentat grupul de control ( CT ) .
Viabilitatea celulelor a fost evaluat prin testul MTT iar morfologia acestora a fost analizata
prin microscopie electronic de baleiaj ( SEM ) . Bioactivitatea MTA - F a fost evaluat prin
activitatea fosfatazei alcaline( ALP ) iar detectarea depozitelor de calciu din cultura cu
colorant rosu alizarin ( ARS ) .
Spectroscopia cu raze X dispersiva dupa energie(EDS) a fost utilizata pentru a caracteriza
chimic cristalele de hidroxiapatit( HAP ) . Saos - 2 au fost cultivate timp de 21 zile pentru
ARS i SEM / EDS . Rezultate ARS au fost exprimate ca numrul de pete colorate pentru
fiecare arie . Analiza statistic a fost realizat cu analiza varianei i testul Bonferroni(p <.01)
Rezultate:
Expunerea la MTA - F timp de 1 , 2 , i 3 zile a determinat citotoxicitate crescuta . n
contrast, viabilitatea a crescut dup 7 zile de expunere la MTA - F .
Expunerea la EP - SE i ZOE a fost citotoxica pe tot parcursul studiului. In ziua 7 , cre terea
activitii fosfatazei alcaline a fost semnificativ n grupul MTA - F . MTA - F a prezentat cel
mai mare procent ARS de pete colorate ( MTA - F > CT >EP - SE > ZOE ) . Analiza SEM /
EDS artat cristale de hidroxiapatita doar n grupurile MTA - F i CT.
In grupul MTA - F , morfologia cristalelor i compoziia lor chimica au fost diferite de grupul
CT .
Concluzii :
Dup aplicare, citotoxicitatea MTA - F scade astfel sigilantul prezint bioactivitate adecvata
pentru a stimula nucleatia cristalelor de HAP. ( J Endod 2012; 38:971-976 )
Cuvinte -cheie
Bioactivitate , biocompatibilitate , hidroxiapatita ,sigilant agregat mineral troxid
endodonie . Prin urmare , au fost propuse noi materiale de obturatie radiculara si sigilanti de
canal pe baza de MTA ( 10-12 ) , precum MTA Fillapex ( MTA - F ; Angelus , Londrina ,
Brazilia ) .
Sigilantii noi pe baza de MTA reflecta o cerin de actualitate pentru materialele utilizate in
terapia endodontica, care sunt capabile s stimuleze procesul de vindecare a esuturilor
periapicale .
Ca rezultat , MTA - F reprezint efortul combinarii unui material de proprieti biologice
excelente ca si MTA cu rini i alte componente pentru a mbunti diverse proprieti
necesare unui sigilant endodontic inclusiv aderenta , stabilitate dimensional , timpul de
lucru, radioopacitate , fluiditate , i efecte antibacteriene.
n conformitate cu informaiile productorului , MTA - F este compus din rin salicilat ,
rin diluant , rin natural , oxid de bismut ca agent radiopacifiant , nanoparticule de
dioxid de siliciu , MTA , i pigmeni. MTA in sine const din particule fine hidrofile de silicat
tricalcic , oxid tricalcic de aluminiu , oxid de tricalcic , gips ( calciu sulfat dihidrat ) , precum
i ali oxizi minerali ( 3 ) . Gipsul este un determinant important de stabilire a timpului .
Cementurile MTA , n general, conin mai puin de gips , pentru a permite mai lung timp de
manipulare . Din pcate , foaie de date MTA - F nu are detalii despre rasina naturala ,
pigmeni i compoziia diluanilor .
Este important s se investigheze dac combinaia acestor rini i alte componente
influeneaz potenialul bioactiv de MTA n noul sigilant endodontic . Prin urmare ,scopul
principal al acestui studiu a fost evaluarea biocompatibilitii i bioactivitatii MTA - F n
stimularea mineralizarii n culturile de celule Saos - 2 , comparativ cu Epiphany SE
( EP - SE , SybronEndo , Orange , CA ) i cu sigilantii endodontici pe baza de oxid de zinc -
eugenol .
Saos - 2 este o celul osteoblast-like umana , care ofer un model adecvat pentru studierea
evenimentelor tardive ale diferentierii osteoblastilor ( 13 ) . EP - SE este un sistem de umplere
a canalului radicular pe baz de rin auto-gravanta cu dublu efect.( 14 ) . Oxid de zinc -
eugenol ( ZOE ) este un sigilant endodontic utilizat n mod obinuit ce prezinta un efect
citotoxic cunoscut.( 15 ) .
Cultura de celule
Celulele osteoblaste umane ( Saos - 2 line ATCC HTB - 85) s-au dezvoltat ca
o cultur monostrat n flacoane T - 75 ( Corning , Union City , CA ) care con in Mediu
Dulbecco modificat de Eagle ( DMEM ) suplimentat cu 10 % ser fetal bovin ( FBS ) ,
penicilin ( 100 IU / ml) , i streptomicin ( 100 mg / ml) pn la confluen . Celulele au fost
subcultivate de dou ori pe sptmn la 37 grade C , 95% umiditate , 5 % CO2 ( toate
dotarile de cultur din Gibco - BRL , Gaithersburg , MD ) . Celulele aderente n faza de
3
cretere logaritmic au fost detaate cu ajutorul unui amestec de tripsin / EDTA ( 0,25 % ) la
37 grade C timp de 2 minute . Celulele colectate au fost nsmnate pe plci cu 12 godeuri
( Corning ) la o densitate de 2 105 pe godeu determinata prin hemocitometrie .
Apoi , celulele au fost incubate n aceleai condiii descrise mai devreme timp 24 ore pentru a
obine o cretere exponenial celular nainte de expunerea la sigilantii endodontici . Celulele
neexpuse au reprezentat grupul de control.
Mediul de cultur a fost rennoit la fiecare 3 zile . Pentru a investiga efectul sigilantului
endodontic asupra fenotipului Saos - 2 i pentru a analiza formarea
de noduli mineralizate prin microscopie electronic de scanare i prin spectroscopie de raze
X dispersiva dupa energie ( EDS ) , celulele au fost nsmnate pe lame de sticla pe placile
cu 12 godeuri ( n = 3 lame / grup de cultur n mediu osteogenic sau nonosteogenic ) . Dup
o zi n cultur , celulele au fost expuse la sigilantii endodontici depusi pe suporturile
membranare de transfer pentru 21 zile n mediu osteogenic ( DMEM , 10 % FBS , 100 UI / ml
penicilin , 100 mg / ml streptomicin , 0,0023 g / ml b - glicerofosfat , i 0,055 mg / ml L -
ascorbat ; Sigma Chemicals , St Louis , MO ) sau nonosteogenic ( DMEM , 10 % FBS , 100
UI / ml penicilin i 100 mg / ml streptomicin ) . In timpul testelor , mediul de cultur a fost
rennoit la fiecare 24 ore timp de 1 sptmn i mai trziu la fiecare 2 zile .
Viabilitate celular
Proliferarea celulelor a fost determinat prin testul MTT . Acest test este
bazat pe capacitatea enzimei mitocondriale a converti o sare de tetrazoliu de culoare galbena
si solubila in apa , 3 - ( 4,5 - dimetil - tiazoil ) -2,5 difeniltetrazoliu bromur de ( MTT ,
Sigma Chemicals ) in compui de formazan de culoare violet . Absorbana msurat este
proporional cu cantitatea de celule viabile . Dup 0 , 1 , 2 , 3 , i 7 zile de expunere a
celulelor la sigilantii endodontici (sau neexpunere n grupul de control ) , s-au ndeprtat
dispozivele de transfer impreuna cu mostrele de materiale dentare , i mediul de cultura a fost
schimbat n DMEM coninnd 0,55 mg / ml MTT .
Plcile au fost incubate timp de nc 4 ore n aceleai condiii descrise anterior . Dup aceea ,
fiecare godeu a fost splat cu 1 ml de solutie salina tamponata cu fosfat ( PBS 1x ) iar 500 ml
alcool izopropilic i acid ( alcool izopropilic , 0,04 N ) au fost adugate pentru a extrage i
solubiliza formazanul .
Alicote de 150 ml din soluia de formazan din fiecare prob au fost transferate pe o plac cu
96 de godeuri i densitatea optic ( OD = 570 nm ) a fost msurat folosind un cititor de
microplci automat ( ELx800 ; Instruments BioTek , Winooski , VT ) . Probele duplicat au
fost pregtite pentru fiecare test i pentru grupurile de control la diferiti timpi de expunere .
Experimentul a fost repetat de trei ori independente. ( n = 6/group ) . Datele au fost apoi
exportate n foi de calcul Excel ( de birou 2007; Microsoft Corporation , Redmond , WA ) i
supus la analiza statistic.
FIGURA 1 (A) viabilitatea Saos-2 (B) activitatea ALP dupa expunerea celulelor la diferiti
sigilanti: MTA-F, EP-SE, si ZOE. Celulele neexpuse au reprezentat grupul de control.
Insemnand +_ SEM (n=6/grup). *S-a observat o diferenta importanta intre grupul de control
si grupurile expuse la sigilantii endodontici. #A diferenta semnificativa la compararea
grupului de control cu grupurile expuse sigilantilor. Analiza variantei, Bonferroni(p<.01)
6
Analiza statistic
Rezultatele MTT , datele de activitate ale ALP , nodulii colorati de alizarin , i
procentajul atomic al elementelor chimice ( EDS de noduli mineralizate )
au fost evaluate printr-o singura metoda de analiza a varianei . Diferenele medii
ntre toate grupurile celule au fost comparate prin testul Bonferroni
post hoc i au fost considerate a fi semnificative la P < .01 .
Rezultate
Viabilitate celular:
Testul MTT a artat scdere semnificativ a viabilitii celulare pentru toti
sigilantii endodontici dup 1 , 2 , i 3 zile de expunere celulare comparativ cu grupul de
control . In ziua 7 , celulele Saos - 2 expuse la MTA F au manifestat o revenire dovada ca
citotoxicitatea a scazut ( Fig. 1 A ) . ZOE i EP- SE au prezentat efecte citotoxice persistente .
Grupurile ambelor materiale dentare au inregistrat o scdere semnificativ a viabilitii
celulare . expunerea la EP - SE redus semnificativ viabilitatea celular odata cu trecerea
timpului.
Activitatea ALP
Celulele Saos - 2 tratate cu materialele de testare au prezentat o scadere
semnificativa a activitatii metabolice si totodata nivele reduse ale activitatii ALP comparativ
cu lotul martor dup 1 i 2 zile de expunere ( Fig. 1B ) . Dup 7 zile de expunere , doar grupul
MTA - F demonstrat mbuntirea activitii ALP ( aproximativ de dou ori mai mare ,
comparativ cu grupul de control , P < .01 ) .
Mineralizare i ARS
Dup 21 de zile de expunere a celulelor , numai MTA - F avut un important efect
stimulator asupra formrii nodulilor de mineralizare. Celulele expuse la MTA-F au dat
nastere unui numr mai mare de noduli de mineralizare dect grupul de control . Mai mult
dect att , nodulii din MTA-F au aprut intens colorati n analiza microscopic ( Fig. 2A ) .
Analiza statistic a datelor ARS au artat diferene semnificative printre sigilanti ( Fig. 2B ) .
Au fost observati noduli ARS colorati la culturile de celule EP - SE dar ntr -o cantitate
semnificativ mai mica dect n MTA - F i grupurile de control . S-au observat rari noduli
mineralizare n culturile ZOE pe tot parcursul studiului( MTA - F > CT > EP - SE > ZOE ) .
expuse la MTA - F ( fig. 3G i H , respectiv ) . Totu i , cristalele din grupa MTA - F avut
caracteristici morfologice diferite fata de cele observate la grupul de control . Noduli de
mineralizare din grupul MTA - F au o suprafa neteda, neregulata format din nanoparticule
sferice compacte , n timp ce noduli n culturile de control au artat o suprafa rugoas format
dintr-un agregat de nanoparticule sub form de bar .
HAP din grupul de control i MTA F cu mediu osteogenic au fost 2,01 i respectiv 1,5 .
Raporturile Si / Ca au fost de 0,18 , 1,18 , i 2,43 pentru grupul de control , pentru grupul
MTA-F cu mediu osteogenic si cristale de HAP si i respectiv pentru grupul MTA-F cu
mediu nonostegenic si nanocristale.
Discutie
Cimenturile si sigilantii pe baza de MTA au fost n centrul a numeroase
studii n domeniul endodontiei realizate de Torabinejad i colaboratorii sai ( 1 , 2 ) . Interesul
major n dezvoltarea materialelor endodontice pe baza de MTA este din cauza ca acest
material prezinta biocompatibilitate bioactivitate , i osteoconductivitate excelente. ( 17 ) . In
acest studiu , am evaluat bioactivitatea un sigilant endodontic inedit , MTA Fillapex , si
capacitatea lui de a induce mineralizare n de cultura de celule umane Saos - 2 . Linia de
celule SAOS - 2 are o bine documentata caracterizare , n special in ceea ce priveste ALP
osoasa si proprietatea de a depune o matrice extracelulara capabila de mineralizare(13).
Figura 4. EDS cristalitelor de hidroxiapatita din cultura de celule Saos-2 n mediu osteogenic
(A) neexpus i (B) sunt expuse la MTA-F si afieaza vrfuri mari de Ca, P, i
O. (C) EDS a nanocristalitelor din grupul MTA-F n mediu nonosteogenic. (D) EDS unei
probe de MTA-F n scop comparativ.
Bibliografie
1. Torabinejad M, Hong CU, McDonald F, Pitt Ford TR. Physical and chemical properties
of a new root-end filling material. J Endod 1995;21:34953.
2. Torabinejad M, White DJ. United States Patent 5, 415, 547 USPTO. Patent Full Text
and Image Database 1995.
3. Parirokh M, Torabinejad M. Mineral trioxide aggregate: a comprehensive literature
12