CULTIVO - Javeriana

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE FLORA BACTERIANA
NATIVA DEL SUELO DE LOS PRAMOS CRUZ VERDE Y GUASCA
(CUNDINAMARCA)
GERMN DAVID BENAVIDES RODRIGUEZ

ANA MARA HERMIDA SILVA
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGA INDUSTRIAL
Bogot D.C
2008
(CUNDINAMARCA)
GERMAN DAVID BENAVIDES RODRIGUEZ

TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar el ttulo
MICROBIOLOGO INDUSTRIAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGA INDUSTRIAL
Bogot D.C
2008
NOTA DE ADVERTENCIA
Artculo 23 de la Resolucin N 13 de Julio de 1946

La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por
sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velar por que no se publique
nada contrario al dogma y a la moral catlica y por que las tesis no
contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien que se
vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia.
(CUNDINAMARCA)
GERMAN DAVID BENAVIDES RODRIGUEZ

APROBADO
DIRECTOR
Rubn Daro Torrenegra

Qumico
JURADO JURADO
(CUNDINAMARCA)
GERMAN DAVID BENABIDES RODRIGUEZ

APROBADO
DECANO ACDEMICO DIRECTOR DE CARRERA
Ingrid Schuler, ph.D. Janeth Arias Palacios, M.Sc. M.Ed.

RESUMEN
En el presente trabajo se realiz el aislamiento y la identificacin de la

flora nativa del suelo de los pramos Cruz verde y Guasca; con el fin de
contribuir al estudio de la poblacin bacteriana de estos ambientes
extremos.
El muestreo se bas en la norma ICONTEC NTC 4113-6 y se llev a cabo
por medio de tres mtodos diferentes: Caja rodac, Pala y Barreno. Se
realizaron dos tcnicas de aislamiento que fueron la tcnica de dilucin en
tubo y dispersin directa, en los medios Agar Extracto de Suelo y Medio
Agar Nutritivo. Por medio de la coloracin Gram se hizo la identificacin
microscpica dividiendo as las cepas en dos grupos Gram positivos y
Gram negativos y posteriormente en subgrupos los esporoformadores y
no esporoformadores,obteniendo un alto porcentaje de bacterias Gram
positivas; mediante el uso de bioqumicas y medios de cultivos selectivos
se identificaron 40 cepas bacterianas correspondientes a los siguientes
gneros: Amphibacillus, Bacillus, Brochothrix, Caryophanon, Kurthia,
Lactobacillus, Lactococcus, Listeria, Micrococcus, Pediococcus,
Sacharococeus, Sarciana, Sporolactobacillus, Sporosarcina,
Staphylococcus y Trichococcus. Los gneros Bacillus y Lactobacillus
fueron los gneros ms predominantes en este proyecto.
Finalmente las cepas identificadas se conservaron con el propsito de
mantener este material biolgico en un estado viable y estable, la
conservacin se hizo por tres mtodos diferentes: Suelo estril, Glicerol,
Sensidiscos.
TABLA DE CONTENIDO
TTULO PGINA
1. Introduccin 2
2. Marco Terico 3
2.1. Suelo 3
2.1.1. Perfil del Suelo 4
2.1.2. Textura del suelo 4
2.1.3. Componentes del Suelo 4
2.1.4. Microorganismos del Suelo 5
2.1.5. Muestreo del Suelo 7
2.2. Pramo 7
2.2.1. Vegetacin de los pramos 7
2.2.2. Suelo de los Pramos 8
2.3. Crecimiento Microbiano 9
2.3.1. Efecto de la Temperatura 10
2.3.1.1. Crecimiento Microbiano a Temperaturas Extremas 10
2.3.2. Acidez y Alcalinidad 11
2.3.3. Oxgeno 12
2.4. Identificacin Bioqumica 12
2.4.1. Prueba de Voges Proskauer 14
2.4.2. Prueba Rojo de Metilo 14
2.4.3. Prueba LIA (Descarboxilacin Lisina) 15

TTULO PGINA
2.4.4. Hidrlisis de Almidn 16
2.4.5. Prueba SIM 16
2.4.6. Prueba TSI 17
2.4.7. Prueba Citocromo Oxidasa 17
2.4.8. Prueba de Citrato 18
2.4.9. Prueba de Ureasa 18
2.4.10. Prueba Reduccin de Nitratos 19
2.4.11. Prueba de Catalasa 19
2.4.12. Licuefaccin de gelatina 20
2.4.13. Prueba de fermentacin de hidratos de carbono 20
2.5. Bioconservacin 21
3. Formulacin del Problema y Justificacin 23
3.1. Formulacin del Problema 23
3.2. Justificacin 23
4. Objetivos 25
4.1. Objetivo General 25
4.2. Objetivos Especficos 25
5. Metodologa 26
5.1. Recoleccin de las Muestras 26
5.2. Procesamiento de las Muestras 28
5.2.1. Tcnicas de aislamiento 28
5.2.1.1. Lavado de Suelo 28

TTULO PGINA
5.2.1.2. Tcnica de placa de conteo de Warcup 28
5.2.1.3. Tcnica de cultivo lquido 29
5.3. Identificacin Bacteriana 29
5.3.1. Identificacin Microscpica y Macroscpica 29
5.3.2. Identificacin Bioqumica 29
5.4. Conservacin de Cepas 30
5.4.1. Mtodos de Conservacin 30
5.4.1.1. Conservacin en Aceite Mineral 30
5.4.1.2. Conservacin por suspensin en agua destilada 30
5.4.1.3. Conservacin en Suelo estril 30
5.4.1.4. Conservacin en Slica Gel 31
5.4.1.5. Conservacin por Liofilizacin 31
5.4.1.6. Criopreservacin 31
5.4.1.7. Conservacin por Desecacin en papel de filtro 32
6. Experimentacin 33
6.1. Reconocimiento de la Zona 33
6.2. Recoleccin de Muestras 34
6.3. Procesamiento de las Muestras 36
6.4. Aislamiento de Bacterias 37
6.4.1. Aislamiento Primario 37
6.4.1.1. Tcnica Dilucin en Tubo 37
6.4.1.2. Tcnica de Aspersin Directa 37

TTULO PGINA
6.4.1.3. Aislamiento a Partir de Caja Rodac 37
6.5. Identificacin Bacteriana 38
6.5.1. Identificacin Microscpica 38
6.5.2. Identificacin Bioqumica 38
6.6. Conservacin de Cepas 39
6.6.1. Conservacin en Suelo Estril 39
6.6.2. Conservacin en Glicerol 40
6.6.3. Conservacin en Sensidiscos 40
7. Resultados y Discusin 41
7.1. Parmetros para la seleccin de gneros 41
7.2. Bacilos esporoformadores Gram positivos 42
7.2.1. Gnero Amphybacillus 44
7.2.1.1. Amphybacillus sp. 44
7.2.1.2. Amphybacillus xylanus 45
7.2.2. Gnero Bacillus 46
7.2.2.1. Bacillus azotoformans 47
7.2.2.2. Bacillus cereus 48
7.2.2.3. Bacillus circulans 49
7.2.2.4. Bacillus globisporus 50
7.2.2.5. Bacillus marinus 51
7.2.2.6. Bacillus pasteurii 52
7.2.2.7. Bacillus sphaericus 53

TTULO PGINA
7.2.3. Gnero Sporolactobacillus 54
7.2.3.1. Sporolactobacillus inulinus 54
7.3. Cocos eporoformadores Gram positivos 55
7.3.1. Gnero Sporosarcina 55
7.3.1.1. Sporosarcina ureae 56
7.4. Bacilos Gram positivos no esporoformadores 57
7.4.1. Gnero Bochotrix 57
7.4.1.1. Brochothrix campestris 58
7.4.1.2. Brochothrix thermosphacta 59
7.4.2. Gnero Caryophanon 60
7.4.2.1. Caryophanon latum 60
7.4.2.2. Caryophanon tenue 61
7.4.3. Gnero Kurthia 62
7.4.3.1. Kurthia gibsonii 62
7.4.3.2. Kurthia sibirica 63
7.4.3.3. Kurthia zopfii 64
7.4.4. Gnero Lactobacillus 64
7.4.4.1. Lactobacillus agilis 65
7.4.4.2. Lactobacillus collinoides 66
7.4.4.3. Lactobacillus confusus 67
7.4.4.4. Lactobacillus fructosus 68
7.4.4.5. Lactobacillus kandleri 69

TTULO PGINA
7.4.4.6. Lactobacillus sake 70
7.4.4.7. Lactobacillus viridescens 71
7.4.5. Gnero Listeria 72
7.4.5.1. Listeria murrayi 72
7.4.5.2. Listeria welshimeri 73
7.5. Cocos Gram positivos no esporoformadores 74
7.5.1. Gnero Lactococcus 74
7.5.1.1. Lactococcus lactis 75
7.5.2. Gnero Micrococcus 76
7.5.2.1. Microccocus luteus 76
7.5.2.2. Micrococcus roseus 77
7.5.3. Gnero Pediococcus 77
7.5.3.1. Pediococcus sp. 78
7.5.4. Gnero Sacharococeus 79
7.5.4.1. Sacharococeus thermophilus 79
7.5.5. Gnero Sarcina 80
7.5.5.1. Sarcina ventriculi 80
7.5.6. Gnero Syaphylococcus 81
7.5.6.1. Staphylococcus arlettae 81
7.5.6.2. Staphylococcus auricularis 82
7.5.6.3. Staphylococcus equorum 83
7.5.6.4. Staphylococcus hominis 84

TTULO PGINA
7.5.6.5. Staphylococcus lentus 85
7.6. Coco-Bacilos no esporoformadores Gram positivos 86
7.6.1. Gnero Trichococcus 86
7.6.1.1. Trichococcus flocculiformis 86
8. Conclusiones 87
9. Recomendaciones 88
10. Referencias 89
TABLA DE FIGURAS
TTULO DE FIGURA PGINA
FIGURA 1. Recorrido en toma de muestras en suelo 26
FIGURA 2. Barrenos 27
FIGURA 3. Mapa de cuadrantes de muestreo 34
FIGURA 4. Toma de muestras con cajas rodac 35
FIGURA 5. Toma de muestras con pala 35
FIGURA 6. Toma de muestras con barreno 36
FIGURA 7. Transporte de muestras 36
FIGURA 8. Aislamiento primario en cajas rodac 38
FIGURA 9. Microscopia 100X de Amphybacillus sp. 44
FIGURA 10. Amphybacillus sp. en Agar Nutritivo 44
FIGURA 11. Microscopia 100X de Amphybacillus xylanus 45
FIGURA 12. Amphybacillus xylanus en Agar Nutritivo 45
FIGURA 13. Microscopia 100X de Bacillus azotoformans 47
FIGURA 14. Bacillus azotoformans en Agar Nutritivo 47
FIGURA 15. Microscopia 100X de Bacillus cereus 48
FIGURA 16. Bacillus cereus en Agar Nutritivo 48
FIGURA 17. Microscopia 100X de Bacillus circulans 49
FIGURA 18. Bacillus circulans en Agar Nutritivo 49
FIGURA 19. Microscopia 100X de Bacillus globisporus 50
FIGURA 20. Bacillus globisporus en Agar Nutritivo 50

FIGURA 21. Microscopia 100X de Bacillus marinus 51
FIGURA 22. Bacillus marinus en Agar Nutritivo 51
FIGURA 23. Microscopia 100X de Bacillus pasteurii 52
FIGURA 24. Bacillus pasteurii en Agar Nutritivo 52
FIGURA 25. Microscopia 100X de Bacillus sphaericus 53
FIGURA 26. Bacillus sphaericus en Agar Nutritivo 53
FIGURA 27. Microscopia 100X de Sporolactobacillus inulinus 54
FIGURA 28. Sporolactobacillus inulinus en Agar Nutritivo 54
FIGURA 29. Microscopia 100X de Sporosarcina ureae 56
FIGURA 30. Sporosarcina ureae en Agar Nutritivo 56
FIGURA 31. Microscopia 100X de Brochothrix campestris 58
FIGURA 32. Brochothrix campestris en Agar Nutritivo 58
FIGURA 33. Microscopia 100X de Brochothrix thermosphacta 59
FIGURA 34. Brochothrix thermosphacta en Agar Nutritivo 59
FIGURA 35. Microscopia 100X de Caryophanon latum 60
FIGURA 36. Caryophanon latum en Agar Nutritivo 60
FIGURA 37. Microscopia 100X de Caryophanon tenue 61
FIGURA 38. Caryophanon tenue en Agar Nutritivo 61
FIGURA 39. Microscopia 100X de Kurthia gibsonii 62
FIGURA 40. Kurthia gibsonii en Agar Nutritivo 62
FIGURA 41. Microscopia 100X de Kurthia sibirica 63
FIGURA 42. Kurthia sibirica en Agar Nutritivo 63
FIGURA 43. Microscopia 100X de Kurthia zopfii 64
FIGURA 44. Kurthia zopfii en Agar Nutritivo 64

FIGURA 45. Microscopia 100X de Lactobacillus agilis 65
FIGURA 46. Lactobacillus agilis en Agar Nutritivo 65
FIGURA 47. Microscopia 100X de Lactobacillus collinoides 66
FIGURA 48. Lactobacillus collinoides en Agar Nutritivo 66
FIGURA 49. Microscopia 100X de Lactobacillus confusus 67
FIGURA 50. Lactobacillus confusus en Agar Nutritivo 67
FIGURA 51. Microscopia 100X de Lactobacillus fructosus 68
FIGURA 52. Lactobacillus fructosus en Agar Nutritivo 68
FIGURA 53. Microscopia 100X de Lactobacillus kandleri 69
FIGURA 54. Lactobacillus kandleri en Agar Nutritivo 69
FIGURA 55. Microscopia 100X de Lactobacillus sake 70
FIGURA 56. Lactobacillus sake en Agar Nutritivo 70
FIGURA 57. Microscopia 100X de Lactobacillus viridescens 71
FIGURA 58. Lactobacillus viridescens en Agar Nutritivo 71
FIGURA 59. Microscopia 100X de Listeria murrayi 72
FIGURA 60. Listeria murrayi en Agar Nutritivo 72
FIGURA 61. Microscopia 100X de Listeria welshimeri 73
FIGURA 62. Listeria welshimeri en Agar Nutritivo 73
FIGURA 63. Microscopia 100X de Lactococcus lactis 75
FIGURA 64. Lactococcus lactis en Agar Nutritivo 75
FIGURA 65. Microscopia 100X de Micrococcus luteus 76
FIGURA 66. Micrococcus luteus en Agar Nutritivo 76
FIGURA 67. Microscopia 100X de Micrococcus roseus 77
FIGURA 68. Micrococcus roseus en Agar Nutritivo 77

FIGURA 69. Microscopia 100X de Pediococcus sp 78
FIGURA 70. Pediococcus sp en Agar Nutritivo 78
FIGURA 71. Microscopia 100X de Sacharococeus thermophilus 79
FIGURA 72. Sacharococeus thermophilus en Agar Nutritivo 79
FIGURA 73. Microscopia 100X de Sarcina ventriculi 80
FIGURA 74. Sarcina ventriculi en Agar Nutritivo 80
FIGURA 75. Microscopia 100Xde Staphylococcus aerlettae 81
FIGURA 76. Staphylococcus aerlettae en Agar Nutritivo 81
FIGURA 77. Microscopia 100X de Staphylococcus auricularis 82
FIGURA 78. Staphylococcus auricularis en Agar Nutritivo 82
FIGURA 79. Microscopia 100X de Staphylococcus equorum 83
FIGURA 80. Sacharococeus equorum en Agar Nutritivo 83
FIGURA 81. Microscopia 100X de Staphylococcus hominis 84
FIGURA 82. Sacharococeus hominis en Agar Nutritivo 84
FIGURA 83. Microscopia 100X de Staphylococcus lentus 85
FIGURA 84. Sacharococeus lentus en Agar Nutritivo 85
FIGURA 85. Microscopia 100X de Trichococcus flocculiformis 86
FIGURA 86. Trichococcus flocculiformis en Agar Nutritivo 86

AGRADECIMIENTOS
Al Dr. Rubn Daro Torrenegra, por sus excelentes aportes de

conocimiento.
A Andrea Garca y Sindy Lorena Rodrguez por su colaboracin.
A Colciencias, por su financiacin parcial para ste proyecto,

12010-IT0101103.
A nuestros padres por su paciencia y apoyo para lograr el objetivo

de ser profesionales.
1. INTRODUCCIN
La bsqueda de microorganismos importantes en la produccin de

metabolitos de inters industrial, ha conducido a los investigadores a
realizar bsquedas en nuevas zonas poco estudiadas en gran mayora
aquellas con climas extremos, debido a la necesidad de mejorar el
rendimiento, eficacia y el contrarrestar otros organismos que durante el
paso del tiempo han ganado tolerancia a metabolitos ya existentes.
As mismo mediante la identificacin de especies microbianas en estas

zonas se pretende ampliar la gama de microorganismos conocidos,
contribuyendo as al conocimiento de la biodiversidad de nuestro pas,
microbiota que puede ser capaz de producir metabolitos de inters
industrial por consecuencia de interacciones microbianas o algn tipo de
estrs ambiental.
El pramo se ha considerado como una fuente muy importante en

almacenamiento de recursos ambientales, pero as mismo en
comparacin con otras zonas de investigacin, es poco el nmero de
proyectos desarrollados en los mismos y es alta la taza de explotacin y
contaminacin que se espera en unos aos.
Los sistemas de pramo juegan un papel importante como reguladores

del recurso hdrico, albergue de un gran nmero de especies animales y
vegetales, riqueza paisajstica y procesos socioeconmicos del territorio
colombiano.
Conjuntamente en la actualidad los ecosistemas paramunos tienen una

gran demanda de explotacin para caracterizar microbiota y con esta
investigacin se pretende contribuir al estudio de la microbiologa de
suelos con el aislamiento e identificacin de bacterias nativas del pramo
de Cruz Verde y Guasca.
2. MARCO TERICO
2.1. Suelo
El termino suelo, que deriva del latn solum, y significa piso, puede
definirse como la capa superior de la tierra que se distingue de la roca
slida y en donde las plantas crecen. Los suelos deben considerarse
como formaciones geolgicas naturales desarrolladas bajo condiciones
muy diversas de clima y materiales de origen, lo cual justifica su continua
evolucin. El suelo independientemente de su origen tiene una funcin:
soportar una vegetacin y en l se deben dar las condiciones necesarias
para el desarrollo de las plantas. Con una concepcin fisiolgica vegetal,
el suelo se define como la mezcla de partculas slidas pulverulentas, de
agua y de aire que provee de los elementos nutritivos necesarios para las
plantas (Forsythe, 2002).).
El suelo posee carga negativa, esta propiedad fsica del suelo tambin
esta relacionada con la densidad y el espacio entre partculas o
porosidad, consecuentemente en relacin con la microbiota, los rangos
entre estas propiedades permiten una retencin de nutrientes y la
viabilidad para que los microorganismos los aprovechen (mer, et al.
2007).
Se sabe que el suelo es el mayor hbitat de colonias bacterianas y en

cualquier rea de la industria las cepas microbianas en su gran mayora
son aisladas e identificadas del suelo, obviamente debido a la gran
variabilidad de condiciones y ambientes que toleran (Shayne, et al.
2003).
Actualmente se ha venido buscando la renovacin del grupo de clulas

manejadas en la industria con microorganismos poco comunes en su
mayora no cultivables, en consecuencia se han desarrollado y modificado
tcnicas y medios de cultivo con el fin de recuperar aquellos
microorganismos (Shayne, et al. 2003).
2.1.1. Perfil del Suelo
Bsicamente el perfil del suelo comprende tres horizontes principales:
El Horizonte A est formado por el suelo superficial y en l se encuentra

la mayor parte de materia orgnica procedente de las races de las
plantas y otros restos que son depositados sobre la superficie. Presenta
un color oscuro debido a la materia orgnica presente (Merchan S, 2007).
El Horizonte B constituye la capa intermedia y suele estar altamente

meteorizado. De color ms claro, en l se sitan las races de los arbustos
y rboles. El contenido en materia orgnica es mucho menor (Merchan S,
2007).
El Horizonte C comprende la capa ms profunda del perfil. Est formado

por partculas de roca poco desmenuzadas y prcticamente sin actividad
por parte de organismos vivos (Merchan S, 2007).
2.1.2. Textura del Suelo
Independiente de los horizontes, los suelos contienen proporciones

variables de arcilla, aluviones y partculas de arena. La proporcin de
estas partculas de diferente tamao constituye la textura del suelo, la
cual es una propiedad importante para la ecologa de los
microorganismos, ya que determina el rea de la superficie disponible
como hbitat para el crecimiento de los microorganismos. Los suelos con
mayor composicin en arcilla tienen una mayor rea de superficie
disponible que aquellos en los que predomina la concentracin de granos
de arena, cuyo tamao es mucho mayor que el de las partculas de arcilla
(Atlas y Bartha, 2002)
2.1.3. Componente suelo
En la mayora de los suelos el reservorio principal de nutrientes se

encuentra presente en los compartimentos de la materia orgnica y en el
suelo mineral, con solamente una pequea cantidad disponible para las
plantas en un corto tiempo (en los nutrientes cambiables/extractables y en
la solucin del suelo) (Navarro y Navarro, 2000).
La materia orgnica del suelo es heterognea con respecto a la actividad

biolgica y la biomasa microbiana por si misma representa una fuente
significativa de nutrientes. As, son importantes los grupos de
bacterias nitrificantes, los hongos y las bacterias solubilizadoras de
fsforo y las interacciones micorrizas vesculo-arbusculares que permite al
ecosistema aumentar la eficiencia de la captacin de algunos de los
nutrientes, necesarios para el crecimiento de las plantas (Crdenas y
Moreno, 1993).
2.1.4. Microorganismos del suelo
Los microorganismos del suelo representan la mayor proporcin de uso a

nivel industrial, la comunidad edfica dependen del conjunto de nutrientes
en el ecosistema pero pueden ser considerados como el principal agente
transformador en el movimiento de los nutrientes a travs del suelo y
como una fuente productora de compuestos para las plantas durante sus
ciclos de renovacin (Duxbury, et al. 1989).
El suelo contiene el ms alto nmero de grupos filogenticos existentes,

9
aproximadamente hay > 10 clulas bacterianas por gramo de suelo,
pero existe una gran problemtica, no es cantidad de microorganismo, es
la sensibilidad de una fraccin de grupos bacterianos muy alterables al
cambio de condiciones ambientales, el mas pequeo cambio climtico y
en respuesta dejan de producir metabolitos y enzimas muy importantes en
el campo cientfico (Duxbury, et al. 1989)
El suelo es generalmente un hbitat favorable para la proliferacin de

microorganismos y en las partculas que lo forman se desarrollan
microcolonias. Tpicamente en los hbitats del suelo se encuentran de 108
a 1010 bacterias por gramo de suelo. Los microorganismos aislados de
suelo comprenden virus, bacterias, hongos, algas y protozoos. (Atlas y
Bartha, 2002).
La mayora de la poblacin bacteriana organotrfica aerobia de gran parte

de los suelos est compuesta por gneros Gram Positivos. No sera
correcto generalizar los porcentajes de varios grupos, pero no es extrao
encontrar que hasta el 70% de la totalidad de los aislamientos bacterianos
del suelo se clasifican dentro de las denominadas bacterias Gram
positivas del gnero Arthrobacter sp, siendo la mayora de la microflora
restante Bacillus sp, y Microccus sp (Grant, 1989).
La poblacin Gram negativa generalmente est compuesta en su mayor

parte por Pseudomonas sp. y Flavobacterium sp. Otros gneros
relativamente frecuentes considerados nativos incluyen Acinetobacter sp,
Agrobacterium sp., Alcaligenes sp. y Nocardia sp. (Grant, 1989)
La variabilidad de las comunidades microbianas en el suelo dependen

mayormente de la viabilidad par metabolizar una fuente de carbono, la
disponibilidad de macro y micro elementos, el contenido de agua, el pH y
el tamao de las partculas. Cuando estas caractersticas se alternan se
producen ambientes anaerobios, saturados o txicos segn sea el nivel
de presencia, hay es donde se encuentran especies bacterianas con
propiedades metablicas incomparables y procesos adaptativos regidos
por componentes enzimticos desconocidos (Hansel, et al. 2008).
Muchos gneros de bacterias aisladas de climas extremos se han

utilizado en biorremediacin de hidrocarburos en diferentes tipos de
terrenos, con un ptimo resultado frente a otros mecanismos fsicos o
qumicos, ms demorados, costosos o con residuos no tan txicos pero
de difcil degradacin. De estos gneros se han creado diferentes
inculos de variados tipos de microorganismos que interaccionan de
forma ms insuperable y cmodo control (Albert, 1996).
2.1.5. Muestreo del Suelo
Se han desarrollado numerosos mtodos con el objetivo de examinar

cuantitativamente y cualitativamente las poblaciones microbianas en
diversos ecosistemas (Hurst, et al.1997), para examinar microorganismos
en sistemas naturales basndose en el nmero total de individuos, en el
nmero de poblaciones especificas, o en sus actividades metablicas, se
han analizado submuestras representativas de los mismos y los
resultados se han aplicado a la totalidad de la comunidad o del
ecosistema (Board, et al. 1973).
En muestreos de suelos en donde tambin importa la profundidad de las

respectivas muestras se pueden introducir tubos en cinco reas
anteriormente seleccionadas basadas en el tipo de terreno, profundidad.
(Albert, 1996)
2.2. Pramo
Se denomina Pramo al ecosistema hmedo de los Andes tropicales.

Sobre 3000m de altura excluyendo de esta definicin las alturas de Per y
Bolivia, porque en ellas predomina la sequedad; Colombia posee as el
60% de los pramos del mundo, el resto lo comparten Venezuela y
Ecuador (Guhl, 1982). Estos ecosistemas son de gran importancia como
reservorio de agua y juegan un papel importante como albergue de un
gran nmero de especies de animales, vegetales y cepas microbianas
nativas (Bernal, 2006), (Chitiva, et. al. 2002).
2.2.1. Vegetacin de los Pramos
En los pramos la vegetacin natural dominante est representada por:

Musgos: Entre estas especies se encuentran los musgos de la
turba (Sphagnum spp) y el llantn de pramo (Plamtago rigida),
caractersticos de zonas pantanosas.
Pajonales o Gramneas: Estn representados por la paja ratn
(Callamagrostis), carrizo (Cortadeiras), frailejn (Espeletia spp), chite
(Hypericum), vira-vira (Gnaphalium spp), chusque (Chusque spp),
romero de pramo (Senecio spp), gaque (Clusia spp), y cardo
(Puyas)
Arbreas y arbustivas: Compuestas por mortio (Hesperomeles
spp), chilco (Baccharis spp), quiebra barriga (Pernettya spp), y
encenillo (Weinmania spp). (Crdenas, et al. 1993).
Estas especies ayudan a la regulacin y captacin de agua proveniente

de los procesos de condensacin en sta zona. La estructura y
composicin del subpramo corresponden a un mosaico de formaciones
arbustivas, que tambin cumple una funcin esencial de proteccin,
mantenimiento y recarga de acuferos (Crdenas, et al. 1993).
2.2.2. Suelo de los Pramos
En la mayor parte de los pramos de Colombia el material a partir del cual

evolucionan los suelos son las cenizas volcnicas y como resultado se
tiene la presencia de suelos de tipo Andisoles, aunque tambin se
presentan Entisoles, Inceptisoles e Histosoles. Si bien existe una variada
gama de suelos en los pramos colombianos, stos se caracterizan por
ser similares en sus propiedades morfolgicas, fsicas, qumicas y
mineralgicas (Malagn, et al. 2000).
En general, son suelos con estructura de bloques finos y medianos,

mediana a alta retencin de humedad, porcentajes altos a muy altos de
carbono orgnico, altos valores de CIC, baja cantidad de bases de
cambio, altos contenidos de aluminio, escasos contenidos de fsforo
disponible y marcada acidez (Malagn, et al. 2000).
Las condiciones del suelo en el pramo incluyen: una escasa capa de
hojarasca con grandes fracciones de suelo descubierto, con un horizonte
A rico en humus que descansa sobre un horizonte C (de material
parental) donde los organismos del suelo son muy escasos, determina la
presencia de una comunidad edfica localizada principalmente en el
horizonte A (Crdenas, et al. 1993).
2.3. Crecimiento Microbiano
A nivel molecular las bacterias precisan de al menos 10 elementos para

produccin de hidratos de carbono, lpidos protenas y cidos nucleicos,
otros elementos no son tan necesarios pero forman parte de enzimas y
cofactores (Prescott, 2004).
Las molculas de nutrientes, con frecuencia no pueden atravesar por

difusin pasiva las membranas plasmticas selectivamente permeables.
En este caso deben ser transportadas por uno de los tres mecanismos
principales de transporte que comprenden la participacin de protenas
transportadoras (Prescott, 2004)
La clula bacteriana es esencialmente una mquina que es capaz de

duplicarse a s misma. Los procesos sintticos del crecimiento celular
bacteriano implican no menos de 2000 reacciones bioqumicas. Algunas
de estas reacciones implican transformaciones de energa. Otras,
implican la sntesis de pequeas molculas as como cofactores y
coenzimas necesarios para las reacciones enzimticas (Madigan, et al.
2000)
En la mayora de los procariotas, el crecimiento de una clula individual

continua hasta que se divide en dos nuevas clulas, un proceso llamado
fisin binaria (binario, para expresar el hecho de que se forma dos clulas
a partir de una) (Madigan, et al. 2000).
Pero tambin en el crecimiento microbiano hay un parmetro de gran
importancia y es la relacin entre microorganismos para favorecer o evitar
la proliferacin celular, por ejemplo la contribucin entre especies
bacterianas y fngicas en la descomposicin de sustratos en funcin de
un ecosistema o contrariamente la interaccin antagonista bacteriana
frente a hongos, debido a su amplio rango de crecimiento y al mas alto
ndice de reduccin y produccin metablica (Rousk, et al. 2008)
2.3.1. Efecto de la Temperatura
En todo el mundo la diversidad de especies microbianas principalmente

se debe a la variabilidad de temperaturas tanto a nivel geogrfico,
alteracin humana o de estaciones ambientales; debido a esto el
crecimiento a latencia de la clula depende del favorecimiento ambiental
(Hansel, et al. 2008)
La temperatura es unos de los factores ambientales ms importantes que

afecta al crecimiento y a la supervivencia microbiana. Puede afectar a los
microorganismos vivos de dos formas muy diferentes. A medida que la
temperatura sube, las reacciones enzimticas son ms rpidas y el
crecimiento se hace ms rpido. Sin embargo, por encima de una cierta
temperatura, las protenas, cidos nucleicos y otros componentes
celulares pueden daarse irreversiblemente. Por encima de este punto las
funciones celulares paran. Por tanto, para cada microorganismo existe
una temperatura mnima por debajo de la cual no existe crecimiento, una
temperatura optima a la cual el crecimiento es el ms rpido posible y una
temperatura mxima rebasada la cual no existe crecimiento. (Mandigan,
et al. 2000)
2.3.1.1. Crecimiento Microbiano a Temperaturas Extremas
Algunos aislamientos de grupos bacterianos en ambientes extremos se

han podido llevar acabo modificando las temperaturas de incubacin, de
las manejadas comnmente (35C), existiendo cepas b acterianas tan
sensibles a estos cambios de temperatura que son incapaces de
recuperarse si no se cultivan a la temperatura exacta donde ellas crecan
(Kathryn, et al. 2005)
Existen cuatro grupos microbianos en relacin con su temperatura ptima:

psicrfilos, con temperaturas ptimas bajas, mesfilos con temperaturas
ptimas medianas, termfilos con temperaturas ptimas ms altas e
hipertermfilos con temperaturas muy altas (Mandigan, et al. 2000)
Los psicrfilos son los microorganismos de inters en este estudio, son

aquellos que son capaces de crecer con una temperatura ptima de
crecimiento de 15 C o ms bajo, una mxima por debajo de 20 C y una
mnima de 0 C o menor. Los psicrfilos se encuentran en ambientes
permanentemente fros y mueren rpidamente si se exponen a
temperatura ambiente (Mandigan, et al. 2000).
Los psicrfilos producen enzimas que funcionan ptimamente en fro y

que se desnaturalizan rpidamente a temperaturas moderadas. Otras
caractersticas de los psicrofilos si se compara con los mesfilos, es que a
bajas temperaturas tienen lugar procesos de trasporte activo, lo que es
una clara indicacin de que la membrana de estos microorganismos es de
distinta naturaleza, pues a bajas temperaturas pueden seguir llevando a
cabo su funcin. Sus membranas contienen una mayor proporcin de
cidos grasos insaturados lo que ayuda a mantener el estado semifluido
de la membrana a bajas temperaturas. (Mandigan, et al. 2000)
2.3.2. Acidez y Alcalinidad
La acidez o alcalinidad de un medio influye sobre el crecimiento

microbiano. Algunos microorganismos se desarrollan mejor a pH alto 9-14
alcalinfilos, mientras que otros a pH bajo 5-2 acidfilos, estos rangos
pueden variar debido a la adaptabilidad de muchas cepas. Aquellos
microorganismos que crecen a rangos de pH de 6-8 se llaman neutrfilo;
hay que tener en cuenta que el pH intracelular debe permanecer prximo
a la neutralidad, aunque el pH externo sea altamente cido o bsico. En
muchos casos el microorganismo como consecuencia de su metabolismo
crea un gradiente extracelular de iones OH- o H+ (Rico, 2004).
Cada organismo tiene un rango de pH dentro del cual es posible el

crecimiento y normalmente posee un pH ptimo muy bien definido. La
mayora de los ambientes naturales tienen valores de pH de 5,9 y los
organismos con pH ptimo equivalente son los habituales. Solo unas
pocas especies pueden crecer a pH inferior a 2 o mayor a 10. Los que
crecen a pH bajos se llaman acidfilos y por el contrario los que crecen a
pH altos se llaman alcalfilos (Mandigan, et al. 2000)
2.3.3. Oxgeno
Como elemento constituyente, tambin es requerimiento para la

respiracin aerbica para cubrir sus necesidades energticas y para ello
el oxigeno funciona como agente oxidante terminal, organismos
denominados aerobios estrictos (Stanier, 1992).
Los organismos que carecen de sistemas respiratorios no pueden utilizar

el oxgeno como aceptor termina de electrones. Tales organismos se
llaman anaerobios, pero existen dos clases de anaerobios: los anaerobios
aerotolerante, que pueden tolerar el oxgeno y crecer en su presencia an
cuando no pueden utilizarlo como por ejemplo las bacterias cido lcticas,
q poseen un metabolismo productor de energa que es exclusivamente
fermentativo y los anaerobios estrictos que mueren en presencia del
oxgeno (Mandigan, et al. 2000) (Stanier, 1992).
2.4. Identificacin Bioqumica
Una especie bacteriana es una coleccin de cepas que comparten

caractersticas comunes. El metabolismo bacteriano es un equilibrio
dinmico entre biosntesis (reacciones anablicas) y degradacin
(reacciones catablicas). La reacciones catablicas adems de proveer
las unidades ms pequeas para los procesos biosintticos posteriores,
provee la energa para manejar las reacciones biosintticas (Koneman,
2001).
En este proceso, la energa proviene de la hidrlisis de uniones qumicas

es capturada de las uniones fosfato de alta energa del adenosintrifosfato
(ATP). Estas uniones suministran la energa para la activacin y la
continuacin de otros elementos bioqumicos. As mismo requieren de la
polimerizacin de protenas, cidos nucleicos, polisacridos y lpidos
(Rico, 2004).
Los anteriores elementos deben encontrarse preformados en el medio

donde se encuentra el microorganismo o deben ser sintetizados por la
propia clula (Rico, 2004)
La capacidad de un microorganismo dado para producir cido a partir de

una variedad de carbohidratos (p. ej., maltosa, sacarosa, manitol,
manosa, etc.) refleja la capacidad enzimtica de estos microorganismos
para convertir inicialmente estos carbohidratos en glucosa, que es el
punto de partida tanto para el metabolismo aerbico de los carbohidratos
como el anaerbico (Koneman, 2001).
En general muchas pruebas empleadas en microbiologa involucran la

deteccin de productos finales del metabolismo bacteriano en medios de
cultivo lquido agotados, tanto por medio de indicadores de pH presentes
en el medio como por cromatografa gas lquido (Prescott, 2004).
Las pruebas bioqumicas consisten en distintos test qumicos aplicados a

medios biolgicos, los cuales, conocida su reaccin, permite identificar
distintos microorganismos presentes. Su sistema de funcionamiento
generalmente consiste en determinar la actividad de una va metablica a
partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la
bacteria al crecer incorpora o no (Mandigan, et al. 2000).
Existen gran cantidad de bioqumicas usadas para la identificacin
bacteriana, las utilizadas en esta investigacin fueron las siguientes:
2.4.1. Prueba de Voges Proskauer
La prueba Voges-Proskauer se basa en la produccin de

acetilmetilcarbinol o acetona, un producto final neutro derivado del
metabolismo de la glucosa, que al reaccionar con los indicadores produce
un color rojo; se emplea para diferenciar especies de Bacillus y bacterias
entricas (Prescott, 2004).
La glucosa es metabolizada a cido pirvico, el principal intermediario en

la gluclisis. A partir del cido pirvico, las bacterias pueden seguir
muchos caminos metablicos; la produccin de acetona es una de las
vas metablicas de la degradacin de la glucosa en las bacterias
(Koneman, 2001)
El primer reactivo agregado es el catalizador -naftol, este acta como

intensificador del color, lo que incrementa la sensibilidad de la reaccin
sin prdida de la especificidad. El segundo reactivo es el KOH al 40%, el
cual ayuda a la absorcin de CO2 en el medio (MacFaddin, 2003)
La prueba positiva muestra un color rosado-rojo en la superficie del medio

(acetona presente) y en una prueba negativa se observa un color amarillo
en la superficie del medio (anexo 1) (MacFaddin, 2003)
2.4.2. Prueba Rojo de Metilo
Es una prueba cuantitativa basada en el uso de un indicador de pH, el

rojo de metilo, para determinar la concentracin del ion hidrgeno cuando
un microorganismo fermenta la glucosa (Koneman, 2001). La validez de la
prueba rojo de metilo depende de una incubacin prolongada para
permitir que ocurra la diferencia en el metabolismo de la glucosa
(MacFaddin, 2003).
Para una prueba positiva el cultivo es suficientemente cido para permitir

que el reactivo rojo de metilo permanezca con un color distintivo rojo
brillante, mientras que en una prueba negativa se observa un color
amarillo en la superficie (anexo 1) (MacFaddin, 2003).
2.4.3. Prueba LIA (Descarboxilacin Lisina)
La descarboxilacin es el proceso por el cual las bacterias que poseen

enzimas descarboxilasas especficas atacan los aminocidos en su
carboxilo terminal (COOH) para formar amina o una diamina y dixido de
carbono (Prescott, 2004).
El aminocido L-lisina es descarboxilado para formar cadaverina (una

diamina) y dixido de carbono por la accin de la enzima especfica lisina
descarboxilasa. El aminocido L-ornitina es descarboxilado por la enzima
ornitina descarboxilasa para formar la diamina putrescina y dixido de
carbono. El aminocido L-arginina es catabolizado por medio de dos
sistemas que pueden ocurrir de manera simultnea o separada. Estas dos
vas metablicas son el sistema de la arginina dihidrolasa y el sistema de
la arginina descarboxilasa (MacFaddin, 2003).
Tambin se utiliza el componente citrato amnico frrico para la deteccin

en la produccin de H2S (Prescott, 2004).
En la prueba positiva se observa un color prpura turbio a amarillo

apagado (el microorganismo produjo cadaverina) y una prueba negativa
se ve un color amarillo brillante, claro (el microorganismo solo ferment la
glucosa) (MacFaddin, 2003).
2.4.4. Hidrlisis de Almidn
El almidn es un homopolisacrido; la estructura bsica del almidn es

una mezcla de dos molculas de polisacrido poliglucosa: amilosa lineal y
amilopectina ramificada (Prescott, 2004).
Las amilasas son enzimas que catalizan la hidrlisis de 1,4 - D

Glucanos como el almidn y glucgeno generando dos moles de glucosa
(Pedroza, 1999).
Para observar la actividad enzimtica se utiliza el agar almidn que es

fundamental por el contenido de almidn que se encuentra disponible, el
cloruro de sodio encontrado en este agar es de vital importancia pues las
amilasas al ser metaloenzimas requieren de calcio para su estabilidad y
su actividad (Serrano, 1990) (Wulf, 1993).
Como reactivo se utiliza el lugol, el yodo contenido en el lugol (Yodato-

Yoduro) se une a los enlaces 1-4 del almidn generando una coloracin
azul-negro mientras que los sitios en que se genera hidrlisis permaneces
incoloras poniendo en evidencia a las colonias de accin amiloltica
(Serrano, 1990).
2.4.5. Prueba SIM (Produccin de sulfuro de Hidrgeno)
Esta prueba tiene tres prpositos:
1. Determinar si la bacteria a travs de Triptofanasas puede degradar el

Triptfano a indol.
2. Determinar si hay produccin de H2S a partir de aminocidos
azufrados.
3. Determinar si la bacteria es mvil.
La presencia de anillo rojo muestra la presencia de indol, es decir, el
triptfano fue degradado, presencia de un precipitado negro muestra la
produccin de H2S y movilidad difuminacin de la bacteria hacia los lados
(Prescott, 2004).
2.4.6. Prueba TSI (Agar con azcar triple y hierro)
El agar TSI es un medio de cultivo diferencial. Para la determinacin de

fermentaciones de tres hidratos de carbono (glucosa, lactosa y sacarosa),
la produccin de CO2 al fermentar los hidratos de carbono y la
determinacin de la produccin de H2S. Adems contiene sulfato amnico
ferroso y tiosulfato sdico (Prescott, 2004).
La fermentacin tiene lugar tanto en aerobiosis como anaerobiosis. El

monosacrido glucosa es catabolizado inicialmente por la va metablica
anaerobia de Embden-Meyerhof-Parnas, usada por aerobios y anaerobios
para producir el intermediario clave cido pirvico. El cido pirvico es
degradado luego a travs del ciclo de Krebs por aerobio o anaerobios
facultativos para rendir CO2, H2O y energa (Koneman, 2001).
Se emplea para identificar los microorganismos entricos por su

capacidad de fermentar la glucosa, la lactosa o la sacarosa, y liberar
sulfuros de sulfato amnico o del tiosulfato sdico (Prescott, 2004).
2.4.7. Prueba Citocromo Oxidasa
Los citocromos son hemoprotenas que transportan electrones,

normalmente como componentes de la cadena transportadora de
electrones (Prescott, 2004).
La prueba de oxidasa se basa en la produccin bacteriana de una enzima

oxidasa intracelular. Esta reaccin de oxidasa se debe a un sistema de
citocromo oxidasa que activa la oxidacin del citocromo reducido por el
oxgeno molecular, el que a su vez acta como un aceptor de electrones
de la fase terminal del sistema de transferencia de electrones (Koneman,
2001).
El sistema citocromo, por lo comn presente slo en los microorganismos

aerobios, permite a stos utilizar el oxgeno como aceptor final de
hidrgeno para reducir el oxgeno molecular a perxido de hidrgeno
(Koneman, 2001).
2.4.8. Prueba de Citrato
El citrato de sodio es una sal del cido ctrico en el ciclo de los cidos
tricarboxilicos, esta prueba determina si este producto es usado como
nica fuente de carbono, por lo tanto el medio utilizado no debe tener
protenas e hidratos de carbono como fuentes de carbono. Se detecta por
la produccin de subproductos alcalinos, puesto que el citrato de sodio es
un anin, la nica fuente de nitrgeno es el fosfato de amonio que puede
convertirse en amoniaco produciendo hidrxido de amonio (NH4OH)
(Koneman, 2001).
En medio citrato de Simmons si se observa un intenso color azul en el

pico de flauta la prueba es positiva y si el medio conserva el mismo color
inicial (verde) la prueba es negativa (anexo 1) (MacFaddin, 2003).
2.4.9. Prueba de Ureasa
El sustrato urea, una diamina del cido carbnico, a menudo se designa

como una carbamida. Todas las amidas son hidrolizadas con facilidad
(MacFaddin, 2003).
Los microorganismos que poseen la enzima especifica ureasa hidrolizan
la urea, con la cual se libera molculas de amonio como producto final,
virando a rojo violeta el indicador rojo de fenol (anaxo1) (Koneman, 2001).
Al desdoblar la urea en amoniaco tambin hay liberacin de CO2, se
utiliza para diferenciar gneros como: Proteus, Klebsiella pneumoniae y
bacterias entricas (Prescott, 2004).
2.4.10. Reduccin de nitratos
La reduccin de nitrato (NO3) a nitrito (NO2) y a nitrgeno gaseoso (N2)

por lo comn se produce en condiciones de anaerobiosis, en las cuales
en un microorganismo produce su oxgeno del nitrato. El oxgeno acta
como un aceptor de hidrgeno, es decir, el protn y el aceptor final de
electrones (MacFaddin, 2003).
La prueba para la presencia de nitritos en el medio, se realiza aadiendo

en cada tubo 0.5 ml de reactivo de Griess, y se observa un color: una
prueba positiva color rojo, una prueba negativa incoloro; si no se observa
cambio de color se adicionara una pequea cantidad de polvo de zinc y si
presenta una coloracin se informar como negativo, si no presenta
cambio ser positiva (anexo 1) (Carrascal, 2003).
Las posibilidades del producto final en la reduccin del nitrato son

muchas: nitrito, amoniaco, nitrgeno molecular, xido ntrico, xido nitroso
o hidroxilamina. El producto formado depende de la especie bacteriana
(MacFaddin, 2003).
2.4.11. Prueba de Catalasa
La catalasa es una enzima que descompone el perxido de hidrogeno

(H2O2) en agua y oxgeno (anexo 1). Es una hemoprotena similar a la
hemoglobina excepto que sus cuatro tomos de hierro estn en estado
oxidado, debido a que el perxido de hidrgeno se forma como producto
final de la oxidacin en el metabolismo aerobio de hidratos de carbono, si
se acumula resulta letal para la clula, se utiliza en la diferenciacin de
Streptococcus (-) de Staphylococcus (+) y Bacillus (+) de Clostridium (-)
(Koneman, 2001) (Prescott, 2004).
2.4.12. Licuefaccin de Gelatina
La gelatina es una protena derivada del colgeno animal, sta se siembra

a diferentes medios de cultivo para determinar la capacidad de un
microorganismo de producir enzimas proteolticas, detectadas por
digestin o licuefaccin de la gelatina (MacFaddin, 2003).
En la prueba de la licuefaccin de la gelatina, la gelatina se siembra

previamente y se lleva a incubar por 24 horas a 35C, su lectura se realiza
visualizando un cambio en la consistencia dura de la gelatina, por una
consistencia liquida, lo que indicara una licuefaccin. Es importante
destacar que la gelatina a 35C es liquida, por lo que es necesario enfriar
las bioqumicas en el chorro de agua fra para evitar falsos positivos
(Carrascal, 2003).
2.4.13. Pruebas de fermentacin de Hidratos de Carbono
Los hidratos de carbono estn formados por carbono, hidrogeno y

oxigeno. Se clasifican en: monosacridos, aldehdos polhidroxilados o
cetonas; en polisacridos u oligosacridos y en alcoholes polihdricos y
ciclitoles. A partir de ellos se obtiene energa, tambin realizan funciones
de reserva energtica (glucgeno) y estructurales como la celulosa
(Salve, 1997).
Un monosacrido o azcar simple por lo comn contiene entre 1 y 6

tomos de carbono; la eritrosa es un azcar de 4 carbonos (C4H8O4); la
ribosa, ribulosa, xilosa y arabinosa son azcares de 5 carbonos(C5H10O5)
y la glucosa, la fructosa, la galactosa y la manosa son azcares de 6
carbonos (C6H12O6) (MacFaddin, 2003).
para todos los procesos fermentativos de los hidratos de carbono, se

toma una colonia a examinar y se adicionara en un tubo con la azcar a
investigar, una coloracin amarilla indicara la fermentacin del azcar por
este microorganismo y se informara como positivo, sino se presenta
cambio ser negativo, para la fermentacin, en el proceso fermentativo
hay produccin de cidos que bajan el pH del medio, existiendo una
variacin en el color dada por el indicador de pH rojo de fenol (Carrascal,
2003).
2.4. Bioconservacin
A medida que la biotecnologa avanza en todos los esquemas de la

innovacin moderna en cualquier trabajo que implique el uso de los
microorganismos, es deseable contar con una fuente pura y viable del
agente de inters, ya que es posible afrontar problemas de pureza y
viabilidad de las cepas as como de prdida de microorganismos por el
simple hecho de no contar con copias adicionales del mismo. Debido a
estas problemticas se trataron e investigaron tres mtodos de
conservacin: mediante glicerol al 20%, sensidiscos y en suelo estril
directo bajo congelacin (Garcia, 1999) (Leveau, 2000).
As mismo las cepas bajo tcnicas de conservacin, son utilizadas en el

futuro despus de varios aos, estas tcnicas de conservacin han
permitido a los cientficos, utilizar cepas cultivadas varios aos atrs con
nuevas tcnicas mejorando el rendimiento y permitiendo obtener nuevos
metabolitos y actividades benficas (Garcia, 1999) (Leveau, 2000).
El aislamiento e identificacin de un microorganismo ideal para un
proceso industrial puede ser un proceso largo y costoso y es esencial que
los microorganismos seleccionados mantengan sus propiedades a lo
largo del tiempo, sin sufrir contaminaciones cruzadas que impidan o
modifique el crecimiento ptimo de la cepa. Los procedimientos de
conservacin utilizados para cepas bacterianas, fueron debidamente
seleccionados con el fin de evitar:
Evitar las mutaciones genticas o alteracin metablica.
Evitar que se produzcan contaminaciones y muerte por

metabolismos antagnicos.
Conservar intacta su viabilidad y mantener intacta las bateras

enzimticas.
As mismo los bancos de conservacin permiten tener reservas, dado

algn imprevisto. Por otro lado permiten tener una base de
microorganismos puros si se desea ampliar el banco de conservacin.
(Garca, 1999) (Leveau, 2000)
Para conservar correctamente las cepas microbianas en los laboratorios

de microbiologa es necesario: que el cultivo a conservar sea puro,
evitando que se produzcan contaminaciones durante el proceso de
conservacin; que durante el tiempo de conservacin sobrevivan al
menos el 70-80% de las clulas, y por ltimo, que estas clulas
permanezcan genticamente estables (Garca, 1999).
El propsito de una coleccin es el de mantener el material biolgico en

un estado viable y estable que retenga todas las propiedades originales,
es necesario mantener cepas confiables utilizando tcnicas apropiadas de
conservacin que eviten variabilidad gentica (Snchez, 2005).
3. FORMULACIN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIN
3.1 Formulacin del problema: El suelo localizado en zonas poco

ptimas para el crecimiento bacteriano no ha sido adecuadamente
estudiado y la poca caracterizacin de especies bacterianas en suelos
paramunos produce un limitante en informacin, potencial y beneficios a
la hora de buscar nuevas cepas productoras de metabolitos como
vacunas, primes, antifngicos, biocidas y bioestticos, entomopatgenos,
biocontroladores, capaces de reemplazar los biocompuestos
tradicionales.
Muchas de las cepas bacterianas aisladas y conservadas en colecciones,

pierden caractersticas metablicas y estructurales significativas debido al
constante agravio al que son enfrentadas en diversos estudios; as mismo
se ha visto que diversos mtodos de conservacin interfieren con la
viabilidad de una cepa. Estas causas interfieren gravemente con el
desarrollo en investigaciones en diversos campos de la ciencia al ver
reducido el rendimiento en produccin industrial.
3.2 Justificacin: Aos atrs se trabajaba con un grupo de

microorganismos muy limitado; debido a la falta de preocupacin por
innovar; actualmente se busca nuevos microorganismos que remplacen y
mejoren las propiedades con las cuales se trabajan actualmente.
En el transcurso de estos ltimos aos, la visin cientfica microbiolgica

se ha centrado en caracterizar microorganismos en ambientes extremos,
donde la mano del hombre no haya interferido con estos microcosmos.
Los cientficos han reconocido cada vez ms que los microorganismos
ocupan una posicin clave en el flujo ordenado de materiales y energa a
travs del ecosistema global, en virtud de sus capacidades metablicas.
Consecuentemente en el transcurso del tiempo se han venido
modificando ciertas sustancias para disminuir su toxicidad, pero aun as
existen y se producen muchas ms contaminantes, de las cuales el
ambiente no est habituado y por ello se ha incursionado en la bsqueda
de cepas las cuales podran dar nuevas pautas en biorremediacin.
As mismo la constante demanda de nuevos medicamentos y compuestos

con mayor espectro, duracin, economa de produccin y menor toxicidad
para otros organismos y el ambiente, ha repercutido en la bsqueda de
microorganismos que no han sido caracterizados y son productores.
Los microorganismos ms tiles en distintos campos han sido aislados de

los ms diversos y extremos ambientes, debido a su adaptabilidad a
condiciones adversas. El pramo un ambiente extremo y una zona poco
explorada en este pas, se ha considerado como una de las reas de las
cuales se encuentra gran biodiversidad y donde se van adquiriendo
novedosas cepas tanto de hongos como de bacterias debido a las bajas
temperaturas, poca disponibilidad de luz solar y anaerobiosis por
saturacin de agua en el suelo.
Otra cualidad interesante en este tipo de zonas es la marcada

transformacin causada por el hombre, extinguiendo cepas nativas,
conjuntamente con la intervencin por la mano del hombre, viene la
contaminacin del suelo, la atmosfera y las corrientes acuferas,
modificando ampliamente el nicho ecolgico en el cual las cepas ya estn
adaptadas.
En consecuencia a la persistente contaminacin en el ambiente de

diversos productos y restos qumicos que son utilizados diariamente, se
ha dado a los microorganismos un papel crucial en la solucin de estos
problemas ambientales y econmicos.
4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo General:
Aislar e identificar cepas bacterianas nativas del suelo de los pramos

Cruz Verde y Guasca.
4.2 Objetivos Especficos:
Utilizar diferentes mtodos de muestreo en suelo, para determinar

aquel que ofrezca mejores condiciones de trabajo, mayor
conservacin de condiciones y nmero de cepas bacterianas
aisladas.
Identificar mediante estudios en cultivos selectivos, procesos

bioqumicos y observaciones morfolgicas a nivel micro y
macroscpico, la microbiota de los pramos Cruz Verde y Guasca
que ha sido recuperada.
Seguir una cadena de procedimientos que nos permitan

caracterizar de manera rpida y concisa diferentes grupos de
bacterias, presentando resultados verdicos.
Elaborar un banco de cepas bacterianas a base de la microbiota

nativa obtenida del suelo del pramo Cruz Verde y Guasca, con el
fin de tener varias cepas en excelentes condiciones para futuros
estudios en diferentes campos de la investigacin.
5. METODOLOGA
5.1. Recoleccin de muestras
No hay un mtodo nico de toma de muestras, debido a la diversidad de

ambientes naturales y los distintos objetivos del anlisis. El recorrido a
efectuar en la toma de muestra es de acuerdo a alguno de los siguientes
esquemas:
Figura 1. Recorrido en toma de muestras en suelo.

Fuente: Atlas M. 2002
Cuando se toman muestras de suelo, no se suelen utilizar tcnicas

aspticas sino que de forma pragmtica se recurre a una pala y a un
cubo; la gran abundancia de microorganismos en el suelo relativiza la
accin de posibles contaminaciones procedentes del aire o de recipientes
no estriles (Atlas y Bartha, 2002).
Si se desea obtener una muestra de suelo de una profundidad

determinada, se usa un muestreador cilndrico (corer) para suelos, (Ver
figura 1) que est formado por un tubo hueco de funcionamiento manual o
dirigido por un motor, con un borde cortante y afilado (Atlas y Bartha,
2002).
Figura 2. Barrenos
Fuente: Atlas y Bartha, 2002
El muestreo de microorganismos presentes en el suelo es un nmero

relativamente bajo puede requerir el uso de atrayentes o cebos. En
muchos casos, es suficiente con ofrecer una superficie que concentrar,
por absorcin, los nutrientes disueltos que se encuentran de forma natural
(Atlas y Bartha, 2002).
La tcnica de Cholodny-Rossi del portaobjetos enterrado se usa

frecuentemente en la recogida y recuento directo de microorganismos de
suelo y sedimentos. En esta tcnica se implanta en el suelo o el
sedimento un portaobjetos (Navarro y Navarro, 2000).
Se supone que la superficie limpia del portaobjetos no es selectiva y acta

como la superficie de las partculas minerales presentes en el suelo. Por
tanto los tipos de organismos que se adhieren a dicha superficie, as
como su proporcin, se pueden considerar representativos de la
comunidad (Navarro y Navarro, 2000).
El estudio de los valores como factor ambiental es muy importante, por su

interferencia en el modo de crecimiento en bacterias (rango ptimo de
crecimiento); debido a la variabilidad de condiciones dentro del
laboratorio se espera conservar el entorno de desarrollo de los pramos
de Cruz de Verde y Guasca.
5.2. Procesamiento de las muestras
5.2.2. Tcnicas de Aislamiento:
5.2.2.1. Lavado del suelo: Elaborar un aparato lavador modificando el

descrito por Valencia (1979), el cual consta de dos embudos buzchner de
5cm de dimetro. En el extremo superior colocar el primer embudo con
un tapn de caucho conectado a una manguera de entrada de agua
contenida en un galn. Dicho embudo a su vez se acopla por su extremo
inferior al segundo embudo que contiene papel de filtro para reducir el
tamao del poro. Este ltimo se acondiciona a un recipiente de vidrio para
recoger el agua del proceso (Chitiva, et al 2002) (Hamaki T. et al. 2005).
Los tapones de caucho, son perforados introduciendo varillas de vidrio

que faciliten la entrada de aire para permitir la circulacin de agua. Tomar
20 g de suelo previamente cernido por tamiz de 2mm y colocar en el
aparato lavador. Las partculas de suelo lavadas se toman del segundo
embudo y se secan sobre el papel de filtro en una caja de Petri, para
luego transferir partculas sobre las placas de agar (Chitiva, et al 2002)
(Hamaki T. et al. 2005).
Se manejaron dos medios de cultivo agar nutritivo y agar extracto de

suelo preparado segn la metodologa descrita (Hamaki T. et al. 2005)
5.2.2.2. Tcnica de Placa de Conteo de Warcup: Es el mtodo ms

empleado para el aislamiento de microorganismos de crecimiento rpido,
por el mtodo de diluciones seriadas (Valencia, 1979). Con esta tcnica
se pretende recuperar la poblacin bacteriana viable y cultivable.
A partir de cada dilucin sembrar de forma masiva por triplicado en los

medios de cultivo seleccionados para el aislamiento de bacterias
obtenidas a partir de suelo. Incubar a 32C por 48 horas (Camacho y
Hernndez, 2002).
5.2.2.3. Tcnica de Cultivo Lquido: Esta tcnica se utiliza con el fin de

proporcionar a las bacterias presentes en el suelo un medio de
preenriquecimiento con los nutrientes y las condiciones necesarias para
su recuperacin (Garca y Ordoez, 2003).
Tomar 10 gramos de cada muestra de suelo y adicionar a erlenmeyers

con 90 mL de caldo tripticasa de soya. Incubar a 32 C por 18 horas. A
partir de cada muestra realizar siembra masiva por triplicado en los
medios establecidos para el aislamiento, incubar a 32 C por 48 horas
(Garca y Ordoez, 2003).
5.3. Identificacin bacteriana
5.3.1. Identificacin microscpica y macroscpica: realizar coloracin

Gram para determinar la morfologa de las bacterias aisladas,
conjuntamente realizar medidas y tomar fotografas, para comparacin y
registro de caractersticas en su crecimiento (morfologa de colonia,
pigmentacin, tipo de borde y tamao).
5.3.2. Identificacin bioqumica: Realizar pruebas de Oxidasa,

Catalasa, Citrato, SIM (H2S, Indol, Motilidad), LIA (Lisina, Hierro Agar),
TSI (Triple Azcar Hierro), OF (Oxidacin-Fermentacin), Voges
Proskauer, Rojo de Metilo, Nitratos, Urea, Gelatina, Almidn, Gelatina,
Glucosa, Sacarosa, Maltosa, Manosa, Manitol, Fructosa, Celobiosa,
Celulosa, Melobiosa, Sorbitol, Inositol, Sucrosa, Ramnosa, Xilosa,
Galactosa, Lactosa; para determinar el metabolismo de los
microorganismos aislados.
Finalmente sembrar los microorganismos identificados en medios
especficos como mtodo confirmatorio y distintivo par los diferentes
gneros (Camacho y Hernndez, 2002).
5.4. Conservacin de cepas
5.4.1. Mtodos de conservacin
Los mtodos ms utilizados en las diferentes colecciones a nivel mundial

son:
5.4.1.1. Conservacin en aceite mineral: Sembrar las cepas en cajas de

petri con Medio Agar Nutritivo, incubar a 35C hasta alcanzar un ptimo
crecimiento, posteriormente hacer coloracin Gram para confirmar la
pureza de la cepa y repiques en viales con el mismo medio de cultivo,
incubar a 35C hasta obtener un crecimiento abundante. Finalmente
agregar a cada vial 3 ml de aceite mineral estril para inhibir la actividad
metablica del microorganismo y sellar con tapn de caucho y agrafe de
aluminio (Corredor, 2002)
5.4.1.2. Conservacin por suspensin en agua destilada: Es un

mtodo alternativo muy utilizado y que da altos porcentajes de viabilidad
en diversos tipos de microorganismos, tanto hongos filamentosos como
levaduras y algunas bacterias. Consiste en suspender en agua estril
unas cuantas clulas del cultivo que se quiere conservar. Se pueden
preparar en criotubos de los anteriormente mencionados. En este caso la
concentracin celular no debe ser superior a 104-105 clulas/ml en el caso
de bacterias y levaduras. (Garca y Uruburu, 2000)
5.4.1.3. Conservacin en suelo estril: Es una tcnica que ha sido

ampliamente usada en laboratorios industriales para el mantenimiento de
cultivos de importancia comercial. Este mtodo es usado para cultivos
que producen esporas y estructuras de resistencia; las cepas pueden
almacenarse en diferentes substratos como arena, papel filtro o perlas de
vidrio. El mtodo consiste en esterilizar y secar el suelo el cual es utilizado
como medio absorbente para una pequea cantidad de inoculo (Abreu et
al, 2003).
5.4.1.4. Conservacin en slica gel: El mtodo consiste en llenar

frascos de vidrio con una malla de granos lisos de slica y luego colocarlos
en bandejas con agua, se llevan a congelar a -20C, luego se prepara una
suspensin de esporas en leche descremada al 5% (p/v), se adiciona la
suspensin a la slica enfriada se agita y se distribuye la suspensin de
esporas; los frasco se deben incubar de 10 14 das a 25C hasta que los
cristales de slica gel se sequen y se separen, luego se almacenan a 4C
en contenedores cerrados (Abreu et al, 2003).
5.4.1.5. Conservacin por Liofilizacin: Es un proceso suave con la

pared celular, mediante el cual se elimina el agua por medio de
desecacin al vacio, mediante efecto de sublimacin del hielo alrededor
de las clulas; primero se congela el agua libre de las clulas y despus
se elimina mediante el vaco, sin que haya necesidad de subir la
temperatura, es este paso el mas critico debido a un incremento en las
presiones dentro y fuera del microorganismos. La estabilidad gentica es
alta en comparacin con otros procesos que utilizan compuestos
alteradores de enzimas (Garca y Uruburu, 2000) (Abreu et al, 2003).
5.4.1.6. La criopreservacin: Es un proceso de almacenamiento no

letal de material biolgico de clulas, tejidos u rganos a ultrasbajas
temperaturas generalmente entre -80C y -196 C (el punto de
congelacin del nitrgeno lquido). A esas temperaturas, cualquier
actividad biolgica que pudieran producir la muerte de una clula, quedan
efectivamente detenidas (Corredor, 2002).
5.4.1.7. Conservacin por desecacin en papel de filtro: Se utiliza un
papel absorbente (Whatman n 3) que se impregna con una solucin
concentrada de clulas y se deja secar al aire (en condiciones estriles)
(Garca y Uruburu, 2000).
Tambin es posible desecarlos por el procedimiento que se llama

desecacin lquida (L-Dry) porque se utiliza para ello el liofilizador, pero
sin que haya habido congelacin previa de las clulas. El vaco producido
por el liofilizador deseca las clulas, pero hay que evitar que un vaco
excesivo provoque evaporacin brusca con ebullicin o que la
temperatura disminuya demasiado, ocasionando la congelacin
incontrolada de las clulas (Garca y Uruburu, 2000).
6. EXPERIMENTACIN
6.1. Reconocimiento de la zona
El rea de muestreo corresponde a la zona del pramo de Cruz Verde

(departamento de Cundinamarca), en la vereda de San Francisco a 17
Km de Bogot, va Choach (436latitud Norte y 74 00 longitud Oeste). El
uso actual de la tierra es principalmente el cultivo de papa y el
levantamiento de ganado de doble propsito. Los suelos corresponden a
inceptisoles que se han desarrollado a partir de cenizas volcnicas
depositadas sobre arcillas (Jaimes y Sarmiento, 2002).
La precipitacin promedio anual es de 1254 mm y presenta un rgimen

monomodal de lluvias, con una estacin lluviosa entre los meses de
marzo a diciembre y un corto periodo seco entre los meses de enero y
febrero. La temperatura media anual es de 8,4C y vara mensualmente
entre 6 a 10C (Jaimes y Sarmiento, 2002).
La humedad relativa permanece durante todo el ao por encima de 80% y

presenta un promedio de 91,7%. La vegetacin natural consiste en la
comunidad de Espeletia grandiflora y Calamagrostis fusa (Jaimes y
Sarmiento, 2002).
Por otro lado la zona del pramo de Guasca se encuentra a 40 Km al

noroeste de Bogot en el municipio de Guasca- Cundinamarca con una
altitud de 3000-350m (IGAC, 1984).
El suelo del pramo Guasca presenta una textura dominante tipo franco
arenoso-orgnica y franco orgnica; estructura de granular a fina;
consistencia en hmedo friable a muy fiable; permeabilidad rpida (IGAC,
1984).
6.2. Recoleccin de muestras
Se realizaron dos muestreos correspondientes a los meses de Agosto y

Septiembre; basados en la norma ICONTEC NTC 4113-6.
Se realiz una inspeccin del rea para determinar los puntos de

muestreos, a partir de estos se escogi un punto central, se demarco con
lana un cuadrado de 25 m2 y se tomaron 5 submuestras en forma de X,
(figura 3) stas fueron mezcladas con el fin de obtener una muestra
compuesta representativa de cada cuadrante.
Figura 3. Mapa de cuadrantes de muestreo.

Fuente: Autores.
En el primer muestreo se utilizaron los siguientes mtodos: Cajas rodac

con medio Nutritivo (Figura 4), extraccin de suelo con el uso de palas
(Figura 5) y perforacin por medio del barreno (Figura 6) con el fin de
comparar el mejor mtodo de muestreo.
Figura 4. Toma de muestras con Cajas Rodac.
Fuente: Autores.
Posteriormente se determin que el mejor mtodo de muestreo era la

perforacin con el uso el barreno, y por tanto para el segundo muestreo
solo se utiliz el mtodo mencionado anteriormente.
Las muestras tomadas con el barreno y las palas, se transportaron en

bolsas resellables y en nevera manteniendo una temperatura constante
de 4 C (figura 7).
En cada muestreo se midi la temperatura ambiental y del suelo.
Figura 5. Toma de muestras con Pala.

Fuente: Autores.
Figura 6. Toma de muestras con Barreno.
Fuente: Autores.
Figura 7. Transporte de Muestras.

Fuente: Autores.
6.3. Procesamiento de las muestras
Las 5 muestras se tamizaron en un tamiz de 2mm y fueron incubadas a

37 C. 24 horas despus se tom el pH del suelo y las muestras fueron
procesadas.
Las muestras tomadas con las cajas rodac se incubaron directamente a

35 C por 48 horas.
6.4. Aislamiento de bacterias
6.4.1. Aislamiento primario:
6.4.1.1. Tcnica dilucin en tubo: Se hizo un pre-enriquecimiento de las

5 muestras, se pesaron 100 g de suelo y se adicionaron a 900 ml de
Caldo Nutritivo, se incubaron a 37C por 24 horas (Hamaky et al, 2005).
A partir de la primera dilucin (pre-enriquecimiento de las muestras) se

realizaron tres diluciones seriadas (102 - 104) en 9 ml agua destilada
estril; cada dilucin se sembr en superficie en Agar Nutritivo y Agar
Extracto de Suelo, por duplicado. Se incub a 37 C por 48 horas
(Hamaky et al, 2005).
Despus de 48 horas de incubacin las cepas recuperadas fueron

aisladas mediante el mtodo de siembra por agotamiento en Agar
Nutritivo (Garca y Ordoez, 2003), se incub a 37C por 48 horas; para
obtener as cultivos puros de cada cepa aislada (Hamaky et al, 2005).
6.4.1.2. Tcnica de aspersin directa: En Medio Agar Nutritivo se

sembr suelo directamente en la superficie del medio distribuida
uniformemente, se incub a 37 C por 48 horas. A partir de las colonias
obtenidas se realizaron aislamientos en Medio Agar Nutritivo (Camacho y
Hernndez, 2002), se incub a 37C por 48 horas.
6.4.1.3. Aislamiento a partir de caja rodac: Las cajas sembradas con

agar nutritivo, fueron manejadas en total asepsia, para evitar falsos
positivos. De las cepas recuperadas de los diferentes horizontes en el
suelo, se diferenciaron macroscpicamente y microscpicamente las
cepas (Figura 8) y posteriormente se realizaron aislamientos en Medio
Agar nutritivo con el fin de obtener cepas puras.
Figura 8. Aislamiento primario en cajas Rodac.
Fuente: Autores
6.5. Identificacin bacteriana
6.5.1. Identificacin microscpica: De cada aislamiento puro obtenido,

se realiz coloracin Gram para determinar la morfologa de las cepas
obtenidas.
6.5.2. Identificacin bioqumica: A partir de cada cepa aislada se

sembraron pruebas bioqumicas de Oxidasa, Catalasa, Citrato, SIM (H2S,
Indol, Motilidad), LIA (Lisina, Hierro Agar), TSI (Triple Azcar Hierro), OF
(Oxidacin-Fermentacin), Voges Proskauer, Rojo de Metilo, Nitratos,
Urea, Gelatina, Almidn, Gelatina, Glucosa, Sacarosa, Maltosa, Manosa,
Manitol, Fructosa, Celobiosa, Celulosa, Melobiosa, Sorbitol, Inositol,
Sucrosa, Ramnosa, Xilosa, Galactosa, Lactosa; para determinar el
metabolismo de los microorganismos aislados (Camacho y Hernndez,
2002).
Cada bioqumica fue incubada a 37 C por 48 horas y pasado el tiempo de

incubacin se observaron resultados de acuerdo a cada reaccin
bioqumica (Camacho y Hernndez, 2002).
Para cada bioqumica se realizaron controles positivos y negativos con los
siguientes microorganismos:
Tabla 1. Controles positivos y negativos de cada bioqumica utilizada

BIOQUMICA CONTROL POSITIVO CONTROL NEGATIVO
Voges-Proskauer Klebsiella sp. E. coli
Rojo de Metilo E. coli No inoculado
TSI E. coli Pseudomonas sp.
Reduccin de E. coli No inoculado
Nitratos
Citrato Salmonella sp. E. coli
Citocromo Oxidasa Pseudomonas aeruginosa E. coli
Gelatina Staphylococcus aureus E. coli
Almidn Bacillus subtilis E. coli
LIA Klebsiella No inoculado
Ureasa Proteus E. coli
Catalasa Staphylacoccus aureus Streptococcus
Fuente: MacFaddin, 2003
6.6. Conservacin de cepas

La conservacin de las cepas identificadas se llev a cabo por medio de
tres mtodos diferentes, la temperatura de congelacin a la cual se
llevaron los tres mtodos fue -4C bajo cero.
6.6.1. Conservacin en Suelo Estril: El suelo utilizado para conservar

las cepas fue recogido del pramo Cruz Verde; este suelo fue tamizado
en un tamiz de 2mm y partculas orgnicas y minerales fueron removidas
(rocas, palos, hojas e insectos). Se manejaron recipientes de vidrio color
mbar para evitar la penetracin de la luz, con tapn de goma y tapa
rosca.
Los envases y el suelo fueron esterilizados a 125 C, 1 atm durante 15

minutos. Previamente se preparo un cultivo lquido de cada cepa en caldo
nutritivo a una concentracin respecto al tubo N 2 de nefelometro de
MacFarlan que fue anticipadamente incubado por 24 horas a 35 C. En
cada recipiente se introdujeron 10 g de suelo y se inocul con 1 mL de
cultivo bacteriano trabajando en condiciones de absoluta esterilidad.
6.6.2. Conservacin en Glicerol: En este mtodo existe una relacin de

volmenes 2-1-1 (cultivo celular caldo nutritivo glicerol 20%)
respectivamente. Se trabaj con tubos eppendorf de capacidad 1.5 mL.
Debido a la expansin por efecto de la congelacin se manejo un volumen
de trabajo de 1 mL de mezcla para cada vial. La relacin de volmenes
trabajada fue de 0.5 mL de cultivo celular, 0.25 mL de caldo nutritivo y
0.25 mL de glicerol al 20%; estos dos ltimos componentes fueron
debidamente esterilizados a 125 C, 1 atm durante 1 5 minutos; el glicerol
fue preparado a partir de un stock de 99% de pureza (Monroy, 2002)
Cada vial fue llenado mediante micropipeta y bajo condiciones de cmara
de flujo laminar. (Mesa y Monroy, 2002).
6.6.3. Conservacin en Sensidiscos: A partir de un cultivo lquido en

caldo nutritivo que fue previamente incubado por 24 horas a 35C a una
concentracin con respecto al tubo N 2 del nefelmetro de MacFarlan
para cada cepa aislada; con el uso de pinzas estriles se sumergieron los
sensidiscos de papel filtro debidamente esterilizados para ser
impregnados; estos sensidiscos se secaron a temperatura ambiente en
condiciones estriles, repitiendo este proceso tres veces. Los sensidiscos
fueron introducidos en tubos eppendorf estriles (125 C, 1 atm y por 15
minutos) (Pedroza, 2003)
Finalmente todos los frascos y viales utilizados en los tres mtodos de
conservacin fueron rotulados con el nombre del microorganismo, el
pramo de donde fue aislado y la fecha de inicio del procedimiento de
conservacin.
7. RESULTADOS Y DISCUSIN
En el momento del muestreo la temperatura ambiental fue 15 C; la
temperatura del suelo 4,7 C. Con la muestra compuesta se realizaron
mediciones de pH del suelo obteniendo como resultado un pH de 5.
7.1. Parmetros para la seleccin de gneros

Del primer muestreo realizado en el pramo de Cruz Verde se
recuperaron 86 colonias bacterianas, con las tcnicas de toma de
muestras mediante uso de pala, tubo PVC y mtodo de contacto en cajas
rodac con agar nutritivo.
Del segundo muestreo realizado en el suelo del pramo de Cruz Verde se

recuperaron 37 cepas utilizando solo el mtodo de muestreo con barreno;
todas las cepas fueron enumeradas para evitar confusiones a la hora de
realizar los procedimientos de identificacin. En total se aislaron 123
cepas puras, sin embargo, despus de la caracterizacin se comprob
que muchas eran repetidas; finalmente se aislaron e identificaron 40
cepas.
Para la seleccin de gnero bacteriano, mediante el uso de material

bibliogrfico, se realizaron varias exclusiones de acuerdo a cuatro
parmetros en general:
Nicho ecolgico: Debido a la existencia de ambientes muy similares al

suelo de la zona paramuna, por ejemplo (suelo sabanero, suelo de alta
montaa, suelos de clima alternado por las cuatro estaciones, suelo de
estepas, suelo en nevados); se descartaron aquellos nichos ecolgicos
que presentaban una marcada diferencia con la zona muestreada
basados en los siguientes parmetros del suelo: estructura, formacin,
compactacin, composicin mineral, contenido de materia orgnica y por
ltimo variables fsicas, qumicas y ambientales (temperatura, pH,
contenido de sales, humedad relativa, retencin de agua lluvia, etc)
Se descartaron aquellos gneros bacterianos que han sido aislados
nicamente en ambientes marinos, suelos adyacentes a playas, suelos
salinos, suelos con humedad relativa menor al 45%, suelos con un pH
menor a 3 y mayor a 8, es decir, cepas bacterianas que se desarrollan en
ambientes totalmente diferentes al pramo. Tambin fueron descartados
gneros halfilos estrictos con requerimientos de NaCl a concentraciones
mayores al 1%.
Requerimientos metablicos: El suelo posee todos los nutrientes

necesarios, debido a esto es el mayor hbitat microbiano, en
consecuencia los gneros bacterianos que necesitan compuestos
especializados para su crecimiento pertenecen a otros ambientes
totalmente diferentes al suelo paramuno.
Los gneros bacterianos que requieren compuestos especficos para su

desarrollo como: cidos mixtos, triptfano, metionina, cistena, cistina,
entre otros, y atmsfera anaerbica estricta, fueron descartados debido a
que los gneros encontrados en los pramos no requieren de estos
compuestos especficos para crecer debido a que las cepas fueron
sembradas en agar nutritivo que por su alto contenido de nutrientes
permite un optimo crecimiento, sin ser selectivo para otras cepas
bacterianas.
Patognicidad: La mayora de las cepas patgenas son anaerobias,

necesitan condiciones y sustratos especiales para su crecimiento, y son
muy susceptibles a cambios climticos. Hay gneros que exclusivamente
crecen en ambientes hospitalarios y en rganos humanos o de otro
mamfero.
Esta clase de gneros presentan caractersticas metablicas similares a

las de los gneros encontrados en el pramo, pero por lo anteriormente
mencionado estos gneros patgenos fueron descartados.
Caractersticas macro y microscpicas: Las bacterias encontradas
fueron divididas inicialmente en los dos grupos ms grandes Gram
positivos y Gram negativas, posteriormente fueron clasificadas dentro de
los subgrupos esporoformadores y no esporoformadores.
Ya con la seleccin de posibles gneros con los pasos anteriormente

mencionados, se comparo macroscpicamente y microscpicamente con
la ayuda de las medidas obtenidas por medio del microscopio Motic.
NOTA: Las imgenes de macroscopia y microscopia, y las tablas de las

bioqumicas publicadas durante todos los resultados en este escrito fueron
efectuadas por los autores.
Las abreviaturas utilizadas en las tablas de las caractersticas bioqumicas

se refieren a: X: xilosa, L: lactosa, SU: sucrosa, M: maltosa, C: celobiosa,
MN: manosa, ME: melobiosa, I: inositol, SO: sorbitol, S: sacarosa, R:
ramnosa, F: fructosa, G: galactosa, Ma: manitol, GE: gelatina, RM: rojo de
metilo, VP: voges preskauer, CI: citrato, AL: almidn, CA: catalasa
7.2. Bacilos esporoformadores Gram positivos
Los gneros correspondientes a bacilos esporoformadores Gram positivos

tericamente existentes son: Amphibacillus, Bacillus, Desulfotomaculum,
Sporohalobacter, Sporolactobacillus, Sulfobacillus, Syntrophospora;
(Bergeys, 2000).
Posteriormente se realiz una seleccin de estos gneros descartando al

gnero Sulfobacillus por requerir un pH ptimo de 1.9-2.4 para su
crecimiento, as mismo requiere temperatura de incubacin de 50C.
Adicionalmente no suelen encontrarse en suelo sino en depsito de pirita.
Las cepas aisladas presentaron catalasa positiva, en consecuencia los
gneros con catalasa negativa Amphibacillus, Desulfotomaculum,
Sporohalobacter, Sporolactobacillus fueron descartados, as mismo
Desulfotomaculum es anaerobio estricto y algunas cepas requieren fuente
de azufre. Sporohalobacter es un gnero estricto anaerobio y halfilo
requiere 0.5 2 M de NaCl para su crecimiento y se encuentra en hbitat
salinos (Bergey, 2000) (Bergey, 1984).
7.2.1. Gnero Amphibacillus
7.2.1.1. Amphibacillus sp.
Amphibacillus, se diferencia de los otros gneros bacilo Gram positivo
esporoformador por ser catalasa negativo, motilidad positivo y su
presencia en suelos con alta concentracin de materia orgnica vegetal
en descomposicin (Bergey, 2000) (Bergey, 1984).
Figura 9. Microscopia 100x de Figura 10. Amphibacillus sp en

Amphibacillus sp Agar Nutritivo.
Tabla 2. Microscopia y macroscopia de Amphibacillus sp.
Caractersticas Microscpicas Caractersticas Macroscpicas
Bacilo Gram positivo; Colonias de forma circular con bordes

largo 3,1 m, ancho 1,1 m irregulares, con apariencia cremosa, de
pigmentacin amarillo claro.
Tabla 3. Caractersticas Bioqumicas de Amphibacillus sp.

X L SU M C MN ME I SO S R
- + + + - + + + - - +
F G Ma GE UREA RM LIA TSI CI AL CA
+ + - + + - - Alk/alk - - -
7.2.1.2. Amphibacillus xylanus
Amphibacillus xylanus es descrito por (Niimura, et al. 1990), como un
microorganismo anaerobio facultativo, bacilo Gram positivo,
esporoformador, que pueden crecer en medios alcalinos.
Figura 11. Microscopia 100x de Figura 12. Amphibacillus xylanus en

Amphibacillus xylanus. Agar Nutritivo.
Tabla 4. Microscopia y macroscopia de Amphibacillus xylanus
Bacilo esporoformador Gram Colonias de forma circular con bordes

positivo; largo 3,5 m, ancho 1,1 irregulares, con centro cremoso, de
m pigmentacin amarillo claro.
Tabla 5. Caractersticas Bioqumicas de Amphibacillus xylanus

- - + + - + + - - + -
F G Ma GE UREA VP LIA TSI CI AL CA
+ + - + - + + Alk/ac - + -
Solo existe una especie reportada que es A. xylanus debido a que este
gnero no aparece en los anteriores volmenes del manual Bergeys y
solo aparece en la versin del ao 2000, porque fue creado en 1990 por
Niimura et al. Por tanto las otras especies que no pertenecen a
Amphibacillus xylanus deben ser catalogadas como Amphibacillus sp
para que en futuros estudios sean realmente diferenciadas (Bergey, 2000)
(Bergey, 1984).
7.2.2. Gnero Bacillus
Este gnero presenta bacilos Gram positivos esporoformadores, poseen

gran adaptabilidad y se disponen en pares o cadenas. Poseen gran
adaptabilidad y bateras enzimticas que les permiten ser aislados en
diversos hbitats con respecto al calor, pH y salinidad (Ordoez, 1998).
Es catalasa positiva y crece en medios sintticos que contengan

azcares, cidos orgnicos, alcoholes, como nicas fuente de carbono.
Producen una enzima hidroltica que degrada polisacridos, cidos
nucleicos y lpidos, lo que permite a estos usar dichos productos como
fuente de carbono y donadores de electrones. Este gnero contiene 77
especies reconocidas (EPSA, 1991).
Este gnero se encuentra comnmente en suelos y plantas donde tiene

un papel importante en el ciclo del carbono y nitrgeno. Son habitantes
comunes de aguas frescas y estancadas, son particularmente activos en
sedimentos (Rusell Et al 1987).
La diferenciacin entre especies del gnero Bacillus se centro en los

resultados de la fermentacin de lactosa, sorbitol, manitol, melobiosa,
hidrlisis de la urea y descarboxilacin de la lisina (Bergey, 2000)
(Bergey, 1984).
7.2.2.1. Bacillus azotoformans
Figura 13. Microscopia 100x Figura 14. Bacillus azotoformans

Bacillus azotoformans. en Agar Nutritivo.
Tabla 6. Microscopia y macroscopia de Bacillus azotoformans.

Bacilo Gram positivo; Colonias de forma circular, pequea, de
esporoformador, largo 2,7 m, consistencia cremosa, bordes regulares
ancho 1,1 m. y de pigmentacin blanco grisceo.
Tabla 7. Caractersticas Bioqumicas de Bacillus azotoformans.

- - + - - - + + - - -
- - - + + - - Alk/acid - + +
7.2.2.2. Bacillus cereus

Figura 15. Microscopia 100x de Figura 16. Bacillus cereus en Agar
Bacillus cereus. Nutritivo.
Tabla 8. Microscopia y macroscopia de Bacillus cereus.

Bacilo Gram positivo; Colonias de forma circular, de tamao
esporoformador, largo 2,8 m, grande, de consistencia cremosa y
ancho 1,0 m presenta una pigmentacin beige.
Tabla 9. Caractersticas Bioqumicas de Bacillus cereus.

+ - + + - + - - - - -
+ - - + + - - Alk/alk - - +
7.2.2.3. Bacillus circulans

Figura 17. Microscopia 100x de Figura 18. Bacillus circulans en Agar
Bacillus circulans. Nutritivo.
Tabla 10. Microscopia y macroscopia de Bacillus circulans.

Bacilo Gram positivo; Colonia redonda, lisa, de contextura
esporoformador, largo 2,3 m, cremosa, crecimiento irregular, elevacin
ancho 1,0 m plana presenta y color blanco amarillento.
Tabla 11. Caractersticas Bioqumicas de Bacillus circulans.

+ + + + - + - + + - +
+ - - + - - +/-
+/- Alk/alk - + +
7.2.2.4. Bacillus globisporus

Figura 19. Microscopia 100x de Figura 20. Bacillus globisporus en
Bacillus globisporus. Agar Nutritivo.
Tabla 12. Microscopia y macroscopia de Bacillus globisporus.

Bacilo Gram positivo; Colonias irregulares, grandes, con
Esporoformador (endoespora), largo 2,8 bordes irregulares, de consistencia
m, Ancho 1,5 m polvorienta, no cremosa y de color
blanco.
Tabla 13. Caractersticas Bioqumicas de Bacillus globisporus.

+ + + + - + + + + + -
+ + + + + + - Ac/Ac + - +
7.2.2.5. Bacillus marinus

Figura 21. Microscopia 100x de Figura 22. Bacillus marinus en
Bacillus marinus. Agar Nutritivo.
Tabla 14. Microscopia y macroscopia de Bacillus marinus

Bacilo Gram positivo; Colonias de forma circular, grandes,
esporoformador (endoespora), largo 3,2 con bordes irregulares, de
m, ancho 1,3 m consistencia cremosa, elevacin
plana y de color blanco.
Tabla 15. Caractersticas Bioqumicas de Bacillus marinus

+ + + + - + - - - + -
+ - - + - - - Al/ac + - +
H2S
7.2.2.6. Bacillus pasteurii

Figura 23. Microscopia 100x. Figura 24. Bacillus pasteurii en Agar
Bacillus pasteurii Nutritivo.
Tabla 16. Microscopia y macroscopia de Bacillus pasteurii

Bacilo Gram positivo; Colonia redonda, de consistencia
esporoformador ; largo 3,5 m, ancho 1,0 cremosa y de color Crema.
m
Tabla 17. Caractersticas Bioqumicas de Bacillus pasteurii

- - + - - + + - - - -
+ - - + + - - Alk/Ad - - +
Para la identificacin de sta cepa, se enfatiz en la hidrlisis de la urea;

del cual existen cuatro especies que corresponden a este resultado,
conjuntamente se utilizo la fermentacin de la melobiosa, obteniendo solo
dos especies: Bacillus globisporus y Bacillus pasteurii; esta ltima fue
seleccionada, debido a la diferenciacin en la no fermentacin de lactosa
y sorbitol (Bergey, 2000) (Bergey, 1984).
7.2.2.7. Bacillus sphaericus

Figura 25. Microscopia 100x Figura 26. Bacillus sphaericus en
Bacillus sphaericus. Agar Nutritivo.
Tabla 18. Microscopia y macroscopia de Bacillus sphaericus.

Bacilo Gram positivo; Colonias de irregular, de consistencia
esporoformador, largo 2,8 m, cremosa. Presenta color beige oscuro y
ancho 1,5 m con produccin de pigmentacin rosado
claro en el medio.
Tabla 19. Caractersticas Bioqumicas de Bacillus sphaericus

- - + + - + - - - + -
- - - + - - - Alk/ac +/-
+/- + +
H2S
7.2.3. Gnero Sporolactobacillus

Este gnero est compuesto por 5 especies y se caracteriza por ser
catalasa negativo, anaerobio facultativo o microaroflico esporoformador.
El hbitat de los miembros de ste gnero incluye productos de leche,
pollo, suelos y plantas (Sanders.et al 2003).
7.2.3.1. Sporolactobacillus inulinus
Sporolactobacillus inulinus se caracteriza por producir cido lctico pero
es incapaz de fermentar la lactosa, su optimo crecimiento es de 35 C
(rango 15 C 40 C) (M. Sanders. 2003)
Figura 27. Microscopia 100x de Figura 28. Sporolactobacillus inulinus

Sporolactobacillus inulinus. en Agar Nutritivo.
Tabla 20. Microscopia y macroscopia de Sporolactobacillus inulinus

Bacilo Gram positivo; Colonias de consistencia cremosa, con
esporoformador ; largo 3,8 m, ancho bordes irregulares, lisas y presenta
1,0 m pigmentacin blanco.
Tabla 21. Caractersticas Bioqumica de Sporolactobacillus inulinus

- - + + - + - - - - -
+ - - - + + - Alk/alk - - -
Se determin que sta cepa, perteneca al gnero Sporolactobacillus,
debido a su formacin de esporas, su catalasa negativa y su nicho
ecolgico (suelo). De este gnero se selecciono como especie S.inulinus,
debido a su capacidad fermentativa de las siguientes hexosas: fructosa,
glucosa, maltosa, manosa, rafinosa, sucrosa, trehalosa, manitol y sorbitol;
la no fermentacin de pentosas: arabinosa, xilosa, galactosa, lactosa,
melobiosa, celobiosa, ramnosa; la no capacidad proteoltica sobre
gelatina y la no hidrlisis del almidn (Bergey, 2000) (Bergey, 1984).
7.3. Cocos esporoformadores Gram positivos.
7.3.1. Gnero Sporosarcina
En cuanto a cocos Gram positivos esporoformadores se determin que

sta cepa pertenece al gnero Sporosarcina por ser catalasa positivo y
no es anaerobio estricto en comparacin con Clostridium (Bergey, 1984).
Dentro de este gnero existen dos especies reportadas, Sporosarcina

ureae y Sporosarcina halophila; segn su metabolismo se diferencian por
ser urea positiva y gelatina negativa, debido a esto se estableci que la
cepa aislada pertenece a Sporosarcina ureae (Bergey, 1984).
7.3.1.1. Sporosarcina ureae
sta especie se encuentra en suelos y en cantidades mayores en
aquellos que reciben aportes de orina, descompone activamente la urea,
transformndola en CO2 y NH3 y crece en medios con pH de hasta 10
(Bergey, 2000).
Figura 29. Microscopia 100x de Figura 30. Sporosarcina ureae en

Sporosarcina urea. Agar extracto se suelo.
Tabla 22. Microscopia y macroscopia de Sporosarcina ureae.

Coco Gram positivo; Colonias pequeas, de contextura
esporoformador dimetro 1,1 m cremosa, elevacin plana, presenta
pigmentacin blanco grisceo.
Tabla 23. Caractersticas Bioqumicas de Sporosarcina ureae.

+ + + - - + + + - - +
+ - - - + - - Ac/ac + - +
7.4. Bacilos Gram Positivos no esporoformadores.
Para el subgrupo de bacilos Gram positivos no esporoformadores, se

descartaron los siguientes gneros: Erysipelothrix por no crecer en el
suelo y no tener otra fuente de aislamiento diferente al de organismos de
mamferos y aves y su relacin patgena frente e ellos, Carnobacterium y
Renibacterium por ser patgena para peces, requerimientos obligatorios
de cistena y rangos de temperatura de 15-18 C (Be rgey, 2000) (Bergey,
1984).
7.4.1. Gnero Brochothrix
El gnero Brochothrix se caracteriza por ser rojo de metilo y Voges-

Proskauer positivo, as mismo presentan enzima catalasa, crecen a
temperatura desde un rango de 0-30 C, no son pigme ntadas, no mviles,
no esporoformador, anaerobio facultativo y se encuentran distribuidos por
todo el medio ambiente (Gregory et al 1993).
Este gnero ha sido clasificado dentro de la rama de Clostridium,

Lactobacillus y Bacillus. Las cepas pertenecientes a este gnero se
caracterizan por no ser patgenas, y generalmente no crecen a
temperaturas arriba de 30 C (Gregory et al 1993).
Las dos cepas B. campestris y B. thermosphacta respectivamente fueron

diferenciadas por la fermentacin de la ramnosa con referencia a la
primera cepa (Bergey, 2000) (Bergey, 1984).
7.4.1.1. Brochothrix campestris
Figura 31. Microscopia 100x de Figura 32. Brochothrix campestris

Brochothrix campestris en Agar Nutritivo.
Tabla 24. Microscopia y macroscopia de Brochothrix campestris

Bacilo Gram positivo, largo 3,5 m, Colonias de forma circular, grandes,
ancho 1,2 m polvorienta, lisas, elevacin plana,
presenta color blanco.
Tabla 25. Caractersticas Bioqumica de Brochothrix campestris

+ - + + - + - - + + -
+ + + + + + + Alk/alk + + +
7.4.1.2. Brochothrix thermosphacta
Figura 33. Microscopia 100x de Figura 34. Brochothrix thermosphacta

Brochothrix thermosphacta. en Agar Nutritivo.
Tabla 26. Microscopia y macroscopia de Brochothrix thermosphacta.

Bacilo Gram positivo; largo 3,9 m, Colonias irregulares, rugosas, de
ancho 1,5 m consistencia cremosa, de pigmentacin
crema oscuro.
Tabla 27. Microscopia y macroscopia de Brochothrix thermosphacta.

- - + - - + + - - + +
+ + + + + + - Ac/ac - - +
7.4.2. Gnero Caryophanon
Caryophanon es un gnero muy poco estudiado, debido a su poca
tolerancia a condiciones de estrs, son mviles, no son
esporoformadoras, estrictas aerbicas y son catalasa positiva. Sus
colonias son de tamao grande y cambian de tonalidad en su
pigmentacin amarilla de oscuro a claro segn el tiempo transcurrido de
crecimiento (Nauman, et al. 1974).
7.4.2.1. Caryophanon latum
Figura 35. Microscopia 100x de Figura 36. Caryophanon latum en

Caryophanon latum. Agar Nutritivo.
Tabla 28. Microscopia y macroscopia de Caryophanon latum.

Bacilo Gram positivo; largo 2,0 m, Colonias redondas, lisas, de consistencia
ancho 0,9 m cremosa, de color amarillo ocre,
produccin de pigmentacin caf en el
medio.
Tabla 29. Caractersticas Bioqumica de Caryophanon latum.

+ - + + - + - - - - -
+ - - - + - - Alk/ac - - +
7.4.2.2. Caryophanon tenue
Figura 37. Microscopia 100x de Figura 38. Caryophanon tenue en
Caryophanon tenue. Agar Nutritivo.
Tabla 30. Microscopia y macroscopia de Caryophanon tenue.

Bacilo Gram positivo; largo 1,8 m, Colonias medianas de tonalidad gris,
ancho 1,1 m cremosas y ovaladas
Tabla 31. Caractersticas Bioqumica de Caryophanon tenue

+ + + + - + + + + + +
+ + + - - + - Ac/ac + - +
Debido a la similitud de caracterizacin bioqumica, el parmetro ms

importante para la determinacin y diferenciacin entre estas dos
especies, son las mediciones microscpicas, en este estudio las
obtenidas mediante el microscopio motic, debido al gran tamao de la
especie Caryophanon latun 2.8-3.2 m, existe una diferenciacin notable
con Caryophanon tenue 1.4-2.0 m (Bergey, 2000) (Bergey, 1984).
7.4.3. Gnero Kurthia
Este gnero se caracteriza por ser fermentadoras de glucosa, ser
catalasa positiva. Tambin presentan batera enzimtica con efecto
proteoltico sobre la gelatina, presenta motilidad, no es patgena para el
ser humano y animales, crece a temperatura optima de 25-30 C, con
tolerancia a altos y bajos cambios drasticos y se encuentra en todo el
medio ambiente debido a que posee alta actividad degradadora de
materia vegetal (Bergey, 2000) (Bergey, 1984).
7.4.3.1. Kurthia gibsonii
Figura 39. Microscopia 100x Figura 40. Kurthia gibsonii en Agar

Kurthia gibsonii. Nutritivo.
Tabla 32. Microscopia y macroscopia de Kurthia gibsonii.

Bacilo Gram positivo; largo 3,2 m, Colonias redondas, pequeas, de
ancho 1,0 m. consistencia cremosa, lisas, con bordes
regulares, de color blanco.
Tabla 33. Caractersticas Bioqumica de Kurthia gibsonii.

- - + + - - - - - + -
- + - + - - - Ac/ac - - +
7.4.3.2. Kurthia sibirica
Figura 41. Microscopia 100x de Figura 42. Kurthia sibirica en Agar

Kurthia sibirica. Nutritivo.
Tabla 34. Microscopia y macroscopia de Kurthia sibirica

Bacilo Gram positivo; largo 3,8 m, Colonias de forma irregular, presentan
ancho 1,5 m centros cremosos el borde polvoriento,
pigmentacin beige.
Tabla 35. Caractersticas Bioqumica de Kurthia sibirica

- - + + - - + - - - -
+ + - + - - - Ac/ac - - +
7.4.3.3. Kurthia zopfii
Figura 43. Microscopia 100x de Figura 44. Kurthia zopfii en agar

Kurthia zopfii. Nutritivo.
Tabla 36. Microscopia y macroscopia de Kurthia zopfii

Bacilo Gram positivo; largo 2,0 m, Colonias pequeas de tonalidad
ancho 0,9 m naranja, contextura cremosa.
Tabla 37. Caractersticas Bioqumica de Kurthia zopfii.

- - + + - - - - - - +
- + + + - - - Ac/ac - + +
7.4.4. Gnero Lactobacillus

Son Bacilos Gram positivos, largos, delgados, formando cadenas. Su
metabolismo es fermentativo y sacaroclsico, el producto final es del
carbono es el lactato. Son microaeroflicos e inmviles. Bioqumicamente
reducen el nitrato, no utilizan la gelatina, son catalasa y citocromo oxidasa
negativ,. Su hbitat es en la superfice de plantas y frutas (De la Rosa,
1996). Las cepas nombradas a continuacin fueron identificadas en el
gnero Lactobacillus por ser catalasa negativa, no actividad proteoltica
sobre la gelatina, su distribucin en el ambiente y la no reduccin de
nitratos (Bergey, 2000) (Bergey, 1984).
7.4.4.1. Lactobacillus agilis
Figura 45. Microscopia 100x de Figura 46. Lactobacillus agilis en Agar

Lactobacillus agilis. Nutritivo.
Tabla 38. Microscopia y macroscopiade Lactobacillus agilis.

Bacilo Gram positivo; largo 2,9 m, Colonias de forma circular, lisas, de
ancho 0,9 m contextura cremosa, blancas.
Tabla 39. Caractersticas Bioqumica de Lactobacillus agilis.

- + + + - + + + - + -
+ - + - + + - Alk/alk - - -
Esta cepa presenta similitud con 4 especies: L. maltaromicus, L,

plantarum, L. salivarius y L. agilis al presentar fermentacin de lactosa,
manitol, melobiosa y no fermentacin de ramnosa pero se diferencio L.
agilis por la no fermentacin del sorbitol (Bergey, 2000) (Bergey, 1984).
7.4.4.2. Lactobacillus collinoides
Fig 47. Microscopia 100x de Fig 48. Lactobacillus collinoides

Lactobacillus collinoides. en Agar Nutritivo.
Tabla 40. Microscopia y macroscopia de Lactobacillus collinoides.

Bacilo Gram positivo; largo 5,3 m, Colonias de forma circular, pequeas, de
ancho 1,3 m. pigmentacin blanca.
Tabla 41. Caractersticas Bioqumica de Lactobacillus collinoides.

- - + + - - - - - - +
+ + - - + + - Alk/alk - + -
7.4.4.3. Lactobacillus confusus
Figura 49. Microscopia 100x de Figura 50. Lactobacillus confusus

Lactobacillus confusus. en Agar Nutritivo.
Tabla 42. Microscopia y macroscopia de Lactobacillus confusus.

Bacilo Gram positivo; largo 2,7 m, Colonias de forma circular, de tamao
ancho 1,1 m variable, de contextura un seca,
irregulares, de pigmentacin beige claro.
Tabla 43. Caractersticas Bioqumica de Lactobacillus confusus.

- - + + - + - - - + -
+ + + - + + - Alk/alk - - -
7.4.4.4. Lactobacillus fructosus

Figura 51. Microscopia 100x de Figura 52. Lactobacillus fructosus en
Lactobacillus fructosus. Agar Nutritivo.
Tabla 44. Microscopia y macroscopia de Lactobacillus fructosus.

Bacilo Gram positivo, largo 4,1 m, Colonias cremosas, tamao y forma
ancho 1,5 m. variable, lisas, de elevacin plana, de
pigmentacin crema con centro oscuro.
Tabla 45. Caractersticas Bioqumica de Lactobacillus fructosus.

- - - - - - - - - + -
+ - - - + + + Ac/ac - + -
7.4.4.5. Lactobacillus kandleri

Figura 53. Microscopia 100x de Fig 54. Lactobacillus kandleri en
Lactobacillus kandleri. Agar Nutritivo.
Tabla 46. Microscopia y macroscopia de Lactobacillus kandleri.

Bacilo Gram positivo; largo 4,2 m, Colonias de forma circular, cremosas,
ancho 1,2 m lisas, de color amarillo claro.
Tabla 47. Caractersticas Bioqumica de Lactobacillus kandleri.

- - - - - - - - - + -
+ + + - + + + Ac/ac - - -
7.4.4.6. Lactobacillus sake

Fig 55. Microscopia 100x de Fig 56. Lactobacillus sake en
Lactobacillus sake. Agar Nutritivo.
Tabla 48. Microscopia y macroscopia de Lactobacillus sake

Bacilo Gram positivo; largo 3,1 m, Colonias irregulares, de consistencia
ancho 1,0 m cremosa, lisa y de pigmentacin
Blanco Hueso.
Tabla 49. Caractersticas Bioqumica de Lactobacillus sake

- + + + - + + - - + -
+ - - - + + - Alk/alk - - -
7.4.4.7. Lactobacillus viridescens

Figura 57. Microscopia 100x de Figura 58. Lactobacillus viridescens
Lactobacillus viridescens. en Agar Nutritivo.
Tabla 50. Microscopia y macroscopia de Lactobacillus viridescens.

Bacilo Gram positivo; largo 3,9 m, Colonias grandes con centro
ancho 1,1 m cremoso, color blanco.
Tabla 51. Caractersticas Bioqumica de Lactobacillus viridescens.

- - - + - + - + - + -
+ - - - + + - Alk/ac - - -
7.4.5. Gnero Listeria

El gnero Listeria, se caracteriza por bacterias no son esporoformadoras,
mviles, crecen a temperatura de 20-25 C, catalasa positiva, as mismo
son cepas no patgenas (Bergey, 2000) (Bergey, 1984).
7.4.5.1. Listeria murrayi
Figura 59. Microscopia 100x Figura 60. Listeria murrayi en

Listeria murrayi. Agar Nutritivo.
Tabla 52. Microscopia y macroscopia de Listeria murrayi.

Bacilo Gram positivo; largo 1,9 m, Colonias de forma circular, de contextura
ancho 1,1 m cremosa, con bordes regulares,
pigmentacin beige claro.
Tabla 53. Caractersticas Bioqumica de Listeria murrayi

- + - + - + - - - + +
+ + + + - + - Alk/alk - - +
7.4.5.2. Listeria welshimeri

Figura 61. Microscopia 100x de Figura 62. Listeria welshimeri en
Listeria welshimeri. Agar Nutritivo.
Tabla 54. Microscopia y macroscopia de Listeria welshimeri.

Bacilo Gram positivo; largo 2,7 m, Colonias irregulares, de una tamao
ancho 1,0 m pequeo, de consistencia cremosa, de
pigmentacin blanco
Tabla 55. Caractersticas Bioqumica de Listeria welshimeri.

+ + + + - - + - - - -
+ - - + - + - Alk/alk - - +
7.5. Cocos Gram positivos no esporoformadores

Los gneros de cocos no esporoformadores Gram positivos descartados
por no encontrarse en ambientes similares al pramo fueron:
Marinococcus, Vagococcus, Planococcus y Salinococcus ya que estos
gneros requiere de una temperatura de crecimiento de 30 a 37 C,
requieren una concentracin de 0.5 a 20 % NaCl, as mismo son
encontrados en suelos salinos y hbitat marinos. Aerococcus demanda
pH 9.6 para su crecimiento, 10% NaCl y 40% de bilis. Coprococcus es
estrictamente anaerbico y es aislado en intestinos y heces humanas.
(Bergey, 2000) (Bergey, 1984).
Gemella, Peptoccoccus, Peptostreptococcus, Stomatococcus y

Streptococcus fueron descartados por ser parsitos obligados de
humanos y mamferos al ser invasivos de membranas mucosas del tracto
respiratorio, tractos intestinales, glndulas mamarias y tener implicacin
en diferentes procesos infecciosos. Por sus caractersticas morfolgicas
se determin que las cepas aisladas no pertenecen al gnero
Deinobacter por mostrar colonias rosadas o rojas y Deinococcus por
presentar colonias rojas o naranjas. Otro requerimiento al momento de ser
cultivados es una atmosfera anaerobia de CO2 para los gneros
descartados Melissococcus y Ruminococcus (Bergey, 2000).
7.5.1. Gnero Lactococcus

Gnero de bacterias del cido lctico formado por cinco especies
relacionadas con Streptococcus. Las bacterias de este gnero son
tpicamente esfricas u ovoides, de 0,5 a 1,2 m por 0,5 a 1,5 m, y se
agrupan en pares o en cadenas cortas. Son no formadoras de esporas y
no mtiles (Valbuena et al. 2005).
Del gnero Lactococcus solo se encontr una cepa, su especie fue

seleccionada por las condiciones de temperatura (40 C) y concentracin
de NaCl para su desarrollo (4%), la especie seleccionada fue L. lactis,
pero esta especie presentaba tres subespecies diferenciadas por la no
fermentacin de la lactosa y el manito, correspondiente a Lactococcus
lactis subespecie hordniae (Bergey, 2000).
7.5.1.1. Lactococcus lactis

El Lactococcus lactis es un microorganismo mesfilo, capaz de fermentar
la lactosa produciendo cido lctico en gran cantidad, de la misma forma
es capaz de producir algunas substancias antibacterianas conocidas en
forma genrica como bacteriocinas, entre las cuales destacan la nisina y
la diplococcina. Ambos factores, acidez y bacteriocinas, son capaces de
inhibir el crecimiento de un amplio rango de microorganismos (Valbuena
et al. 2005).
Figura 63. Microsocopia 100x de Figura 64. Lactococcus lactis en Agar

Lactococcus lactis. Nutritivo.
Tabla 56. Microscopia y macroscopia de Lactococcus lactis.

Coco Gram positivo; dimetro 1,1 m. Colonias de forma circular, de
tamao diminuto, de consistencia
cremosa y color blanco.
Tabla 57. Caractersticas Bioqumica de Lactococcus lactis.

- + + + - - + + - - -
- - - + + + - Alk/alk - + -
7.5.2. Gnero Microccocus
Los microorganismos pertenecientes al gnero Micrococcus poseen
clulas esfricas, que pueden agruparse en pares, ttradas o en forma
irregular. Las colonias son pigmentadas. Son aerobios estrictos, su
metabolismo es respiratorio con escasa o nula produccin de cido, y
crecen bien en medios simples. La prueba de la catalasa es positiva, la de
la oxidasa frecuentemente lo es aunque dbilmente (Altamirano y Pozzo.
2000).
7.5.2.1. Microccocus luteus
Figura 65. Microscopia 100x de Figura 66. Micrococcus luteus en

Microccocus luteus. Agar Nutritivo.
Tabla 58. Microscopia y macroscopia de Microccocus luteus.

Coco Gram positivo; dimetro 1,7 m. Colonias redondas, lisa, de
contextura cremosa, de
pigmentacin amarillo.
Tabla 59. Caractersticas Bioqumicas de Micrococcus luteus.

+ - + + - + - - - - -
+ - - + + - - Alk/alk - - +
7.5.2.2. Micrococcus roseus
Figura 67. Microscopia 100x Figura 68. Micrococcus roseus en

Micrococcus roseus. Agar Nutritivo
Tabla 60. Microscopia y macroscopia de Micrococcus roseus.

Coco Gram positivo; dimetro 0,9 m. Colonias redondas y lisas,
cremosas, de pigmentacin rosa.
Tabla 61. Caractersticas Bioqumicas de Micrococcus roseus.

+ - + + - - - - - - -
+ - - + + + - Alk/acid - - +
7.5.3. Gnero Pediococcus

Son cocos Gram positivos, inmviles, no forman esporas.
Microscopicamente se observan formando ttradas, pero tambin pueden
estar en pares. Son homofermentativos Su rango ptimo de crecimiento
es de 25 C a 40 C. (De la Rosa 1996)
7.5.3.1. Pediococcus sp.

Segn las caractersticas sta cepa, no pertenece al gnero
Micrococccus, Planococcus o Deinococcus, gneros caractersticos por
presentar pigmentacin en las colonias; debido a la no presencia de la
batera enzimtica catalasa, as mismo se determin que pertenece al
gnero Pediococcus por su no motilidad, no formacin de esporas,
fermentacin de glucosa y carbohidratos, no reduce nitratos, no es
patgena para animales o humanos y se ha aislado de material vegetal
(Bergey, 2000).
Figura 69. Microscopia 100x de Figura 70. Pediococcus sp en

Pediococcus sp. Agar Nutritivo.
Tabla 62. Microscopia y macroscopia de Pediococcus sp.

Coco Gram positivo; dimetro 1,2 m Colonias de forma circular, lisas, de
consistencia cremosa, de
pigmentacin amarillo.
Tabla 63. Caractersticas Bioqumica de Pediococcus sp.

+ + + + - + + - - - -
+ + - + + + - Alk/ac + - -
7.5.4. Gnero Sacharococeus

7.5.4.1. Sacharococeus thermophilus
En diferentes estudios Saccharococcus thermophilus se ha aislado en

refineras de azcar, a pesar de su resistencia a altas temperaturas se ha
venido encontrando en otros hbitats con bajas temperaturas (Bergey,
2000).
Figura 71. Microscopia 100x de Figura 72. Sacharococeus thermophilus

Sacharococeus thermophilus. en Agar Nutritivo.
Tabla 64. Microscopia y macroscopia de Sacharococeus thermophilus.

Coco Gram positivo; dimetro 0,9 m Colonias de forma circular, de
consistencia cremosa, lisa, de
pigmentacin Beige.
Tabla 65. Caractersticas Bioqumica de Sacharococeus thermophilus

+ - + + - + + - - + -
+ + + + + - + Ac/ac + + +
7.5.5. Gnero Sarcina

El gnero Sarcina fue seleccionado por su produccin de CO2, hidrlisis
de almidn y catalasa negativa, existen dos especies: Sarcina maxima y
Sarcina ventriculi esta ltima fue seleccionada por ser fermentadora de
melobiosa y celulosa y no fermentadora de xilosa (Bergey, 2000).
7.5.5.1. Sarcina ventriculi
Figura 73. Microscopia 100x de Figura 74. Sarcina ventriculi en Agar

Sarcina ventriculi. Nutritivo.
Tabla 66. Microscopia y maroscopia de Sarcina ventriculi.

Coco Gram positivo; dimetro 1,1 m Colonias de formas irregulares, de
consistencia rugosa, presenta
pigmentacin blanca.
Tabla 67. Caractersticas Bioqumica de Sarcina ventriculi.

- + + - + + + - - - -
+ - - + - - +/- Ac/ac - + -
CO2
7.5.6. Gnero Staphylococcus

Son cocos Gram positivos, necesita una fuente nitrogenada orgnica y en
sus necesidades de oxgeno es facultativo, se caracteriza por ser catalasa
positivo (Prescott. 1999). La cepas a continuacin se determinaron que
pertenecan al gnero Staphylococcus debido a su no formacin de
esporas, no motilidad, sus colonias opacas blancas, raramente amarillas o
naranjas, son catalasa positiva, y no son cepas patgenas (Bergey,
2000).
7.5.6.1. Staphylococcus arlettae
Figura 75. Microscopia 100X de Figura 76. Staphylococcus arlettae en

Staphylococcus arlettae. Agar Nutritivo.
Tabla 68. Microscopia y macroscopia de Staphylococcus arlettae.

Coco Gram positivo; dimetro 1,1 m Colonias redondas, de tamao
pequeo, lisas, de pigmentacin
blanco.
Tabla 69. Caractersticas Bioqumica de Staphylococcus arlettae.

+ + + + - + + - - + -
+ + + + - + + Ac/ac + - +
Esta cepa se diferenci de las otras especies del gnero Staphylococcus
por ser urea negativa, pero as mismo presentaba dos posibles especies:
Staphylococcus auricularis y Staphylococcus arlettae; sta ltima fue
seleccionada por presentar fermentacin de lactosa (Bergey, 2000).
7.5.6.2. Staphylococcus auricularis
Esta cepa fue identificaba como Staphylococcus auricularis por no

fermentar manitol y manosa que permiti diferenciarla de otras cepas
bacterianas de especia metablicamente similares (Bergey, 1984).
Figura 77. Microscopia 100X de Figura 78. Staphylococcus auricularis

Staphylococcus auricularis. en Agar Nutritivo.
Tabla 70. Microscopia y macroscopia de Staphylococcus auricularis.

Coco Gram positivo; dimetro 0.9 m Colonias de contextura cremosa, lisa,
de pigmentacin Amarillo,
translucidas.
Tabla 71. Caractersticas Bioqumica de Staphylococcus auricilaris.

+ - + - - - + - - - +
+ - - + + + - Alk/ac - - +
7.5.6.3. Staphylococcus equorum
Figura 79. Microscopia 100x de Figura 80. Staphylococcus equorum

Staphylococcus equorum. en Agar Nutritivo.
Tabla 72. Microscopia y macroscopia de Staphylococcus equorum

Coco-Bacilo Gram positivo, largo 1,5 Colonias irregulares, lisas, de
m, ancho 1,1 m. consistencia seca, elevacin plana,
de pigmentacin Blanca.
Tabla 73. Caractersticas Bioqumica de Staphylococcus equorum

- + + + - + + - - + +
+ + - + + + - Alk/alk - - +
7.5.6.4. Staphylococcus hominis
Estas cepas fueron identificadas Staphylococcus equorum y

Staphylococcus hominis por la hidrlisis de la urea, estas dos especies se
diferenciaron respectivamente por no presentar fermentacin de la
aldopentosa xilosa y el polialcohol manitol respecto a S. equorum y si
fermentadora por parte de S. hominis (Bergey, 2000).
Figura 81. Microscopia 100x de Figura 82. Staphylococcus hominis

Staphylococcus hominis. en Agar Nutritivo.
Tabla 74. Microscopia y macroscopia de Staphylococcus hominis.

Coco Gram positivo, largo 1,7m y Colonias de forma circular, cremosas
ancho 0,9 y lisas, de pigmentacin blanco.
Tabla 75. Caractersticas Bioqumica de Staphylococcus hominis.

+ + + + - - + - - + -
+ + + + + - - Ac/ac + - +
CO2
7.5.6.5. Staphylococcus lentus

Esta cepa, tambin urea negativa presentaba dos opciones S. kloosii y S.
lentus pero esta ltima fue seleccionada por fermentar sucrosa y manosa
(Bergey, 2000) (Bergey, 1984).
Figura 83. Microscopia 100x de Figura 84. Staphylococcus lentus en

Staphylococcus lentus. Agar Nutritivo.
Tabla 76. Microscopia y macroscopia de Staphylococcus lentus.

Coco Gram positivo; dimetro 1,1 m Colonias lisas, de consistencia
cremosa, de pigmentacin amarillo.
Tabla 77. Caractersticas Bioqumica de Staphylococcus lentus

- + + - - + + - - + +
+ + + + - + - Alk/ac - - +
7.6. Coco-Bacilos no esporoformadores Gram positivos.
7.6.1. Gnero Trichococcus

7.6.1.1. Trichococcus flocculiformis
Figura 85. Microscopia 100x de Figura 86. Trichococcus flocculiformis

Trichococcus flocculiformis. en Agar Nutritivo.
Tabla 78. Microscopia y macroscopia de Trichococcus flocculiformis.

Coco-Bacilo Gram positivo, largo 1,7 Colonias redondas, consistencia
m, ancho 0,8 m cremosa y pigmentacin blanca
Tabla 79. Caractersticas Bioqumica de Trichococcus flocculiformis.

- + + + - + + - - + -
+ + + + + + +/- Alk/acid - + +
CO2
8. CONCLUSIONES
Se realiz una renovacin del grupo de cepas microbianas del

laboratorio de bioensayos de la Pontificia Universidad Javeriana en la
lnea de investigacin de fitoqumica , con especies bacterianas nativas
que han sido encontradas en diferentes ambientes y lugares del mundo
entero, proporcionando nuevas herramientas microbiolgicas.
Se ampli las expectativas en encontrar cepas bacterianas, que

metabolicen nuevos compuestos con efecto bactericida, antifungicos,
bacteriostticos y biocontroladores de plagas, necesarios para la
innovacin en reas biotecnolgicas y bioqumicas.
Se aislaron en total 123 cepas, de las cuales se identificaron mediante

estudios de gnero y especie 40 cepas.
Se sigui una cadena de parmetros en la identificacin, centrndose

en las caractersticas metablicas mediante procesos bioqumicos, sus
requerimientos y condiciones de cultivo, el nicho ecolgico y por ltimo
las caractersticas taxonmicas: microscpicas mediciones celulares
mediante microscopio motic y macroscpicas con la caracterizacin
morfolgica de las colonias.
Mediante los diferentes pases en agar nutritivo y agar extracto de suelo

se obtuvieron las diferentes cepas bacterianas puras y viables.
Utilizando los diferentes mtodos de conservacin (glicerol al 20%,

sensidiscos y en suelo), se mantuvo la coleccin de cepas en
condiciones puras y genticamente estables, para que en tiempos
futuros sean utilizadas mediante nuevas tcnicas en descubrimiento de
capacidades metablicas.
9. RECOMENDACIONES
Llevar a cabo procesos de aislamiento e identificaci0n in situ, as
mismo cultivar las cepas bacterianas a temperatura de 5C
correspondiente a la temperatura aislada del suelo de un pramo,
para recuperar aquellos gneros bacterianos que no son tolerantes a
las temperaturas comnmente utilizadas en incubacin y
enriquecimiento.
Realizar pruebas confirmativas mediante identificacin molecular y

as mismo realizar comparacin mediante el banco de genes.
Ejecutar extracciones en secciones de genes codificantes para

poder establecer una mejor caracterizacin de las propiedades
metablicas, de sntesis y tolerancia de una clula bacteriana.
Evaluar estadsticamente los diferentes mtodos de muestra y

tcnicas de recuperacin celular a partir de suelo segn: numero de
colonias aisladas y recuperadas, propiedades de muestra
representativa, nmero de muestreos entre otros.
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industrial. Editorial Acribia. Zaragoza Espaa
ANEXO 1
RESULTADOS DE LAS BIOQUMICAS
VOGES-PROSKAUER
ROJO DE METILO
REDUCCIN DE NITRATOS
UREASA
PRUEBA DE CITRATO
PRUEBA CATALASA
INDOL
Fuente: www.joseacortez.com

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AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE FLORA BACTERIANA

NATIVA DEL SUELO DE LOS PRAMOS CRUZ VERDE Y GUASCA

GERMN DAVID BENAVIDES RODRIGUEZ

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

NATIVA DEL SUELO DE LOS PRAMOS CRUZ VERDE Y GUASCA

GERMAN DAVID BENAVIDES RODRIGUEZ

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

Artculo 23 de la Resolucin N 13 de Julio de 1946

NATIVA DEL SUELO DE LOS PRAMOS CRUZ VERDE Y GUASCA

GERMAN DAVID BENAVIDES RODRIGUEZ

Rubn Daro Torrenegra

NATIVA DEL SUELO DE LOS PRAMOS CRUZ VERDE Y GUASCA

GERMAN DAVID BENABIDES RODRIGUEZ

DECANO ACDEMICO DIRECTOR DE CARRERA

Ingrid Schuler, ph.D. Janeth Arias Palacios, M.Sc. M.Ed.

En el presente trabajo se realiz el aislamiento y la identificacin de la

2.1.1. Perfil del Suelo 4

2.1.2. Textura del suelo 4

2.1.3. Componentes del Suelo 4

2.1.4. Microorganismos del Suelo 5

2.1.5. Muestreo del Suelo 7

2.2.1. Vegetacin de los pramos 7

2.2.2. Suelo de los Pramos 8

2.3. Crecimiento Microbiano 9

2.3.1. Efecto de la Temperatura 10

2.3.1.1. Crecimiento Microbiano a Temperaturas Extremas 10

2.3.2. Acidez y Alcalinidad 11

2.4. Identificacin Bioqumica 12

2.4.1. Prueba de Voges Proskauer 14

2.4.2. Prueba Rojo de Metilo 14

2.4.3. Prueba LIA (Descarboxilacin Lisina) 15

2.4.4. Hidrlisis de Almidn 16

2.4.5. Prueba SIM 16

2.4.6. Prueba TSI 17

2.4.7. Prueba Citocromo Oxidasa 17

2.4.8. Prueba de Citrato 18

2.4.9. Prueba de Ureasa 18

2.4.10. Prueba Reduccin de Nitratos 19

2.4.11. Prueba de Catalasa 19

2.4.12. Licuefaccin de gelatina 20

2.4.13. Prueba de fermentacin de hidratos de carbono 20

3. Formulacin del Problema y Justificacin 23

3.1. Formulacin del Problema 23

4.1. Objetivo General 25

4.2. Objetivos Especficos 25

5.1. Recoleccin de las Muestras 26

5.2. Procesamiento de las Muestras 28

5.2.1. Tcnicas de aislamiento 28

5.2.1.1. Lavado de Suelo 28

5.2.1.2. Tcnica de placa de conteo de Warcup 28

5.2.1.3. Tcnica de cultivo lquido 29

5.3. Identificacin Bacteriana 29

5.3.1. Identificacin Microscpica y Macroscpica 29

5.3.2. Identificacin Bioqumica 29

5.4. Conservacin de Cepas 30

5.4.1. Mtodos de Conservacin 30

5.4.1.1. Conservacin en Aceite Mineral 30

5.4.1.2. Conservacin por suspensin en agua destilada 30

5.4.1.3. Conservacin en Suelo estril 30

5.4.1.4. Conservacin en Slica Gel 31

5.4.1.5. Conservacin por Liofilizacin 31

5.4.1.7. Conservacin por Desecacin en papel de filtro 32

6.1. Reconocimiento de la Zona 33

6.2. Recoleccin de Muestras 34