FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES

LABORATORIO BIOQUMICA

Alumno: ___________________________________________ Cdigo: _________________

Alumno: ___________________________________________ Cdigo: _________________

Prctica 7: VALORACIN DE GLUCOSA Y ACIDO LACTICO EN SUERO Y/O PLASMA

OBJETIVOS:

Determinar por espectrofotometra el contenido de la glucosa en suero y/o en plasma

sanguneo humano y/o de cordero.

Determinar por espectrofotometra el contenido de lactato en suero y/o en plasma

sanguneo humano y/o de cordero.

1. FUNDAMENTO TERICO

Experimento 1A: Valoracin de glucosa en suero o plasma por el mtodo GOD/POD.

La glucosa es la principal fuente de energa en los seres vivos. Por tal razn es un metabolito
fundamental en los procesos biolgicos.

La determinacin cuantitativa de este bio-compuesto, ha sido objeto de muchos estudios y la

literatura ofrece diversas tcnicas de anlisis que varan de acuerdo con diferentes factores
como la naturaleza de la muestra, los contenidos de glucosa y la viabilidad experimental.

Uno de los mtodos, utilizado actualmente a nivel clnico y de investigacin, para valorar
glucosa en el plasma y/o suero sanguneos es el enzimtico colorimtrico desarrollado por

Bayer, conocido como SERA-PAK PLUS para glucosa, en el que la glucosa presente en el
suero o plasma sanguneo, es transformada por la glucosa oxidasa (GOD) en cido glucnico y
perxido de hidrgeno (H 2 O 2 ), el cual en presencia de peroxidasa (POD) oxida el cromgeno
4-aminoantipirina/fenol convirtindolo en un compuesto de color rojo que absorbe entre 492 y
550 nm, con un pico de mxima absorbancia a 500 nm.

Experimento 1B: Valoracin de Lactato en suero y/o plasma por el mtodo

enzimtico colorimtrico.

El L-Lactato es uno de resultados netos de la glucolisis anaerobia producida en el msculo

esqueltico activo. El L_Lactato s metabolizado en el hgado. El NADH s producido en la
gluclisis en los tejidos por oxidacin aerbica. Si no hay presencia suficiente de oxgeno para
que se produzca esta oxidacin, se regenera NAD+ a partir de NADH en la
reduccin de piruvato a lactato Una concentracin incrementada de lactato en la sangre es as
un indicador de metabolismo anaerbico hecho que se da, por ejemplo, si disminuye el flujo de
sangre a los tejidos y el suministro de oxgeno es insuficiente. En casos de reducciones de
oxgeno severas, podra darse la Acidosis Lctica. El L-Lactato
por lo tanto se puede utilizar como un indicador de fallo circulatorio severo.
La concentracin de L-Lactato en la muestra se determina de acuerdo a la siguiente reaccin.

Lactato Oxidasa

L-Lactato + O2 piruvato + H2O2

 Peroxidasa

H2O2 + 4-aminoantipirina + TOOS Producto prpura + 4H2O

TOOS = N-etil-N-(2 hidroxi-3-sulfopropil) m-toluidina

El producto purpura se puede monitorear a 550 nm y su concentracin va a ser proporcional a

la concentracin de lactato en la muestra.

2. SEGURIDAD DURANTE LA PRCTICA

2.1 Normas de seguridad

El estudiante debe referirse al manual de normas de seguridad.

2.2 Equipos de proteccin personal

Usar durante todo el desarrollo de la prctica los siguientes elementos de seguridad:

Bata de laboratorio
Guantes de nitrilo
Gafas de seguridad
Mantener los elementos personales de seguridad identificados y en buen estado. Est prohibido su
intercambio con los dems compaeros de laboratorio.

2.3 Manejo de Residuos qumicos

Tanto por razones de seguridad como por respeto al medio ambiente, es importante disponer los
residuos generados en las prcticas del laboratorio de qumica en forma adecuada. Por ello el
estudiante debe:

1. Emplear los recipientes destinados para eliminar los residuos o desechos de laboratorio, los
cuales estn debidamente identificados segn el tipo de sustancia a desechar.

2. Verter nicamente los residuos en el recipiente correspondiente para evitar reacciones no

controladas y potencialmente peligrosas.

No arrojar por el desage los desechos o residuos qumicos obtenidos durante el desarrollo de la
prctica. Si tiene alguna inquietud al respecto comunquela al responsable del laboratorio, quien le
indicar la forma correcta de hacerlo

3. TRABAJO INTEGRADO DE LABORATORIO

Consultas previas.

Consulte:

1 Composicin promedio de la sangre humana.

2 Niveles normales de glucosa y lactato en sangre humana.

3 Niveles de riesgo de glucosa y lactato en sangre humana.

4 Enfermedades asociadas a los niveles altos de glucosa y lactato en sangre.

5 Enfermedades asociadas a los niveles bajos de glucosa en sangre.

6 Fuentes endgenas de glucosa y lactato.

7 Fuentes de exgenas de glucosa y lactato.

8 El estudiante debe elaborar las tablas de datos con base en los procedimientos, para
su uso durante la prctica.

4. METODOLOGIA

4.1 MATERIALES

Tabla 1. Listado de materiales necesarios para el desarrollo de la prctica por pareja.

ITEM Cantidad
Termostato 8
Micropipetas de 100 y 1000 L 1 c/u
Gradilla 1
tubos de ensayo (16 x 125 mm) 16
Pipeta graduada de 5 mL 2
Gotero de vidrio 1
Propipeta 1
Vaso de precipitados 25 mL 2
Celdas de para espectrofotmetro (plsticas) de 4
microlitro y con paso de luz hasta el fondo
Jeringas de 5 mL 2 por grupo

4.2 REACTIVOS

Tabla 2. Listado de reactivos necesarios para el desarrollo de la prctica por pareja.

Reactivos Cantidad
Estndar de Glucosa 0,14 mL
Estndar de Lactato 0,14 mL
SERA PAK para glucosa 14,4 mL
SERA PAK para lactato 14,4 mL

4.3 EQUIPOS

Tabla 3. Listado de Equipos necesarios para el desarrollo de la prctica por pareja.

Equipos Cantidad
Espectrofotmetro 2 por grupo
Centrifuga 1 por grupo

4.4 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Mtodo 1: Valoracin de glucosa en suero o plasma por el mtodo GOD/POD.

Sacar el kit de la nevera y dejarlo a temperatura ambiente por lo menos 30 minutos antes de
utilizarlo.

En cuatro tubos de ensayo, limpios y secos, marcados como blanco, estndar, suero y plasma,
proceder segn la secuencia de la siguiente tabla.
Tabla de procedimiento: Determinacin de glucosa

TUBO
BLANCO ESTNDAR SUERO PLASMA
SECUENCIA SOLUCIN
O
1 Reactivo SERA-PAK PLUS,para 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
glucosa
O
2 Agua destilada 10 uL - - -
O
3 Estndar - 10 uL - -
O
4 Muestra - - 10 uL 10 uL
O o
5 Mezclar bien e incubar a 37 C por 10 minutos
O
6 Leer absorbancia a 500nm en celda de 1 cm de paso de luz, el color es estable mnimo
1hora

Mtodo 2: Valoracin de lactato en suero y/o plasma por el mtodo enzimtico

colorimtrico.

En cuatro tubos de ensayo, limpios y secos, marcados como blanco, estndar, suero y plasma,
proceder segn la secuencia de la siguiente tabla.

Tabala de procedimiento: Determinacin de lactato

TUBO
BLANCO ESTNDAR SUERO PLASMA
SECUENCIA SOLUCIN
O
1 Reactivo SERA-PAK PLUS 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
O
2 Agua destilada 10 uL - - -
O
3 Estndar - 10 uL - -
O
4 Muestra - - 10 uL 10 uL
O o
5 Mezclar bien e incubar a 37 C por 5 minutos
O
6 Leer absorbancia a 550nm en celda de 1 cm de paso de luz, el color es estable mnimo
1hora

5. RESULTADOS Y ANLISIS PRELIMINAR DE RESULTADOS.

Experimento 1: Valoracin de glucosa y lactato en plasma y suero.

Mtodo 1: Valoracin de glucosa en suero o plasma por el mtodo GOD/POD.

1 Realizar los clculos correspondientes, segn:

1.1 Glucosa en mg/dL = ABSORBANCIA DE LA MUESTRA x 100 mg/dL

ABSORBANCIA DEL ESTNDAR

1.2 Glucosa en mmol/dL= ABSORBANCIA DE LA MUESTRA x 5.56 mmol/L

ABSORBANCIA DEL ESTNDAR

1.3 Glucosa en g/dL = ABSORBANCIA DE LA MUESTRA x 1 g/L

ABSORBANCIA DEL ESTNDAR

1.4 Analizar los resultados obtenidos, por comparacin con los niveles promedio de
glucosa consultados para el preinforme, y establecer si hay alguna condicin de enfermedad y
de que clase.
1.5 Plantear todas las ecuaciones qumicas de las reacciones en las que se fundamenta el
anlisis.

1.6 Consultar sobre las familias de enzimas a las que pertenecen las enzimas empleadas
por este mtodo.

1.7 Complementar segn las instrucciones adicionales del docente.

Mtodo 2: Valoracin de lactato en suero y/o plasma por el mtodo enzimtico

colorimtrico.

2.1 Calcular el contenido de colesterol, segn las siguientes ecuaciones:

Lactato en mg/dL = ABSORBANCIA DE LA MUESTRA x 40mg/dL

ABSORBANCIA DEL ESTNDAR
Lactato en mmol/dL = ABSORBANCIA DE LA MUESTRA x4.4 mmol/L
ABSORBANCIA DEL ESTNDAR

Lactato en g/dL = ABSORBANCIA DE LA MUESTRA x 0,4 g/L

ABSORBANCIA DEL ESTNDAR

2.2 Analizar los resultados obtenidos, por comparacin con los niveles promedio de Lactato
consultados previamente, y establecer si hay alguna condicin de enfermedad y de que clase.

2.3 Plantear todas las ecuaciones qumicas de las reacciones en las que se fundamenta el
anlisis.

2.4 Consultar sobre las clases y subclases de enzimas a las que pertenecen las enzimas
empleadas por este mtodo.

2.5 Complementar segn las instrucciones adicionales del docente.

PRECAUCIONES:
Slo para diagnstico in vitro. No pipetear con la boca.
Ejecutar las precauciones normales requeridas para el manejode reactivos de
laboratorio.
La solucin R1a contiene Azida Sdica. Evitar su ingestin o elcontacto con la piel o las
membranes mucosas. En caso de contacto con la piel, lavar la zona afectada con
abundante agua. En caso de contacto con los ojos o ingestin, buscar atencin mdica
inmediatamente.
La Azida Sdica reacciona con el plomo y cobre de las caeras, formando cidos
potencialmente explosivos. Asi que utilizar un frasco de desechis para eliminar las
sustancias, NO VERTER LAS SOLUCIONES DE DESECHO POR LAS CAERIAS.

UTILIZAR GUANTES.

6.REFERENCIAS
1. Shimojo N et al, CLIN CHEM 1989; 35(9): 1992 - 1994.
2. Shimojo N, Fujino K et al, CLIN CHEM 1991; 37(11) 1978
- 1980.
3. Lehninger Al: Principles of Biochemistry, Worth Publishers,
New York, 2010, p 416.
4. Mascini M et al, CLIN CHEM. 1987; 34(4) 591 - 593.
5. Jacobs DS, Kasten BL, Demott WR and Wolfson WL:Laboratory Test Handbook, LEXI
COMP INC, OHIO,1990, p. 245.