UN INHIBIDOR DE LA CALPANA MEJORA LA CARGA CONVULSIVA EN UN

MODELO EXPERIMENTAL DE EPILEPSIA DEL LBULO TEMPORAL

Philip M. Lam, Jessica Carlsen, Marco I. Gonzlez

Departamento de Pediatra, Divisin de Neurologa y Programa de Investigacin

de Epilepsia Traslacional, Facultad de Medicina de la Universidad de Colorado,
Aurora, CO 80045, EE.UU.

En los seres humanos, casi la mitad de los individuos que experimentan de

novo Status epilepticus (SE) desarrollan epilepsia despus de un intervalo sin
convulsiones Un breve intervalo libre de convulsiones (perodo latente) tambin
precede a la aparicin de crisis espontneas en los modelos quimoconvulsivos
(pilocarpina o kainato) Adems de las convulsiones recurrentes, los roedores
que padecen una epilepsia inducida por quimio-convulsivo demuestran
lesiones cerebrales (Prdida neuronal, astrogliosis, brotes de fibras musgosas y
hipocampo Esclerosis) altamente isomorfo a la condicin humana.

Las proteasas dependientes del calcio con actividad parecida a la papana

(calpainas) pertenecen a una familia de cistena proteasas no lisosmicas
activadas por el calcio Dos isoformas principales de la calpana se expresan
omnipresente en el cerebro:
Calpain - 1 y calpain 2
Despus de una lesin cerebral, un aumento sostenido en el calcio intracelular
da lugar a la activacin de calpana La activacin de calpaina puede
detectarse fcilmente despus de una lesin cerebral inducida por
quimoconvulsivos (pilocarpina o cainato) tpicamente usados para
desencadenar SE(estatus epileptico)
Como tal, hay evidencia de que la activacin sostenida de la calpana
contribuye a la neurodegeneracin crnica y aguda en una amplia gama de
condiciones patolgicas, incluyendo SE (Vanderklish y Bahr, 2000, Beers y
Neumar, 2008, Saatman et al. , 2010). La inhibicin farmacolgica de la
calpana despus de la SE inducida por quimio- convulsivo proporciona
neuroproteccin (Araujo et al., 2008, Wang et al., 2008), lo que sugiere que las
calpainas tienen una contribucin activa al proceso neurodegenerativo agudo.
Adems, el anlisis de tejido obtenido de pacientes con epilepsia mostr una
mayor expresin de calpana. A pesar de este conocimiento, la contribucin de
la sobreactivacin de calpaina al proceso epileptognico sigue siendo poco
estudiada.

Debido a la existencia de una estrecha correlacin entre la activacin de la

calpana y una amplia gama de protenas que pueden ser escindidas por esta
proteasa, la inhibicin de la calpana es un objetivo teraputico atractivo
(Vosler y cols., 2008; Saatman et al., 2010). Como caracterstica adicional, se
espera que la inhibicin de calpana tenga pocos efectos secundarios ya que
los niveles basales de activacin de calpana que prevalecen en el cerebro
normal son relativamente bajos (Saatman et al., 2010). Aqu, se informan los
efectos de un inhibidor de la calpana en varios aspectos relacionados con la
epileptognesis, incluyendo la carga de convulsiones y patologas celulares
asociadas a la ocurrencia de convulsiones. Nuestros hallazgos sugieren que la
inhibicin farmacolgica de la calpana representa un nuevo enfoque
teraputico para reducir la carga convulsiva.

2. mtodo

2.1. El estado epilptico inducido por pilocarpina

Se alojaron ratas Sprague Dawley macho (Charles River, Wilmington, MA) en un

ambiente controlado con alimento y agua ad libitum. Los experimentos con
animales se realizaron de acuerdo con los reglamentos y protocolos del Comit
Institucional de Cuidado y Uso de Animales aprobados por el Campus Mdico
Anschutz de la Universidad de Colorado. El estado epilptico se indujo a las 8-9
semanas de edad de acuerdo con un protocolo reportado de manera no
deseada (Brooks-Kayal et al., 1998, Shumate et al., 1998). Para reducir los
efectos perifricos de la pilocarpina, se aplic una inyeccin intraperitoneal (ip)
de nitrito de metilo de escopolamina (1 mg / kg, Sigma, St. Louis, MO) 30 min
antes de la administracin de hidrocloruro de pilocarpina (385 mg / kg ip,
Sigma, St. Louis, MO). Si las ratas no presentaban ataques convulsivos 1 h
despus de la inyeccin de pilocarpina, se administr una segunda o tercera
dosis de pilocarpina (192,5 mg / kg) para lograr la equivalencia de convulsiones
entre animales. Para disminuir la progresin de las convulsiones y disminuir la
mortalidad, el diazepam (6 mg / kg, i.p., Hospira, Lake Forest, IL)

Se administr 1 h despus del inicio de la SE y se administraron dosis

adicionales (3 mg / kg, i.p.) cada 2 h si persistan las convulsiones. Las ratas de
control se manejaron de manera similar pero recibieron una dosis
subconvulsiva de pilocarpina (38,5 mg / kg, i.p.) y 1/10 de la dosis de diazepam
(0,6 mg / kg, i.p.). Como criterios para la inclusin, todas las ratas utilizadas
haban confirmado la etapa 5 convulsiones conductuales.

2.2. Lisados de tejidos Despus del rpido aislamiento del hipocampo del resto
del cerebro, se prepararon rebanadas de hipocampo (600 m) usando un
cortador de tejidos McIlwan. Cada trozo individual se microdissec a
continuacin para aislar el Cornus Ammonis 1 (CA1); La regin del hipocampo
donde se pueden detectar niveles ms prominentes de activacin de calpana y
muerte neuronal despus de SE (Araujo et al., 2008). Para la microdiseccin, la
regin CA3 se separ de la CA1 y DG; Entonces, la regin CA1 se separ de DG
a travs del surco hipocampal (Silva et al., 2001). Se reunieron todas las piezas
de CA1 recogidas de la misma rata, se congelaron en hielo seco y se
almacenaron a -80C. Se prepararon lisados de tejido completo mediante
sonicacin breve de tejido en tampn RIPA que contena una mezcla de
inhibidores de proteasa y fosfatasa. Para eliminar los restos celulares, los
lisados se eliminaron por centrifugacin a 17.000 xg durante 20 min. La
concentracin de protena se determin usando el kit de reactivo Bio-Rad RC /
DC (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.).

2.3. Transferencia de Western Las muestras de protena se separaron en geles

de SDS-poliacrilamida y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las
manchas se bloquearon con leche en polvo sin grasa al 5% en solucin salina
tamponada con Tris (pH 7,4) ms Tween 20 al 0,05%. Las manchas se
incubaron durante la noche a 4C con anticuerpos primarios diluidos en leche
en polvo sin grasa al 1%. Se produjo un anticuerpo policlonal de conejo, AB38,
que reconoce fragmentos de espectrina escindidos en calpana de ~ 150 kDa y
se caracteriz previamente (Roberts-Lewis et al., 1994) y fue un regalo
generoso del Dr. David R. Lynch (Universidad de Pensilvania, PENSILVANIA). Un
anticuerpo monoclonal de conejo que detecta la -espectrina de longitud
completa y escindida se obtuvo de Epitomics (Cat. No. 2507-1, Burlingame,
CA). Para estimar la variabilidad potencial en el contenido de protenas y la
carga, blots fueron re-probed con un anticuerpo anti-actina (Sigma, St. Louis,
MO). Despus de la incubacin con el anticuerpo primario, las transferencias se
lavaron y despus se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h con los
anticuerpos secundarios apropiados. Los anticuerpos secundarios anti-conejo o
anti-ratn conjugados con peroxidasa de rbano picante procedan de los
laboratorios GE Healthcare (Piscataway, NJ) o Jackson Immunoresearch (West
Grove, PA), respectivamente. Las bandas inmunorreactivas se visualizaron
utilizando sustrato quimioluminiscente Super Signal West Dura (Pierce,
Rockford, IL, EE.UU.) y pelcula. Despus de escanear las pelculas, las bandas
inmunorreactivas del tamao apropiado se cuantificaron usando ImageJ (NIH,
Bethesda, MD, EE.UU.). La inmunoreactividad para las bandas de inters se
normaliz a la inmunoreactividad de actina y se compar con los valores de
control.

2.4. Anlisis histolgico Las ratas fueron profundamente anestesiadas y

perfundidas transcardialmente, primero con PBS enfriado con hielo y luego con
PFA al 4% enfriado con hielo en tampn de fosfato 0,1 M pH 7,4. Se retiraron
los cerebros del crneo y se fijaron despus durante la noche en solucin al 4%
de PFA. Los cerebros fijos fueron crioprotegidos en una solucin de sacarosa al
30% y embebidos en un compuesto OCT (Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance,
CA). Los cerebros enteros se seccionaron en serie para obtener secciones
coronales de 15 m. Para la tincin, se seleccionaron tres secciones montadas
de una serie 1 en 15 comenzando aproximadamente al mismo nivel de
hipocampo (2,8 mm posterior a Bregma). Para la consistencia y minimizar la
variabilidad en el procedimiento de tincin, los cerebros de control y SE se
procesaron y se tieron en paralelo. Despus de la tincin, los recuentos
celulares se realizaron cegados al tratamiento administrado. El nmero de
clulas contadas en tres secciones se promedi y el nmero medio de clulas
es el valor informado para cada animal. Los controles en los que se omitieron
los anticuerpos primarios se realizaron para confirmar que la tincin era
dependiente del anticuerpo primario. Las imgenes se obtuvieron utilizando un
microscopio de fluorescencia Nikon Eclipse TE2000-U. Para detectar las
neuronas degeneradas, las secciones se tieron con una tcnica simple, fiable
y sensible utilizando el fluoro cromo fluorado Fluoro-Jade B (FJB, n de catlogo
1FJB, Histo-Chem Inc., Jefferson, AR). Las secciones montadas se secaron a
temperatura ambiente y se rehidrataron con etanol al 100% durante 10 min,
etanol al 70% durante 2 min y finalmente se aclararon en agua destilada
durante 2 min. Las secciones se sumergieron en permanganato de potasio al
0,06% durante 10 min, se enjuagaron con agua destilada durante 2 min y
finalmente se sumergieron en solucin de tincin FJB al 0,0004% durante 10
min. Despus de la tincin, las secciones se enjuagaron con agua destilada, se
secaron y se sumergieron en CitriSolv (Fisher, Pittsburgh, PA). Despus de la
tincin, las secciones de tejido se montaron en portaobjetos usando Permount
(Fisher Scientific, Pittsburg, PA, EE.UU.). Para estimar la astrogliosis, las
secciones cerebrales se tieron con un anticuerpo para detectar GFAP (un
marcador de astrocitos). Las secciones de tejido se bloquearon con PBS que
contena suero de cabra normal al 10%, BSA al 0,1%, glicina al 0,01% y Triton
X-100 al 0,3%. Las secciones se incubaron entonces durante la noche con un
anti-GFAP monoclonal de ratn (N Cat. G3893, Sigma, St. Louis, MO) diluido 1:
1000 en tampn de bloqueo. Al da siguiente, se lavaron las rebanadas y se
incubaron con un anticuerpo secundario antimsculo de cabra Alexa Fluor 568
adsorbido altamente cruzado. Para estimar la inflamacin, las rodajas de
cerebro se tieron con un anticuerpo para detectar Iba-1 (un marcador de
microglia). Se bloquearon las secciones de tejido con PBS que contena suero
de cabra normal al 10% y Triton X-100 al 0,3%. Las secciones se incubaron
luego durante la noche con un anticuerpo policlonal anti-Iba1 de conejo (N de
cat. 019-19741, Wako, Richmond, VA) diluido a 1: 500 en tampn de bloqueo.
Al da siguiente, las rebanadas se lavaron y se incubaron con un anticuerpo
secundario anti-conejo de cabra Alexa Fluor 568 altamente adsorbido en cruz.
Despus de la tincin, las secciones de tejido se montaron en portaobjetos
usando Vectorshield (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE.UU.). Para
evaluar la formacin de brotes de fibras musgosas, las rebanadas de cerebro
se tieron con un anticuerpo para detectar Zinc Transporter 3 (ZnT3), una
medida fiable de brotes de fibras musgosas (Chi et al., 2008; Hester y Danzer,
2013). Se bloquearon las secciones de tejido con PBS que contena suero de
cabra normal al 10% y Triton X-100 al 0,3%. Las secciones se incubaron luego
durante la noche con un anticuerpo policlonal de conejo anti-ZnT3 (N Cat. 197
002, Synaptic Systems GmbH, Gottingen, Alemania) diluido a 1: 500 en tampn
de bloqueo. Al da siguiente, las rebanadas se lavaron e incubaron con un
anticuerpo secundario anti-conejo de cabra Alexa Fluor 568 altamente cruzado.
Despus de la tincin, las secciones de tejido se montaron en portaobjetos
usando Vectorshield.

2.5. Implantacin de electrodos y electroencefalograma (EEG) Las ratas fueron

implantadas con electrodos de EEG intracraneal aproximadamente una semana
antes de la induccin de SE. Se utilizaron dos tornillos como electrodos
subdurales y se colocaron bilateralmente a ~ 2,5 mm lateralmente desde la
lnea media y 4 mm caudales a Bregma sobre los cortijos temporolmbicos.
Adems, se utiliz un alambre de acero inoxidable recubierto de poliamida
(Plastics-One, Roanoke, VA) como electrodo de profundidad y se coloc caudal
de aproximadamente 3,3 mm a Bregma, 1,69 mm lateral desde la lnea media
y 2,6 mm por debajo del crneo en el hipocampo derecho . Los electrodos de
referencia y tierra se colocaron en la parte posterior del crneo ligeramente
detrs de lambda. Se us acrlico dental para asegurar un conector de plstico
(Plastics-One, Roanoke, VA) unido a los electrodos de acuerdo con mtodos
estndar (Zhang et al., 2004; Grabenstatter et al., 2014). Los animales se les
permiti recuperarse de la ciruga durante una semana antes de la
experimentacin adicional. Para la grabacin de EEG, los animales se colocaron
en una cmara de registro y se conectaron a cables flexibles con un
conmutador (es decir, giratorio elctrico) para permitir el libre movimiento. Las
grabaciones se obtuvieron 24 h / da utilizando un sistema de video-EEG digital
Pinnacle (Pinnacle Technology Inc., Lawrence, KS). Un tcnico capacitado
cegado al tratamiento examin las grabaciones electrogrficas fuera de lnea
con el fin de identificar convulsiones electrogrficas y artefactos potenciales.
La actividad de convulsin difiere del ruido de fondo por la presencia de
seales de EEG con progresin de la frecuencia de pico, de gran amplitud y
actividad de alta frecuencia que dura al menos 10 s. La caracterizacin
conductual de las convulsiones se realiz de acuerdo con la escala de Racine
(Racine, 1972), que se basa en los comportamientos observados durante un
episodio convulsivo y clasifica las convulsiones en cinco categoras:
movimientos bucales y faciales, estadio 1; Cabeza asintiendo, etapa 2; Clonus
del antebrazo, etapa 3; Cra, etapa 4; Y la elevacin y la cada en la etapa 5.
Las convulsiones con un componente electrogrfico asociado con
manifestaciones sutiles o sin conducta fueron calificadas como de clase 2 o
inferior y etiquetadas como "no convulsivas", mientras que las convulsiones
con manifestaciones manifiestas de comportamiento fueron clasificadas como
clase 3 o superior y Etiquetados como "convulsivos" (Krook-Magnuson et al.,
2013, Grabenstatter et al., 2014).

2.6. Se us el software de anlisis de potencia de laboratorio (AD Instruments,

Colorado Springs, CO) para calcular la potencia de las seales EEG entre 1 y 50
Hz. La potencia se calcul para EEG individuales de una duracin de 1 min. Se
calcul un valor para las grabaciones basales recogidas antes de SE como
sigue: se calcul la potencia total para cada intervalo de un minuto dentro de
un perodo de 2 horas de registro EEG y se promedi con el fin de obtener un
valor de potencia nico que representaba la lnea de base promedio. El valor de
lnea de base promedio se utiliz entonces para normalizar los valores de un
minuto de tiempo obtenidos del anlisis de registros de EEG obtenidos antes,
durante y despus de SE. Los valores de potencia EEG del software Lab Chart
en mV2 se registraron de forma logtransformada en unidades de dB usando la
frmula: 10 log10 mV2 (Cahn et al., 2010). Un enfoque similar para el
anlisis de potencia se ha propuesto como mtodo estandarizado para el
anlisis cuantitativo de electrografa SE (Lehmkuhle et al., 2009). Para calcular
la Potencia Integral, se utilizaron los valores de potencia bruta obtenidos con el
Diagrama de Laboratorio. En este caso, se aadieron los valores para cada
poca oneminua y se reportaron como log mV2 / Hz. El poder integral se
calcul por perodos de tiempo que abarcaban la primera hora de SE (0 a 1 h
antes de la administracin de diazepam) o las primeras 6 h de SE (0 a 6 h,
incluido un perodo de tiempo despus de la administracin de diazepam).

2.7. Anlisis estadstico Los datos se presentan como la media SEM. Para la
evaluacin estadstica, se utilizaron pruebas paramtricas o no paramtricas
dependiendo de la distribucin de los datos. Se utiliz la prueba t de Student
para evaluar las diferencias entre dos grupos. El anlisis de varianza (ANOVA)
seguido de pruebas post hoc se utiliz para evaluar las diferencias cuando se
compararon ms de dos grupos. Valores de p 0,05 se consideraron
significativos. Se utiliz el software GraphPad InStat (GraphPad Software, Inc.,
San Diego, CA, EE.UU.) para realizar el anlisis estadstico.

3. Resultados En este estudio se evalu el papel que la sobreactivacin de

calpana podra tener en la epileptognesis. Western blot anlisis se utiliz para
caracterizar el tiempo de curso de calpaina activacin durante el "silencioso"
perodo despus de la pilocarpina inducida por SE. Se estim la activacin de
calpana mediante la deteccin de la formacin de productos de
descomposicin de -espectrina (SBDPs), un sello distintivo de la actividad de
la calpana. Dos anticuerpos diferentes se utilizaron para este anlisis: el
primero, el anticuerpo AB38, detecta SBDPs generados por la divisin de
calpana especfica; El segundo anticuerpo anti- espectrina detecta tanto la
protena de longitud completa como las SBDP generadas despus de la escisin
(Figura 1). Western blot anlisis de lisados de tejidos obtenidos en diferentes
puntos de tiempo a lo largo del epileptogenic perodo mostr un tiempo de
dependencia en el aumento de SBDPs que

Se detect de forma similar con ambos anticuerpos. El anticuerpo AB38

detect un aumento significativo en las SBDP dentro de las 24 h de la induccin
de SE que se mantiene 4 das despus de SE y parece disminuir a los 8 das
post-SE (Figura 1). Aunque en estos experimentos ambos anticuerpos
detectaron un aumento significativo en la formacin de SBDPs, los resultados
obtenidos con el anticuerpo AB38 fueron ms consistentes que los revelados
por el anticuerpo de -espectrina. Para evaluar los efectos de la inhibicin de la
calpana en la generacin de SBDP se utiliz un tratamiento de dosis baja y alta
con MDL-28170 (50 mg / Kg, i.p.). La dosis y la concentracin aplicadas se
eligieron de acuerdo con estudios previos que describan la administracin de
MDL-28170 al cerebro (Li et al., 1998, Markgraf et al., 1998, Araujo et al.,
2008). Cuando se compararon con los animales de control, las ratas tratadas
con vehculos mostraron un aumento espectacular en la generacin de SBDP
(Figura 1). Las muestras de animales tratados con

Tanto la dosis baja como la dosis alta de MDL-28170 mostraron una reduccin
parcial pero significativa en las SBDPs detectadas por el anticuerpo AB38
(Figura 1E). Los resultados obtenidos con el anticuerpo -espectrina fueron
ms variables ya pesar de una tendencia a la baja no fueron estadsticamente
significativos (Fig. 1F). La reduccin limitada en la formacin de SBDPs
detectada con el anticuerpo AB38 sugiri que, tal como se describi
anteriormente, el tratamiento MDL-28170 podra utilizarse para bloquear al
menos parcialmente la sobreactivacin de calpana y prevenir la muerte
neuronal (Araujo et al., 2008, Wang et al., 2008 ). Para corroborar el efecto de
MDL-28170 sobre la degeneracin neuronal, FJB tincin se utiliz para evaluar
la muerte neuronal despus de la induccin SE. Las secciones de tejido de
ratas tratadas con vehculo mostraron un aumento variable pero consistente en
el nmero de clulas FJB + detectadas en la regin CA1 del hipocampo
mientras que no se detect tincin obvia en el tejido de los animales testigo
(Figura 2). El nmero de clulas FJB + positivas en el grupo de dosis baja fue
variable y ms similar al tejido tratado con vehculo, pero el nmero de clulas
FJB + en el grupo de dosis alta disminuy significativamente, lo que sugiere
que la inhibicin de la calpana despus de SE redujo el nmero de clulas
degeneradas . La observacin de que el tratamiento de dosis alta con MDL-
28170 previene la neurodegeneracin despus de la SE inducida por quimio-
convulsivo es consistente con evidencia previa que sugiere que la
administracin frecuente de MDL-28170 durante un corto perodo de tiempo es
necesaria para prevenir la muerte neuronal (Araujo et al. 2008). Para evaluar
los efectos de MDL-28170 sobre la carga de convulsiones, se recogieron
grabaciones de EEG y vdeo continuas. El anlisis inicial de los registros
electroencefalogrficos revel que los tres grupos de animales (vehculo, baja y
alta dosis) presentaron actividad convulsiva, lo que sugiere que MDL-28170 no
aboli la aparicin de SRS siguiendo la SE inducida por pilocapina. Sin
embargo, se detectaron diferencias en la frecuencia de convulsiones entre el
vehculo y las ratas tratadas con MDL-28170. En los animales tratados con
vehculos, el nmero de convulsiones detectadas en bases diarias aument de
manera constante durante las dos primeras semanas despus del SE
(epileptognico) hasta entonces, como se ha descrito anteriormente, entran en
un ciclo de baja frecuencia de convulsiones durante las semanas tres y cuatro
(Goffin et al., 2007, Grabenstatter et al., 2014). Los animales tratados con
vehculo mostraron un pico prominente en el nmero promedio de convulsiones
por da que se detect durante la segunda semana de registro. En adicin,

El nmero de animales que presentaron mayor frecuencia de convulsiones

(20 convulsiones por da) fue ms prominente en el grupo tratado con
vehculo

(Figura 3A). En contraste, el nmero medio de convulsiones por da detectado

en el grupo de dosis baja no mostr un pico prominente y permaneci plano
durante las cuatro semanas de registro. En comparacin con el grupo de
vehculos, el nmero de convulsiones detectadas durante la segunda semana
de registro se redujo significativamente en el grupo de dosis baja (Fig. 3).

Inesperadamente, ya pesar de una tendencia hacia la reduccin, el nmero de

convulsiones detectadas en el grupo de dosis alta no fue significativamente
diferente del grupo tratado con vehculo. Un anlisis adicional que incluy
todas las convulsiones detectadas durante cuatro semanas de registro mostr
que el nmero total de convulsiones detectadas en el grupo de dosis baja se
redujo significativamente en comparacin con el grupo de vehculo, lo que
sugiere una reduccin neta en el nmero de convulsiones detectadas en dosis
bajas grupo. Cabe mencionar que, tal como se ha descrito anteriormente
(Goffin et al., 2007, Grabenstatter et al., 2014); Existe una gran variabilidad en
el nmero de convulsiones en cualquier da dado. As, es posible que, a pesar
de una tendencia, los altos niveles de variabilidad inter e intra-animal
oscurecieran las posibles diferencias. El anlisis de las convulsiones detectadas
en las grabaciones de EEG junto con el anlisis de las grabaciones de vdeo
correspondientes de acuerdo con la escala de Racine (Racine, 1972) ayud a
clasificar y clasificar los episodios de convulsiones individuales en dos grandes
grupos: convulsivo (escala de Racine 3-5 o convulsiones generalizadas ) Y no
convulsivas (escala de Racine 1-2 o convulsiones parciales). La clasificacin de
convulsiones convulsivas y no convulsivas demostr que la mayora de los
comportamientos asociados con anomalas EEG correspondan a crisis
convulsivas (escala 3-5 de Racine) y que el nmero de convulsiones fue el que
ms cambi (Fig. 3). Un anlisis posterior mostr un efecto preponderante de
MDL-20817 en la prevencin de la aparicin de crisis convulsivas y un efecto
menos evidente sobre convulsiones no convulsivas. El anlisis del nmero total
de crisis convulsivas detectadas durante las cuatro semanas de seguimiento
mostr una disminucin significativa en el grupo de dosis baja, pero
sorprendentemente no se detect ningn cambio significativo en el grupo de
dosis alta (Figura 3C). Adems, el porcentaje de convulsiones conductuales y
no conductuales detectadas en ratas tratadas con vehculos y en dosis bajas
fue similar (Fig. 3D). Otro parmetro analizado fue la duracin de la convulsin
y, en general, la duracin de la convulsin fue similar en todos los grupos
analizados y no cambi con el tratamiento (Fig. 3E). Cuando las convulsiones
convulsivas se analizaron de forma independiente, la duracin de la convulsin
permaneci inalterada. En resumen, un tratamiento de dosis baja con MDL-
28170 fue ms eficaz para reducir la aparicin de convulsiones durante la fase
temprana de la enfermedad cuando la frecuencia de las crisis es mayor.

La primera dosis de MDL-28170 se administr 1 h despus del inicio de SE, al

mismo tiempo que se administr la primera dosis de diazepam para
interrumpir SE y reducir la mortalidad. Esto se hizo con el fin de reducir la
posibilidad de que el tratamiento MDL-28170 podra modificar el insulto
iniciado SE inicial. Para evaluar ms a fondo si MDL-28170 tratamiento alterado
SE, un anlisis de potencia se llev a cabo. La potencia total calculada durante
las primeras 12 h de SE muestra que todos los grupos analizados muestran un
patrn similar de aumento de potencia y evolucin en el hipocampo y la
corteza (Fig. 4). Adems, el tratamiento con MDL-28170 no redujo
significativamente la potencia integral detectada durante la primera hora de SE
(antes de la administracin de diazepam, 0 a 1 h) o durante las primeras 6 h de
SE (antes y despus de la administracin del diazepam, de 0 a 6 h ). Puesto
que no se observaron diferencias importantes en el poder, parece que la
severidad de SE fue equivalente entre los diferentes grupos analizados. La
epileptognesis se asocia comnmente con la neuroinflamacin, una patologa
que puede detectarse en el tejido cerebral como gliosis reactiva. Para
determinar una posible correlacin entre reduccin de SRS y reduccin de la
inflamacin como consecuencia del tratamiento con MDL-28170, se analiz la
inmunoreactividad de GFAP (astrogliosis) e Iba-1 (microgliosis) en tejido
obtenido 24 h despus de SE. En el grupo tratado con vehculo, la
inmunotincin con anticuerpos tanto para GFAP como para Iba-1 mostr un
aumento espectacular en el nmero de clulas inmunopositivas (figura 5). Un
anlisis semicuantitativo de la regin CA1 del hipocampo mostr que el
tratamiento con dosis baja redujo significativamente el nmero de clulas GFAP
e Iba-1 positivas. Sin embargo, a pesar de una tendencia a la baja, la reduccin
en el nmero de GFAP y Iba-1 clulas positivas en el grupo de dosis alta no fue
estadsticamente significativa. Un efecto a largo plazo de la SE inducida por
pilocarpina es la aparicin de brotes de fibras musgosas aberrantes en clulas
granulares de giro dentado. Estudios anteriores han demostrado que la
deteccin de inmunoreactividad de ZnT3 en la

Terminales de axn de las clulas granulares de la circunvolucin dentada

proporciona una medida fiable de brotes de fibras musgosas (Chi et al., 2008;
Hester and

Danzer, 2013). Para probar si el tratamiento con el inhibidor de calpana

bloqueaba la formacin de brotes de fibras musgosas, se recogi tejido de un
subconjunto de animales crlneamente epilpticos y se ti para detectar la
inmunoreactividad de ZnT3. En los animales epilpticos crnicos tratados con
vehculo despus de la induccin de SE, se detect tincin intensa de ZnT3
(figura 6). El tratamiento agudo con MDL-28170 despus de SE redujo
significativamente la tincin de ZnT3, lo que sugiere una reduccin en la
formacin de brotes en el grupo de dosis baja. No se detect una reduccin
significativa en el brote en el grupo de dosis alta, lo que se correlaciona con
una falta de efecto sobre la reduccin de la carga de convulsiones.

4. Discusin

Los mecanismos moleculares involucrados en la transformacin de un cerebro

normal en un epilptico no se entienden completamente. En este estudio,

Se utiliz el modelo de pilocarpina de la epilepsia para evaluar la participacin

de la desregulacin de calpana en la epileptognesis. La generacin de SBDPs
(un sello distintivo de la activacin de la calpana) se detect despus de la SE
pilocarpina inducida, antes y durante la aparicin de convulsiones
espontneas, lo que sugiere la existencia de la activacin sostenida de
calpana durante la epileptognesis. La administracin de MDL-28170, un
inhibidor farmacolgico permeable a las clulas de calpana, dio lugar a una
disminucin parcial pero significativa en la deteccin de SBDPs. El tratamiento
con MDL-28170 tambin result en una reduccin significativa en la carga de
convulsiones. Esta reduccin en la ocurrencia de convulsiones se correlacion
con una disminucin en la inflamacin de los tejidos y germinacin celular
proporcionando un posible vnculo entre la ocurrencia de convulsiones y los
cambios a nivel celular.

En el cerebro, la sobreactivacin de calpana se observa generalmente despus

de condiciones excitotxicas como traumatismo fsico, insulto hipxico /
isqumico o

Desafo qumico (Liu et al., 2008). La escisin dependiente de calpana de las

protenas funcionales y estructurales requeridas para la funcin cerebral
adecuada es un componente principal del dao celular que sigue comnmente
a la lesin excitotxica (Liu et al., 2008; Curcio et al., 2016). Informes
anteriores han demostrado que la administracin de MDL-28170 bloquea la
aparicin de SBDPs y la muerte neuronal (Araujo et al., 2008; Vosler et al.,
2008; Wang et al., 2008). Aqu, se evalu el papel de la sobreactivacin de
calpana en la epileptognesis. El tratamiento con MDL-28170 despus de la
induccin de SE produjo una reduccin en la carga de convulsiones. Sin
embargo, el efecto beneficioso de esta inhibicin no fue sencillo y parece ser
dependiente de la dosis. De los dos grupos tratados con el inhibidor de la
calpana, el grupo de dosis baja mostr una reduccin significativa en la carga
de convulsiones asociada con una reduccin en la deteccin de marcadores de
inflamacin y brotacin. Curiosamente, el grupo de dosis alta, un grupo de
animales tratados con una mayor cantidad de MDL-28170 no mostr una
reduccin significativa en la frecuencia de convulsiones o una reduccin
significativa en la manifestacin de los marcadores de inflamacin y brotacin.
Es bien sabido que en modelos animales de epilepsia, la induccin de SE con
quimio-convulsivos provoca una cascada inflamatoria rpida y intensa (Vezzani
et al., 2015).

La interleucina-1 (IL-1) es una de las varias molculas inflamatorias implicadas

en las respuestas perjudiciales observadas despus de SE y sus isoformas, IL-
1 e IL-1 se han asociado con la respuesta inflamatoria detectada en la
epilepsia. En el hipocampo y el prosencfalo de ratones y ratas adultos, se
pueden detectar niveles elevados de transcritos de IL-1 inmediatamente
despus de la aparicin de SE (30-60 min). Esta expresin aumentada precede
a la respuesta inflamatoria glial tpicamente observada durante la
epileptognesis (Vezzani et al., 2015). Adems, se ha detectado una
inmunorreactividad incrementada de IL-1 en tejido obtenido del lbulo
temporal de pacientes epilpticos (Sheng et al., 1994, Kan et al., 2012).
Adems, los polimorfismos de un solo nucletido que conducen a una
expresin aumentada de IL-1 se han asociado a epilepsia (Dominici et al.,
2002, Salzmann et al., 2008). Curiosamente, tanto la IL-1 como la IL-1 se
expresan como protenas precursoras que se activan completamente despus
del procesamiento proteoltico por calpainas y caspasas, respectivamente
(Inglaterra et al., 2014). Estas observaciones plantean la posibilidad de que el
procesamiento aumentado de IL-1 por calpana podra ofrecer un vnculo
entre la activacin de calpana y la aparicin de la inflamacin relacionada con
IL-1. Se cree que el dao hipocampal es crtico para el desarrollo de TLE y los
frmacos neuroprotectores han sido considerados como una estrategia
potencial para bloquear la epileptognesis (Loscher y Brandt, 2010).
Basndose en el concepto de que la neuroproteccin podra ser beneficiosa
despus de SE, la prevencin de la prdida neuronal se adopt como una
estrategia viable para prevenir

Epilepsia (Walker, 2007). Sin embargo, en algunos casos particulares, la

neuroproteccin no evita las convulsiones espontneas, sugiriendo
fuertemente que la neurodegeneracin podra no ser un requisito previo para la
epileptognesis (Brandt et al., 2003). Estudios previos han demostrado que
MDL-28170 reduce la muerte neuronal despus de SE (Araujo et al., 2008,
Wang et al., 2008) y los resultados presentados aqu confirman la participacin
de calpana en la neurodegeneracin. Sin embargo, la reduccin ms marcada
en la carga de crisis fue detectada en condiciones en las que la muerte
neuronal no se evit. Esto plantea la posibilidad de que, como se sugiri
anteriormente, la prdida neuronal extensa tambin podra prevenir las
convulsiones evitando la formacin de una red (dis) funcional necesaria para
sostener la actividad epilptica (Walker, 2007). Por lo tanto, es posible que
mientras que el tratamiento de dosis baja no previene significativamente la
prdida de clulas, el tratamiento de dosis alta previno la prdida de clulas
que se integraron anormalmente en la red y contribuy a la generacin de
convulsiones y cancel algunos de los efectos beneficiosos del tratamiento. De
hecho, hay evidencia de que los mecanismos neuroprotectores endgenos
pueden ser proepileptognicos porque promueven la reorganizacin axonal
mientras que la prdida extensa de neuronas puede reducir la susceptibilidad a
las convulsiones (Walker, 2007). El brote de fibras musgosas aberrantes es una
caracterstica neuropatolgica comn del tejido epilptico crnico (Sutula et al.,
1989, Buckmaster et al., 2002). Sin embargo, aunque algunos estudios han
encontrado una correlacin entre la extensin de la brote de la fibra musgosa y
la frecuencia de las convulsiones, otros no lo han hecho (Buckmaster y Lew,
2011). La rapamicina, un frmaco que inhibe la va de sealizacin que implica
la activacin del objetivo mamfero de la rapamicina, suprime la brotacin de la
fibra musgosa y la frecuencia de las convulsiones en algunos modelos de TLE
en ratas, pero no en todos (Zeng et al., 2009). Tambin, en algunos casos, la
rapamicina bloque la brotacin de la fibra musgosa sin afectar la frecuencia
de las crisis (Buckmaster y Lew, 2011; Heng et al., 2013). As,

Los experimentos que usan rapamycin sugieren que el brote musgoso no

puede ser absolutamente necesario para que ocurra epileptogenesis. En la
corriente

, Se detect una reduccin significativa en el brote de fibras musgosas en el

grupo de dosis baja y se correlacion con una reduccin en la frecuencia de las
crisis. A pesar de una tendencia a la baja, el grupo de dosis alta no mostr una
clara reduccin en la frecuencia de brotes o convulsiones. Puesto que no est
claro si la brotacin de la fibra musgosa es pr o antiepileptognica y las
convulsiones espontneas durante el perodo crnico pueden ocurrir en
ausencia de brotes de fibras musgosas (Buckmaster y Lew, 2011; Buckmaster,
2014), es posible que la inhibicin aguda de la calpana Interfiere con la
manifestacin de brotes de fibras musgosas durante la fase crnica al reducir
la recurrencia de las convulsiones crnicas espontneas.

La falta de un efecto ms prominente sobre la reduccin de convulsiones en

animales tratados con mayores cantidades de MDL-28170 fue inesperada ya
que la prediccin inicial era que una inhibicin ms eficiente de la calpana
sera ms beneficiosa. La razn de esta dicotoma es desconocida, pero
algunas explicaciones plausibles incluyen: (i) dosis ms altas de inhibidor
podran resultar en una mayor inhibicin de la calpana extendida que a su vez
promover efectos perjudiciales. Se puede especular que una dosis baja de
inhibidor de calpana slo tiene como objetivo efectos "indeseables" de la
sobreactivacin de calpana, pero dosis ms alta tambin bloquea los efectos
"deseables" que requieren actividad de calpana. En estas lneas, hay evidencia
que sugiere que la actividad de la calpana es necesaria para la reparacin de
la membrana y la cicatrizacin de heridas (Mellgren et al., 2007; Nassar et al.,
2012). De este modo, el bloqueo completo de la actividad de la calpana puede
inhibir la membrana y los mecanismos de reparacin celular necesarios para
mantener la homeostasis celular retrasando la recuperacin y dando lugar a
efectos adversos. (Ii) Los subtipos de calpana ms abundantes encontrados en
el cerebro de los mamferos son la calpana-1 y la calpana-2 (Vanderklish y
Bahr, 2000; Bevers y Neumar, 2008; Liu et al., 2008; Saatman et al. Al., 2010).
La actividad de la calpana detectada en el cerebro lesionado como SBDPs
resulta ms probable de la activacin tanto de la calpana-1 como de la
calpana-2 y la contribucin especfica de cada subtipo de calpana es en su
mayor parte indistinguible. La evidencia reciente sugiere que la calpana-1 y la
calpana-2 desempean papeles opuestos en neuroproteccin y
neurodegeneracin (Seinfeld et al., 2016, Wang et al., 2016), siendo necesaria
la activacin de la calpana-1 para la neuroproteccin mientras que la calpana-
2 da como resultado neurodegeneracin (Baudry y Bi, 2016). Por lo tanto, es
posible que a pesar del hecho de que ambos subtipos de calpana tengan
afinidades similares para el inhibidor usado en este estudio, la calpana-1 es
preferentemente inhibida por el tratamiento de dosis baja y la dosis alta de
tratamiento inhibe tanto la calpana-1 como la calpana-2 . Lamentablemente,
los resultados obtenidos en el presente estudio no pueden determinar la
contribucin de calpaina-1 o calpaina-2, pero una progresin natural de los
estudios actuales es investigar ms si hay un papel independiente para la
calpana-1 o la calpana-2 durante la epileptognica proceso.

5. Conclusin

Este estudio encontr que el tratamiento con un inhibidor de calpana redujo

parcialmente la carga de convulsiones y que la reduccin en la carga de
convulsiones se correlacion con una disminucin en la deteccin de
marcadores asociados con la inflamacin de tejido y brotacin celular. Estas
observaciones proporcionan alguna evidencia que sugiere que los inhibidores
de la calpana podran usarse como agentes para bloquear la aparicin de crisis
epilpticas crnicas. Proponemos que la inhibicin farmacolgica de la calpana
podra representar un nuevo enfoque teraputico para reducir la carga
convulsiva en la epilepsia postraumtica