UNIVERSIDAD DE SANTANDER -UDES

Facultad de Ciencias Exactas Fsicas y Naturales

Laboratorio de Anlisis Qumico

DETERMINACION SIMULTANEA DE DIEZ FARMACOS ANTIRRETROVIRALES

MEDIANTE CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA EFICACIA

Alaguero Calero M1, Gutirrez Garca TJ 2, Rosado Mara C1, Costa Garca A2
1 Servicio de Farmacia. Hospital Universitario Central de Asturias. Oviedo.
2 Departamento de Qumica Fsica y Analtica. Universidad de Oviedo.

OBJETIVO

Desarrollar y validar un mtodo analtico de cromatografa HPLC para la determinacin

simultnea de concentraciones plasmticas de 10 frmacos antirretrovirales.

INTRODUCCIN

En la cromatografa lquida, la fase mvil es un lquido que fluye a travs de una columna
que contiene a la fase fija. La separacin cromatografa en HPLC es el resultado de las
interacciones especficas entre las molculas de la muestra en ambas fases, mvil y
estacionaria.

A diferencia de la cromatografa de gases, la cromatografa de lquidos de alto

rendimiento (HPLC, de high-performance liquid chromatography) no est limitada por la
volatilidad o la estabilidad trmica de la muestra.
La HPLC es capaz de separar macromolculas y especies inicas, productos naturales
lbiles, materiales polimricos y una gran variedad de otros grupos polifuncionales de alto
peso molecular.

Esta prctica tiene como objetivo determinar las concentraciones plasmticas de 10

frmacos antirretrovirales 8 inhibidores de la proteasa (amprenavir, atazanavir, indinavir,
lopinavir, nelfinavir, ritonavir, saquinavir y tipranavir) y 2 inhibidores de la transcriptasa
inversa no nucleosdicos (efavirenz y nevirapina), por medio de un mtodo analtico
HPLC, utilizando como como fase mvil una mezcla de acetonitrilo y tampn Na2HPO4
0,1%. Realizando el tratamiento de la muestra mediante una extraccin en fase slida
utilizando cartuchos C18. Se logr determinar la concentracin plasmtica de cada
frmaco antirretroviral.

PROCEDIMIENTO

El mtodo cromatogrfico desarrollado emplea como fase mvil una mezcla de acetonitrilo
y tampn Na2HPO4 0,1% de pH=6. La duracin del anlisis es de 25 minutos y el flujo
utilizado es de 1,5 mL/min.
El equipo de cromatografa utiliza un detector Visible-UV Simadzu SPD-10AV y la longitud
de onda que detecta durante el anlisis es de 215nm. La columna seleccionada es una
Kromasil C-18 (5m, 25cm x 4,6mm) y se mantiene una temperatura de 30C.
El tratamiento de las muestras de plasma de los pacientes se realiza mediante una
extraccin en fase slida utilizando cartuchos C18.
MATERIALES Y REACTIVOS (Fichas de Seguridad, Ver Anexo)
Equipo cromatogrfico
Detector Visible-UV Simadzu SPD-10AV
Columna a Kromasil C-18
1,5 mL de metanol
Acetonitrilo
Tampn Na2HPO4 0,1%

DIAGRAMA DE FLUJO

RESULTADOS

En la Figura 2, se observan los tiempos de retencin obtenidos fueron: nevirapina 2,0;

indinavir 3,0; amprenavir 3,9; clozapina 5,2; atazanavir 6,4; ritonavir 7,5; lopinavir 8,7;
saquinavir 9,4; efavirenz 10,6; tipranavir 15,2 y nelfinavir 18,1 minutos.
La precisin y exactitud del mtodo se evaluaron analizando 5 veces muestras de 3
concentraciones diferentes ( 1, 5, y 10 g/mL) y repitiendo el proceso durante 3 das
(Tabla 1). Las desviaciones respecto del valor nominal fueron inferiores al 15 %. Los
lmites de deteccin varan entre 0,02 y 0,04 g/mL y los de cuantificacin entre 0,04 y
0,06 g/mL.

Las rectas de calibrado se elaboraron siguiendo el mtodo del estndar interno (Figura 3).
Todos los frmacos determinados mostraron una respuesta lineal en un rango de
concentraciones entre 0,05 y 20 g/mL (Tipranavir hasta 50 g/mL).

Finalmente se determinaron las concentraciones plasmticas de antirretrovirales en

pacientes VIH positivos (Figura 4).

ANEXO: Fichas de seguridad

 METANOL
Punto de ebullicin: 65C
Punto de fusin: -98C
Densidad relativa (agua = 1): 0.79
Solubilidad en agua: miscible
Presin de vapor, kPa a 20C: 12.3
Densidad relativa de vapor (aire = 1): 1.1
Densidad relativa de la mezcla vapor/aire a 20C (aire = 1): 1.01
Punto de inflamacin: 12C c.c.
Temperatura de autoignicin: 464C
Lmites de explosividad, % en volumen en el aire: 5.5-44
Coeficiente de reparto octanol/agua como log Pow: -0.82/-0.66

R11 : Fcilmente inflamable

R23/24/25 : Txico por inhalacin, por ingestin y en contacto con la piel
R39/23/24/25: Txico: peligro de efectos irreversibles muy graves por inhalacin, contacto
con la piel e ingestin
S(01/02) : (Consrvese bajo llave y mantngase fuera del alcance de los nios)
S07 : Mantener el recipiente bien cerrado
S16 : Mantngase alejado de cualquier fuente de ignicin - No fumar
S36/37 : sese indumentaria y guantes de proteccin adecuados
S45 : En caso de accidente o malestar, acuda inmediatamente al mdico (si es posible,
mustrele la etiqueta)

ACETONITRILO

Cianuro de metilo
Cianometano
Etanonitrilo
C2H3N/CH3CN
Masa molecular: 41.0
Punto de ebullicin: 82C
Punto de fusin: -46C
Densidad relativa (agua = 1): 0.8
Solubilidad en agua, g/100 ml a 20C: 1390 (muy elevada)
Presin de vapor, kPa a 25C: 9.9
Densidad relativa de vapor (aire = 1): 1.4 Densidad relativa de la mezcla vapor/aire a 20C
(aire = 1): 1.04
Punto de inflamacin: 2C c.c.
Temperatura de autoignicin: 524C
Lmites de explosividad, % en volumen en el aire: 3.0-17
Coeficiente de reparto octanol/agua como log Pow: -0.3

FOSFATO DE SODIO DIBASICO

Sinnimos: Heptahidratado Disodium del fosfato;

cido fosfrico, sal disodium, heptahidratado;
Fosfato Disodium del hidrgeno, hidrato 7.
CAS.: 7558-79-4 (anhidro).
Peso molecular: 268.07
Frmula qumico: Na2HPO4.7H2O
Aspecto: Sal descolorida o blanca, granular.
Olor: Inodoro. Solubilidad: Soluble en agua.
Densidad: 1.7.
pH: 9.5.
% de volatiles por el volumen @ 21C (70F): 0.
Punto que hierve: No aplicable.
Punto de fusin: 48.1C (118F) pierde 5 H2O.

CONCLUSIONES

El mtodo permite la determinacin de concentraciones plasmticas de 10 frmacos

antirretrovirales, incluyendo dos inhibidores de la proteasa de reciente comercializacin:
atazanavir y tipranavir, en un tiempo de anlisis inferior al descrito en otros mtodos
publicados.

La aplicacin de este anlisis a la determinacin de niveles plasmticos de

antirretrovirales en pacientes VIH positivos puede servir tanto para controlar la adherencia
como para mejorar la eficacia y seguridad del tratamiento antirretroviral.

Bibliografa

http://www.quiminet.com/articulos/que-es-la-cromatografia-liquida-de-alta-eficiencia-hplc-
14764.htm
http://www.hca.es/huca/web/contenidos/websdepartam/farmacia/HPLC%20Poster.pdf