UNIVERSIDAD NACIONAL DE CORDOBA

FACULTAD DE PSICOLOGA
CATEDRA DE NEUROFISIOLOGIA Y PSICOFISIOLOGIA

TRABAJO PRCTICO N 2: MICROSCOPIA DEL SISTEMA NERVIOSO

LIC. VERONICA BALASZCZUK

Lab. Neurobiologa de los Sistemas Catecolaminrgicos. IMMF

LIC. CRHISTIAN BENDER

Lab. Neuroanatoma y Neurotoxicologa Experimental. IMMF

INTRODUCCIN

El estudio de la fisiologa de la conducta implica el esfuerzo de investigadores de muchas

disciplinas cientficas, incluyendo la fisiologa, la neuroanatoma, la bioqumica, la histologa, la
endocrinologa y la psicologa experimental. Los avances sobre el estudio del sistema nervioso no
se extraen de un nico experimento, sino de diversas investigaciones que abordan el mismo
problema con mtodos diferentes.
As como es ms fcil entender el concepto de longitud o peso conociendo los instrumentos
que utilizamos para medir tales variables (un centmetro, una balanza), tambin ser ms fcil
comprender lo que sabemos del sistema nervioso si conocemos las herramientas que utilizan los
neurocientficos. Aqu se presentaran las principales estrategias de estudio a nivel microscpico.
Este manuscrito esta dividido en tres secciones acorde a como sern presentadas en el
prctico:
1)- Demostracin y explicacin del procedimiento de la obtencin del material neurohistolgico.
2)-Sesin de pster, donde se mostrarn las principales tcnicas de tincin que permite estudiar
la morfologa, fenotipo y conexiones de las distintas poblaciones celulares.
3)-Sala con microscopios para observar algunas muestras de tejido cerebral teidas con las
tcnicas presentadas en la seccin anterior.

Seccin 1: OBTENCIN DEL MATERIAL NEUROHISTOLGICO

Para aplicar las tcnicas de tincin que permiten estudiar el tejido cerebral a nivel
microscpico, el mismo debe ser sometido a un proceso llamado fijacin. El objetivo de este paso
es: detener la autlisis, endurecer el tejido, que es extremadamente blando y frgil, conservar la
estructura de las protenas y eliminar cualquier microorganismo que pudiera destruirlo. Existen
muchos tipos de fijadores siendo el ms usado el paraformaldehdo (formol).
En animales de laboratorio, la aplicacin del fijador se realiza mediante perfusin
transcardaca. La perfusin implica la extraccin de la sangre y la sustitucin con otro lquido, en
este caso, con el formol. Bsicamente, a una rata anestesiada se le conecta un catter en la aorta
ascendente, que es la arteria que lleva la sangre al cerebro. El catter est conectado a una
bomba peristltica (como el aparato para las nebulizaciones) que impulsa el fijador hacia la aorta y
desde all a todas las arterias que irrigan las clulas del cerebro. Mediante este procedimiento el
fijador llega a todas las regiones del cerebro, tal como lo hace la sangre cuando el animal esta
vivo.
 Figura 1: Se introduce una cnula a
travs del ventrculo izquierdo del
corazn para que la solucin fijadora
penetre a partir del sistema
circulatorio. Se utiliza una bomba de
perfusin (aparato que imita el
bombeo del corazn) para introducir
los dos tipos de soluciones.

Finalizada la perfusin, se extrae el cerebro del crneo y se lo coloca en una solucin

crioprotectora que prepara al tejido para el siguiente paso de seccionamiento. El cerebro se corta
en lminas finas (por ejemplo de 40 micrones -1 micrn es la milsima parte de un milimetro-)
mediante un aparato llamado micrtomo (del latn, aquello que corta en finas lminas). Los cortes
se colocan de manera seriada, en una cubetera con solucin fijadora o con sales especiales para
mantener el tejido, dependiendo de la tcnica que se use a posteriori. Despus de aplicar la
tcnica, los cortes se montan en portaobjetos cubrindolos con un vidrio fino denominado
cubreobjetos.

Figura 2: A la izquierda se muestra un micrtomo con su cuchilla especial y a la derecha cortes coronales de
cerebro de rata.
APARATO ESTEREOTXICO:
El aparato estereotxico fue desarrollado a principios del siglo XX por dos
neuroanatomistas norteamericanos: Horsely y Clark. A pesar de su antigedad y sencillez, este
dispositivo contina siendo una herramienta insustituible en la investigacin neurocientfica.
El instrumento permite inmovilizar la cabeza del animal de manera estndar gracias a la
insercin de barras de acero en los conductos auditivos y una prensa que se ajusta al hocico. El
aparato tambin cuenta con un brazo que se puede mover en tres direcciones: anterior-posterior,
dorsal-ventral y lateral-medial. En la punta del brazo se colocan las pipetas, cnulas o electrodos
segn el experimento que se vaya a realizar. La virtud de este sistema radica en que, con la gua
de un atlas estereotxico, es posible ubicar cualquier rea del cerebro en donde queramos inyectar
una sustancia o implantar un electrodo.
Una vez obtenidas las coordenadas estereotxicas, a partir del atlas, anestesiamos al
animal y luego, de colocarlo en el aparato, se le practica una incisin en el cuero cabelludo.
Posteriormente, se localiza el bregma (el punto de referencia del crneo desde el cual se calculan
las distancias) y colocamos el brazo en los nmeros adecuados (que dependen del rea que se
pretende localizar). Finalmente, se perfora el crneo para poder insertar la pipeta o el electrodo.
Este sistema permite colocar electrodos que sirven para: registrar la actividad elctrica de
las neuronas, estimular reas especificas, o para provocar lesiones. Adems, con micropipetas, se
puede inyectar frmacos que estimulen las neuronas o bloqueen receptores especficos. Por
ltimo, tambin es posible instalar cnulas de modo permanente que permiten la posterior
aplicacin de frmacos o para medir concentraciones de neurotransmisores u otras molculas
dentro del cerebro.
Los aparatos estereotxicos no solo se utilizan para investigacin, tambin los hay para
realizar tratamientos en seres humanos. A veces, los cirujanos efectan lesiones subcorticales
para, por ejemplo, reducir los sntomas de la enfermedad de Parkinson. Por lo general, se valen de
mltiples puntos de referencia y verifican la localizacin del electrodo (o de otro dispositivo)
insertado en el encfalo tomando imgenes de resonancia magntica antes de producir la lesin
cerebral.

Figura 3: Esquema del aparato esterotxico

 Figura 4: Izquierda: Fotografa de una intervencin quirrgica en humanos utilizando aparato
estereotxico. Derecha: Rata anestesiada en un aparato estereotxico

Seccin 2: TECNICAS DE TINCIN

TECNICA DE NISSL:
Esta tcnica es una de las tinciones ms utilizadas y fue introducida por el alemn Franz
Nissl a finales del siglo XIX. Este cientfico puso de manifiesto que una serie de colorantes bsicos
(azul de metileno, violeta de cresilo, rojo neutro) tean los ncleos celulares y aglutinaciones
presentes en el citoplasma conocidas como retculo endoplasmtico rugoso.
La tincin de Nissl sirve para el estudio de la citoarquitectura del sistema nervioso.
Concretamente permite: describir la disposicin de las neuronas en ncleos o capas, estudiar el
nmero de neuronas que componen cada rea cerebral, y realizar apreciaciones acerca del
tamao y morfologa de las neuronas. Es importante mencionar que esta tcnica no tie axones ni
dendritas.

Figura 5: Neuronas de la
amgdala del cerebro de una
rata teidas con tcnica de
NISSL. Ntese como esta
tecnica permite visualizar los
los cuerpos celulares pero
no sus prolongaciones
(axones y dendritas)
TINCION DE GOLGI:
En 1873 el histlogo Camillo Golgi descubri que, sumergiendo el tejido cerebral en una
solucin con sales de plata, un pequeo porcentaje de neuronas se tean por completo de negro.
Esto puso de relieve que el cuerpo de la neurona, la regin que se pone de manifiesto con la
tincin de Nissl, es slo una pequea fraccin de la estructura total de estas clulas. La tincin de
Golgi muestra que las neuronas poseen dos partes distinguibles: una regin central, que contiene
el ncleo de la clula, y numerosas proyecciones finas (dendritas y axones), que irradian desde la
regin central. Esta tcnica marca en gran detalle la morfologa total de la clula nerviosa
permitiendo su clasificacin en diferentes tipologas (por ejemplo, neuronas bipolares, estrelladas,
piramidales, etc)

Figura 6: Neuronas de la corteza

cerebral teidas con la tcnica
de Golgi. Ntese como esta
tcnica no solo tie el soma sino
tambin sus prolongaciones,
axones y dendritas.

TECNICA INMUNOCITOQUIMICA:
La inmunocitoqumica es la tcnica ms popular de todos los mtodos de tincin. El
espectacular desarrollo de la neurobiologa en las ltimas dcadas se debe en gran medida a la
invencin de esta tcnica.
Este mtodo sirve para definir la distribucin de los receptores cerebrales, el neuropptido
o transmisor contenido en las neuronas, as como tambin el de tantas otras molculas (protenas,
enzimas, canales inicos, hormonas, etc) presentes en el sistema nervioso.
Esta tcnica se vale de la utilizacin de anticuerpos que se unen de manera ultraespecfica
a la molcula que se quiere localizar (que funciona como antgeno). Existen en el mercado casi
tantos anticuerpos como molculas se conocen en el sistema nervioso.
Por ejemplo, si queremos identificar neuronas que contienen tiroxina hidroxilasa (TH-
enzima que sintetiza las catecolaminas) se incubar el tejido con anticuerpos TH (llamado
anticuerpo primario) que se unen selectivamente con esta enzima. Luego se incuba con un
segundo anticuerpo (anticuerpo secundario) que se une al primario y finalmente una tercera
solucin se une al anticuerpo secundario llamada ABC (Complejo Avidina-Biotina) que se utiliza
para hacer ms visible la unin del anticuerpo primario con la molcula de inters (en nuestro
ejemplo, la TH). Si observramos estos cortes hasta este punto, todava no se podra ver ninguna
tincin. La marca visual se obtiene luego de introducir el sustrato de la enzima peroxidasa y un
cromgeno que da color a la reaccin. Una vez montados los cortes, cotejaramos con un atlas
cuales son las reas cerebrales que muestran neuronas marcadas con TH. De esta manera se
puede establecer la neuroqumica de los distintos ncleos del encfalo. Siguiendo con el ejemplo,
esto ha permitido constatar que las poblaciones catecolaminrgicas se concentran en el
mesencfalo y en el tronco enceflico.

Figura 7: Neuronas catecolaminrgicas de

las sustancia nigra, una estructura del
mesencfalo. El tejido cerebral de la rata
fue procesado con el mtodo
inmunocitoqumico utilizando un anticuerpo
dirigido contra la tiroxina hidroxilasa,
enzima que sintetiza las catecolaminas.

Cmo se obtienen los anticuerpos que se utilizan en las tcnicas inmunocitoqumicas?

Se inyecta la molcula que deseamos estudiar (por ejemplo TH) en el torrente sanguneo
de un animal provocando una respuesta inmunitaria. Un aspecto de la respuesta inmunitaria es la
generacin de anticuerpos que pueden unirse ajustadamente a sitios especficos de la molcula
extraa (en este caso, la TH). Estos anticuerpos especficos pueden recuperarse a partir de una
muestra de sangre del animal inmunizado y luego de un proceso de purificacin, estn aptos para
el uso en estudios como en el ejemplo comentado anteriormente. En la actualidad, existen
laboratorios que se dedican a fabricar y vender diversos anticuerpos lo que ha facilitado la
utilizacin de esta metodologa.

Figura 8: Representacin de los pasos en la produccin de anticuerpos utilizados en la investigacin

cientfica.
TECNICA DE PLATA:
Los primeros neuroanatomistas descubrieron que las neuronas que degeneran se tornan
argiroflicas, es decir, aumentan su afinidad por las sales de plata (por ejemplo, nitrato de plata).
Basados en este principio, se han elaborado distintos protocolos que permiten identificar con
precisin las neuronas que mueren a causa de un tratamiento dado. Si bien esta tcnica se puede
aplicar en tejido humano postmortem es tpicamente utilizada en modelos animales de
enfermedades neurodegenerativas, como la epilepsia y el Alzheimer, o para evaluar el dao
cerebral inducido por txicos (como el alcohol o la anfetamina)
Dentro de los mtodos utilizados en la valoracin neurotoxicolgica, las tcnicas de plata se
destacan porque, adems de teir el soma de las neuronas, marcan con gran detalle las dendritas,
axones y terminales que sufren degeneracin.

Figura 9: Neuronas en
estado degenerativo,
detectadas con tcnica de
plata, en un modelo
animal de epilepsia.

TECNICA PARA MARCADO ANTERGRADO:

Para marcar axones eferentes entre las distintas estructuras cerebrales, se utiliza un
mtodo de marcado antergrado (Antergrado significa que se mueve hacia adelante). Este
mtodo emplea sustancias que son captadas por las dendritas o los somas celulares y
transportadas a lo largo del axn hasta los botones terminales. La sustancia ms utilizada es una
protena llamada PHA-L (phaseolus vulgaris leukoaglutinin) producida por la juda (una especie de
planta). Esta tcnica carecera de utilidad sin el uso del aparato estereotxico (mencionado ms
arriba) que permite que inyectemos esta solucin a travs de micropipetas en reas cerebrales
especficas.
Una vez inyectado, las molculas de PHA-L son captadas por las dendritas y transportadas
a travs del soma al axn, por donde viajan mediante transporte axoplsmico rpido hasta los
botones terminales. En pocos das las clulas estn llenas de molculas de PHA-L en su totalidad:
dendritas, soma, axn y botones terminales. Para poder ver las molculas de PHA-L se aplica un
mtodo de inmunocitoqumica esencial, y las preparaciones se examinan al microscopio.

Figura 10: Esquema

que muestra el
funcionamiento de
PHA-L, una tcnica de
marcado antergrado.
MARCADO RETROGRADO:
Los mtodos de marcado retrgrado (Retrgrado significa que se mueve hacia atrs)
emplean sustancias que son captadas por los botones terminales y transportadas a lo largo de los
axones hacia los somas celulares. El mtodo sirve para identificar las aferencias que recibe una
determinada regin del encfalo y el proceso es similar al utilizado para identificar sus eferencias.
Lo nico que se modifica es la sustancia a utilizar, en este caso es el oro fluorado (fluor gold). Esta
molcula es absorbida por los botones terminales y transportada de vuelta a los somas celulares
mediante transporte axoplsmico retrgrado. Pocos das despus se examina el tejido bajo una luz
de longitud de onda adecuada y las molculas de oro fluorado emiten fluorescencia bajo esta luz.
Entonces en las partes del cerebro en donde veamos cuerpos neuronales que hayan incorporado
el trazador, son las estructuras que envan aferencias al rea donde se inyecto el marcador
retrgrado.

MARCADO TRANSNEURONAL:
Esta tcnica identifica una serie de dos, tres o ms neuronas que forman conexiones
sinpticas en serie unas con otras. El mtodo de marcado transneuronal ms eficaz emplea un
virus de la seudorrabia (una forma debilitada del virus herpes que originalmente se concibi como
vacuna). El virus se inyecta directamente en una regin cerebral, es captado por las neuronas del
lugar y las infecta. El virus se extiende a travs de las neuronas infectadas y finalmente es
liberado, contagiando a las neuronas con las que establece conexiones sinpticas. Algunas
neuronas son destruidas por el virus; otras sobreviven a la infeccin. Este mtodo puede utilizarse
para marcar los circuitos, ya sea en direccin antergrada o retrgrada. Cuanto ms espera el
investigador tras inyectar el virus, mayor es la cantidad de neuronas que llegan a infectarse. Luego
se aplica el mtodo de inmunocitoqumica para localizar una de las protenas producida por el
virus.
La combinacin de los mtodos antergrado, retrgrado y transneuronal permiten descubrir
circuitos de neuronas interconectadas. As, estas tcnicas contribuyen a obtener un diagrama del
cableado neural del encfalo.

TECNICA DE CULTIVO CELULAR:

Las tcnicas que hemos estudiado hasta ahora sirven para el estudio del tejido intacto.
Pero existen mtodos que se aplican a clulas cerebrales que han sido aisladas del tejido cerebral.
En su conjunto se las conoce como tcnicas in Vitro o de cultivo celular.
Esta metodologa permite la evaluacin de diversos parmetros de manera independiente a
las mltiples interacciones que participan in vivo porque asla la clula del medio que la rodea. De
esta manera se pueden analizar los mecanismos intracelulares que seran imposibles de realizar
en tejido intacto.
Los cultivos celulares permiten estudiar:
1) La actividad intracelular: trascripcin de ADN, sntesis de protenas, metabolismo
energtico, metabolismo de drogas, ciclo celular, diferenciacin, apoptosis (muerte celular
programada)
2) Flujo Intracelular: ARN, receptores de hormonas, transduccin de seales, etc.
3) La interaccin clula-clula: morfognesis, adhesin y motilidad celular.
4) La accin de: agentes biolgicos (virus, bacterias), qumicos (drogas), fsicos (radiaciones),
etc.
 Cmo se cultiva una neurona?
Cultivar neuronas no es tan fcil como germinar un poroto pero en trminos generales el
proceso es similar. Tal como las semillas de los porotos se extraen de la chaucha, las neuronas se
extraen del cerebro de un animal que se sacrifica a tal fin. Luego se utilizan medios fsicos y
qumicos para separar las clulas entre s y se las coloca en una cpsula de petri. All son
regadas con un lquido que contiene todos los nutrientes que necesitan para sobrevivir y son
mantenidas en estufas a 37C. Una vez que estn en sus cpsulas, se pueden realizar todo tipo
de estudios ya que existe un verdadero arsenal tcnico (entre ellos inmunocitoqumicos) para
estudiar las clulas en cultivo.

Figura 11: La foto muestra

una neurona de
hipocampo en la cpsula
de Petri.
Estas clulas en cultivo
desarrollan un largo axn
con varias ramificaciones.

Seccin 3: ANALISIS MICROSCOPICO DE LA CLULA

El ojo humano puede distinguir dos puntos slo si estn separados por ms de una
dcima de milmetro (100 m). Por consiguiente, podemos decir que 100 m es prcticamente el
lmite de resolucin a simple vista. Las neuronas tienen un dimetro aproximado de 20 m y las
neuritas pueden medir una fraccin de micrmetro. Por consiguiente, el microscopio ptico fue un
desarrollo necesario antes que pudiera estudiarse la estructura neuronal. A pesar de que los
primeros microscopios datan desde el siglo XVIII, es recin a finales del siglo XIX cuando los
padres de la neuroanatoma, Camilo Golgi y Santiago Ramn y Cajal, lo aplicaron para estudiar las
clulas nerviosas.
Con el devenir de los aos, se ha logrado incorporar en la investigacin distintos tipos de
microscopa que sirven para estudiar diferentes aspectos del sistema nervioso. El uso de uno u
otro depender de la pregunta que el investigador se haga. A continuacin se presentarn los
microscopios ms utilizados:

Microscopio ptico:
Se trata de un instrumento que contiene una o varias lentes
que permiten obtener una imagen aumentada del objeto y que
funciona por refraccin. Los elementos mecnicos que lo componen
son: pie, columna, tubo, revlver (pieza giratoria que soporta los
objetivos), platina y tornillos. Posee 3 sistemas pticos: condensador,
objetivos (cantidad de aumento) y oculares. Este microscopio se
utiliza para observar la mayora de los preparados vistos en la
seccin anterior.
 Microscopio invertido:
Se usa para la observacin de clulas vivas en
cultivos. Provisto de condensador y objetivos para contraste
de fase, cara fotogrfica y sistema de video para registrar
procesos dinmicos. Es una variante del microscopio
convencional que tiene invertida la posicin de los objetivos,
ubicados por debajo de la platina mientras que la fuente de
iluminacin, condensador y diafragma estn situados sobre la
platina.

Microscopio confocal:
Se usa iluminacin con rayo lser. Con este microscopio se pueden visualizar molculas
fluorescentes en un plano de foco simple, creando una imagen muy ntida. La muestra es barrida
con luz excitante desde un rayo lser. Los rayos luminosos de la imagen que convergen, la
atraviesan y son recogidos por un detector que transfiere la informacin a una computadora para
integrarlos en la pantalla de un monitor. Un ejemplo de sustancia fluorescente que se puede ver en
este tipo de microscopio es el fluor Gold, visto en la seccin anterior.

Microscopio Electrnico de Transmisin:

Para ver estructuras anatmicas tan pequeas como las vesculas sinpticas y detalles de
los orgnulos celulares, los investigadores han de utilizar un microscopio electrnico. Con l se
pasa un haz de electrones de un lado a otro del tejido a examinar. Este microscopio tiene un can
electrnico con filamento de tungsteno (fuente de electrones). Por calentamiento del filamento y
diferencia de voltaje entre ctodo y nodo se desprenden electrones que son acelerados y forman
un haz que viaja por una columna al vaco. Hay lentes electromagnticas condensadoras, con
objetivos y proyectores. El campo magntico enfoca a los electrones y la imagen se forma en una
pantalla fluorescente.

Figura 12: Izquierda: Microscopio Electrnico de Transmisin. Derecha: Imagen de una

clula tomada con este microscopio. Ntese las membranas marcadas con las flechas
y las mitocondrias.
Microscopio Electrnico de Barrido:
Este microscopio permite obtener una imagen en tres dimensiones. Un haz de electrones
barre el tejido dinmicamente. La informacin recibida por la reflexin del haz se utiliza para
producir una imagen tridimensional muy detallada. Se diferencia del electrnico de transmisin en
dos aspectos principales: uno es que ofrece imgenes a menor aumento y el otro es que sirve para
revelar la superficie de los objetos en estudio en vez de sus componentes internos.

Figura 13: Izquierda: Microscopio

Electrnico de Barrido. Derecha: Imagen
de la superficie de una neurona donde se
puede observar los botones terminales de
otra neurona.

Tabla comparativa entre Microscopio de Luz (Optico) y Microscopio Electrnico

MICROSCOPIO MICROSCOPIO
DE LUZ ELECTRONICO
Iluminacin Haz de luz Haz de electrones
Longitud de onda 2000 - 7500 0.037 - 0.086
Lentes Vidrio Electromagnticas
Medio Atmsfera Vaco
Resolucin 2000 3
Magnificacin 10 x - 2000 x 100 x - 450000 x
Focalizacin Mecnica Elctrica
Contraste Absorcin - Reflexin Scattering

En este prctico se realiz un recorrido por las metodologas utilizadas para estudiar el
sistema nervioso a nivel microscpico. Muchsimas tcnicas han quedado afuera de esta
presentacin, pero lo fundamental ha sido expuesto. Lo que debe quedar como mensaje, es que
no hay una sola tcnica o un nico experimento que pueda responder las preguntas que plantean
los neurocientficos. Esto se obtiene del trabajo de miles de investigadores y es el conjunto de
datos obtenidos desde distintas perspectivas de donde obtenemos las respuestas. Por otro lado,
continuamente se estn desarrollando nuevas tecnologas que permiten ver cosas que antes no
podamos. Por lo tanto, el conocimiento actual viene con fecha de vencimiento. A no dejarse
estar

BIBLIOGRAFA:

Bear,M; Connors,B; Paradiso;M (1998): Neurociencia Explorando el cerebro.Masson-

Williams & Wilkins Espaa.
Hamilton,L.W (1976): Basic Limbic System Anatomy of The Rat. Plenum Press, New York.
Beltz,B & Burd,G (1989): Immunocytochemical Techniques (Principles and
Practice).Blackwell Scientific Publications. USA
Kandel,E;Jesell,T;Schwartz,J (1997): Neurociencia y Conducta. Prentice Hall. Madrid
Carlson,N (2006): Fisiologia de la conducta. 8va Edic. Pearson Educacin. Madrid
Centro de Microscopia Electrnica.Cba-Arg (2006): Curso de Postgrado Tcnicas de
Biologa Celular y Molecular utilizadas en Investigacin Bsica y Aplicada. Dictado por la
Facultad de Ciencias Mdicas (U.N.C).