2013 REMCB V34 No1 No2 PDF

ISSN 0034-9313
REVISTA ECUATORIANA DE
MEDICINA Y
CIENCIAS BIOLGICAS
VOLUMEN XXXIV - N 1 y 2 - OCTUBRE 2013

Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biolgicas
Volumen XXXIV Nmeros 1 y 2 - octubre 2013
ISSN 0034-9313
Impresin:
Centro de Publicaciones
Pontificia Universidad Catlica del Ecuador

Av. 12 de Octubre 1076 y Roca, Quito, Ecuador
Correccin de estilo: Alfonso Snchez
QualityPrint Ca. Ltda., Quito, Ecuador

Diseo y diagramacin: Claudia Hernndez Mora
Fotografa portada (Noche en la Estacin Cientfica Yasun): Rubn D. Jarrn E.

Fotografa contraportada: (Hongo ramificado de Yasun): Lucas M. Bustamante
REVISTA ECUATORIANA
DE MEDICINA Y CIENCIAS BIOLGICAS
Pontificia Universidad Catlica del Ecuador
Rector: Dr. Manuel Corrales Pascual, S.J.
Casa de la Cultura Ecuatoriana Benjamn Carrin
Presidente: Sr. Ral Prez Torres
Sociedad Ecuatoriana de Ciencias Biolgicas, Ncleo de Pichincha
Presidente: Dr. Jaime Costales Cordero
Editores:
Dr. Carlos A. Soria Proao1 (Ciencias Naturales)

1Pontificia Universidad Catlica del Ecuador
Dr. Sergio Barba 1,2,3 (Medicina)

1Sociedad Ecuatoriana de Alergologa, Inmunologa y Ciencias Afines
2Universidad Central del Ecuador; 3Centro mdico AXXIS, Quito
La Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biolgicas (REMCB) (ISSN 0034-9313) es un

rgano de difusin cientfica auspiciada por la Casa de la Cultura Ecuatoriana Benjamn Carrin,
la Pontificia Universidad Catlica del Ecuador y la Sociedad Ecuatoriana de Biologa, ncleo de
Pichincha. La REMCB se encuentra incluida en el Citation Index Expanded, se publica anualmente
y est dirigida a cientficos nacionales e internacionales as como a estudiantes de las Ciencias de
la Vida. Para solicitud de sobretiros o cualquier correspondencia relacionada con la revista, favor
dirigirse a: Dr. Carlos A. Soria, Quito-Ecuador. E-mail: revecuatorianamedycb@gmail.com o en la
seccin de contacto en la pgina web http://www.puce.edu.ec/revistaciencia.
El contenido de los artculos cientficos y de las publicaciones que aparecen en la revista son responsabilidad
exclusiva de sus autores o de los auspiciantes y no representan necesariamente el sentir de los editores
de la REMCB, quienes no se responsabilizan por errores o por las consecuencias surgidas por el uso del
material que aparece publicado en la misma.
3
NDICE
EDITORIAL 07
TRABAJOS CIENTFICOS
Evaluacin de la variabilidad gentica del capul

(Prunus serotina subsp. capul) en tres provincias del Ecuador
Dmaris P. Intriago-Balden, Mara de Lourdes Torres, Venancio Arahana y
Jos Tobar 11
Estudio de gentica poblacional de Polylepis pauta y Polylepis sericea en

Pichincha mediante la utilizacin de marcadores moleculares SSRs
Rosa Andrade, Mnica Jadn y Claudia Segovia-Salcedo 27
Estructuracin gentica de muestras del hongo Batrachochytrium

dendrobatidis en Ecuador
Mara del Carmen Vizcano, Charles W. Barnes y Mara Eugenia Ordez 47
Obtencin de embriones en fase cotiledonar de Caf Robusta (Coffea

canephora) con el empleo de un sistema de inmersin temporal, mediante la
tcnica de embriognesis somtica a partir de segmentos foliares
Gabriela Paredes, Cristian Pea y Mnica Jadn 63
Inhibicin de enterobacterias portadoras de carbapenemasas con

secreciones peptdicas de anfibios nativos ecuatorianos
Camila Cilveti, Myrian Rivera, Mercedes Rodrguez Riglos e Iliana Alcocer 85
Desarrollo neural, somitognesis y morfologa interna de los embriones de

Hyloxalus vertebrales y Dendrobates auratus (Anura: Dendrobatidae)
Francisca Hervas Sotomayor y Eugenia M. del Pino 99
Caracterizacin de la actividad amilsica presente en extractos larvarios de

dos polillas plagas de la papa: Tecia solanivora y Symmetrischema tangolias
Patricia Mora-Criollo, Andrea Rodrguez-Guerra y Carlos A. Soria 113
Diversidad de microalgas y cianobacteria en muestras provenientes de

diferentes provincias del Ecuador destinadas a una coleccin de cultivos
Ever Morales, Vernica Luna, Luca Navarro, Vismeli Santana, Ana Gordillo y
Andrs Arvalo 129
Diversidad del gnero Drosophila (Diptera, Drosophilidae) en el pramo de

Papallacta, Pichincha, Ecuador
Mara Luna Figuero y Violeta Rafael 151
5
REVISIN DE TRABAJOS CIENTFICOS
Integrones: plataformas bacterianas de recombinacin gentica y su

influencia en la resistencia bacteriana
David Ortega-Paredes y Jeannete Zurita 167
Gestin e inventario de la coleccin faunstica de los Centros de Tenencia y

Manejo de Fauna Silvestre de la provincia de Pastaza
Karen Noboa 187
NOTAS CIENTFICAS
Asociacin entre los polimorfismos -308 y -238 del gen TNF-a y la artritis
reumatoide (datos preliminares)
Carlos Mestanza, Camilo Zurita-Salinas, Estefana Espn,
David Ortega-Paredes, Marcelo Mora, Carlos Vallejo, Rmulo Villacs y
Maril Mestanza-Peralta 205
Diversidad del gnero Drosophila (Diptera, Drosophilidae) en la Quebrada

de Cruz Loma, Pichincha, Ecuador
Diego Cspedes y Violeta Rafael 215
INSTRUCTIVO PARA AUTORES
Instructivo para autores

Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biolgicas 223
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EDITORIAL 2013
El editor cientfico de la Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biolgicas quien

se ha responsabilizado por su publicacin durante los ltimos cinco aos y con el fin de
rescatar trabajos anteriores, coordin tambin la digitalizacin de todos los volmenes
disponibles. Si algn lector tiene acceso a los materiales faltantes, le agradeceramos que
nos comunique para completar la recuperacin electrnica de nuestra revista, disponible
en el sitio www.puce.edu.ec/revistaciencia.
El volumen actual XXXIV 2013 incluye materiales relacionados con la caracterizacin

de embriones cotilednicos de caf mediante embriognesis somtica; la evaluacin con
marcadores microsatelitales heterlogos sobre la diversidad y variabilidad gentica del
capul; o cmo analizar regiones de ADN ribosomal en hongos quitridiomicsicos para
determinar haplotipos. Otros marcadores moleculares vegetales fueron usados para
estudiar gentica de poblaciones mientras que la diversidad del gnero Drosophila ha
sido utilizada como indicadores de la conservacin de ecosistemas. Se analiz tambin el
manejo de fauna silvestre en centros de tenencia provisionales.
El estudio de la artritis reumatoide asocia ciertos polimorfismos genticos con la

enfermedad, mientras que a los integrones bacterianos nos presentan como plataformas
para incorporar y expresar genes casete de resistencia. Otros autores reportaron el uso de
secreciones peptdicas anricas para inhibir carbapenemasas.
La informacin comparativa sobre el desarrollo embrionario temprano de algunos

anuros fue estudiada en uno de los trabajos, al igual que el aislamiento de protenas
y amilasas larvarias para explicar diferencias infectivas entre estadios y especies de
plagas. Otras metodologas de estudio se utilizaron para distinguir diferentes especies de
microalgas y cianobacterias.
La portada de este nuevo volumen XXXIV 2013, muestra un extraordinario paisaje

nocturno fotografiado desde la Estacin Cientfica Yasun. La va lctea brilla con
esplendor sobre este paraje ecuatoriano nico y privilegiado.
La UNESCO declar al Yasun reserva de la bisfera terrestre, debido a la inigualable

diversidad de sus recursos naturales, que han evolucionado, seguramente desde el
pleistoceno en la poca cuaternaria. Comprende casi un milln de hectreas de la regin
nororiental del pas y es la cuna de la cultura ancestral Tagaeri Taromenane, y donde se
7
encuentran al menos 2244 especies de rboles y arbustos, 567 especies de aves, 205 especies
de mamferos, 105 especies de anfibios, 83 especies de reptiles, 382 especies de peces de
agua dulce, 100.000 especies de insectos, microflora, microfauna, macromolculas an
inidentificadas, adems de reservas hidrocarburferas de importancia.
El pas ofreci al mundo el proyecto innovador sostenible Yasun ITT, para solicitar
que se invirtiera en su conservacin, con la finalidad que se mantuviera libre de modelos
hidrocarburferos extractivistas que perturbaran la secuencia de millones de aos de
evolucin y que adems pondra en peligro su papel como controlador de emisiones
de dixido de carbono y guardin de importantes fuentes de agua dulce. Se present a
la comunidad cientfica y a los pases del mundo a Yasun como uno de los lugares de
mayor biodiversidad del planeta y se enfatiz la importancia de preservarla. Por diversas
razones no se obtuvo la respuesta esperada.
Frente a esta disyuntiva, nuestro gobierno decidi proceder con la explotacin de los
hidrocarburos de ciertos sectores del Yasun. Esta decisin nos obliga a meditar sobre los
peligros de una economa extractivista, especialmente en una zona tan preciosa y nica
como es esta. Nuestra comunidad cientfica debera reflexionar sobre temas vitales como
son la extraccin, reposicin, conservacin, equilibrio, manejo de recursos, obligaciones,
responsabilidades y veeduras, bajo impacto, inversin, certificacin de reservas y otros.
Si las exigencias econmicas de la sociedad imponen la explotacin de estos recursos
debemos meditar sobre las consecuencias irreversibles de una decisin de la cual no se
podr echar pie atrs.
Entre las consecuencias inevitables de la extraccin de petrleo se encuentran los

derrames, piscinas abiertas o lodos superficiales, que al no permitir la aireacin ni el
intercambio inico, afectan a los seres vivos del entorno. Las molculas poliaromticas
son carcingenos liposolubles que se absorben a travs del tracto gastrointestinal y
algunos derivados como las naftalinas y mercaptanos, conocidos contaminantes del agua,
son agresivos inhibidores de la respiracin mitocondrial. La misma mezcla de gases del
proceso de extraccin son txicos citoplasmticos y mitocondriales. A esto se sumaran
los millones de litros de aguas de formacin salinizadas, azufradas y poliaromatizadas,
que igualmente son contaminantes. Esto y ms ocurrir en mayor o menor grado, aunque
se usen modernas y sofisticadas tcnicas de perforacin y extraccin.
La naturaleza es sabia al seleccionar bacterias y hongos capaces de procesar

hidrocarburos. El antagonismo o las atracciones biolgicas que seguramente se habrn
desarrollado durante millones de aos en el Yasun, en medio de presiones moleculares
abundantes y estrechas, una vez perdidos o alterados, sern irrepetibles e irrecuperables.
8
Mientras tanto, los mecanismos de resistencia se desarrollan tan rpidamente en bacterias,
hasta el extremo que los ms recientes antibiticos de ltima generacin ya no logran
controlar microorganismos que se han vuelto apocalpticamente patognicos, con el
riesgo de amenazar hasta la propia supervivencia de nuestra especie.
Qu nos podr ensear el Yasun, donde el pool gentico se ha amasado, repartido,

evolucionado y diversificado con tanta abundancia durante cientos de miles de aos?
La lgica nos dice que dentro de su flora y fauna, de su suelo y de sus fuentes de agua,
se encuentran los grmenes de nuevas especies de vida. Lo ms probable es que existan
o se estn formando mecanismos desconocidos en organismos capaces de controlar la
multiplicacin de otros, o que haya antibiticos y principios activos a la espera de ser
descubiertos. Somos los depositarios de esta incalculable y enorme riqueza a punto de
ponerse en riesgo, presionados por la necesidad econmica emergente que es imperante
evaluar frente a la responsabilidad de conservarla y entregarla a las generaciones
siguientes.
Este ao, igual que los anteriores la investigacin ha dado sus frutos; les presento
el nuevo volumen XXXIV 2013 de la Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biolgicas.
Que lo disfruten!
Dr. Carlos A. Soria, PhD

Editor Cientfico REMCB
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TRABAJOS CIENTFICOS
Evaluacin de la variabilidad gentica del capul
(Prunus serotina subsp. capul) en tres provincias del Ecuador
Dmaris P. Intriago-Balden, Mara de Lourdes Torres,
Venancio Arahana y Jos Tobar

Universidad San Francisco de Quito, Colegio de Ciencias Biolgicas y Ambientales, Laboratorio de
Biotecnologa Vegetal. Calle Diego de Robles y Va Interocenica, Campus Cumbay, Edif. Charles
Darwin. Casilla Postal 17-1200-841, Quito, Ecuador
ltorres@usfq.edu.ec
Recibido: 24, 06, 2013; aceptado: 19, 09, 2013
Resumen.- Prunus serotina subsp. capul es una especie arbrea, silvestre y tetraploide que
se distribuye a lo largo del continente americano y est presente en el callejn interandino
ecuatoriano. A pesar de su potencial econmico en las industrias alimenticia, maderera
y mdica, existe poca informacin acerca de la historia y el cultivo del capul en el pas.
Este estudio evalu la diversidad gentica de P.serotina en tres provincias de la sierra
ecuatoriana. Se analizaron 88 individuos de capul provenientes de Pichincha, Caar y
Azuay, mediante el uso de ocho marcadores microsatlites heterlogos. Se gener un
dendrograma con su respectivo bootstrap, un anlisis de coordenadas principales (PCoA),
un anlisis de Mantel y valores del ndice de distancia gentica (Fst). Los resultados
muestran un grado moderado de variabilidad gentica entre los individuos de capul
analizados, junto con un cierto nivel de diferenciacin gentica entre individuos siguiendo
una distribucin norte-sur que no est relacionado con la distancia geogrfica entre las
muestras analizadas. Se discuten varias hiptesis que tratan de explicar estos resultados.
Palabras claves: Capul, Prunus serotina subsp. capul, microsatlites, variabilidad

gentica
Abstract.- Prunus serotina subsp. capul is a wild arboreal tetraploid species widely
distributed throughout America and can be found in the Ecuadorian highlands. Capuli
has a high economic potential for food, timber, and medicine; however, there is little
information available concerning the history and development of this crop in Ecuador.
11
Revista Ecuatoriana de
MEDICINA Y CIENCIAS BIOLGICAS
This study evaluated the genetic diversity of capul in three provinces in the Ecuadorian
highlands. A total of 88 capul individuals from Pichincha, Caar, and Azuay provinces
were analyzed using eight heterologous microsatellite (SSR) markers. A dendrogram
with its respective bootstrap analyses, a principal coordinate analysis (PCoA), a Mantel
test, and Fst genetic distance index values were generated. The results show a moderate
degree of genetic variability among capul individuals analyzed and some level of genetic
differentiation between individuals following a north-south distribution which is not
related to the geographical distance among the evaluated samples. Various hypotheses
that attempt to explain these results are discussed.
Keywords: Capul, Prunus serotina subsp. capul, SSR markers, genetic variability
Introduccin de moscas (Orden Diptera), una especie

El capul, Prunus serotina subsp. capul de escarabajo (Orden Coleoptera) y
(McVaugh), es una especie frutal arbrea, algunas especies de abejas con inclusin
silvestre y de rpido crecimiento que de la abeja productora de miel (Orden
pertenece a la familia Rosaceae (Fresnedo- Hymenoptera). Las semillas de capul se
Ramrez et al., 2011; Pairon et al., 2008; dispersan por aves y mamferos pequeos;
Downey e Iezzoni, 2000; Ulloa y Moller su tasa de germinacin aumenta luego
Jorgensen, 1995). Es tetraploide (2n = 32) y de la regurgitacin o defecacin de estos
se considera que se gener a travs de un animales (Mulligan y Munro, 1981).
proceso de alopoliploidizacin espontnea
(Pairon et al., 2008; Downey e Iezzoni, Se considera que P. serotina es
2000). Tiene flores blancas dispuestas en originaria de Norteamrica y que desde
racimos delgados, las cuales poseen cliz all se ha distribuido al resto del continente
lobulado semejante a un cono invertido americano desde el sur de Canad hasta
y cinco ptalos redondos. Los frutos son el sur de Bolivia (Fresnedo-Ramrez et al.,
drupas globosas, lampias, carnosas, de 2011; McVaugh, 1951; Popenoe y Pachano,
corteza fina, que poseen una semilla dura. 1922). De hecho, los registros histricos
Al inicio de su fase de maduracin, el fruto indican que el capul fue trasladado desde
es de color rojo oscuro; luego, adquiere una Mxico a diferentes lugares de Amrica
tonalidad negra rojiza (CONABIO, 2012; Latina luego de la conquista espaola (Mille,
Mille, 1942; Popenoe y Pachano, 1922). 1942). Sin embargo, los frutos de P. serotina
de Amrica del Norte son pequeos con un
Entre los polinizadores principales dimetro entre 6 a 10 mm, poco carnosos
de P. serotina se incluyen varias especies y carecen de valor comercial; mientras
12
Dmaris P. Intriago-Balden, Mara de Lourdes Torres, Venancio Arahana y Jos Tobar
EVALUACIN DE LA VARIABILIDAD GENTICA DEL CAPUL
(Prunus serotina subsp. capul) EN TRES PROVINCIAS DEL ECUADOR
que las variedades cultivadas en Amrica P. serotina tiene un potencial

Central y Sudamrica se caracterizan por econmico importante. Su madera se
producir frutos grandes con un dimetro caracteriza por su dureza, facilidad de
de entre 2 a 3.5 cm, carnosos y de agradable manejo, capacidad de adquirir un atractivo
sabor. Una hiptesis que explicara este pulimento y podra ser incorporada a la
hecho es que las variedades de capul industria maderera. El extracto etanlico
con frutos grandes fueron el resultado de del fruto posee propiedades antioxidantes
procesos de domesticacin y seleccin de y antimicrobianas por lo cual podra ser
individuos por tamao, sabor y calidad del empleado como aditivo para alimentos.
fruto (Downey e Iezzoni, 2000). P. serotina Adems, las infusiones elaboradas a base
tambin fue introducida en el continente de sus hojas y corteza tienen propiedades
europeo donde ha constituido una opcin medicinales (Jimnez et al., 2011; Mille,
viable para lograr la forestacin de zonas 1942; Popenoe y Pachano, 1922).
abiertas y el enriquecimiento del suelo
(Pairon et al., 2008; Auclair y Cottam, 1971). En el Ecuador no existen cultivos
comerciales de capul y solo crece en
En Ecuador, el capul est presente a jardines, parcelas familiares y en los bordes
lo largo del callejn interandino, entre los de carreteras. Tambin, se lo planta en los
1800 a 3400 m.s.n.m, desde la provincia bordes de terrenos donde cumple la funcin
del Carchi localizada cerca del lmite norte de cortina rompevientos. Los campesinos
hasta la provincia de Loja ubicada al sur. Se nativos de la regin interandina cosechan
concentra principalmente en las provincias los frutos de capul para consumo familiar
centrales desde Cotopaxi hasta Azuay y comercializacin a nivel local (diario El
(Mille, 1942). Comercio, 2012; Palacios, 2011; Downey
e Iezzoni, 2000; Popenoe y Pachano, 1922).
P. serotina tiene un ptimo crecimiento No existe investigacin sobre este frutal en
en suelos arenosos y de marga aluvial, el pas que permita aprovechar su potencial.
terrenos altamente arcillosos, laderas
secas y rocosas, y reas sueltas de arenas La determinacin de la diversidad
volcnicas. Estos sitios son comunes en gentica de P. serotina subsp. capul podra
las altiplanicies de la sierra ecuatoriana constituir el primer paso para conocer sobre
(Popenoe y Pachano, 1922). Adicionalmente, esta especie con un uso agrcola-econmico
el capul es intolerante a la sombra por potencial en el Ecuador y emprender
lo cual se desarrolla mejor en claros. Los programas de mejoramiento gentico
rboles de capul son entes dominantes que puedan generar variedades de capul
durante la sucesin secundaria ya que altamente rentables y competitivas a nivel
proliferan en terrenos donde recientemente comercial (Moose y Mumm, 2008; Budak
se han producido alteraciones o desastres et al., 2004).
naturales (CONABIO, 2012).
13
Los microsatlites o Short Tandem Materiales y mtodos

Repeats (SSR) son marcadores moleculares rea de estudio y recoleccin de
utilizados para realizar anlisis de muestras.- Se recolectaron muestras
diversidad gentica, identificacin de de hojas de P. serotina subsp. capul en
cultivares y ejecucin de programas de las provincias de Pichincha, Azuay y
seleccin asistida por marcadores (Wang Caar. Estas provincias forman parte del
et al., 2009). Los SSR se caracterizan por piso temperado o regin de los valles
ser abundantes en el genoma, altamente interandinos, que se extiende a lo largo de
polimrficos, reproducibles e informativos; la cordillera de Los Andes y se caracteriza
poseen herencia codominante y son fciles por una topografa irregular con amplios
de analizar mediante PCR (Reaccin en valles y hoyas separadas por nudos. Se
cadena de la Polimerasa) (Mondini et extiende entre los 1 800 a los 3 000 m.s.n.m.
al., 2009; Wang et al., 2009). A pesar de (Vargas, 2002; Guevara, 1979).
sus mltiples ventajas, el desarrollo de
primers SSR puede ser un proceso costoso En general, la temperatura promedio
y laborioso. Este involucra el escaneo en la regin oscila entre los 12 a los 18 C
de bibliotecas genmicas con sondas con un nivel de precipitacin entre los 500 a
marcadas y la secuenciacin de los clones los 2 000 mm. En la provincia de Pichincha,
hibridados con el fin de poder determinar las temperaturas oscilan entre 3 y 26 C; en
las secuencias de las regiones flanqueantes Azuay, entre 0 y 27 C; y en Caar, entre
del microsatlite. Sin embargo, es posible 3 y 23 C (INAMHI, 2013; Guevara, 1979).
transferir primers SSR entre especies
filogenticamente relacionadas dentro del En cada una de las provincias, se
mismo gnero o entre especies de diferentes identificaron reas donde haba presencia
gneros dentro de una misma familia de rboles de capul en base a la informacin
(Wang et al., 2009). Este hecho es altamente de campo obtenida de los pobladores de
beneficioso ya que reduce substancialmente cada lugar. Cabe recalcar que no existen
el tiempo y costos invertidos. Esto se ha cultivos agrcolas de capul sino grupos
comprobado en varios estudios previos de rboles dispersos dentro de las tres
realizados en distintas especies vegetales, provincias. De cada rea identificada, se
con inclusin de P. serotina (Mondini et al., tom al azar una muestra de un individuo
2009; Wang et al., 2009; Pairon et al., 2008). de capul. La distancia entre reas fue
de entre 3 a 5 km. En Pichincha, el rango
El presente estudio evala la variabilidad altitudinal de las zonas donde se colectaron
gentica de Prunus serotina subsp. capul en tres las muestras fue de 2 777 a 3 028 m.s.n.m;
provincias del territorio ecuatoriano, mediante en Azuay, de 2 252 a 2 700 m.s.n.m: y en
marcadores microsatlites heterlogos Caar de 2 440 y 3 181 m.s.n.m.
provenientes de especies emparentadas
filogenticamente con el capul.
14
A cada muestra se le asign un originalmente diseados para genomas de

cdigo especfico formado por el prefijo especies filogenticamente relacionadas
de la provincia de origen y el nmero de con P. serotina subsp. capul como el durazno
coleccin (e.g. PIC 001= Pichincha 001). (Prunus persica L. (Batsch)), la cereza dulce
Se tomaron datos como lugar, provincia, (sweet cherry-Prunus avium (L.) L.) y la
fecha de coleccin, altitud y coordenadas cereza agria (sour cherry-Prunus cerasus
geogrficas. Las muestras fueron L.) (Dirlewanger et al., 2002; Downey e
guardadas en fundas ziploc y rotuladas Iezzoni, 2000; Testolin et al., 2000). Los pares
apropiadamente. Durante la fase de campo, de primers que generaron productos de
las muestras se almacenaron dentro de amplificacin en capul fueron utilizados
un cooler con hielo para promover su para evaluar las 88 muestras.
preservacin a corto plazo. A su llegada al
laboratorio, las muestras de capul fueron Las reacciones de PCR tuvieron
trasladadas a un congelador a -20 C para un volumen final de 10 l y consistieron
su conservacin a largo plazo. En total, se en 2040 ng/l de ADN, buffer PCR 1X
colectaron 88 muestras de capul en las tres (Invitrogen), 1.5 mM de MgCl2 (Invitrogen),
provincias: 33 en Pichincha, 25 en Caar y 0.2 U de Taq polimerasa (Invitrogen),
30 en Azuay. 0.5 mM de dNTPs y 0.2 mM de cada
primer (F y R) (Downey e Iezzoni, 2000). El
Extraccin de ADN.- Se extrajo ADN programa de amplificacin se efectu en
a partir de las hojas de capul mediante un un termociclador T-Personal (Biometra)
protocolo basado en el detergente CTAB y consisti de una desnaturalizacin
(Kieleczawa, 2006). Luego de la extraccin, inicial de 95 C por 5 minutos, 35 ciclos de
se determin la concentracin y calidad desnaturalizacin a 94 C por 45 segundos,
del ADN mediante un espectrofotmetro annealing de 48-63 C (segn el primero)
NANODROP 1000 (Thermo Scientific) por 1 minuto, extensin de 45 segundos a
y electroforesis en geles de agarosa al 72 C y una extensin final de 8 minutos a
1 %. Previo a la ejecucin de los anlisis 72 C (Cipriani et al., 1999). Las secuencias
moleculares, se realizaron diluciones de las de cada uno de los pares de primers y sus
muestras stock de ADN hasta alcanzar una temperaturas de annealing se describen en
concentracin de 20 ng/l. la Tabla 1. Los productos de PCR fueron
resueltos en geles desnaturalizantes de
Amplificacin de ADN y poliacrilamida al 6 % y visualizados
electroforesis.- Se evalu la eficiencia de mediante tincin con nitrato de plata
transferibilidad de 12 pares de primers SSR (Benbouza et al., 2006).
15
Tabla 1
Primers SSR heterlogos seleccionados para evaluar la diversidad gentica en individuos de Prunus
serotina subsp. capul de Pichincha, Caar y Azuay
Cdigo del Primer Secuencia (5-3) Especie de origen Nmero de alelos* Temperatura de
y referencia annealing (C)
PceGA34 F:GAACATGTGGTGTGCTGGTT Cereza agria 10 60

(Downey e Iezzoni, 2000) R:TCCACTAGGAGGTGAAATG ("Sour Cherry")
PS12A02 F: GCCACCAATGGTTCTTC Cereza dulce 4 62
(Downey e Iezzoni, 2000) R:AGCACCAGATGCACCTGA ("Sweet Cherry")

pchpgms3 F:ACGCTATGTCCGTACCATCTCCATG Durazno 8 60
(Downey e Iezzoni, 2000) R:CAACCTGTGATTGCTCCTATTAAAC

pchgms2 F:GTCAATGAGTTCAGTGTCTACACTC Durazno 5 52
(Downey e Iezzoni, 2000) R:AATCATAACATCATTCAGCCACTGC
UDP98-410 F:AATTTACCTATCAGCCTCAAA Durazno 4 49
(Testolin et al., 2000) R:TTTATGCAGTTTACAGACCG

UDP96-001 F:AGTTTGATTTTCTGATGCATCC Durazno 7 56,3
(Testolin et al., 2000) R:TGCCATAAGGACCGGGATGT

BBPCT-017 F:TTA AGA GTT TGT GAT GGG AAC C Durazno 4 53,2
(Dirlewanger et al., 2002) R:AAG CAT AAT TTA GCA TAA CCA AGC
UDP98-416 F:TTT TCT CAG CAG CCA AAC AA Durazno 7 56
(Testolin et al., 2000) R:ATG TTT CGT GCT TCT GCT CC
*Este nmero se refiere a los alelos encontrados en este estudio
Anlisis de datos.- Los alelos de principales (PCoA) que permite ver la

los loci evaluados fueron visualizados dispersin de los individuos en un eje
como fragmentos de apariencia doble y de coordenadas. Adems, se emple el
documentados como (0) para ausencia y (1) programa ARLEQUIN (Schneider et al.,
para presencia. Se elabor una matriz binaria 1997) para calcular el ndice Fst que indica
con los datos moleculares de los individuos los niveles de diferenciacin gentica
de las tres provincias. Se emple el software entre los individuos de las tres provincias
NTSYS-pc 2.11 (Rohlf, 2008) para generar estudiadas. Finalmente, se utiliz el paquete
un dendrograma mediante matrices de estadstico GenAlEx 6.5 (Peakall y Smouse,
similitud y el mtodo UPGMA con el fin 2012) para realizar un anlisis de Mantel
de poder determinar agrupamientos entre que permite evaluar la correlacin entre la
individuos. Para el anlisis de Bootstrap, distancia geogrfica y la distancia gentica
se emple el programa WINBOOT (Yap y presente entre los individuos colectados.
Nelson, 1996) con el propsito de evaluar el
nivel de confiabilidad de los agrupamientos Resultados
mostrados por el dendrograma. El software Ocho de los doce (66.7 %) pares
DARwin 5.0.158 (Dissimilarity Analysis de primers SSR heterlogos probados
and Representation for Windows) (Perrier y mostraron amplificacin exitosa en los 88
Jacquemoud-Collet, 2006) fue utilizado individuos colectados.
para realizar un anlisis de coordenadas
16
En los 88 individuos, provenientes se agrupan de forma estricta de acuerdo

de las tres provincias, se encontr un total con su provincia de origen. De los 11 clsteres
de 49 alelos. El nmero de alelos por locus encontrados, solo dos incluyen individuos
oscil entre 4 y 10 y es el par de primers provenientes de una misma provincia.
PceGA34 proveniente de P. cerasus L., el El resto de clsteres estn formados por
ms informativo con 10 alelos y los pares de mezclas de individuos provenientes de dos
primers PS12A02, UDP98-410, y BBPCT-017, o tres provincias. El ndice de similitud es
provenientes de P. avium (L.) L. y P. persica de 0.694. Los valores de bootstrap indican
L. (Batsch), los menos informativos con que solo dos de los agrupamientos
cuatro alelos cada uno. El promedio de presentes en el dendrograma (uno formado
alelos para los ocho loci SSR fue de 6.13 por dos individuos de Pichincha y el otro
alelos por locus (Tabla 1). formado por dos individuos de Caar) son
confiables (>70 %) (Baldauf, 2003).
El dendrograma UPGMA de similitud
(Figura 1) muestra que los individuos no
1
2*
3
*
6
7
8
9
10
11
0,60 0,67 0,75 0,82 0,90

Coefficient
Figura 1. Dendrograma de similitud UPGMA que muestra el agrupamiento de los individuos de P.

serotina subsp. capul de Pichincha, Caar y Azuay. El coeficiente de similitud global aproximado fue
de 0.694. Se identificaron 11 grupos y las provincias que los conforman se detallan al lado derecho
del grfico. Se us el software NTSYS-pc 2.11. PIC = Pichincha, CAN = Caar, y AZU = Azuay.
*Agrupamientos con Bootstrap significativo.
17
El anlisis de coordenadas principales mayora de los individuos de Pichincha

(PCoA) (Figura 2) muestra una dispersin ocupan los cuadrantes superior e inferior
amplia de los individuos a lo largo de los derechos del grfico. Estos resultados
dos ejes (X: -0.25 a 0.25 y Y-:0.25 a 0.25). podran sugerir una posible diferenciacin
Se visualiza una tendencia de agrupacin de los individuos de las tres provincias en
de individuos provenientes de Caar y dos grupos de acuerdo con su distribucin
Azuay en los cuadrantes superior e inferior geogrfica norte-sur.
izquierdos del grfico, mientras que la
Figura 2. Anlisis de coordenadas principales (PCoA) que muestra el grado de dispersin de los
individuos de P. serotina subsp. capul provenientes de Pichincha (PIC), Caar (CAN), y Azuay (AZU)
en un eje de coordenadas XY. Se us el software DARwin 5.0.158.
18
Segn los parmetros de interpretacin En seis de los ocho pares de primers

propuestos por Balloux y Lugon-Moulin, SSR utilizados en este estudio (Tabla
(2002), los valores del ndice Fst de 1), el nmero de alelos es menor que el
diferenciacin gentica entre los individuos documentado para estos mismos seis
de las tres provincias ( = 0.05) indican pares de primers en tres estudios previos
que no existe un nivel significativo de que analizaron individuos de P. serotina, P.
diferenciacin gentica entre los capules prsica L. (Batsch) y P. persica var. nucipersica
de Caar y Azuay (Fst = 0.053, p = (Dippel). As, cuatro de los ocho pares de
0.144) mientras que hay un alto nivel de primers empleados en esta investigacin
diferenciacin gentica entre los capules fueron utilizados tambin por Downey e
de Pichincha y Caar (Fst = 0.218, p = 0.000) Iezzoni (2000) para evaluar 66 individuos
y un moderado nivel de diferenciacin de P. serotina provenientes del Estado de
gentica entre Pichincha y Azuay (Fst = Michigan (Estados Unidos) (6), Mxico (50),
0.081, p = 0.000). y Ecuador (10) y encontraron un nmero
mayor de alelos (primer PceGA34, 14 alelos;
Finalmente, el anlisis de Mantel primer PS12A02, 12 alelos; primer pchpgms3,
mostr una ausencia de correlacin (R2 = 19 alelos; y primer pchgms2, nueve alelos).
0.064, p = 0.001) entre las variables distancia Otros tres pares de primers fueron evaluados
geogrfica y distancia gentica de los tambin por Dirlewanger et al. (2002), en 27
capules provenientes de las tres provincias cultivares de P. persica L. (Batsch) originarias
estudiadas. de Estados Unidos (15), Francia (11) e Italia
(1) y en el caso del par de primers BBPCT-017
Discusin encontraron un mayor nmero de alelos (5).
Estudios previos han constatado la El par de primers UDP98-410 fue utilizado
alta eficiencia de transferibilidad de primers tambin por Testolin et al. (2000) para
SSR dentro de las especies del gnero evaluar 50 cultivares de importancia en
Prunus. Tambin se ha observado que el los mercados occidentales de P. persica L.
nivel de transferibilidad se reduce en cierta (Batsch) y P. persica var. nucipersica (Dippel),
proporcin si se emplean estos primers y encontraron ocho alelos. Solo dos pares de
para analizar especies pertenecientes a primers (UDP96-001 y UDP98-416) dieron
otros gneros dentro de la familia Rosaceae un nmero de alelos mayor en la presente
(Wang et al., 2012; Mnejja et al., 2010). El investigacin que en el estudio realizado por
grado de transferibilidad de los primers SSR Testolin et al. (2000). Para el primer UDP96-
heterlogos seleccionados para este estudio 001, ese estudio report seis alelos, mientras
(66.7 %) se acerca a los niveles registrados que para el primer UDP98-416 se reportaron
por investigaciones previas realizadas con cuatro alelos.
este mismo propsito dentro del gnero
Prunus (Wang et al., 2012; Mnejja et al., 2010; Esto podra indicar que el pool gentico
Downey e Iezzoni, 2000). de P. serotina en las tres provincias de la
19
sierra ecuatoriana posee una base gentica originarias de cuatro provincias de China.
ms estrecha que la reportada para otras Adems, Gao et al. (2004) analiz diecinueve
latitudes y especies. cultivares de P. mume Sieb. et. Succ.
provenientes de China y cinco originarios
La informacin allica obtenida de Japn. Finalmente, Zhebentyayeva
durante este estudio sugiere que existe un et al. (2003) evalu 74 accesiones de P.
grado moderado de variabilidad gentica armeniaca (Lam.) Koch provenientes de
en el capul en las tres provincias analizadas. cuatro regiones geogrficas: Europa (15),
Sin embargo, se requiere ampliar este la zona Irano-Caucsica (10), China (11)
estudio preliminar con inclusin de y Asia Central (32). Los autores de los
individuos de las otras provincias que estudios mencionados, concluyeron que
tambin conforman el callejn interandino los resultados obtenidos sugeran que
con el fin de adquirir una visin ms las progenies del mismo lugar provenan
acertada sobre la diversidad gentica de P. de diferentes progenitores y que habra
serotina en la sierra ecuatoriana. entrecruzamiento entre poblaciones.
El dendrograma de similitud UPGMA En esta investigacin se encontr

(Figura 1) no muestra una tendencia solo dos grupos con valores de bootstrap
general de agrupamiento de individuos superiores al 70 %, por lo cual la inclusin
por su lugar de origen. Solo dos clsteres de otros marcadores moleculares para
estn conformados por individuos de una analizar ms loci dentro del genoma
misma provincia. Este patrn tambin ha del capul podra contribuir a obtener
sido observado en estudios moleculares dendrogramas que posean un mayor
realizados en otras especies del gnero nmero de agrupamientos con altos valores
Prunus como P. mume Sieb. et. Succ. (conocido de confiabilidad (Koskinen et al., 2004).
como albaricoque japons o ciruela china),
P. armeniaca (Lam.) Koch (albaricoque) y P. En el anlisis de coordenadas
davidiana (Carr.) Franch (Cheng et al., 2011;principales (PCoA) (Figura 2), se observa
Gao et al., 2004; Zhebentyayeva et al., 2003),
una gradiente de diversidad con tendencia
en los cuales siguiendo una lgica similar a la formacin de dos grupos. Un grupo que
a la del presente estudio, se incluyeron incluye a individuos de Pichincha y otro
individuos procedentes de distintas con individuos de Caar y Azuay. Cabe
reas geogrficas que fueron analizados recalcar que estos no son grupos discretos
con primers SSR y no se pudo identificar ya que pocos individuos de Pichincha estn
agrupamientos por rea de origen. presentes en el grupo de Caar y Azuay,
mientras que algunos individuos de
Cheng et al. (2011) evalu 192 Caar y Azuay forman parte del grupo de
accesiones de P. davidiana (Carr.) Franch, Pichincha. Esto reflejara un cierto grado de
provenientes de siete poblaciones distintas, diferenciacin gentica entre la provincia
20
del norte (Pichincha) y las del sur (Caar dispersin de semillas de capul en la
y Azuay). Los valores Fst encontrados sierra ecuatoriana, se puede mencionar al
en este estudio respaldan este patrn de comercio regional de frutos de capul. Se ha
distribucin. El anlisis de Mantel no reportado que los campesinos de la regin
encontr una correlacin estadsticamente interandina recogen frutos de P. serotina que
significativa entre las distancias geogrficas crecen en sus parcelas o en campos abiertos
y genticas existentes entre los individuos y luego los llevan a los mercados. Adems,
de capul analizados. algunas personas conservan semillas de
individuos de capul que provienen de otras
Al interpretar los resultados obtenidos provincias y que producen frutos de buena
en este estudio, se puede sugerir un cierto calidad para sembrarlas en los jardines de
grado de diferenciacin gentica entre sus casas. Finalmente, los consumidores de
individuos pertenecientes a la provincia del esta fruta compran los frutos de P. serotina
norte (Pichincha) con los de las provincias provenientes de diferentes provincias y
del sur (Caar y Azuay). No obstante, la botan las semillas en distintos terrenos (J.
distancia geogrfica no es el factor que Tobar, comunicacin personal, 22 abril
explica la distancia gentica encontrada 2013; diario El Comercio, 2012; Downey
entre ambas zonas. Este anlisis tendra que e Iezzoni, 2000; Mille, 1942; Popenoe y
corroborarse con un estudio ms amplio Pachano, 1922).
que abarque individuos del capul del resto
de las provincias de la sierra ecuatoriana. Se requieren estudios ecolgicos,
datos econmicos y reportes antropolgicos
Las formas de dispersin de las sobre el uso y manejo del capul en la sierra
semillas de capul donde intervienen factores ecuatoriana para corroborar las ideas
biolgicos y antropognicos podran explicar propuestas en este estudio.
parcialmente los resultados obtenidos en
esta investigacin. Un factor biolgico a La informacin de este estudio
considerar es la dispersin de semillas de debera ampliarse al anlisis de individuos
P. serotina a travs de las aves o pequeos de P. serotina provenientes del resto de
mamferos. Esta dinmica ecolgica ya ha provincias del callejn interandino. De
sido descrita en investigaciones previas esta forma, se podra tener un panorama
realizadas en Amrica del Norte (Morden- completo acerca de la diversidad gentica
Moore y Willson, 1982; Mulligan y Munro, del capul en Ecuador. Los resultados
1981). Sin embargo, no hay estudios que de estas investigaciones podran
hayan documentado estas interacciones ser empleados posteriormente para
biolgicas en el Ecuador. determinar la factibilidad de programas de
mejoramiento gentico de este frutal que
Entre los factores antropognicos posee un interesante potencial agrcola y
que podran estar involucrados en la econmico para el pas.
21
CONCLUSIONES Agradecimientos
En esta investigacin, se comprob Esta investigacin fue financiada por
la eficiencia de amplificacin de regiones la IFS, International Foundation For Science
microsatlites en Prunus serotina subsp. (Suecia), y por la Universidad San Francisco
capul, con el empleo de primers SSR de Quito USFQ (Ecuador) (Chancellor Grant
provenientes de especies filogenticamente 2012). Agradecemos a Juan Jos Guadalupe
relacionadas con el capul. por su valioso apoyo y contribuciones
durante la ejecucin de este proyecto. A
Se encontr un nivel moderado de Bernardo Gutirrez y Jennifer Fiallos por
variabilidad gentica en las 88 muestras sus comentarios a este manuscrito.
de individuos de capul provenientes de
Pichincha, Caar y Azuay y un cierto Referencias Bibliogrficas
grado de diferenciacin gentica entre
los individuos de capul de la provincia Auclair A y Cottam G. 1971. Dynamics
del norte (Pichincha) y las provincias del of black cherry (Prunus serotina
sur (Caar y Azuay) los cuales no estn Erhr.) in Southern Wisconsin oak
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Factores biolgicos como la
dispersin de semillas entre provincias Baldauf SL. 2003. Phylogeny for the faint of
por medio de aves y pequeos mamferos heart: a tutorial. TRENDS in Genetics,
junto con factores antropognicos como la 19: 345-351.
movilizacin de semillas por el comercio
regional de frutos de capul y los sembros Balloux F y Lugon-Moulin N. 2002. The
espordicos de P. serotina en jardines de estimation of population differen-
casas y otros terrenos podran explicar los tiation with microsatellite markers.
resultados obtenidos. Molecular Ecology, 11: 155165.
Se requieren investigaciones acerca Benbouza H, Jacquemin J-M, Baudoin J-P

de la ecologa y dinmicas humanas que y Mergeai G. 2006. Optimization of
giran en torno al capul en Ecuador para a reliable, fast, cheap, and sensitive
poder corroborar las ideas propuestas en silver staining method to detect SSR
este estudio. markers in polyacrylamide gels.
Biotechnology, Agronomy, Society and
Un anlisis de diversidad gentica Environment, 2: 7781.
que abarque individuos de todas las
provincias de la sierra ecuatoriana Budak H, Bolek Y, Dokuyucu T y Akkaya
contribuira a entender mejor la distribucin A. 2004. Potential Uses of Molecular
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25
Estudio de gentica poblacional de Polylepis pauta y Polylepis sericea
en Pichincha mediante la utilizacin de marcadores moleculares SSRs
Rosa Andrade1, Mnica Jadn1 y Claudia Segovia-Salcedo1, 2

1
Grupo de Conservacin de Bosques de Polylepis. Facultad de Biotecnologa, ESPE,
Sangolqu, Ecuador roselena2007@hotmail.com

2
Deparment of Biology. University of Florida. Gainesville, Florida. EEUU
claudia@ufl.edu
RESUMEN.- Los bosques de Polylepis son centros de biodiversidad con alto impacto
antropognico. En nuestro pas no existen estudios de estructura gentica en el gnero,
informacin indispensable para su conservacin gentica. El presente estudio se centra
en dos especies con conflicto taxonmico: P. pauta y P. sericea en la provincia de Pichincha
(Yanacocha, Mojanda y Cayambe-Coca). En total se analizaron 142 individuos de las
tres poblaciones. El ADN se extrajo mediante el mtodo CTAB para luego amplificarlo
con cinco microsatlites diseados para este gnero. Se detectaron 18 alelos compartidos
entre las dos especies. El anlisis mediante Structure revel la existencia de dos grupos.
El primero conformado por Cayambe-Coca y Mojanda y el otro por Yanacocha. Los
valores de heterocigocidad observada (Ho) en Cayambe-Coca, Mojanda y Yanacocha
fueron de 0.576 y 0.299. Mientras que la esperada (He) fue de 0.605 y 0.524. La mayor
diferencia corresponde a Yanacocha y se puede atribuir a la seleccin a favor de un alelo
o endogamia. Mediante anlisis de diferenciacin se comprob que ambos grupos son
diferentes con p=0.00072 (=0.05). AMOVA mostr que la mayor variacin corresponde
a dentro de las poblaciones (88 %). El anlisis de agrupamiento detect dos grupos:
el primero conformado por Cayambe-Coca y Mojanda, y el segundo por Yanacocha.
Sin embargo, se detect un agrupamiento diferente para la subpoblacin Mojanda
1 (P. pauta x P. incana). No se encontr correlacin entre distancia gentica y distancia
geogrfica. En este estudio se pudo diferenciar a ambas especies molecularmente, por lo
cual se demuestra que los SSRs diseados fueron marcadores poderosos en anlisis de
diversidad, diferenciacin y estructura en este gnero.
PALABRAS CLAVES: conservacin, gentica poblacional, Polylepis, SSRs
27
ABSTRACT.- Polylepis forests are one of the most vulnerable centers of Andean diversity
that have been affected by anthropogenic impacts. In Ecuador there are no studies of
genetic structure in this genus, which is fundamental information for genetic conservation.
This study analyzed two species with taxonomic uncertainty, P. pauta and P. sericea,
in three populations: Yanacocha, Mojanda, and Cayambe-Coca National Park. Each
population consisted of three subpopulations with a total of 142 individuals. DNA was
extracted using the CTAB method and was amplified with 5 SSR primers designed for
this genus. Eighteen alleles were detected between the two species. Analysis for genetic
structure detected two groups. The first one contained the Cayambe-Coca and Mojanda
populations and Yanacocha was in the second group. The observed heterogeneity (Ho)
for the Cayambe-Coca and Mojanda population was 0.576, and 0.299 for the Yanacocha
population. In contrast, the expected heterogeneity (He) was 0.605 and 0.524 for the
populations in Cayambe-Coca and Mojanda and Yanacocha. The biggest difference
between these statistics was in the Yanacocha population. This could be attributable to
one allele selection or inbreeding. Through differentiation analysis it was probed that
both population established are different p=0.00072 (=0.05). The largest source of
variation corresponds to within populations differences (AMOVA). Clustering analysis
detected a significant clustering in a subpopulation from Mojanda (Moj1). This may
be due to a hybrid origin (P.pauta x P. incana) of this population. Correlation between
genetic and geographic distance was not detected. Through this study it was possible
to differentiate both species; therefore, SSRs were powerful markers to detect genetic
diversity, differentiation, and population structure in this genus.
KEYWORDS: conservation, Polylepis, population genetics, SSRs
INTRODUCCIN ms amenazados en el Neotrpico (Gareca

A nivel mundial durante el perodo de et al., 2013). Se estima que la tasa de
1990 al 2012, se han reportado las mayores deforestacin en el Ecuador es del 3 %
reducciones de reas de bosques en los anual; est dentro de los pases con el
trpicos en pases en vas de desarrollo porcentaje ms alto de deforestacin en
(White et al., 2007). Es ms, se estima que Latinoamrica, con prdidas entre 60 000 a
ms del 98 % del bosque primario en el 200 000 hectreas de bosques nativos, que
mundo se ha perdido debido a actividades son resultado de cortes ilegales, expansin
humanas en los ltimos 1000 aos. Los de los cultivos, presin por compaas
Andes no son la excepcin, en los cuales los mineras y petroleras (Mecham, 2001).
bosques de Polylepis entre los ecosistemas
28
Rosa Andrade, Mnica Jadn y Claudia Segovia-Salcedo
ESTUDIO DE GENTICA POBLACIONAL DE Polylepis pauta Y Polylepis sericea
EN PICHINCHA MEDIANTE LA UTILIZACIN DE MARCADORES MOLECULARES SSRs
La fragmentacin de estos bosques En este trabajo se pretende examinar

genera varios cambios, entre ellos la la estructura gentica de P. pauta y P.
alteracin de los patrones de flujo gnico, sericea, ambas especies con caractersticas
con aumento de la diferenciacin entre las morfolgicas similares (Segovia-Salcedo
poblaciones y por ende una disminucin et al., 2010; Romoleroux, 1996). Mediante
en el xito reproductivo de los individuos, este estudio ser posible diferenciarlas
debido a la endogamia (White et al., 2007; molecularmente con el propsito de
Fjeldsa y Kessler, 1996). En nuestro pas resolver el conflicto taxonmico de las
se han identificado 7 especies nativas mismas. Este es el primer trabajo realizado
pertenecientes al gnero Polylepis, entre las en este gnero con la utilizacin de los
cuales se encuentran P. weberbaueri, P. pauta, marcadores microsatlites diseados para
P. sericea, P. incana, P. microphylla, P. reticulata este grupo taxonmico, por lo cual los
y P. lanuginosa; las dos ltimas son endmicas resultados obtenidos son promisorios para
de nuestro pas (Romoleroux y Pitman, investigaciones futuras.
2004). Los bosques de Poylepis proveen
numerosos servicios ecolgicos que han sido MATERIALES Y MTODOS
subestimados durante siglos por una falta de Recoleccin y conservacin del mate-
conocimiento. Las hojas agrupadas al final de rial vegetal.- En la presente investigacin,
las ramas colectan agua de la neblina tpica de se utilizaron hojas frescas recolectadas en
los ecosistemas altoandinos. Su fuerte relacin las salidas de campo, as como muestras bo-
con musgos y lquenes ayudan a controlar el tnicas. Las hojas fueron colectadas en bol-
flujo del agua. Estos bosques proveen refugio sas plsticas e inmediatamente colocadas en
de cientos de plantas y animales muchos de neveras porttiles para evitar la oxidacin
ellos endmicos. A pesar de la importancia del material. Se recolectaron muestras de
de Polylepis, en los ecosistemas altoandinos tres poblaciones: Cayambe-Coca, Mojanda
no existen estudios suficientes sobre la y Yanacocha, con un total de 142 individuos
estructura gentica de sus especies (Gareca en la provincia de Pichincha. Cada poblacin
et al., 2013). Con la informacin obtenida en const de tres subpoblaciones, con un pro-
este estudio ser posible elaborar proyectos medio de 15.7 individuos por subpoblacin.
de restauracin y de reforestacin exitosos Ejemplares colectados en cada una de las
que contribuyan a un manejo adecuado y poblaciones se encuentran depositados en el
conservacin de los bosques de Polylepis en Herbario Nacional (QCNE) (Tabla 1).
el Ecuador.
29
Tabla 1
Descripcin de las muestras de Polylepis pauta y Polylepis sericea recolectados para el
presente estudio
Nmero de
Poblacin Especie Ubicacin Geogrfica (UTM) y elevacin Individuos
Colectados
Los individuos (rboles) en los (GPS), con los cuales se elaboraron mapas
muestreos fueron seleccionados al azar, de distribucin mediante el programa
adems se tom una distancia mnima MapSource 6.13.7 y GPS Visualizer 2012.
de 10 m entre individuos para asegurar Las poblaciones muestreadas corresponden
que se estaban recolectando individuos a tres sectores: Cayambe-Coca, Mojanda
diferentes. En todas las salidas de campo se y Yanacocha de la provincia de Pichincha
georeferenciaron los puntos de coleccin (Figura 1).
30
Figura 1. Gentica poblacional Polylepis pauta y Polylepis sericea en Pichincha mediante SSRs.
Mapa de distribucin de las muestras recolectadas de P. pauta y P. sericea. Reserva Cayambe Coca
(crculos rojos), Fundacin Conservacin Jocotoco, Yanacocha (crculos verdes), Mojanda (crculos
azules). Mapa elaborado mediante MapSource y GPS Visualizer.
La distancia en lnea recta entre las Extraccin y cuantificacin de

poblaciones de Yanacocha y Mojanda es ADN genmico.- La extraccin de ADN
de 44.4 km, la distancia entre Mojanda genmico en tejidos vegetales implica:
y Cayambe-Coca es de 47.9 km y entre remocin de las membranas que cubren
Cayambe-Coca y Yanacocha es de 51 km. el ADN, separacin del ADN de otros
Las poblaciones de Yanacocha se encuentran componentes celulares y el mantenimiento
en la cordillera Occidental, mientras que de la integridad del ADN durante el
las de Cayambe-Coca y de Mojanda se proceso. Para la extraccin de ADN se
encuentran en la cordillera Oriental. probaron 4 protocolos: Doyle y Doyle,
31
1987; Porebski et al., 1997; Khanuja et al., y calidad en estas muestras de Polylepis se
1999 y un protocolo modificado de CTAB. llev a cabo mediante el protocolo de CTAB
De acuerdo con los resultados obtenidos modificado (Figura 2).
la extraccin de ADN con mayor cantidad
Figura 2. Electroforesis en geles de agarosa al 0.8 % teido con Sybr Safe (0.035 ng/ml de gel) para la
verificacin de la calidad de ADN de las poblaciones de Polylepis. A) Cayambe Coca, B) Mojanda C)
Yanacocha. High: Marcador de alto peso molecular.
Para este protocolo, primero se tampn de extraccin. Al momento de

congelaron tanto los morteros como los la extraccin se aadi en el tampn de
pistilos a -20 C. Despus se coloc en extraccin (CTAB 2 %, EDTA 0.25 M, NaCl
ellos la muestra (5 g) y se la macer con 5 M y Tris-HCl 1 M (pH 8) los antioxidantes
nitrgeno lquido, hasta obtener una (PVP 2 % y 15 l -Mercaptoetanol). En cada
muestra pulverizada. Este macerado se microtubo de 2 ml se colocaron 800 l de
lo almacen en tubos Falcon de 15 ml en este tampn y fueron mezclados mediante
el congelador de -80 C hasta su posterior pistilos y con vrtex hasta obtener una
uso. Para la extraccin de ADN se pesaron solucin homognea. Luego, se colocaron
aproximadamente 200 mg del macerado 400 l ms de tampn hasta que se obtuvo
anterior en microtubos de 2 ml y se los una muestra completamente disuelta en el
mantuvo en nitrgeno hasta colocar el tampn de extraccin. A esta solucin se
32
la incub a 65 C durante una hora. Una INVITROGEN y con geles de agarosa al

vez enfriados los tubos, se aadieron en 0.8 % teidos con Sybr Safe (0.035 l/ml de
la sorbona 800 l de CIA (24:1). Despus, gel). En la corrida se incluyeron 2 l de un
se agit vigorosamente en el vrtex, hasta marcador de peso, High DNA Mass Ladder
obtener una emulsin blanquecina. A esta INVITROGEN, a un voltaje constante
emulsin se la centrifug a 14500 rpm por de 120 V por una hora. La visualizacin
10 minutos. Y se traspas el sobrenadante de esta corrida electrofortica se la realiz
a un tubo de 1.5 ml sin topar la interfase mediante un transiluminador de luz
presente. Luego, se aadieron 700 l de UV, VILBER LOURMAT TFX- 20.M y el
isopropanol a -20 C y se guardaron los almacenamiento se lo realiz en el equipo
tubos a -20 C durante 2 horas. En caso Bio-DocIT System.
de no visualizarse el precipitado de ADN
se incub por 1-2 horas ms en -20 C. Amplificacin de secuencias micro-
Despus, se centrifugaron los tubos por 15 satlites.- Los primers especficos para la
minutos a 14 500 rpm y el sobrenadante amplificacin de los microsatlites utiliza-
obtenido se lo descart. Luego, se realizaron dos en este estudio, fueron diseados en
dos lavados del precipitado con 300 l de el laboratorio de Sistemtica Molecular y
etanol al 70 % a -20 C. Una vez realizados Gentica Evolutiva de la Universidad de
estos dos lavados se realiz un lavado Florida a partir de una biblioteca genmica
final con 200 l de etanol puro. Todos los de P. racemosa (datos no publicados). Se
lavados se los realiz en un termobloque analizaron 32 primers para microsatlites.
a 300 rpm por 5 minutos, seguido de 3 Para la validacin de estos primers se pro-
min de centrifugacin rpida. Una vez cedi primero con una TD-PCR (Touchdown
concluidos los lavados se evaporaron los PCR), para verificar la amplificacin. Las
restos del alcohol presente, de preferencia condiciones de temperatura y de tiempo
esto se lo realiz en una sorbona por unos para la amplificacin fueron: 3 minutos a
30 minutos. Despus, se resuspendi este 94 C, 35 ciclos (30 segundos a 94 C, 45 se-
pellet, para incubarlo a 37 C con 100 l de gundos en (46, 48, 50 y 52 C), 30 segundos
tampn TE y 3 l de RNAasa por una hora o a 72 C), finalmente una extensin de 20
hasta que se observ la completa disolucin minutos a 72 C. El volumen de reaccin fi-
del mismo. Una vez disuelto el ADN se lo nal fue de 10 l, mediante concentraciones
almacen durante una media hora a 4 C y 1X Tampn, 1.5 mM MgCl2, 0.05 mM de
despus se realizaron alcuotas a 20 ng/l. dNTPs, 0.45 M de primer Forward, 0,45
Estas alcuotas se almacenaron a 4 C y el M de primer Reverse, 1.8 U/l de Taq
resto en el congelador de -80 C. polimerasa y para completar la reaccin
6.24 l de agua PCR.
La calidad y cantidad de ADN
extrado se la evalu mediante fluorometra Se utilizaron cinco sets de primers:
con el uso de Quant-iT dsDNA BR Assay, 2F-2Ra, 2F-2Rb, 13F-13R, 17F-17Ra y
33
20F-20R (Tabla 2), que fueron seleccionados El primer paso fue la bsqueda de
por brindar los datos ms polimrficos en controles positivos adecuados en base
cada poblacin. a los alelos presentes en la poblacin.
Tabla 2
Sets de Primers empleados con su respectiva secuencia
Primer Secuencia del primer T alineamiento
Despus con estos controles se realizaron hora. Los geles fueron visualizados bajo luz
dupletas de todas las muestras. En UV y se fotodocumentaron para seleccionar
todas las validaciones se incluyeron los mejores patrones de los alelos en las
controles negativos y el marcador de peso poblaciones de estudio.
molecular Track-It 100 bp DNA Ladder de
INVITROGEN. Los productos de PCR Anlisis de datos.- Los datos fueron
fueron visualizados mediante electroforesis registrados en una matriz de Microsoft
en geles de agarosa al 3 % a 100 V por una Office Excel 2007, en base al ingreso de
34
informacin de marcadores codominantes vez analizados los valores de He y Ho, para

exigido por GenAlEx v6.4. En el presente cada una de las poblaciones, se realiz la
estudio se analizaron la diversidad, prueba de X2 con el objetivo de probar si los
diferenciacin y estructura gentica para genotipos observados son consistentes con
cada grupo de muestras con los 5 sets de los esperados bajo apareamiento al azar
primers microsatlites seleccionados. con =0.05 %.
La asignacin de los individuos a La diferenciacin gentica se la

grupos, se la realiz mediante Structure calcul mediante la comparacin de pares
v6.4 (Pritchard et al., 2000), si se toma en de poblaciones, a travs de la estadstica
cuenta el modelo de admixture junto con F de Wrights. Este anlisis se lo realiz en
frecuencias correlacionadas como lo sugieren Arlequin 3.5, ya que este programa permite
Falush et al., 2007 en casos de una sutil es- evaluar la hiptesis nula mediante los
tructura poblacional. Se determinaron va- valores p. Para ello se utiliz la funcin de
lores de burning lenght de 10 000 y un lar- Compute Pairwise Differences mediante
go de cadena de 100 000 con un valor de la opcin de Compute a distance matrix.
=0.0607. Luego se defini al valor K segn Despus se realiz el anlisis de varianza
la tcnica de Evanno et al., 2005, con lo cual molecular (AMOVA), para conocer en
se obtuvo una probabilidad de la existencia donde se encuentra la mayor variabilidad.
de tres poblaciones. Con este valor, se cal- La matriz de distancia gentica se la elabor
cul Q (proporcin de cada individuo en k mediante GenAlEx v6.4 a travs de la opcin
poblaciones) y estos datos se transfirieron de Codom Genotypic, que proporciona una
a Distruct para su visualizacin y posterior matriz de distancias genticas individuo
anlisis. por individuo (NxN) (Peakall y Smouse,
2006). Una vez elaborada la matriz de
Una vez establecido el nmero de distancia gentica se procedi a calcular la
poblaciones de acuerdo con la estructura distancia gentica de Nei.
gentica, se prosigui con los anlisis
de diversidad y diferenciacin gentica. Los anlisis de agrupamiento se los
Se calcularon frecuencia de alelos, realiz mediante el programa Mega v5.0
heterocigosidad esperada y observada (He- de Tamura et al., 2011. Se especific el tipo
Ho), coeficiente de endogamia, equilibrio de de dato DataType=distance y la forma
Hardy-Weinberg, distancia gentica de Nei de la matriz triangular de las distancias
y anlisis de agrupamientos. Los valores de genticas DataFormat=lowerleft. Para
He y Ho se los obtuvo a partir de la inferencia determinar si exista o no correlacin entre
del equilibrio de Hardy-Weinberg mediante la composicin gentica y la localizacin
el programa ARLEQUIN 3.5 con 1 000 000 geogrfica se aplic el test de Mantel. Para
de iteraciones para la cadena de Markov y ello se utilizaron los datos obtenidos del
con 1 000 pasos de dememorization. Una GPS y la matriz de distancia gentica de
35
Nei elaborada mediante GenAlEx v6.4. RESULTADOS

Las distancias geogrficas se las realiz Mediante anlisis en Structure v6.4, se
con log (1+x), esto para poder visualizar pudo determinar una estructura gentica
mejor la correlacin entre ambas matrices. de dos poblaciones. Los resultados indican
La relacin entre ambas matrices para el que tanto las poblaciones de Cayambe-
test de Mantel se la elabor con XLSTAT Coca como las de Mojanda comparten un
2012, mediante la opcin de pruebas de mismo patrn, mientras que la poblacin
correlacin/asociacin. de Yanacocha muestra otro (Figura 3).
ca ha a
eCo oc nd
mb na
c oja
ya Ya M
Ca
Figura 3. Representacin de Q mediante grfico de barras en Distruct. Cada individuo se representa

en una lnea vertical, divida en los tres conglomerados definidos. La poblacin Cayambe-Coca es
prpura, Mojanda es verde y Yanacocha es azulado.
En la Figura 4 se muestran los 18 alelos para los 142 individuos con los 5 loci.
registrados con sus respectivas frecuencias
Frecuencia de alelos
Frecuencia
Locus
Figura 4. Frecuencia de alelos en los cinco loci para las tres poblaciones. A=Cayambe-Coca y Mojanda,
B=Yanacocha.
36
Los valores obtenidos de heterocigo- mayor diferencia entre He y Ho se da en

sidad esperada (He), heterocigosidad obser- la poblacin de Yanacocha. Igualmente, la
vada (Ho) e ndices de fijacin para las tres mayor diferencia en el ndice de fijacin es
poblaciones se resumen en la Tabla 3. atribuible a Yanacocha, lo cual indica que
existe la probabilidad de endogamia en
Los resultados muestran que la esta poblacin.
Tabla 3
Valores de Heterocigosidad observada (Ho), Heterocigosidad esperada (He) e ndice de fijacin (F) para
las dos poblaciones
Poblacin Ho He F
El anlisis de diferenciacin FST en poblaciones son significativamente diferentes

los pares de poblaciones a travs de valores (p=0.00072). El anlisis de AMOVA mostr
p, con 100 000 permutaciones y un nivel de que la mayor variacin se atribuye a nivel
significancia (=0,05) mostr que las dos individual con casi el 90 % (Tabla 4).
Tabla 4
Anlisis de varianza molecular (AMOVA). Considerando 2 poblaciones (Yanacocha y Cayambe Coca-
Mojanda) y 3 subpoblaciones por poblacin
Fuente de Grado de Suma de

Varianza % de variacin
variacin libertad cuadrados
37
El dendograma mediante UPGMA otro extremo a Yanacocha. Sin embargo, se

(elaborado con el uso de la distancia gentica muestra separada la subpoblacin Mojanda
de Nei), mostr dos grupos principales: 1 (Figura 5).
primero Cayambe-Coca, Mojanda y en
Figura 5. Dendograma derivado de anlisis de 5 SSR polimrficos mediante UPGMA, basado en la

distancia gentica de Nei.
Esta poblacin, debido a indicios de Mantel. El valor calculado en esta prueba es

variaciones morfolgicas ha sido reportadamayor que el nivel de significancia =0.05
ya como hbrida (P. pauta x P. incana) (0.233), por lo tanto no se puede rechazar
(Romoleroux, 1996). la hiptesis nula. Es decir, que no existe
correlacin entre la matriz de distancia
Tambin dentro de los anlisis de gentica de Nei y la de distancia geogrfica,
estructura gentica se incluy el Test de donde R2= 0.0199 (Figura 6).
Figura 6. Representacin grfica del test de Mantel, distancia geogrfica versus distancia gentica de Nei.
38
DISCUSIN mediante pistilos), precipitacin mediante

Al ser esta una primera investigacin isopropanol y los lavados con etanol, por lo
en el gnero Polylepis con microsatlites, cual se sugiere que en ensayos con muchos
los resultados son bastante promisorios. individuos ( 100), se use este protocolo ya
Los resultados indican que Cayambe-Coca que es una forma rpida y econmica de
y Mojanda (a excepcin de Mojanda 1) extraer ADN de alta concentracin a partir
corresponderan a una poblacin, de acuerdo de material vegetal fresco.
con estudios previos taxonmicos y revisin
de muestras de herbario, pertenecen a la En este gnero se ha reportado el uso
especie P. pauta, mientras que la poblacin de de marcadores del tipo ITS y marcadores
Yanacocha correspondera a otra (P. sericea). cloroplastdicos (Kerr, 2004), AFLPs
Por lo cual el objetivo principal de poder (Hensen et al., 2011; Schmidt-Lebuhn et al.,
discriminar dos especies morfolgicamente 2006), RAPD e ISSR (Julio et al., 2008; Ochoa
ambiguas, se cumpli a cabalidad. et al., 2008) y marcadores bioqumicos
como las aloenzimas (Aragundi et al.,
En cuanto a la metodologa empleada, 2011). Este es el primer estudio en Polylepis
en primer lugar, el mtodo de extraccin en el cual se utilizan microsatlites para
de ADN descrito fue apropiado para la estudios de diversidad gentica y estructura
amplificacin de secuencias microsatlites. poblacional. Al trabajar con un marcador
En este gnero se han reportado varios de tipo codominante, se tiene la ventaja
mtodos de extraccin de ADN mediante de poder usar menos microsatlites; se
kits comerciales (Julio et al., 2011; Schmidt- conoce que para tener inferencias similares,
Lebuhn et al., 2006; Kerr, 2004). Adems, en se debe emplear al menos cuatro veces
el 2011, Hensen et al. reportan un protocolo ms individuos por locus en un marcador
de extraccin en base a CTAB modificado dominante que con un codominante. Es
para el estudio de AFLPs. El presente trabajo ms, cuando las tasas de migracin son
prob todos estos mtodos; sin embargo, altas y la heterogeneidad en el genoma
dado el nmero de muestras a tratarse y es baja, se sugiere incluso el uso de 10
la cantidad de reactivos a emplear, se opt veces ms individuos por locus (Lynch
por utilizar el protocolo de CTAB al 2 % con y Milligan, 1994). Por lo tanto, el uso de
las modificaciones descritas en materiales y SSRs en Polylepis puede brindar estimados
mtodos. Este protocolo mostr los mejores genticos similares con menor nmero
resultados tanto en calidad como en costo. de secuencias. Los cinco sets de primers
Las altas concentraciones de ADN obtenidas aqu utilizados (2F-2Ra, 2F-2Rb, 13F-13R,
mediante este protocolo se atribuyen a 17F-17Ra y 20F-20R) fueron seleccionados
varios factores como: alta concentracin de de acuerdo con el nmero de productos
antioxidantes (PVP y -mercaptoetanol), amplificados, calidad en los perfiles de
amplia superficie de contacto entre la amplificacin, nivel de polimorfismo
muestra y tampn de extraccin (mezcla y reproducibilidad. Sin embargo, es
39
importante notar que este es un ensayo mutaciones de un solo nucletido o eventos

piloto. Se logra diferenciar estas dos de insercin o deleccin, que generan los
especies, pero estimaciones genticas ms polimorfismos detectables mediante otros
finas debern realizarse con un mayor marcadores como los AFLPs (dominantes)
nmero de muestras y ms secuencias (Powell et al., 1996).
microsatlites.
La diversidad gentica presente
En el presente estudio se detect que dentro y entre las poblaciones surge, de un
solamente las poblaciones de Yanacocha balance entre la deriva gnica, la endogamia,
presentaron una diferencia significativa la recombinacin, el flujo gnico, la
entre la heterocigosidad observada y mutacin y la seleccin. Este balance es
esperada. Segn el equilibrio de Hardy- afectado tanto por factores naturales como
Weinberg, se espera una mayor cantidad antropognicos (Loveless y Hamrick,
de heterocigotos de los observados. Este 1984). En el presente estudio, luego de
dficit de heterocigotos se puede explicar calcular las heterocigosidades observada
por la seleccin a favor o en contra de un y esperada dentro de las poblaciones de
alelo, mediante la endogamia o por la falla Yanacocha (Ho=0.3, He=0.52), Cayambe-
de amplificacin (Selkoe y Toonen, 2006; Coca, Mojanda (Ho=0.58, He=0.61) se
Nybom, 2004). En las poblaciones de P. determin que la mayor diferencia en base
sericea de la localidad Yanacocha, se detect a X2 corresponde a Yanacocha.
una heterocigosidad observada de 0.3. Este
valor es cercano al reportado por Julio Por lo tanto, se puede considerar
et al., 2008 (Ho=0.258), en donde explica que las poblaciones de Cayambe-Coca y
que este dato es comn en plantas con Mojanda tienen un comportamiento de
caractersticas similares de vida a Polylepis
reproduccin al azar, mientras que las
(polinizacin cruzada, anemfilas y un poblaciones de Yanacocha no lo tienen. En
alto nmero de cromosomas). En el caso la presente investigacin se observ que
de la heterocigosidad esperada se detect la poblacin de Yanacocha se limita un
el valor de 0.576 en la poblacin Cayambe-solo bosque continuo. Por el contrario, las
Coca, Mojanda. Este valor discrepa con lospoblaciones de Mojanda y Cayambe-Coca
estudios de Hensen et al. 2011 realizado tienen una mayor rea geogrfica, que a
mediante AFLPs en especies ecuatorianas pesar de mostrar fragmentacin de hbitat,
de P. pauta (He = 0.164-0.273). puede darse flujo gnico entre sus diversos
parches. Por lo tanto, la falta de variabilidad
Estas diferencias se pueden deber al de Yanacocha se puede atribuir a un proceso
tipo de marcador molecular empleado. En de endogamia dentro de esta poblacin.
los SSR (codominante) se espera un valor Es necesario evaluar en otras regiones del
mayor de diversidad ya que los errores en pas, la gentica de P. sericea para plantear
la replicacin son ms frecuentes que las acciones de conservacin en esta especie.
40
Los valores de diferenciacin gentica ha sido reportado tambin por Aragundi

reportados en el presente estudio se et al., (2011) en poblaciones de P. pauta, en
obtuvieron mediante Fst calculados a partir estudios de P. australis por Hensen et al.,
de AMOVA, prueba con la cual se obtiene (2011) y en estudios mediante AFLPs en P.
una matriz de distancias euclideanas. besseri (Gareca et al., 2013).
Esta medida es la ms apropiada para
determinar la influencia de los procesos El anlisis de agrupamiento mediante
demogrficos como deriva gentica UPGMA, muestra dos poblaciones. Estn
y migracin en la estructura gentica claramente diferenciadas las poblaciones
poblacional (Meirmans y Hedrick, 2011). Cayambe-Coca y Mojanda de Yanacocha.
Sin embargo, es importante considerar que Adems, se logra observar que Mojanda
las tasas de migracin calculadas mediante 1 (poblacin hbrida) se agrupa en otro
Fst, presentan problemas de equilibrio. conjunto. Los resultados de este anlisis
Esto se debe al modelo usado (isla), que permiten considerar a los individuos
implica supuestos tales como: migracin no exclusivos de Yanacocha como P. sericea.
espacial, tamaos de poblaciones iguales y En cambio, a P. pauta como exclusivo de
ausencia de seleccin. En este trabajo las Cayambe-Coca y Mojanda. Sin embargo,
dos poblaciones descritas (Cayambe-Coca se necesita extender esta investigacin a
y Mojanda, Yanacocha) son diferentes entre poblaciones ms distantes en el Ecuador,
s. Cayambe-Coca, Mojanda y Yanacocha, para confirmar estos resultados.
se encuentran en lados diferentes de la
Coordillera de Los Andes lo cual evitara En este estudio no se detect correlacin
el flujo gnico a travs de polen entre ellas. entre distancia gentica y distancia geogrfica,
lo cual sugiere que las poblaciones de estudio
La mayor variabilidad detectada se (Cayambe-Coca, Yanacocha y Mojanda) no
atribuy a los individuos dentro de cada se conforman con un patrn de aislamiento
una de las poblaciones (cerca 90 %) de por distancia. Estos resultados son comunes
toda la variacin. Una alta variabilidad en el gnero Polylepis, donde individuos de
en los individuos es consistente con una diferentes poblaciones tienen mayor similitud
fragmentacin reciente de hbitat que que los individuos en la misma poblacin
adems es comn en especies ampliamente (Aragundi et al., 2011; Ochoa et al., 2008).
dispersas, perennes, con polinizacin Los resultados en este estudio indican que al
cruzada, anemfilas y un alto nmero menos en las poblaciones estudiadas no existe
de cromosomas (Hamrick et al., 1979). evidencia de aislamiento por distancia, lo cual
Por lo cual se podra hipotetizar que la se explica por un alto flujo gnico entre las
visualizacin en parches de estos bosques poblaciones. En especial, en las poblaciones
no es su estado natural, sino ms bien de Cayambe-Coca y Mojanda. Finalmente, al
a efectos de tipo antropognico. Este analizar los resultados de esta investigacin
porcentaje de variabilidad en los individuos se puede concluir que los marcadores
41
moleculares SSRs fueron tiles para detectar Los anlisis de diversidad gentica
diversidad, diferenciacin y estructura gnica muestran que las poblaciones de Cayambe-
en el gnero Polylepis. Se determin que las Coca y Mojanda tienen un comportamiento
muestras del Parque Nacional Cayambe- de reproduccin al azar, as como una poca
Coca y Mojanda son consistentes con una sola diferenciacin gentica. Por el contrario, las
especie: P. pauta. Mientras que las muestras poblaciones de Yanacocha no presentaron
de Yanacocha pertenecen a P. sericea. Sin este tipo de reproduccin. Para poder
embargo, se necesitan estudios ms amplios conocer el impacto de la fragmentacin
para poder realizar planes de restauracin y y degradacin del hbitat en este gnero,
conservacin en estos bosques. se sugiere comparar las diferentes
subpoblaciones dentro de bosques continuos
CONCLUSIONES y remanentes de Polylepis con rboles de
El mtodo de extraccin empleado diferentes edades para poder caracterizar
(CTAB al 2 % modificado) fue ptimo para directamente la paternidad, patrones de
la extraccin de ADN de Polylepis, ya que cruces y eventos de flujo gnico.
permiti la obtencin de una concentracin
de ADN superior a 50 ng/l. Es importante Finalmente, los microsatlites SSRs
mencionar que la extraccin debe realizarse fueron tiles para anlisis previos de
en muestra fresca y recin colectada debido diversidad, diferenciacin y estructura
a que las muestras tienden a oxidarse gnica en el gnero Polylepis, ya que se
fcilmente, por lo cual, mantener la cadena pudo determinar dos grupos altamente
de fro hasta la incubacin de las muestras diferenciados. El primero conformado
es muy importante. por las poblaciones de Cayambe-Coca y
Mojanda, donde se considera a la especie
Se lograron seleccionar 5 sets de P. pauta como individuos exclusivos y el
primers para microsatlites a partir de segundo por las poblaciones de Yanacocha
tcnicas de PCR tales como TD-PCR y con P. sericea. Se recomienda correlacionar
PCR en gradiente, los cuales brindaron los anlisis genticos aqu reportados con los
gran cantidad de informacin, buena citogenticos en las poblaciones analizadas,
calidad de datos y disminucin de para afinar los resultados de diversidad
errores de puntuacin para los anlisis de obtenidos. Tambin sera adecuado
diversidad, diferenciacin y estructura para extender el estudio con otras especies
las poblaciones de Polylepis reportadas. dentro del gnero de Polylepis y otros
Se sugiere que se incluyan, en futuros marcadores codominantes para realizar
estudios, ensayos de secuenciacin para anlisis de filogenia y de filogeografa ms
poder verificar los resultados obtenidos, completos de este gnero.
as como comprobar la ausencia de efectos
homoplsicos.
42
AGRADECIMIENTOS using multilocus genotype data:

Un agradecimiento a los laboratorios dominant markers and null alleles.
de Biotecnologa vegetal y Cultivo de Tejidos Molecular Ecology Notes, 7: 574578
de la Carrera de Ingeniera en Biotecnologa
y a los profesionales colaboradores: Dra. Fjeldsa J y Kessler M. 1996. Conserving
Karina Proao e Ing. Paola Prraga (Escuela the biological diversity of Polylepis
Politcnica del Ejrcito - Departamento woodlands of the highland of Peru and
de Ciencias de la Vida). As mismo un Bolivia. A Contribution to Sustainable
agradecimiento al Ministerio del Ambiente, Natural Resource Management in the
Direccin Nacional de Pichincha, por Andes. Nordeco. Dinamarca.
el permiso de investigacin otorgado
para el Parque Nacional Cayambe-Coca Gareca E, Breyne P, Vandepitte K, Chaill
(N 048-2011-IC-FLO-DPAP-MA) y a la J, Fernandez M y Honnay O. 2013.
Fundacin Jocotoco por la autorizacin para Genetic diversity of Andean Polylepis
colectar muestras en su reserva Yanacocha. (Rosaceae) woodlands and inferences
regarding their fragmentation
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45
Estructuracin gentica de muestras del hongo
Batrachochytrium dendrobatidis en Ecuador
Mara del Carmen Vizcano1, Charles W. Barnes2 y Mara Eugenia Ordez1

1
Escuela de Ciencias Biolgicas, Pontificia Universidad Catlica del Ecuador, Quito
2
Centro de Investigacin de la Biodiversidad y Cambio Climtico, Universidad Tecnolgica Indoamrica, Quito.
meordonez@puce.edu.ec
RESUMEN.- El hongo Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), causante de la quitridiomico-

sis, ha ocasionado severos impactos en las poblaciones de anfibios a nivel mundial. El
objetivo de la presente investigacin fue estudiar la variabilidad gentica de muestras del
hongo tomadas de hospederos de diferentes localidades en el Ecuador, para determinar si
Bd ha sido introducido recin o si es nativo en el Ecuador. Se analiz la regin ITS1-5.8S-
ITS2 de ADN ribosomal (ADNr) del hongo. Se identificaron 11 haplotipos en el Ecuador,
de los cuales 6 fueron nicos para el pas; lo cual sugiere que estos podran ser endmicos.
Los anlisis de diversidad gentica indican que existe poca variabilidad gentica en las
muestras de Bd analizadas. Esto sugiere una introduccin reciente del patgeno al Ecua-
dor. A pesar que no se observ un patrn de diferenciacin geogrfico o de hospedero
entre los diferentes haplotipos, la diversidad de haplotipos encontrada sugiere que pudo
haber mltiples eventos de introduccin del hongo al pas, relativamente recientes.
PALABRAS CLAVES: Batrachochytrium dendrobatidis, diversidad gentica, quitridiomi-

cosis, regin ITS ADNr
ABSTRACT.- The chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), which causes

chytridiomycosis, has contributed to the decline of amphibian populations worldwide.
The objective of this research was to study the genetic variability of this fungus from
samples from different localities to determine if Bd has been recently introduced or is
native to Ecuador. We analyzed the ITS1-5.8S-ITS2 ribosomal DNA (rDNA) of the fungus.
Eleven haplotypes were found for Ecuador; of which six were unique to the country,
suggesting that they may be endemic. Analyses of genetic diversity indicate that there
was little genetic variability in the Bd samples analyzed, which would suggest a recent
introduction of the pathogen. However, while there was no geographic pattern of
47
differentiation or host association between haplotypes, the diversity found suggests that
there may have been multiple independent introductions of the fungus into the country,
but relatively recently.
KEYWORDS: Batrachochytrium dendrobatidis, chytridiomycosis, genetic diversity, ITS

region rDNA
INTRODUCCIN dinmica patgeno-hospedero (Rachowicz

La quitridiomicosis, causada por el et al., 2006). Sin embargo, Goka et al. (2009)
hongo Batrachochytrium dendrobatidis (Bd) basados en secuencias de la regin ITS
(Longcore et al., 1999), ha sido catalogada del ADN ribosomal, sugieren que una
como la enfermedad emergente ms combinacin de ambas hiptesis estara
devastadora en los anfibios a nivel mundial explicando la pandemia actual del hongo.
(Morgan et al., 2007). Fue identificado por
primera vez en 1998 y descrito en 1999 y Estudios de diversidad gentica en
confirm la hiptesis que un patgeno era muestras de Bd procedentes de Amrica del
el causante de muertes masivas de anfibios Norte, frica y Australia, han encontrado
en Australia, Estados Unidos, Costa Rica niveles extremadamente bajos de diferencias
y Panam (Collins y Crump, 2009; James en las secuencias de ADN nuclear y
et al., 2009; Longcore et al., 1999). Hasta el mitocondrial entre cepas del hongo (James
momento se han reportado 350 especies et al., 2009; Morehouse et al., 2003). Esta poca
infectadas por este hongo, de las cuales 200 diferenciacin gentica sugiere que las cepas
han declinado o se han extinguido por esta de distintos continentes tienen un reciente
causa, incluso en lugares remotos y prstinos ancestro comn y no han evolucionado
(Skerratt et al., 2007; Fisher et al., 2009). separadamente por mucho tiempo
(Whittaker y Vredenburg, 2010). Los datos
Se han planteado dos hiptesis sobre moleculares existentes hasta el momento
el origen de Bd. La primera, conocida sugieren un nico origen de Bd con evidencia
como hiptesis del patgeno nuevo o de de dispersiones locales e internacionales,
la dispersin del patgeno, sugiere que que apoyan la hiptesis del patgeno
este es de aparicin reciente en los sitios nuevo. Los descubrimientos de que Bd es
vulnerables (Berger et al., 1999). La segunda, un organismo diploide, de baja diversidad
la hiptesis del patgeno endmico, gentica y alta heterocigosidad, sugieren que
sugiere que este ha estado presente con la globalizacin de este linaje es producto
su hospedero, ya sea como comensal o del apareamiento entre cepas parentales no
simbionte y se ha vuelto virulento debido idnticas, pero cercanamente relacionadas y
a cambios ambientales que afectan la heterotlicas (Fisher et al., 2009).
48
Mara del Carmen Vizcano, Charles W. Barnes y Mara Eugenia Ordez
ESTRUCTURACIN GENTICA DE MUESTRAS DEL HONGO Batrachochytrium dendrobatidis EN ECUADOR
Ecuador es uno de los pases con mayor analizadas, mientras que si este patgeno
diversidad de anfibios a nivel mundial, lleva un largo perodo en el Ecuador, la
con 535 especies registradas, de las cuales variabilidad gentica y la diferenciacin
42 % son endmicas (Ron et al., 2013). Sin seran altas debido a una mayor asociacin
embargo, tambin es uno de los pases con evolutiva con el rea (Morgan et al., 2007).
mayor nmero de especies amenazadas,
pues alcanza un 31.3 % (Ron et al., 2013). MATERIALES Y MTODOS
Estudios previos sobre Bd en Ecuador se Muestras de B. dendrobatidis.- Se
han limitado a determinar su presencia y es analizaron un total de 62 muestras de ADN
muy poco lo que se conoce sobre su origen de Bd que representan 11 provincias del
o mecanismos de transmisin. El objetivo pas; de estas, 46 muestras son procedentes
del presente estudio fue determinar la de anfibios infectados de 16 localidades
variabilidad gentica de la regin ITS1- del Ecuador, entre el 2008 y 2009, que se
5.8S-ITS2 de ADN ribosomal (ADNr) de encontraban almacenadas a -20 C en el
muestras del hongo tomadas de hospederos Laboratorio de Biologa Molecular del
de diferentes localidades en el Ecuador, Museo de Zoologa QCAZ de la Pontificia
para indicar si Bd ha sido introducido Universidad Catlica del Ecuador (Tabla 1);
recin o si es nativo en el Ecuador. Si Bd y 16 provienen de dos estudios realizados
ha sido introducido recin se esperara por Manzano (2010) y Senz (2011). La
obtener una baja diversidad gentica y distribucin de las muestras analizadas se
poca diferenciacin en las poblaciones encuentra en la Figura 1.
Localidades Bd
Durango
Elevacin Cuellaje
0 1200 Reserva Siempre Verde
1200 2400 Reserva Maquipucuna
2400 3600 La Virgen
Parque Metropolitano
3600 4800 Cuendina
Papallacta
4800 6000 Ro Pita
Cordillera Guacamayos
Sigchos
Parque Nacional Yasun
Yambo
Yanayacu
Palmira
Figura 1. Mapa de distribucin

de las muestras ecuatorianas
de Batrachochytrium den-
El Cajas
Chaucha Cuenca Ro Napinaza
drobatidis analizadas. Los Tarqui
Girn
crculos morados indican
las localidades muestrea-
das en el presente estudio;
N
los azules, las localidades
muestreadas en estudios 0 200
anteriores. kilmetros
49
Tabla 1
Muestras ecuatorianas de Batrachochytrium dendrobatidis utilizadas en el estudio
Modo de reproduccin v
Especie No. Haplotipo Provincia Localidad Procedencia*
Puesta Larva
Agalychnis spurrelli 1 H1 Esmeraldas Durango Silvestre Arborcola Charcas, troncos, huecos

Atelopus exiguus 1 H1 Azuay Girn Cautiverio Acutica Arroyo
Atelopus sp. 4 H1 Morona Santiago Ro Napinaza Silvestre Acutica Arroyo
Bolitoglosssa peruviana 1 H1 Orellana PNY Silvestre Arborcola Desarrollo directo
Engystomops petersi* 1 H1 Orellana PNY Silvestre Terrestre Charcas, arroyos lentos
Gastrotheca litonedis 1 H1 Azuay Cuenca Cautiverio Marsupio Charca

Gastrotheca pseustes 12 H1, H5 Azuay, Chimborazo, Cotopaxi, Pichincha Girn, PNC, Sigchos, Palmiraw, La Virgenw Cautiverio, silvestre Marsupio Charca
Gastrotheca riobambae 15 H1, H2, H3 Azuay, Cotopaxi, Pichincha Cuenca, Yambo, PM , Cuendinaw Cautiverio, silvestre Marsupio Charca
Gastrotheca sp. 2 H1 Azuay Chaucha, PNC Cautiverio Marsupio Charca
Hyloxalus jacobuspetersi 1 H1 Pichincha Ro Pita Silvestre Terrestre Arroyo
Leptodactylus discodactylus* 2 H1 Orellana PNY Silvestre Terrestre Charca
Leptodactylus pentadactylus* 4 H7, H8, H9, H10 Orellana PNY Silvestre Terrestre Charca
Leptodactylus rhodomystax* 1 H1 Orellana PNY Silvestre Terrestre Charca
Nelsonophryne aequatorialis 5 H1, H3 Azuay Tarqui Cautiverio Terrestre Charca
Osornophryne guacamayo 2 H1 Napo Cordillera de los Guacamayos Silvestre Terrestre Desarrollo directo
Pristimantis achatinus 2 H1 Pichincha Reserva Maquipucuna Silvestre Terrestre Desarrollo directo
Pristimantis aureolineatus* 3 H1, H11 Orellana PNY Silvestre Terrestre Desarrollo directo
Pristimantis calcarulatus 1 H1 Indeterminada Oso Verde Silvestre Terrestre Desarrollo directo
50
Pristimantis conspicillatus 1 H4 Morona Santiago Ro Napinaza Silvestre Terrestre Desarrollo directo
Pristimantis festae 7 H1, H2 Napo, Pichincha Papallactaw, La Virgenw Silvestre Terrestre Desarrollo directo
Pristimantis kirklandi 1 H1 Tungurahua Yanayacu Silvestre Terrestre Desarrollo directo
Pristimantis lanthanites* 1 H1 Orellana PNY Silvestre Terrestre Desarrollo directo
Pristimantis leoni 1 H1 Imbabura Reserva Siempre Verde Silvestre Terrestre Desarrollo directo
Pristimantis ockendeni* 1 H6 Orellana PNY Silvestre Terrestre Desarrollo directo
Pristimantis sp. 3 H1, H4 Morona Santiago Ro Napinaza Silvestre Terrestre Desarrollo directo
Pristimantis waoranii* 4 H1, H11 Orellana PNY Silvestre Terrestre Desarrollo directo
Raebo cf. glaberrimus 1 H1 Morona Santiago Ro Napinaza Silvestre Terrestre Arroyo lento
Cuatro muestras con datos indeterminados no constan en la tabla.

*Secuencias de ADN procedentes del estudio de McCracken et al., 2009.
Las muestras de cautiverio provienen de la Balsa de los Sapos de la Pontificia Universidad Catlica
del Ecuador.
PNY: Parque Nacional Yasun
PNC: Parque Nacional Cajas
PM: Parque Metropolitano, muestras procedentes del estudio de Manzano (2010).
wLocalidades de las muestras procedentes del estudio de Senz (2011).
vSegn Ron et al., 2012
Anlisis de la regin ITS1-5.8S-ITS2 mundial las poblaciones fueron los pases;

del ADN ribosomal.- Para la amplificacin y en el anlisis local, fueron las provincias.
del ADN ribosomal, se utiliz la tcnica de Se buscaron diferencias a nivel global, entre
PCR anidado segn Goka et al. (2009). Las los haplotipos encontrados en el Ecuador
muestras amplificadas fueron secuenciadas con los de otros pases incluidos en este
por la compaa Macrogen (Sel, Corea). estudio y a nivel local, se analizaron los
Las secuencias obtenidas fueron alineadas y haplotipos encontrados en las diferentes
analizadas con el programa Geneious 5.4.6 provincias del pas. En este ltimo caso,
(Drummond et al., 2010) y comparadas con los anlisis se enfocaron en determinar
las secuencias internacionales disponibles si existen diferencias relacionadas con
en GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih. las diferentes localidades (provincias);
gov/genbank) de Bai et al. (2012), Kaiser regiones (norte-sur del pas), se tomaron
y Pollinger (2012) y Schloegel et al. (2012), en cuenta como provincias del norte a:
Tupper et al. (2011), Gaertner et al. (2009), Esmeraldas, Pichincha, Napo, Orellana,
Goka et al. (2009), Federici et al. (2009), Cotopaxi, Tungurahua y Chimborazo; y
McCracken et al. (2009), Rodriguez y Hirt como provincias del sur a: Azuay y Morona
(2009). La alineacin final fue ajustada Santiago; procedencia (silvestre-cautiverio);
manualmente en el programa Mesquite hospederos; y modo de reproduccin del
2.75 (Maddison y Maddison, 2011). hospedero, se tom en cuenta la puesta de
los huevos: acutica, terrestre, arborcola
Se utiliz el programa TCS (Templeton, o marsupio; y el desarrollo larvario de
Crandall y Sing) versin 1.21 (Clement et al., cada gnero: arroyo, desarrollo directo y/o
2000) para realizar una red de haplotipos de charca (Tabla 1). El nivel de significacin de
las secuencias ecuatorianas y las secuencias todos los estadsticos calculados se bas en
internacionales. Se consideraron como 999 permutaciones.
poblaciones a las provincias y los pases. Las
secuencias incompletas fueron eliminadas RESULTADOS
para evitar falsos haplotipos debido a bases En total se encontraron 11 haplotipos
faltantes; sin embargo, se mantuvieron (H1 H11) en las muestras ecuatorianas, los
las secuencias incompletas compartidas cuales difieren en deleciones y sustituciones
entre poblaciones. Se calcularon las de bases (Figura 2). El haplotipo H1 tiene
distancias genticas de Nei entre las una frecuencia de 0.82 y est compartido
diferentes poblaciones con el programa por al menos una muestra en cada una
GenAlEx V.6.41 (Peakall y Smouse, 2006). de las provincias ecuatorianas incluidas
Igualmente, se realiz un anlisis molecular en este estudio, adems de las muestras
de variancia (AMOVA), para determinar procedentes del terrario y de datos
si exista subdivisin gentica dentro y indeterminados (Tabla 1). El haplotipo
entre las poblaciones analizadas, mediante H3, presente en tres muestras, tuvo una
el mismo programa. En el anlisis a nivel frecuencia de 0.036 y es compartido por las
51
provincias de Morona Santiago, Pichincha estuvo compartido por dos muestras de la

y Azuay. Los haplotipos H2, H4 y H11 provincia de Orellana. Los seis haplotipos
tuvieron una frecuencia de 0.024. De restantes (H5, H6, H7, H8, H9 y H10)
estos, el primero fue compartido por tuvieron una frecuencia de 0.012 y son
las provincias de Napo y Pichincha; el nicos para cada muestra, cinco pertenecen
haplotipo H4 corresponde a dos muestras a la provincia de Orellana y uno a la
de Morona Santiago, y el haplotipo H11 provincia de Pichincha (Tabla 1).
3 (0.036)
68 (0.82)
2 (0.024)
H3
H2
Pichincha
1 (0.012)
Orellana
H8
Azuay
H1 Morona Santiago
1 (0.012) Napo
H5 Imbabura
1 (0.012)
2 (0.024) Chimborazo
H10 2 (0.024) Esmeraldas
1 (0.012) H11
H4 H9 Cotopaxi
1 (0.012)
Tungurahua
H7
1 (0.012) Indeterminada
H6
Figura 2. Red de haplotipos de la regin ITS1-5.8S de ADN ribosomal de muestras de Batrachochytrium

dendrobatidis procedentes de diferentes localidades del Ecuador. La forma y tamao de las figuras
estn dados por la frecuencia de cada haplotipo. Los nmeros dentro de cada figura simbolizan a los
diferentes haplotipos. Los nmeros sobre las figuras indican las frecuencias absolutas y relativas de
cada haplotipo. Las localidades de las cuales provienen los haplotipos se encuentran en la Tabla 1.
En el anlisis de haplotipos y otros pases son: H1 (compartido con todos

internacionales estuvieron representados 9 los pases), H2 (con Estados Unidos), H6
pases adems del Ecuador: Blice, Brasil, (con China y Japn), H8 (con China) y H11
China, Estados Unidos, Italia, Japn, (con Blice, China y Sudfrica) (Figura 3a).
Panam, Per y Sudfrica. Se encontraron Los haplotipos H3, H4, H5, H7, H9, y H10
99 haplotipos en las 260 secuencias incluidas son nicos para Ecuador (Figura 3b). De los
en el anlisis (Figura 3). El haplotipo con dems haplotipos, 14 fueron compartidos
mayor frecuencia fue H1 con 109/260 (0.42) entre algunos de los pases analizados; y
y se encuentra en todos los pases analizados. 85 fueron nicos para los diferentes pases
Los haplotipos compartidos entre Ecuador (Figura 3b).
52
a) 3 (0.012)
H6 5 (0.02)
2 (0.008)
H8 H11
109 (0.42)
Ecuador
4 (0.015) Brasil
H2 Japn
China
Panam
H1 Per
Blice
Sudfrica
Italia
EEUU
Distancia de 27 pasos
b) 48
30
Hc
26 Hu
15 83
20
22
Figura 3. Red de haplotipos de la regin ITS1-5.8S de ADN ribosomal de muestras de Batracho-

chytrium dendrobatidis a nivel mundial. a) Se indican nicamente los haplotipos compartidos
entre Ecuador y los otros pases incluidos en el estudio. La forma y tamao de las figuras estn
dados por la frecuencia de cada haplotipo. Los nmeros dentro de cada figura simbolizan a los
diferentes haplotipos. Los nmeros sobre las figuras indican la frecuencia absoluta y relativa de
los haplotipos. b) Los cuadrados representan el total de haplotipos encontrados en cada pas, el
tamao de cada uno es proporcional al nmero de haplotipos. Las barras dentro de los cuadra-
dos representan los haplotipos de cada pas: en gris oscuro, el nmero de haplotipos comparti-
dos (Hc) de ese pas, con otros pases; y en gris claro, el nmero de haplotipos nicos (Hu) para
cada pas. Los nmeros sobre los cuadrados indican el nmero de muestras de cada pas. No se
incluyeron las muestras de Italia (14), Panam (1) y Per (1) ya que presentaron nicamente un
haplotipo (H1).
Los resultados del AMOVA reali- de reproduccin del hospedero (terrestre

zado para evaluar diferenciacin genti- con desarrollo directo, terrestre en nido
ca entre y dentro de las poblaciones del de espuma, acutico, marsupial) (PT
Ecuador, revelaron que no existen dife- -0.072 P 0.865); el mayor porcentaje de
rencias significativas entre las poblacio- la variacin se encontr dentro de las po-
nes analizadas en el Ecuador (Tabla 2). Al blaciones sin diferencias significativas
considerar diferencias entre dos regiones entre ellas (Tabla 2).
(norte-sur) del pas (PT 0.032 P 0.051),
entre provincias (PT 0.089 P 0.077), por El AMOVA realizado entre las
procedencia del hospedero (silvestre-cau- muestras del Ecuador y las de los pases
tiverio) (PT 0.004 P 0.269), especie de incluidos en este estudio (tomados en
hospedero (PT -0.003 P 0.496), y modo cuenta como una poblacin diferente)
53
revel diferencias significativas (PT 0.199 En relacin con las distancias genti-
P 0.002) (Tabla 2), con el mayor porcentaje cas, Brasil presenta la mayor distancia gen-
de variacin dentro de las poblaciones tica de Nei comparado con Ecuador (0.035),
(80 %). La variacin entre pases es seguida de Japn (0.013), Sudfrica (0.012) y
mayor a la encontrada entre las muestras Estados Unidos (0.009). Por el contrario, no
ecuatorianas (Tabla 2). existe diferencia gentica con Italia (Tabla 3).
Tabla 2
Anlisis molecular de la varianza (AMOVA) de los haplotipos de la regin ITS1-5.8S- ITS2
de ADN ribosomal de Batrachochytrium dendrobatidis encontrados en el Ecuador,
agrupados por regiones, provincias, procedencia del hospedero, modo reproductivo
del hospedero y poblaciones internacionales del hongo
Fuente de Grados de Suma de Componentes de Porcentaje de PT P

variacin libertad cuadrados varianza variacin
Entre
1 1.933 0.030 3 0.032 0.051
poblaciones
(norte-sur*)
Dentro de
81 74.899 0.925 97
poblaciones
Total 82 76.831 0.955
Entre
9 13.472 0.085 9 0.089 0.077
poblaciones
(provincias)
Dentro de
73 63.360 0.868 91
poblaciones
Total 82 76.831 0.952
Entre
1 0.980 0.004 0 0.004 0.269
poblaciones
(silvestres-
cautiverio)
Dentro de
83 71.232 0.858 100
poblaciones
Total 84 72.212 0.862
Entre
11 5.817 0.000 0 -0.003 0.496
poblaciones
(hospederos)
Dentro de
83 78.994 0.952 100
poblaciones
Total 94 84.811 0.952
54
Cont. tabla 2
Fuente de Grados de Suma de Componentes de Porcentaje de PT P

variacin libertad cuadrados varianza variacin
Entre
4 3.501 0.000 0 -0.072 0.865
poblaciones
(modo de
reproduccin )
Dentro de
83 81.263 0.923 100
poblaciones
Total 94 84.763 0.923
Entre
9 249.530 0.993 20 0.199 0.002
poblaciones
internacionales
Dentro de
251 1.001.853 3.991 80
poblaciones
internacionales
Total 260 1.251.383 4.985
*Se tomaron en cuenta como provincias del norte a: Esmeraldas, Pichincha, Napo,
Orellana, Cotopaxi, Tungurahua y Chimborazo; las provincias del sur fueron Azuay
y Morona Santiago.
Para diferenciar el modo reproductivo se tom en cuenta la puesta de los huevos:
acutica, terrestre, arborcola, marsupio; y el desarrollo larvario de cada gnero:
arroyo, desarrollo directo, charca.
DISCUSIN Cinco de los once haplotipos encon-

Los resultados obtenidos en este trados en el Ecuador son compartidos con
estudio muestran que la diversidad gentica otros pases, lo cual denota la posibilidad
de la poblacin de Bd basada en secuencias de varios eventos de introduccin del
de la regin ITS1-5.8S del ADN ribosomal hongo al pas. Los seis haplotipos restan-
en el Ecuador es baja. Se identificaron tes, nicos para Ecuador, podran ser end-
11 haplotipos, mientras que en las micos. En Brasil se ha sugerido la presencia
poblaciones internacionales se encontraron de cepas endmicas de Bd (Schloegel et al.,
99 haplotipos. La diferenciacin gentica 2012). En China, Bai et al. (2012) tambin
entre las muestras ecuatorianas no fue concluyen que podra existir un linaje de Bd
significativa, pues indic que no hay una endmico en ese pas, asociado a los hospe-
subestructuracin dentro de la poblacin deros locales. Esto podra ocurrir tambin
de Bd en el Ecuador. La baja diferenciacin en Ecuador, aunque se necesitan mayores
gentica sugiere que la poblacin del Bd en estudios para comprobarlo.
el Ecuador es de origen reciente.
55
La alta diversidad de haplotipos en proviene de una cepa hipervirulenta y es

China (Bai et al., 2010) est relacionada parte del recientemente nominado linaje
con muestras tomadas del mercado de panzotico global (GPL, por sus siglas en
Lythobates catesbeianus. Estudios enfocados ingls) ya que ha emergido en al menos
en esta rana toro norteamericana muestran cinco continentes durante el siglo XX y est
que, no solo esta especie est ampliamente asociado con el inicio de la epizotia en varios
distribuida, sino que es portadora de una pases en Norteamrica, Centroamrica,
alta diversidad de genotipos de Bd y su el Caribe, Australia y Europa (Farrer et al.,
invasin pudo contribuir y facilitar el 2011). Al ser de introduccin reciente ha
flujo gnico intercontinental del hongo causado fuertes estragos en las poblaciones
(Schloegel et al., 2012; Bai et al., 2010; Goka locales de anfibios (Schloegel et al., 2012;
et al., 2009). En Ecuador los criaderos de esta Farrer et al., 2011). Este haplotipo, entonces,
especie de rana datan de los aos ochenta pudo haber tenido varios eventos de
(Villacs y Zurita, 2002), que coincide con el introduccin en diferentes pases o tambin
tiempo del primer registro del qutrido en el pudo existir flujo gnico entre estos. En la
pas, el cual data de 1980 de una muestra de provincia de Orellana hay la presencia del
piel infectada de un especmen de Atelopus haplotipo H1 hipervirulento; sin embargo,
bomolochos (Ron y Merino, 2000). Esto a su no se han registrado declinaciones debido
vez sugiere que Bd estuvo presente cuando a la infeccin del hongo en esa zona.
el problema de declinaciones de anfibios Esto podra deberse a una alta defensa
en el Ecuador era evidente a finales de la inmune por parte de los hospederos que
dcada de los 80 (Coloma et al., 2000; Ron y no han sido afectados por cambios en
Merino, 2000; Coloma, 1996; Coloma, 1995; su hbitat (Fisher et al., 2009), como en el
Stebbins y Cohen, 1995). No se descarta la caso de los hospederos de tierras altas.
posibilidad que Bd estuviera presente antes Igualmente, podra deberse a un efecto en la
de su deteccin, posiblemente por que no patogenicidad del qutrido en tierras bajas,
se evidenciaron sntomas de la enfermedad pues las condiciones para el desarrollo de
en los hospederos. Esto podra dar soporte la infeccin dentro del hospedero podran
a la hiptesis que el patgeno es endmico ser limitadas. Sin embargo, estudios
al pas y, tal vez, fueron los cambios adicionales sera necesarios para poder
ambientales producidos en la dcada de los confirmar esta aseveracin.
ochenta (Merino, 2001) los que generaron
una alteracin en la dinmica patgeno- Tres haplotipos ecuatorianos se
hospedero, permitiendo que los hospederos encontraron restringidos al Parque Nacional
sean ms vulnerables y se iniciara su Yasun en la provincia de Orellana y fueron
declinacin (Fisher et al., 2009). reportados por McCracken et al. (2009).
Esta circunstancia podra ser resultado de
El haplotipo H1 fue el ms frecuente un muestreo no representativo de otras
en el Ecuador y a nivel mundial. Este provincias o que realmente en Orellana
56
hay una mayor diversidad de haplotipos. cada pas, lo cual sugiere que existe una alta
Si se toma en cuenta que las poblaciones diversidad gentica e inclusive especificidad
de tierras bajas y hmedas no se han visto de nicho entre los haplotipos (Kaiser y
afectadas por la quitridiomicosis (James Pollinger 2012). La diversidad gentica
et al., 2009; Bustamante et al., 2005; Ron, encontrada para Bd a nivel internacional
2005; La Marca y Ltters, 1997) es posible pudiera estar relacionada con la rigurosidad
que existan haplotipos endmicos de Bd de los muestreos que se realicen en cada pas.
en esta regin que no han sido detectados
o descritos. Esto, una vez ms, estara En general, la baja diversidad gentica
dando soporte a la hiptesis del patgeno encontrada en las poblaciones del Bd en
endmico, puesto que los anfibios podran el Ecuador y la semejanza de haplotipos
estar conviviendo con cepas del hongo sin con poblaciones del hongo de otros
que este los estuviera afectando, ya que los pases, apoya la hiptesis del patgeno de
anfibios ms vulnerables son los que habitan introduccin reciente. Los datos reportados
a una mayor altitud (Ron y Merino, 2000). en varios estudios de gentica de
poblaciones de Bd, indican que puede existir
En Pichincha, Cotopaxi, Morona un reciente cuello de botella correspondiente
Santiago y Azuay (Figura 2) se encontraron a una cepa ancestral diploide (James et al.,
haplotipos nicos. Al estar estas provincias 2009; Morgan et al., 2007; Morehouse et al.,
principalmente ubicadas en tierras altas, en 2003). Tanto la extremada baja variacin,
donde se ha visto la mayor vulnerabilidad como la amplia dispersin de genotipos
de los anfibios (Ron y Merino, 2000), se cercanamente relacionados, proveen un
puede sugerir que en estos lugares, otros fuerte soporte para la hiptesis del patgeno
factores han podido influir en el desarrollo nuevo. Sin embargo, no se ha encontrado
de la quitridiomicosis en los hospederos. Es en ninguna de las regiones muestreadas en
posible, entonces, que haya la presencia de estos estudios, evidencia del posible origen
ms haplotipos endmicos en otros sitios de la cepa ancestral (James et al., 2009).
del pas.
AGRADECIMIENTOS
Los resultados del anlisis de A la Pontificia Universidad Catlica
diferenciacin gentica para las muestras del Ecuador, por la asignacin de fondos
internacionales presentan diferencias de investigacin PUCE 2010 y 2011. Al
significativas entre pases. En los estudios Laboratorio de Biologa Molecular del
de Bai et al. (2012), en China, Kaiser y Museo de Zoologa QCAZ y La Balsa de los
Pollinger (2012) en Blice; Schloegel et al. Sapos por su colaboracin en la elaboracin
(2012) en Brasil y Goka et al. (2009), en del proyecto. A Miguel Pinto por su
Japn, se reportan nuevos haplotipos para asistencia con los programas biostadsticos.
57
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61
Obtencin de embriones en fase cotiledonar de Caf Robusta
(Coffea canephora) con el empleo de un sistema de
inmersin temporal, mediante la tcnica de embriognesis somtica a
partir de segmentos foliares
Gabriela Paredes , Cristian Pea y Mnica Jadn

Departamento de Ciencias de la Vida, Carrera de Ingeniera en Biotecnologa, Laboratorio de Cultivo de Tejidos,
ESPE, Sangolqu, Ecuador
magabriela_paredes@yahoo.com
RESUMEN.- En el presente trabajo se llev a cabo la estandarizacin de la fase de esta-

blecimiento, en donde la concentracin de cloro 1.5 % y una inmersin de 20 minutos, re-
sult ser efectiva en cuanto a bajos porcentajes de contaminacin y oxidacin. Para la fase
de induccin de callo se utiliz el medio M&S (Murashige & Skoog) con 3 % de sacarosa y
7 % de agar, con diferentes concentraciones de 2,4-D (cido-2,4- diclorofenilactico), BAP
(bencilaminopurina) y KIN (Kinetina); el mejor medio result ser: M&S adicionado con
0.5 mgL-1 de 2,4-D y 2 mgL-1 de KIN. Los embriones se desarrollaron en medio M&S a la
mitad de la concentracin sin reguladores de crecimiento; dicho medio se prob tambin
en forma lquida en tarrinas (sistema de inmersin casero) y en un sistema de inmersin
temporal automatizado (SIT), en donde el primero mostr crecimiento de embriones ya
que a los 20 das se visualizaron embriones en estado globular y a las 12 semanas de cul-
tivo se lograron obtener 611 embriones, de los cuales 15 presentaron el estado cotiledo-
nar. El Sistema de Inmersin Temporal automatizado no mostr resultado alguno.
PALABRAS CLAVES: embriognesis, estado cotiledonar, medio lquido, sistema de

inmersin temporal
ABSTRACT.- Standard methods were developed to obtain cotyledon-stage embryos of

Coffea canephora in the laboratory. The stablishment phase was standarized using a chlorine
concentration of 1.5 % and 20 minutes immersion time. This method was effective because
it reduced contamination and produced low percentages of oxidation. In the callus
induction phase, the medium used was M&S (Murashige & Skoog) with saccharose (3 %)
and agar (7 %). We tested different concentrations of 2,4-D (2,4- dichlorophenilacetic acid),
63
BAP (benzylaminopurine) and KIN (kinetin). The best medium was: M&S with 0.5 mg/
L of 2,4-D and 2 mg/L of KIN. The embryos were grown in M&S medium at half strength
without growth regulators. This medium was also tested as a liquid in large tubs in two
systems, the home immersion system and Automated Temporary Immersion System
(TIS). There was embryo growth after 20 days in the home inmmersion system. We
produced globular stage embryos in the system and after 12 weeks we had 611 embryos,
15 of these embryos were in the cotyledon stage. The automated temporary immersion
system did not produced embryos.
KEYWORDS: cotyledonar stage, embryogenesis, liquid medium, temporary immersion

system
INTRODUCCIN gran potencial de exploracin (Rezende et

En el Ecuador el caf est dentro de al., 2003).
los cinco productos ms exportados. Para
noviembre del 2012 alcanz un total de 180 La embriognesis somtica constituye
mil quintales exportados (Pro Ecuador, una importante alternativa respecto a la
2013). Ecuador es uno de los 14 pases que forma tradicional de cultivo de caf, ya que
tiene produccin mixta, es decir, cultiva las permite aumentar la tasa de multiplicacin
dos especies comerciales: arbiga (Coffea y la propagacin rpida de plantas
arabica) y robusta (Coffea canephora); esta seleccionadas (Gonzlez et al., 2004).
ltima es la de mayor inters debido a la
resistencia contra la broca del caf y porque Los primeros embriones somticos
puede cultivarse en suelos bastante pobres de cafeto fueron obtenidos a principios de
en nutrientes (Delgado et al., 2002). 1970 por Staritsky, al emplear secciones de
hojas de ramas ortotrpicas (crecimiento
Es por eso que la introduccin de de las ramas o los brotes principales de
mtodos biotecnolgicos como herramienta manera vertical) jvenes de C. canephora
para la produccin masiva de plantas, ha (Dublin, 1991). En los ltimos aos, se ha
sido de utilidad principalmente en cultivos incrementado la regeneracin de plantas
perennes, como el caf. Un importante por esta va y en particular el cultivo de
mtodo de propagacin in vitro de plantas clulas en suspensin (Cevallos et al., 2002;
de C. canephora es la embriognesis de Feria et al., 2005; Etienne-Barry et al.,
somtica, la misma que consiste en el 1999; Montes et al., 1995; Zamarripa et al.,
desarrollo de embriones sin la fusin de 1991). La utilizacin de los biorreactores ha
gametos, que permitieron la propagacin permitido que sea la va ms promisoria
masiva acelerada y se convirtieron en un para el proceso de micropropagacin
64
OBTENCIN DE EMBRIONES EN FASE COTILEDONAR DE CAF ROBUSTA
(Coffea canephora) CON EL EMPLEO DE UN SISTEMA DE INMERSIN TEMPORAL,
MEDIANTE LA TCNICA DE EMBRIOGNESIS SOMTICA A PARTIR DE SEGMENTOS FOLIARES
a gran escala, particularmente para la invernadero de aproximadamente 5 meses

embriognesis somtica, ya que durante de edad, se recolectaron 3 hojas de las
los ltimos 15 aos en varios pases, los partes ms cercanas al meristema apical.
biorreactores han sido usados en caf Previo a esto se realiz un tratamiento
para optimizar la regeneracin masiva fitosanitario en invernadero que consisti
de embriones somticos a partir de tejido en la aplicacin mediante aspersin de un
embriognico (Etienne et al., 2006). En fungicida sistmico Amistar (1 gL-1) en las
el Ecuador todava se siguen realizando plantas madre una vez al da por 3 das
ensayos para determinar el mejor mtodo seguidos antes de la recoleccin de las hojas.
para inducir embriones y poder obtenerlos
a gran escala. Desinfeccin.- Las hojas fueron
lavadas en una corriente de agua por
De all que los objetivos de este estudio un minuto para eliminar el fungicida
consisten en estandarizar el protocolo sistmico Amistar y las impurezas de la
de desinfeccin de hojas de caf robusta hoja. Se las sumergi durante 10 min en
(Coffea canephora) y los medios de cultivo el detergente comercial DEJA al 1 % p/v
para la induccin de callo y embriones, as con la adicin de 0.1 % Tween 20; luego se
como tambin determinar la frecuencia de las coloc en diferentes concentraciones de
inmersin de los callos en el Sistema de cloro (1 y 1.5 % v/v) y a diferentes tiempos
Inmersin Temporal para la produccin de de inmersin (15 y 20 min), finalmente se
embriones. realizaron 3 enjuagues en cmara con
agua destilada estril. Con un bistur, se
MATERIALES Y MTODOS cortaron segmentos de hoja de diferentes
A partir de 10 plantas jvenes de tamaos: 0.25 y 1 cm2, segn la Tabla 1 y
Tabla 1
Tratamientos de desinfeccin para hojas de Coffea canephora
Tratamiento Concentracin Tratamiento Tamao de hoja

de cloro (%) (min) (cm2)
65
se colocaron en frascos con medio de cultivo a los 15 das de cultivo, se determin la

slido con las sales de Murashige y Skoog presencia de colonias bacterianas o fngicas
(1962), sacarosa 3 % p/v y 7 gL-1 de agar. y se le asign el valor de 1, mientras que a
Las condiciones de cultivo fueron a 251 un explante no contaminado se le asign el
C, humedad relativa 50-60 % sin luz directa. valor de 0, segn la Figura 1.
Se evaluaron contaminacin y oxidacin
Figura 1. (A) Explante viable (0). (B) Explante con contaminacin bacteriana (1). (C) Explante con
contaminacin fngica (1).
Para la oxidacin se determin si un oxidado se le asign el valor de 0, segn

explante estaba oxidado y se le asign el la Figura 2.
valor de 1, mientras que a un explante no
Figura 2. (A) Explante viable (0). (B) Explante oxidado (1).
Se realizaron 10 repeticiones por experimental fue un segmento de hoja por

cada tratamiento, en donde la unidad frasco.
66
Medio de induccin de callo.- Una binacin factorial de dos concentraciones

vez determinado el mejor tratamiento de de cido 2,4-D (0.5 y 1 mgL-1) con dos con-
desinfeccin, se dio inicio a la fase de in- centraciones de Bencilaminopurina, BAP (4 y
duccin de callo, en donde los explantes 8 mgL-1) y dos concentraciones de Kinetina,
fueron colocados en frascos con 30 ml de 6-furfurilaminopurina, KIN (2 y 4 mgL-1),
medio de cultivo con el haz en contacto con ms un tratamiento control carente de hor-
este. El medio de cultivo contena las sales monas como se indica en la Tabla 2. Se
de Murashige y Skoog (1962) y vitaminas realizaron 10 repeticiones por tratamiento.
de Morel y Wetmore (1951), sacarosa 3 % Se incubaron los explantes a 271 C de
p/v y agar 8 gL-1. Ocho medios de induccin temperatura, 50-60 % de humedad relativa
de callo (I 1-I 8) fueron evaluados: la com- y en completa oscuridad.
Tabla 2
Tratamiento para la induccin de callo
Tratamiento 2,4-D (mg L-1) BAP (mg L-1) Kin (mg L-1)
Se evalu el ndice de crecimiento de se establecieron niveles del 0 al 4: el 0

callo con la prueba de Tukey y el tipo de equivale al 0 % de crecimiento del callo y
callo a los 20 y 45 das de cultivo, mediante el 4 al 90-100 % de crecimiento, como se
observacin para el ndice de crecimiento indica en Tabla 3 y Figura 3.
Tabla 3
Niveles que determinan la formacin de callo
Niveles Formacin de callo
67
Figura 3. (A) Nivel 0. (B) Nivel 1. (C) Nivel 2. (D) Nivel 3, (E) Nivel 4.
El tipo de callo friable o no friable se casena hidrolizada, 20 mgL-1 de tiamina,

determin de manera visual, un callo 200 mgL-1 de inositol, 20 mgL-1 de glicina,
friable es de apariencia seca, compacta, de 60 mgL-1 de adenina, sacarosa 3 % p/v y
coloracin amarillo-blanquecina, segn la 5 gL-1 de agar. Ocho medios de induccin
escala planteada por Prez (1998). de embriones (E1-E8) fueron probados;
estos resultaron de la combinacin
Medio de induccin de embriones.- factorial de dos concentraciones de cido
Establecido el mejor medio de induccin a-naftalenactico, ANA (0.1 y 1 mgL-1)
de callo y despus de 45 das de cultivo, con dos concentraciones de KNO3 (0.126 y
los callos se cultivaron en el medio de 1.26 mgL-1) y dos concentraciones de KIN
induccin de embriones, basado en lo (0.5 y 5 mgL-1), ms un tratamiento control
propuesto por Etienne (2005) sales de carente de hormonas (Tabla 4) .
Murashige y Skoog (1962), 200 mgL-1 de
Tabla 4
Tratamientos para la induccin de embriones
Tratamiento ANA (mg L-1) KNO3(mg L-1) KIN (mg L-1)
68
Se realizaron 10 repeticiones por tratamiento Induccin de embriones en medio

con un explante por frasco. Se incubaron a lquido.- Una vez estandarizado el medio
271 C de temperatura, 50-60 % de humedad de cultivo para induccin de embriones
relativa y con un fotoperodo de 16 h luz. en medio slido, se evalu esa misma
composicin en consistencia lquida. Se
En esta etapa se evaluaron como prob el medio de cultivo lquido en 2
variables: el tiempo en el cual se forman las sistemas de inmersin, uno casero (tarrinas
estructuras globulares (das en los cuales se plsticas) y otro automatizado (frascos de
observan embriones en fase globular) y la vidrio transparentes).
capacidad embriognica que se determin
al contar la cantidad de embriones El sistema de inmersin temporal
somticos obtenidos en estado globular casero const de 2 tarrinas de plstico de
dividido para el nmero total de callos (por 2 tamaos; a la ms pequea se le hizo
tratamiento) por 100. La variable capacidad cuatro agujeros y se la coloc dentro de la
embriognica se analiz a las 8 y 12 semanas ms grande y se tap la cmara (Figura 4);
despus de la siembra.
Figura 4. Proceso de elaboracin de los SIT caseros. A) Agujeros en la tarrina pequea. B) Colocar la
tarrina pequea dentro de la grande. C) Colocar la tapa de la tarrina grande.
en la tarrina pequea se aadi 1 g MF L-1 embriones por 100. La variable capacidad

(gramo de masa fresca por litro de medio de embriognica se analiz a las 8 y 12 semanas
cultivo) y se coloc en un agitador orbital despus de la siembra.
a 110 rpm. Se evalu el tiempo en el cual
se forman las estructuras globulares (das En el sistema de inmersin temporal
en los cuales se observen embriones en automatizado, el medio de cultivo de
fase globular) y la capacidad embriognica induccin de embriones estandarizado fue
que se determin al contar la cantidad de adicionado a los biorreactores con el fin de
embriones somticos obtenidos en estado evaluar 3 frecuencias de inmersin con un
globular dividido para el nmero total de tiempo de 1 min, segn la Tabla 5.
69
Tabla 5
Tratamientos para obtencin de embriones en el Sistema de Inmersin Temporal
Tiempo de Inmersin Frecuencia

Tratamiento
(min) (horas)
1 1 8
2 1 10
3 1 12
RESULTADOS Y DISCUSIN concentraciones de 1 y 1.5 % v/v de

Desinfeccin.- Los resultados obteni- hipoclorito de sodio, se observ que el
dos de la variable contaminacin, permi- tamao del explante influye en la presencia
tieron determinar que el mejor porcentaje de oxidacin y es por eso que bajos
de descontaminacin se encontr en la con- porcentajes de oxidacin se encuentran a la
centracin de 1.5 % v/v de hipoclorito de concentracin del 1 % de hipoclorito de sodio
sodio. Es por esto que el tratamiento 7 indi- y un tamao de hoja de 1 cm2, sin importar el
cado en la Tabla 1, es considerado el mejor, tiempo de inmersin; este hecho mostr que
lo cual se asemeja con el trabajo realizado los mejores tratamientos son los dos primeros
por Santana et al., (2004) en donde el pro- propuestos en la Tabla 1.
ceso de desinfeccin establecido consta de
la inmersin en hipoclorito de sodio 1.5 % La Figura 5 muestra un resumen de
v/v por 20 min. El tamao de explante no las variables evaluadas en cada uno de los
influy al momento de evaluar esta variable tratamientos de desinfeccin, donde se
ya que segn las pruebas de chi-cuadrado evidencia que los tratamientos 6 (1.5 % - 15
que se realizaron al tomar o no en cuenta min - 1 cm2) y 8 (1.5 % - 20 min - 1 cm2) son
el tamao del explante, arrojaron el mismo los que presentaron mayor porcentaje de
resultado de independencia en cuanto a la explantes no contaminados y no oxidados
concentracin de cloro. (el tratamiento 8 es igual al utilizado por
Santana et al. 2004).
En los resultados obtenidos para
la variable oxidacin cuando se utizaron
70
100 %
90 %
80 %
70 %
60 %
50 %
no contaminado
40 %
no oxidado
30 %
20 %
10 %
0%
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8
Tratamientos de desinfeccin
Figura 5. Porcentaje de explantes no contaminados y no oxidados con respecto

al tratamiento de desinfeccin.
Induccin de callo.- Gonzlez et al., iniciacin de la embriognesis somtica. A

(2008), Gatica et al. (2007), Santana et al. diferencia de los resultados obtenidos por
(2004) y Rezende et al. (2003), en la etapa Quiroz-Figueroa et al., (2002), ya que en
de induccin de callo, evaluaron diferentes su trabajo al utilizar 1 mgL-1 de 2,4-D y 2
concentraciones de auxinas y citoquininas en mgL-1 de KIN en Coffea arabica obtuvieron
distintos genotipos de caf. En este trabajo 68 % de callos embriognicos mientras que
se pudo evidenciar que para la variedad de en este trabajo solo se obtuvo un 10 % de
caf robusta utilizada, con la concentracin callos embriognicos y el resto fueron no
de 2,4-D (0.5 mgL-1) y KIN (2 mgL-1) se pudo embriognicos. De esta manera se prob
obtener gran crecimiento de callo (nivel 4) la existencia de un control gentico en
y la friabilidad deseada del mismo, pero no el comportamiento in vitro de los clones
se obtuvo un alto porcentaje de desarrollo (Santana, 1993).
de callo embriognico que es lo que se
esperaba para la obtencin de embriones Para el ndice de crecimiento, de
somticos; ya que como menciona acuerdo con la prueba de Tukey a los 20 das
Samson et al. (2006) la concentracin de los se encontraron cuatro grupos estadsticos
reguladores de crecimiento y especialmente (A, B, C y D), donde se observa que el mejor
el balance entre las auxinas y citocininas es tratamiento, el que tiene la mayor media, es
un factor clave en la induccin de callo y la el I5, que se muestra en la Tabla 6.
71
Tabla 6
Prueba de Tukey para la variable ndice de crecimiento con respecto a la interaccin de las
hormonas 2,4-D BAP y 2,4-D KIN a los 20 y 45 das de cultivo
A los 45 das de cultivo se encontraron la concentracin de 2,4-D BAP y 2,4-D

cinco grupos estadsticos (A, B, C, D y E), KIN (20 das de cultivo) y el tipo de callo,
al mostrar que los mejores tratamientos, se evalu mediante un grfico que muestra
es decir los que presentan la media ms el porcentaje de friabilidad existente en
alta son I5 y I6 que pertenecen al grupo cada uno de los tratamientos, en donde
E, con lo cual se puede concluir que el se observa que la mayor cantidad de callo
tratamiento 5 es el mejor. La relacin entre friable se encuentra en los tratamientos I7 e
72
I8 indicados en la tabla 2. La relacin entre de porcentaje, en donde se observa que la

la concentracin de 2,4-DBAP y 2,4-D mayor cantidad de callo friable se encuentra
KIN (45 das de cultivo) y el tipo de callo, en los tratamientos I5, I6, I7 e I8, segn la
se evalu tambin mediante un grfico Figura 6.
20 das de cultivo
100 %
90 %
80 %
70 %
60 %
Friable
50 %
No friable
40 %
30 %
20 %
10 %
0%
I0 I1 I2 I3 I4 I5 I6 I7 I8
Tratamientos
45 das de cultivo
100 %
90 %
80 %
70 %
Friable
60 %
No friable
50 %
40 %
30 %
20 %
10 %
0%
I0 I1 I2 I3 I4 I5 I6 I7 I8
Tratamientos
Figura 6. Porcentaje de callos friables y no friables encontrados al utilizar diferentes

combinaciones de 2,4-D-BAP y 2,4-D-KIN, despus de 20 y 45 das de cultivo.
73
La combinacin de 0.5 mgL-1 de 2,4- medio de induccin de embriognesis, se

D y 2 y 4 mgL-1 de KIN a los 45 das de consideran esenciales para el desarrollo
evaluacin segn la figura 6 y la tabla 6, de los embriones somticos de la ESAF
muestran que presentaron un ndice de en Coffea sp., lo cual fue comprobado por
crecimiento nivel 4 y hubo el 100 % de Moncada et al. (2005), Gonzlez (2003) y
explantes que presentaron callos friables, Cevallos et al. (2002); sin embargo, en el
que se utilizan en este presente trabajo presente trabajo no se corrobor esto, ya que
la combinacin de 2,4-D (0.5 mgL-1) y KIN en ninguno de los tratamientos probados
(2 mgL-1). En estudios como el de Cevallos con combinaciones de ANA y KIN en 8
et al., (2002) se verific que las frecuencias meses de cultivo present produccin de
ms altas de los callos embriognicos embriones.
fueron observados cuando la auxina estuvo
presente en un cultivo primario asociado El momento de aparicin de
con la kinetina a las mismas concentraciones los primeros embriones, las tasas de
mencionadas anteriormente. embriognesis (porcentaje de explantes
que producen embriones) y el nmero
Induccin de embriones.- Para inducir de embriones producidos por explante
la formacin del embrin somtico a partir dependen de varios factores; entre ellos,
de los proembriones, es necesario adicionar la combinacin de auxina/citocinina
al medio de cultivo, bajas concentraciones utilizadas en la etapa de induccin de callo,
de auxina, auxinas menos fuertes o la duracin de dicha etapa, el origen del
incluso no adicionar auxinas (Nomura y explante y el estado fisiolgico de la planta
Komamine, 1995). Otro factor a considerar madre (Dublin, 1991).
en la respuesta a la embriognesis es el
cambio estacional, ya que variaciones de Del 10 % de callos embriognicos se
temperatura, humedad y precipitaciones lograron obtener embriones a los 8 meses
provocan cambios fisiolgicos en las de cultivo en el medio M&S a la mitad
plantas de invernadero que influyen el de la concentracin y sin la presencia de
comportamiento in vitro de los explantes reguladores de crecimiento (medio de
(Prela y Mogolln, 1996). induccin de callo), as como Gonzlez
et al., (2008), Samson et al., (2006) y Roca y
Segn Dublin (1991) para la activacin Mroginski (1991), que emplearon tambin
de la embriognesis somtica de alta en sus estudios el mismo medio basal para
frecuencia (ESAF) y su eficacia es necesaria la obtencin de embriones somticos. En el
la adicin de 2,4-D en combinacin con presente trabajo a las 8 semanas de cultivo
KIN durante el cultivo primario. Adems se obtuvieron 45 embriones y a las 12
la remocin de 2,4-D y la disminucin de semanas se obtuvieron 61 (Tablas 7 y 8).
las concentraciones de ANA y KIN, en el
74
Tabla 7
Conteo de embriones en todos los estados encontrados a las 8 semanas de visualizado
estructuras embrionarias en medio slido
Estado # de
embrionario embriones
Tabla 8
Conteo de embriones en todos los estados encontrados a las 12 semanas de visualizado estructuras
embrionarias en medio slido
Estado # de
Induccin de embriones en medio a nivel fisicoqumico la difusin de los

lquido.- El uso de medio lquido tiene elementos nutritivos es aproximadamente
muchas ventajas como por ejemplo: mayor de dos a cuatro veces ms alta que el medio
contacto del explante con el medio nutritivo, gelificado (Girn, 1998); es por esto que se
lo cual permite el intercambio gaseoso decidi ensayar la formacin de embriones
dentro del recipiente que ayuda a mejorar somticos en Sistemas de Inmersin ya que
el crecimiento y desarrollo de los explantes, en muchos estudios ha dado resultados con
al mismo tiempo que es considerado como un alto porcentaje de produccin.
una tcnica ideal para la produccin
en masa de plntulas y embriones, que En el Sistema de Inmersin Temporal
simplifican los cambios de medio. Adems, Automatizado (SIT) no se obtuvo resultado
75
alguno en cuanto a la produccin de parte inferior con papel filtro, para impedir
embriones; esto se debe a que los callos el paso de los embriones a travs de la
utilizados no eran embriognicos, ya que no manguera cuando se elimine el medio del
se realiz un estudio histolgico con el cual frasco; en este caso el papel filtro siempre
se garantice el estado embriognico de los permaneci hmedo, por ende los callos
callos y poder obtener un mejor resultado estuvieron siempre en contacto con residuo
al utilizar este Sistema. Adems que el de medio de cultivo, lo cual no pasa al
Sistema Automatizado no fue el adecuado utilizar el Sistema de Inmersin RITA.
para el desarrollo de la embriognesis, ya
que en estudios como el de Gatica et al. En el Sistema de Inmersin Casero, s
(2007), Barreto (2003), Etienne y Berthouly se obtuvieron resultados; esto pudo deberse
(2002) y Girn (1998), se utiliz el Sistema a que el callo escogido fue embriognico y
de Inmersin Temporal (RITA), el cual a que la agitacin favoreci la produccin
tiene un soporte especial que permite que de embriones, debido a que existe una
los embriones estn en contacto con el disgregacin de clulas, por lo cual a los 20
medio el tiempo programado, porque en das de cultivo ya se observaron estructuras
esta investigacin se construy un soporte embriognicas (embriones en diferentes
con una malla de plstico, tapada en la estados de desarrollo) (Figura 7).
Figura 7. Embriones obtenidos en medio de induccin de callo a la mitad de la concentracin (lquido).
76
A las 8 semanas se obtuvieron un total de semanas se obtuvieron 611 embriones,

337 embriones, segn la Tabla 9 y a las 12 mostrados en la Tabla 10.
Tabla 9
Conteo de embriones en todos los estados encontrados a las 8 semanas de cultivo en medio lquido
en el sistema casero
Estado # de
Tabla 10
Conteo de embriones en todos los estados encontrados a las 12 semanas de cultivo en medio lquido en el
sistema casero
Estado # de
Resulta difcil establecer cultivos de independientemente uno del otro, por lo

embriones somticos que mantengan una cual en un mismo tejido podemos tener
uniformidad de sus clulas en el desarrollo embriones somticos en diferentes etapas de
de nuevos clones o individuos, ya que la desarrollo, que se muestran en las Figuras 8
formacin de los embriones se produce y 9 (Moncada et al, 2005; Muoz, 2003).
77
Figura 8. Formacin de embriones en medio lquido. A.1) embrin en fase globular. A.2) embrin en
fase cotiledonar. B.1) embrin en fase globular. B.2) embrin en fase corazn. B.3) embrin en fase
cotiledonar.
Figura 9. Embriones individuales vistos en el estereoscopio (1.6X). A.1) embrin en estado globular.
A.2) e4mbrin en estado corazn. A.3) embrin desarrollando el meristema apical. B) Embriognesis
secundaria.
Adems, no todas las clulas responden del crecimiento (Gonzlez, 2008). Todo
a la formacin de embriones somticos de lo dicho se comprueba en este estudio ya
igual manera, ya que solamente ciertas que a lo largo del cultivo se presentaban
clulas parecen estar aptas a responder diferentes etapas embrionarias (globular,
a la embriognesis somtica debido a la corazn y torpedo).
sensibilidad diferencial a los reguladores
78
Se encontraron malformaciones en el deformaciones, protuberancias, torcedura

desarrollo del 16.86 % de los embriones, que del eje radical, detalladas en la Figura 10.
presentaron fusiones entre 2 o 3 embriones,
Figura 10. Malformacin de los embriones observados en el estereoscopio (1.6X). A) embriones

fusionados. B) embrin desarrollando slo eje radical. C) embrin sin forma especfica. D) embrin con
protuberancia lateral. E) embrin con torcedura del eje radical.
El uso de medio lquido ha permitido la anormalidades morfolgicas, desarrollo

proliferacin y la produccin en masa asincronizado y tamao heterogneo. Este
de embriones somticos en recipientes estudio evidencia dichos problemas en
como erlenmeyers o en biorreactores para el porcentaje considerablemente alto de
C. arabica y C. canephora (Santana, 2004; embriones anormales que podra deberse
Quiroz-Figueroa et al., 2002; Von, 2002; a la elevada densidad de embriones en
Etienne y Berthougly, 2002; Etienne-Barry la tarrina o bien a la concentracin de
et al., 1999 y Zamarripa et al., 1991), aunque reguladores de crecimiento en el medio de
desafortunadamente existen problemas de cultivo (Barreto, 2003).
calidad en los embriones que pueden ser:
79
CONCLUSIONES AGRADECIMIENTOS
El tratamiento fitosanitario con un A la Escuela Politcnica del Ejrcito
fungicida sistmico AMISTAR, al cual fueron y al Laboratorio de Cultivo de Tejidos
sometidas las plantas mantenidas en inver- Vegetales, que financiaron la presente
nadero ayud a que exista bajo porcentaje investigacin.
de contaminacin en condiciones in vitro.
El uso de hipoclorito de sodio al
1.5 % con tiempos de inmersin de 15 y 20 Barreto CA. 2003. Evaluacin de tres den-
minutos, lograron controlar eficientemente sidades de siembra y dos frecuen-
la contaminacin (0 % de explantes con- cias de inmersin en biorreactor tipo
taminados) y presentaron bajos porcentajes RITA, sobre la calidad morfolgica
de oxidacin (10 %). de embriones somticos de caf
(Coffea arabica L.) Tesis de Maestra en
Los biorreguladores de crecimiento Ciencias, Centro Agronmico Tropi-
2,4-D y Kinetina resultaron beneficiosos en cal de Investigacin y Enseanza.
la induccin de callo de hoja de caf y el Turrialba, Costa Rica.
mejor fue el tratamiento 5 (0.5 mgL-1 2,4-D
y 2 mgL-1 KIN). Cevallos M, Snchez I y Montes S. 2002.
Caracterizacin Histolgica de la
En medio lquido la toma de nutrien- Embriognesis en Coffea canephora
tes es mucho ms eficiente y los embriones P. var. Robusta. Proteccin Vegetal,
se pueden obtener a los 20 das de cultivo. 17: 1419.
El sistema casero, en el cual los callos De Feria M, Jimnez E, Barbn R, Capote

estuvieron inmersos todo el tiempo en el A, Chvez M y Quiala E. 2005. Dife-
medio de cultivo, result ser ms eficiente renciacin y germinacin de em-
al momento de generar embriones, en briones somticos de Coffea arabica
comparacin con el SIT automatizado, L. cv. Catimor 9722 obtenidos en
en donde no se obtuvo ningn resultado, agitador orbital. Biotecnologa Vege-
debido a que no se utilizaron callos tal, 5(2): 95101.
embriognicos verificados mediante una
prueba histolgica y luego a que el sistema Delgado P, Larco A, Garca C, Alcvar R,
no era el adecuado para el desarrollo de la Chiln W y Patio M. 2002. Caf en
embriognesis ya que segn bibliografa el Ecuador: Manejo de la broca del
el sistema de inmersin RITA, es el que fruto /Hypothenemus hampei/
mejores resultados ha dado en cuanto Ferrari. Informe de terminacin del
a produccin en masa de embriones proyecto manejo integrado de la
somticos en diferentes especies. broca del caf. Pgina de Internet:
80
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83
Inhibicin de enterobacterias portadoras de carbapenemasas con
secreciones peptdicas de anfibios nativos ecuatorianos
Camila Cilveti1, Miryan Rivera2, Mercedes Rodrguez Riglos1 e Iliana Alcocer1

1
Laboratorio de Microbiologa, Escuela de Ciencias Biolgicas, Pontificia Universidad Catlica del Ecuador,
Quito, Ecuador
camicilveti@gmail.com
2
Laboratorio de Citogentica de Anfibios, Escuela de Ciencias Biolgicas, Pontificia Universidad Catlica del
Ecuador, Quito, Ecuador
RESUMEN.- La resistencia bacteriana representa un problema para la salud pblica,

especialmente la producida por enzimas llamadas betalactamasas, que bloquean a un
grupo importante de antibiticos, los betalactmicos, utilizados ampliamente para
el tratamiento de infecciones en seres humanos. Las enterobacterias productoras de
betalactamasas de espectro extendido (BLEEs) son las ms preocupantes, pues son un
grupo importante dentro de la etiologa de las infecciones tanto severas como no severas.
Los carbapenemes son antibiticos betalactmicos para el tratamiento de infecciones
causadas por enterobacterias BLEE, que estn resultando ineficientes por el aparecimiento
de cepas resistentes a estos antibiticos. Ante la escasez de otras opciones teraputicas,
el presente estudio tuvo como objetivo caracterizar molecularmente carbapenemasas en
enterobacterias y analizar su posible inhibicin con secreciones peptdicas de un bufnido
nativo ecuatoriano. Se caracterizaron 57 enterobacterias resistentes a carbapenemes
de pacientes hospitalizados. Esta poblacin fue caracterizada molecularmente,
encontrndose los genes blaKPC, blaGES, blaVIM y blaIMP. Los genes con mayor prevalencia
fueron blaKPC y blaGES, seguidos por blaVIM y blaIMP. Todos los aislados fueron inhibidos por
el pptido. La concentracin inhibitoria mnima fue 250 g/ml para Klebsiella pneumoniae,
Serratia marcescens, Enterobacter aerogenes y E. cloacae, 125 g/ml para Morganella morganii,
62.5 g/ml para Klebsiella oxytoca y Serratia rubidaea y 31.3 g/ml para Escherichia coli. La
presencia de genes para betalactamasas en elementos mviles facilita su propagacin.
Por esta razn la importancia de analizar nuevos compuestos antimicrobianos.
PALABRAS CLAVES: betalactamasas, carbapenemes, concentracin inhibitoria mnima,

resistencia bacteriana, secreciones peptdicas
85
ABSTRACT.- Bacterial resistance to antibiotics represents a major public health problem,

especially resist the one produced by betalactamases enzymes, which block an important
antibiotic group, the betalactamic antibiotics. These antibiotics are widely used for the
treatment of human infections. Extended spectrum betalactamase producing bacteria
(ESBL) are of the greatest concern, since they are an important group in the etiology of
both severe and non-severe infections. Carbapenems are betalactamic antibiotics for
the treatment of ESBL bacterial infections and have become inefficient due to emerging
carbapenem resistant strains. Given the lack of therapeutic options, the aims of this study
were the molecular characterization of carbapenemase producing bacteria and possible
inhibition of this enzyme with peptid secretions of a native Ecuadorian bufonid frog
(Anura: Bufonidae). Fifty-seven carbapenem resistant enteric bacteria from hospitalized
patients were characterized. The blaKPC, blaGES, blaVIM and blaIMP genes were molecularly
identified from bacteria. The most prevalent genes were blaKPC y blaGES, followed by blaVIM
and blaIMP. Carbapenemase activity from every isolate was inhibited by the bufonid peptide.
The minimal inhibitory concentration was 250 g/ml for Klebsiella pneumoniae, Serratia
marcescens, Enterobacter aerogenes and Escherichia cloacae, 125 g/ml for Morganella morganii,
62.5 g/ml for Klebsiella oxytoca and Serratia rubidaea and 31.3 g/ml for Escherichia coli.
The betalactamase genes present in motile genetic elements facilitate the spread of these
genes in bacterial populations. It is important to analyze new antimicrobial compounds to
combat the spread of antibiotic-resistant bacterial pathogens.
KEYWORDS: betalactamase, carbapenem, minimal inhibitory concentration, bacterial

resistance, peptidic secretions
INTRODUCCIN en pacientes crticamente enfermos. Los

A nivel mundial, la resistencia anti- agentes ms comnmente utilizados para
microbiana ha aumentado rpidamente, tratar infecciones de bacterias gram
particularmente en el ambiente hospitalario. negativas resistentes son los betalactmi-
Los microorganismos resistentes representan cos, fluoroquinolonas, aminoglucsidos,
un grave peligro para la vida de los pacientes polimixinas y tigeciclina (Fraimow y Tsigrelis,
que ingresan con diferentes patologas a los 2011).
hospitales (Zurita, 2012; del Ro et al., 2007).
Dentro de los betalactmicos estn los
Las infecciones causadas por bacte- carbapenemes que son tradicionalmente
rias gram negativas resistentes traen como considerados antibiticos de la ltima
consecuencia alta morbilidad y mortalidad lnea de defensa contra bacterias gram
86
Camila Cilveti, Miryan Rivera, Mercedes Rodrguez Riglos e Iliana Alcocer
INHIBICIN DE ENTEROBACTERIAS PORTADORAS DE CARBAPENEMASAS
CON SECRECIONES PEPTDICAS DE ANFIBIOS NATIVOS ECUATORIANOS
negativas resistentes, especialmente caractersticas superadoras respecto de los

para aquellos patgenos que producen actualmente disponibles (Torcato et al.,
betalactamasas de espectro extendido, 2012; Takahashi et al.,2010).
BLEE. Sin embargo, el uso excesivo de
estos antimicrobianos gener la aparicin Los pptidos antimicrobianos son
de resistencia a este grupo de antibiticos armas evolutivamente antiguas y su
(Findlay et al., 2012). Este tipo de resistencia amplia distribucin en los reinos Animalia
se da por la produccin de betalactamasas, y Plantae sugiere que estos han cumplido
que es el mecanismo ms frecuente de un papel fundamental en el xito evolutivo
resistencia bacteriana para este grupo de organismos complejos (Rudi et al., 2010;
de antimicrobianos. Estas enzimas son Rollins-Smith et al., 2005; Papo y Shai, 2003).
numerosas, y mutan continuamente en
respuesta a la fuerte presin ejercida Para poder interactuar con la clula
por el uso de antibiticos, lo cual lleva al diana, los AMPs deben pasar por cambios
desarrollo de nuevas betalactamasas. Desde conformacionales. En el agua, su estructura
su descripcin inicial, se han identificado debe ser hidroflica. Sin embargo, cuando
alrededor de 900 betalactamasas y de estas, interactan con las membranas, estos
ms de 300 son de tipo BLEE (Zurita, 2012). deben exponer una regin hidrofbica al
constituyente lipdico de la membrana
A pesar de todo el progreso en (Urbn et al., 2007; Shai, 2002).
el descubrimiento de nuevos agentes
antimicrobianos, la prevalencia de las Todos los pptidos deben interactuar
bacterias resistentes ha aumentado y con la membrana citoplasmtica, aunque
el nmero de antibiticos aprobados su blanco sea intracelular. Actualmente, se
ha decado. Debido a las pocas opciones sabe que muchos pptidos antimicrobianos
teraputicas, se ha iniciado una bsqueda de no causan la permeabilizacin de la
compuestos que puedan inhibir el crecimiento membrana en la concentracin mnima
de bacterias resistentes. Las glndulas efectiva y, sin embargo, causan la muerte
granulares presentes en la piel de los anuros, celular. Un creciente nmero de pptidos
sintetizan y almacenan polipptidos han demostrado translocarse a travs de la
de amplio espectro de actividad membrana y acumularse en el citoplasma,
antimicrobiana. En la piel de los anuros donde actan en una variedad de procesos
estos pptidos se movilizan rpidamente celulares para mediar la muerte celular.
despus de una infeccin microbiana y El AMP buforin II se transloca a travs
actan de una manera gil para neutralizar de la membrana bacteriana sin causar la
un amplio rango de microbios. Los anfibios permeabilizacin y se une tanto al DNA
generan pptidos antimicrobianos (AMPs) como al RNA dentro del citoplasma de
que por sntesis qumica podran convertirse E. coli (Jenssen et al., 2006; Hancock y
en nuevos agentes antimicrobianos con Chapple, 1999).
87
La seleccin positiva sobre los genes Enterobacter aerogenes, Escherichia coli,

de AMPs es muy comn y resulta en Serratia rubidaea y Morganella morganii.
una gran diversidad funcional de estas Los aislados provienen de pacientes con
molculas entre las especies y entre los loci diversas patologas atendidos en la red
de muchos taxa (Tennessen y Blouin, 2008). de salud pblica y privada y donados por
Por lo tanto, el estudio de los pptidos Zurita&Zurita Laboratorios.
antimicrobianos es de gran importancia,
porque tienen gran potencial como base Los aislados clnicos bacterianos
para el desarrollo de nuevos agentes que fueron identificados fenotpicamente
permitan controlar a microorganismos como resistentes a carbapenemes por
multirresistentes, hongos, protozoos e Zurita&Zurita Laboratorios, de modo que
incluso virus. El potencial uso biomdico la poblacin de estudio del presente anlisis
de estas secreciones abre un camino en la representa nicamente a la poblacin
bsqueda de soluciones farmacolgicas a resistente a carbapenemes que fueron
los problemas de salud pblica. Adems, encontrados.
el estudio de las secreciones de especies
endmicas ecuatorianas es de gran Los aislados se mantienen conser-
importancia, porque aporta otra razn para vados a -20 C, a -80 C en caldo Infusin
la proteccin y conservacin de anfibios Cerebro Corazn (BHI por sus siglas en ingls
que se encuentran en peligro de extincin. Brain Heart Infusion, DifcoTM), con 30 %
Es por esto que el objetivo de este estudio fue de glicerol y a temperatura ambiente en
comprobar la inhibicin de enterobacterias agar nutriente, como parte de la Coleccin
portadoras de carbapenemasas con Bacteriana Quito Catlica (CB-QCA).
secreciones peptdicas de anfibios nativos
ecuatorianos, identificacin molecular de Deteccin molecular de la presencia
dichas enzimas y determinar su prevalencia de los genes.- Para la extraccin de DNA
relativa en aislados clnicos obtenidos en se utiliz el equipo comercial de extraccin
un centro de Ecuador. Wizard Plus SV Minipreps DNA
Purification System, con sujecin a las
MATERIALES Y MTODOS recomendaciones del fabricante.
Poblacin de estudio.- Se analizaron
57 aislados: 28 aislados de Serratia Para la amplificacin de cada gen
marcescens, 22 aislados de Klebsiella se utilizaron primers especficos segn la
pneumoniae, 2 aislados de Enterobacter Tabla 1.
cloacae, y 1 aislado de Klebsiella oxytoca,
88
Tabla 1
Set de Primers utilizados para la deteccin de los genes
Primer Secuencia Blanco Amplicn Referencia
KPC forward CGGAACCATTCGCTAAACTC blaKPC 738 pb Iiguez et al., 2010

KPC reverse GGCCTCGCTGTRCTTGTCAT blaKPC 738 pb Iiguez et al., 2010
GES 1A forward ATGCGCTTCATTCACGCAC blaGES 864 pb Poirel et al., 2000
GES 1B reverse CTATTTGTCCGTGCTCAGG blaGES 864 pb Poirel et al., 2000
VIM forward GTTTGGTCGCATATCGCAAC blaVIM 500 pb Pitout et al., 2005
VIM reverse AATGCGAGCACCAGGATAG blaVIM 500 pb Pitout et al., 2005
IMP forward GAAGGYGTTTATGTTCATAC blaIMP 587 pb Pitout et al., 2005
IMP reverse GTAMGTTTCAAGAGTGATG blaIMP 587 pb Pitout et al., 2005
Los programas de amplificacin de diluidos en tampn TBE (1X), en tampn

los genes se realizaron en el termociclador de corrida TBE (0.5X). Se emple como
Multigene Gradient 080845 de Labnet marcador de peso molecular ADN de
International Inc y fueron diseados en el 100 pb (Invitrogen). La tincin del gel se
Laboratorio de Microbiologa. El programa realiz con SYBR Gold (InvitrogenTM) y
para los genes blaKPC y blaGES consisti en una la visualizacin de las bandas se realiz en
denaturacin inicial a 94 C por 5 minutos, el sistema de captura de imagen Molecular
seguido de 35 ciclos de denaturacin a 94 Imager Gel DocTM XR+ (BIO-RAD).
C por 30 segundos, hibridacin de 55 C
durante 30 segundos y extensin de 72 C Extraccin de la secrecin peptdica
por 30 segundos; por ltimo, un perodo de de una especie de bufnido.- La extraccin
extensin final de 10 minutos a 72 C. de la secrecin peptdica se realiz en
32 individuos pertenecientes a la familia
El programa para amplificar los genes Bufonidae preservados en la Balsa de los
blaVIM y blaIMP consisti de una denaturacin Sapos de la PUCE. Todo el pptido obtenido
inicial de 95 C por 5 minutos, seguido de los individuos fue reunido y probado
de 30 ciclos de denaturacin a 95 C por como uno solo. No hubo diferenciacin ni
1 minuto, hibridizacin de 52 C por 1 por individuo ni por generacin.
minuto y una extensin de 72 C por 2
minutos y un perodo de extensin final de Para la extraccin peptdica se
10 minutos a 72 C. estimul a la rana mediante masajes a lo
largo del dorso durante 30 segundos y luego
Los productos de la PCR fueron un lavado de 30 segundos con agua MiliQ;
analizados por electroforesis (125 V, este proceso se repiti 3 veces para poder
50 minutos) en geles de agarosa al 1 % recolectar la mayor cantidad de secrecin
89
posible. Los pptidos diluidos fueron Invitrogen) (Wiegand et al., 2008).

colectados en una caja Petri y congelados a
-80 C para su posterior liofilizacin, para El resultado fue ledo en un lector
poder realizar los ensayos de sensibilidad de ELISA en el Centro de Investigacin
antibitica. Esto se realiz en la Balsa de los de Enfermedades Infecciosas (CIEI) de la
Sapos de la PUCE. PUCE a una longitud de onda de 620 nm.

La liofilizacin se ejecut en el Anlisis estadstico.-
Se realiz un
Laboratorio de Citogentica de Anfibios ANOVA de un factor, una regresin Probit
de la PUCE en el equipo VirTis adVantage y una transformacin de datos en el pro-
Plus con un programa de 16 horas diseado grama estadstico PASW Statistics versin
en el laboratorio especficamente para 18 (Snchez-Otero, 2010).
pptidos catinicos.
RESULTADOS
Determinacin de la concentracin Deteccin molecular de la presencia
inhibitoria mnima (CIM) de la secrecin de los genes.- La visualizacin de la
cutnea del bufnido.- Se utiliz la tcnica PCR permiti identificar las diferentes
de microdilucin en caldo. Se realizaron bandas de los cuatro genes analizados.
10 diluciones seriadas (2000 g/ml, 1000 Al compararlas con la escalera de peso
g/ml, 500 g/ml, 250 g/ml, 125 g/ molecular se pudo evidenciar una banda de
ml, 62.5 g/ml, 31.3 g/ml, 15.6 g/ml, 738 pb que corresponde al gen blaKPC, una
7.8 g/ml y 3.9 g/ml) de los pptidos banda de 864 pb perteneciente al gen blaGES,
diluidos en 0.01 % de cido actico y 0.2 % una de 500 pb del gen blaVIM y una de 587
de Albmina Srica Bovina (BSA por sus pb que corresponde al gen blaIMP (Figura 1).
siglas en ingls Bovine Serum Albumin,
Figura 1. Geles representativos de la amplificacin de los genes correspondientes a la resistencia a los car-
bapenemes. 1a. Genes blaGES y blaKPC en los aislados clnicos. 1 y 4, marcador de peso molecular (100 -2000
pb); 2, gen blaGES con un peso molecular de 864 pb; 3, blaKPC con un peso molecular de 738 pb. 1b. Genes
90
blaVIM y blaIMP en los aislados clnicos. 1 y 4, marcador de peso molecular (100-2000 pb); 2, gen blaVIM con
un peso molecular de 500 pb; 3, gen blaIMP con un peso molecular de 587 pb.
De los 57 aislados analizados, 52 (91.2 %) 1 aislado (1.8 %) present el gen blaIMP

presentaron el gen blaKPC, 5 (8.7 %) el gen (Figura 2), con inclusin de los primeros
blaGES, 4 (7.0 %) el gen blaVIM y nicamente registros de resistencia a carbapenemes para
Figura 2. Frecuencia en la presencia de genes codificantes para betalactamasas en los aislados hospitalarios
analizados entre noviembre de 2009 a mayo de 2012. Esta poblacin fue previamente seleccionada y solo se
encuentran los aislados resistentes a carbapenemes durante el perodo de anlisis.
Serratia marcescens, Escherichia coli, Morganella pertencen a Serratia marcescens, 22 (42.3 %)

morganii, Enterobacter aerogenes y Enterobacter son Klebsiella penumoniae y Enterobacter
cloacae. En 9 ocasiones se encontr ms de un cloacae, Enterobacter aerogenes, Morganella
gen en la misma cepa bacteriana. morganii, Escherichia coli, Serratia rubidaea y
Klebsiella oxytoca presentan nicamente un
De los 52 aislados que presentaron aislado (1.9 %) cada uno (Figura 3).
resistencia a los carbapenemes, 24 (46.1 %)
Figura 3. Porcentaje de aislados hospitalarios resistentes a carbapenemes por especie.
91
Determinacin de la concentracin Los resultados del ANOVA mostraron

inhibitoria mnima 50 (CIM-50) de la que no existen diferencias entre los grupos
secrecin cutnea del bufnido.- Se con una significacin de 0.154 en los datos
analizaron 57 bacterias de aislados clnicostransformados y una significacin de 0.830
con secreciones peptdicas provenientes de en los datos originales. El anlisis se realiz
32 individuos pertenecientes a la familia en tres especies: Klebsiella pneumoniae, Serratia
Bufonidae. marcescens y Enterobacter cloacae, debido
a que las especies Enterobacter aerogenes,
Los resultados de los valores del Morganella morganii, Klebsiella oxytoca y
pptido que eliminan a por lo menos el Serratia rubidaea presentaron nicamente
50 % de las bacterias, mostraron que para un aislado clnico y las pruebas estadsticas
Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, requieren, para estas especies, de ms datos.
y Enterobacter, tanto E. aerogenes como
E. cloacae, el valor es de 250 g/ml, para DISCUSIN
Morganella morganii el valor de la CIM-50 A pesar que la resistencia antibitica
es de 125 g/ml, para Klebsiella oxytoca y ha sido motivo de preocupacin desde la
Serratia rubidaea es de 62.5 g/ml y para introduccin de la penicilina, las ltimas
Escherichia coli es de 31.3 g/ml como se dos dcadas han mostrado un aumento
puede ver en la Figura 4. significativo en la resistencia, especialmente
Figura 4. Figura representativa de la Concentracin Inhibitoria Mnima 50 de la secrecin peptdica de un

bufnido para las especies analizadas.
92
relacionada con los betalactmicos. Esta Este gen se encuentra principalmente en

resistencia se ha convertido en la principal Pseudomonas aeruginosa; sin embargo, se
preocupacin tanto dentro como fuera del han encontrado bacterias de la familia
ambiente hospitalario (Bush, 2010). Enterobacteriaceae que presentan este gen.
La frecuencia (8.7 %) de la presencia de este
Se ha demostrado que las entero- gen concuerda con anlisis de prevalencia
bacterias, Pseudomonas aeruginosa y otras de carbapenemasas que revelan su poca
bacterias gram negativas, productoras de frecuencia en Latinoamrica, como se
betalactamasas, son responsables de hasta ha mencionado previamente (Walther-
un 60 % de las muertes en sujetos interna- Rasmussen y Hoiby, 2007).
dos en la unidad de cuidados intensivos
(del Ro et al., 2007; Walther-Rasmussen y En cuanto a los genes blaVIM y blaIMP
Hoiby, 2007). que codifican para metalo-betalactamasas,
se encontr una frecuencia de 7.0 % y
En vista de este alto porcentaje de 1.8 %; respectivamente. Estos resultados
mortalidades es necesaria la identificacin concuerdan con estudios en donde plantean
gentica de la resistencia a carbapenemes. que las enzimas metalo-betalactamasas
Los resultados de este estudio demuestran se han expandido rpidamente alrededor
que, dentro de la poblacin previamente del mundo y dentro de estas se destacan
seleccionada como productora de dos grupos principales comunes: VIM
carbapenemasas, hay una frecuencia de e IMP. El grupo VIM, especialmente
91.2 % de bacterias con el gen blaKPC. A pesar la variante VIM-2, es el que se asla de
que en el ao 2007 Walther-Rasmussen manera predominante en todo el mundo,
et al., determinaron que la presencia con inclusin de Latinoamrica. Adems, a
de enzimas tipo serin-betalactamasas pesar que la produccin de IMP se ha visto
predomina en Norteamrica, Asia y incrementada en Amrica en los ltimos
Europa, es necesario recalcar que las aos, en pases como Argentina, Chile,
enzimas KPC son las ms frecuentes dentro Colombia y Ecuador, la frecuencia de esta
del grupo y con mayor diseminacin entre enzima contina menor que la de VIM
Enterobacterias (Zurita, 2012; Nguyen (Zurita, 2012; Coln et al., 2009).
et al., 2010), como fue sealado en el alerta
realizado por Argentina, que en el ao 2010 Debido al aumento de la resistencia a
encontraron una prevalencia del 86.0 % de antimicrobianos, especialmente a carbepe-
patgenos portadores de KPC en todos los nemes en enterobacterias, en este estudio
aislados clnicos del ao (Malbrn, 2010). se analiz la actividad antimicrobiana de
las secreciones peptdicas de una especie
El gen blaGES fue identificado en 5 perteneciente a la familia Bufonidae, en
(8.7 %) de los aislados portadores de genes contra de las bacterias previamente iden-
que codifican para serin-betalactamasas. tificadas como productoras de carbape-
93
nemasas. Estas secreciones en bufnidos Este estudio representa el primer

pueden contener esteroides como bufoge- reporte de actividad antimicrobiana de
ninas y bufotoxinas que estn involucradas la secrecin peptdica de esta especie y
en la defensa qumica en contra de micro- fue basado en la investigacin realizada
organismos (Jared et al., 2009). por Caicedo (2007) en el cual se utiliz
la secrecin cutnea de una especie de
En los resultados de la CIM-50 de las la familia Hylidae y demostr su alta
secreciones con las diferentes bacterias, po- actividad antimicrobiana a concentraciones
demos ver que para Klebsiella pneumoniae, desde 2000 g/ml.
Serratia marcescens y Enterobacter, tanto E.
cloacae como E. aerogenes, el valor es de Sin embargo, Caicedo (2007) estableci
250 g/ml, el ms alto del estudio. que aquellas bacterias con CIM-50 peptdica
igual o menor a 250 g/ml se consideraban
En el caso de Klebsiella pneumoniae como cepas inhibidas por las secreciones
y Enterobacter, tanto E. aerogenes como E. peptdicas y que cada bacteria reacciona de
cloacae, estas cuentan con una cpsula de manera independiente a las secreciones. En
polisacridos (ms gruesa en Klebsiella) base a esto se puede determinar que todas
que las hace ms impermeables hacia las bacterias analizadas son inhibidas por
diferentes protenas. Adems, al ser esta las secreciones peptdicas del bufnido
cpsula mucosa, dificulta el movimiento con una CIM igual o menor a 250 g/
del pptido hacia la membrana externa ml. Estudios previos de Chuang 2012,
con explicacin del alto valor de CIM-50 demuestran que los pptidos extrados
necesario (250 g/ml). de individuos de la familia Hylidae no
solo eliminan bacterias sino que tambin
Los anlisis estadsticos muestran destruyen clulas cancergenas a las
que no existe diferencia significativa entre mismas concentraciones (250 g/ml).
los grupos; es decir que el comportamiento
bsico de las tres especies analizadas frente Estos resultados pueden dar paso a
al pptido es similar. estudios posteriores que puedan purificar
la secrecin total de la piel de los anfibios
Morganella morganii, Klebsiella oxytoca, pertenecientes a la familia Bufonidae y as
Serratia rubidaea y Escherichia coli presentan identificar las molculas presentes en la
un valor de CIM que se encuentra entre secrecin cutnea. Una vez identificados
31.5 g/ml y 125.0 g/ml; en estos casos los componentes de la secrecin, se pueden
al tener nicamente un aislado clnico no sintetizar molculas anlogas con mayor
es posible realizar pruebas estadsticas actividad antimicrobiana. Dentro de esta
que ayuden a agrupar a estas especies de familia existe la produccin de un pptido
acuerdo con su comportamiento frente al antimicrobiano llamado Buforin II, que
pptido antimicrobiano. destruye a la clula e impide la produccin
94
de protenas y la sntesis de DNA (Wang, la gente y a prevenir la destruccin de sus

2010). Las molculas sintetizadas de Buforin hbitats.
II muestran una actividad antimicrobiana,
con CIM menor a 4 g/ml (Cho et al., CONCLUSIONES
2009). Adems, las dermaseptinas son Los resultados del presente
una familia de pptidos aislados de varias estudio representan el primer reporte
ranas del gnero Phyllomedusa spp. Los de actividad antimicrobiana de las
derivados sintticos de la dermaseptina, secreciones peptdicas de una especie de
como la dermaseptina S4 tienen actividad bufnido con enterobacterias resistentes
antimicrobiana con CIM menores a 100 a los carbapenemes. Todos los aislados
g/ml (Zairi et al., 2007). Estos ejemplos estudiados fueron inhibidos por la
demuestran la necesidad de continuar con secrecin cutnea del bufnido.
estudios que permitan, a futuro, sintetizar
nuevos compuestos derivados de molculas Los genes que codifican para serin-
secretadas de bufnidos que tengan el carbapenemasas blaKPC y blaGES fueron
potencial de eliminar bacterias a menores identificados con ms frecuencia (91.2 %
concentraciones inhibitorias mnimas. y 8.7 %) que aquellos que codifican para
metalo-betalactamasas (7.0 % bla VIM y
En vista de la gravedad a la cual 1.8 % blaIMP).
nos estamos enfrentando actualmente
con la resistencia bacteriana en ambientes Este estudio demuestra por primera
hospitalarios y al alto potencial de vez en el Ecuador, genes que codifican
transmisin de cepas con resistencia KPC en especies como Serratia marcescens,
antibitica mltiple, se puede comprender la Escherichia coli, Morganella morganii,
importancia de la bsqueda de compuestos Enterobacter aerogenes y Enterobacter cloacae.
con potencial actividad antimicrobiana,
que sean esperanzadores para ayudar AGRADECIMIENTOS
a controlar este problema. Este estudio Las autoras desean agradecer a
pretende ayudar a proveer informacin Zurita&Zurita Laboratorios por la donacin
acerca de una posible fuente de agentes de cepas para el estudio. Al grupo de
antimicrobianos que ayuden a minimizar trabajo del laboratorio de Microbiologa
este problema, adems de ampliar la de la Escuela de Ciencias Biolgicas de la
investigacin de la resistencia bacteriana PUCE, al laboratorio de Citogentica
en el Laboratorio de Microbiologa de de Anfibios, a la Balsa de los Sapos, al
la Pontificia Universidad Catlica del Centro de Investigacin de Enfermedades
Ecuador. Adicionalmente, el contar con Infecciosas y a la Pontificia Universidad
secreciones de una especie de anfibio Catlica del Ecuador por el apoyo econmico
endmica del Ecuador, puede ayudar a que hizo posible este estudio a travs del
crear una conciencia de conservacin en proyecto Genotipaje de la resistencia a
95
antimicrobianos en bacterias entricas carbapenemasas y su relacin con

productoras de carbapenemasas y su posible estructuras genticas en aislamientos
inhibicin con secreciones peptdicas de clnicos de Acinetobacter baumannii
anfibios con potencial de uso biomdico. de hospitales de la ciudad de
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Pontificia Universidad Catlica del Ecuador, Escuela de Ciencias Biolgicas,
Laboratorio de Biologa del Desarrollo
Quito, Ecuador. edelpino@puce.edu.ec
RESUMEN.- Se analizaron y compararon las caractersticas de la neurulacin, morfologa

interna de los embriones desde la nurula hasta la eclosin del renacuajo y el modo de
miognesis de dos especies de ranas de la familia Dendrobatidae (Hyloxalus vertebralis
y Dendrobates auratus) con otras especies de la misma familia y Xenopus laevis. Se realiz
este anlisis debido a que los huevos de H. vertebralis y D. auratus tienen el tamao ms
grande detectado hasta ahora en la familia Dendrobatidae (2.6 y 3.5 mm de dimetro,
respectivamente). La morfologa interna de los embriones y la neurulacin de H. vertebralis
y D. auratus fueron similares a lo observado en X. laevis y otros Dendrobatidae. Se observ
retraso en la diferenciacin del cerebro en estas especies en comparacin con X. laevis.
La miognesis de H. vertebralis y D. auratus ocurre por interdigitacin celular como en
Bombina variegata (Bombinatoridae), cuatro especies adicionales de Dendrobatidae, dos
especies de Leiuperidae y una especie de Hemiphractidae. El estudio comparativo permite
documentar la diversidad de programas del desarrollo entre los anuros y contribuir al
conocimiento de la fauna ecuatoriana.
PALABRAS CLAVES: mesodermo presomtico, miognesis, neurulacin, somitognesis,

Xenopus laevis
ABSTRACT.- The features of neurulation and internal morphology of the embryos and
the mode of myogenesis were analyzed and compared from the neurula stage until
tadpole hatching in two species of the family Dendrobatidae (Hyloxalus vertebralis and
Dendrobates auratus) in comparison with other species of the same family and Xenopus
laevis. This analysis was undertaken because the eggs of H. vertebralis and D. auratus are
among the largest detected in the family Dendrobatidae (2.6 and 3.5 mm of diameter,
respectively). Internal morphology and neurulation in H. vertebralis and D. auratus were
99
similar with the features of X. laevis and other Dendrobatidae. There was retardation in
the differentiation of the brain in these species in comparison with X. laevis. The mode
of myogenesis of H. vertebralis and D. auratus occurs by cell interdigitation as found
in Bombina variegata (Bombinatoridae), four additional species of Dendrobatidae, two
species of Leiuperidae, and one species of Hemiphractidae. The comparative analysis
allows documentation of the diversity of developmental programs among anurans and
represents a contribution to the better knowledge of the ecuatorian fauna.
KEYWORDS: myogenesis, neurulation, presomitic mesoderm, somitogenesis, Xenopus

laevis
INTRODUCCIN Dendrobatidae. Las ranas dendrobtidas

Los mecanismos del desarrollo estn caracterizadas por grandes diferencias
temprano de los vertebrados son altamente en el tamao de sus huevos de acuerdo con
conservados (Pourqui, 2003); pero se han las especies. Los embriones de las especies
encontrado diferencias en estos procesos, analizadas se desarrollan a partir de huevos
al comparar especies cercanamente muy grandes (2.63.5 mm de dimetro). Su
relacionadas (Pourqui, 2001). Incluso desarrollo es lento, en comparacin con el
dentro de los anfibios existen diferencias desarrollo rpido descrito para Xenopus laevis,
fundamentales en el desarrollo temprano la rana modelo de la Biologa del Desarrollo
(Elinson y del Pino, 2012). Lo que ha llevado (del Pino et al., 2007; del Pino et al., 2004).
a sugerir que la historia evolutiva de cada El desarrollo temprano de varias especies
especie puede haber determinado una de Dendrobatidae, ha sido estudiado con
divergencia en los procesos del desarrollo amplitud en el Laboratorio de Biologa del
de los anfibios (Radice et al., 1989). Esta Desarrollo de la Pontificia Universidad
divergencia puede ser el resultado de la largaCatlica del Ecuador (PUCE). Las
historia filogentica de los anfibios, o de las
investigaciones realizadas en el Laboratorio
adaptaciones sufridas por los embriones de Biologa del Desarrollo de la PUCE,
para poder desarrollarse en diferentes sobre la embriognesis de varias especies
ambientes (Elinson y del Pino, 2012). de la familia Dendrobatidae, han aportado
con informacin invaluable para el estudio
En este estudio se analizaron las comparativo del desarrollo embrionario
caractersticas de la neurulacin, morfologa temprano (Elinson y del Pino, 2012).
interna de los embriones desde la nurula
hasta la eclosin del renacuajo y el modo Hyloxalus vertebralis y D. auratus tienen
de miognesis de embriones de Hyloxalus una distribucin geogrfica diferente.
vertebralis y Dendrobates auratus, familia Hyloxalus vertebralis es una rana ecuatoriana
100
Francisca Hervas Sotomayor y Eugenia M. del Pino
DESARROLLO NEURAL, SOMITOGNESIS Y MORFOLOGA INTERNA DE LOS EMBRIONES
DE Hyloxalus vertebralis Y Dendrobates auratus (ANURA: DENDROBATIDAE)
endmica, que habita en los bosques caudal y son bloques de clulas que se
nublados de Los Andes del sur del Ecuador separan de manera secuencial y sincrnica
(Coloma et al., 2011). Adems, D. auratus del mesodermo presomtico (Radice et al.,
se distribuye en Centroamrica y la parte 1989). De los somitas se originarn los tejidos
norte de Suramrica (Sols et al., 2004). Las seo, cartilaginoso, muscular y la dermis
dos especies depositan sus huevos en nidos (Krneta-Stankic et al., 2010; Mallo et al., 2009;
terrestres sobre la hojarasca. Los embriones Wolpert et al., 2007; Radice et al., 1989).
reciben cuidado parental por parte del
macho, y en el momento de la eclosin, este El proceso de diferenciacin de
los lleva en su espalda hacia una fuente de los mioblastos que formarn las fibras
agua (Coloma et al., 2011; Sols et al., 2004). musculares se conoce como miognesis
El dimetro del huevo de H. vertebralis es (Radice et al., 1989). La miognesis en X. laevis
de aproximadamente 2.6 mm y el huevo ocurre por rotacin celular (Radice et al., 1989;
de D. auratus es ms grande (3.5 mm de Youn y Malacinski, 1981; Hamilton, 1969).
dimetro). La velocidad del desarrollo de Se han encontrado modelos adicionales de
las dos especies se asemeja a la de otros miognesis en otros anfibios (Radice et al.,
dendrobtidos (del Pino et al., 2007). 1989). Los mioblastos pueden interdigitarse,
fusionarse o formar rosetas de acuerdo con las
En los anfibios, como en otros especies (Radice et al., 1989). Las diferencias
vertebrados, el desarrollo del sistema en el patrn de somitognesis podran
nervioso se inicia con la formacin del tubo estar ligadas a las diversas estrategias
neural (Harrington et al., 2009). Los primeros reproductivas que presentan los anfibios
indicios de la neurulacin, en los anfibios, (Radice et al., 1989). Adems, es probable
corresponden a la formacin de la placa que los diversos patrones de miognesis
neural que es la regin dorsal del ectodermo provean ventajas funcionales a cada especie o
que se encuentra por encima del notocordio. representen historias naturales especficas de
En los bordes laterales de la placa neural se cada linaje (Fan et al., 2001). Por eso el estudio
elevan los pliegues neurales, los mismos comparativo de la somitognesis dentro de
que finalmente se juntan y fusionan en la los linajes puede proporcionar informacin
lnea media para formar el tubo neural. El filogentica invaluable (Smetanick et al., 2000).
tubo neural se diferenciar en las partes del
cerebro y el cordn espinal en estadios ms El modo de miognesis por interdig-
avanzados del desarrollo (Wolpert et al., 2007). itacin celular ha sido descrito originalmente
para Bombina variegata (Kiebwna, 1981).
La somitognesis es el desarrollo de En este modo, el mesodermo presomtico y
los somitas a partir del mesodermo paraxial los somitas formados recientemente consis-
localizado a cada lado de la lnea media del ten de numerosos mioblastos, que son pe-
cuerpo (Mallo et al., 2009; Pourqui, 2003). queos, redondeados y sin arreglo especfico.
Los somitas se generan en sentido rostro- Conforme avanza el desarrollo, los mioblastos
101
se alargan e interdigitan, hasta finalmente especies fueron donadas al Laboratorio de

alcanzar la longitud del somita y quedar Biologa del Desarrollo de la PUCE para la
paralelos al notocordio (Kiebwna, 1981). realizacin de este trabajo.
Este modo de miognesis tambin ha sido
detectado en los embriones de Gastrotheca Los embriones fueron mantenidos en
riobambae (Hemiphractidae), Engystomops cmaras hmedas a temperatura ambiente
coloradorum, Engystomops randi (Leiuperi- del laboratorio, que fluctu entre 18 a
dae), y en las especies de Dendrobatidae: 23 C. Se analiz la morfologa desde la
Epipedobates anthonyi; Epipedobates boulengeri; nurula hasta la eclosin del renacuajo. La
Epipedobates machalilla y Epipedobates tricolor determinacin de los estadios del desarrollo
(del Pino et al., 2007; Moya, 2005; del Pino et as como el cultivo y procesamiento de los
al., 2004; Gatherer y del Pino, 1992). embriones fue de acuerdo con lo descrito
para E. machalilla (del Pino et al., 2004). Para
En esta investigacin se utiliz un analizar la morfologa de los embriones,
marco comparativo con respecto a otros estos fueron fijados en el reactivo de Smith.
dendrobtidos y a Xenopus laevis. Este Se observ la morfologa externa y se
trabajo aporta informacin complementaria realizaron secciones transversales, sagitales
al estudio de los eventos del desarrollo y horizontales de los embriones con un
temprano y al mejor conocimiento de las Vibratomo Oxford. Las secciones fueron
caractersticas del desarrollo de anuros teidas con el tinte fluorescente Hoechst 33
ecuatorianos. Cabe resaltar que H. vertebralis 258, el cual se acopla al ADN y posibilita
es una especie en peligro crtico de extincin la deteccin de ncleos celulares. Los
(Coloma et al., 2011) y por lo mismo es de embriones y secciones se observaron con los
particular inters documentar su desarrollo microscopios Stemi SV6 y AxioObserver.
embrionario. Z1 que permite microscopa de fluorescencia
(Carl Zeiss, Overkochen, Alemania). Se
MATERIALES Y MTODOS realiz microfotografa mediante las cmaras
Los ejemplares adultos de Hyloxalus Axiocam asociadas a ambos microscopios
vertebralis fueron colectados en Sevilla de y el programa de adquisicin de imgenes
Oro, provincia del Azuay por el personal de la Axiovision versin 4.6.3 (Carl Zeiss,
Divisin de Anfibios del Museo de Zoologa Overkochen, Alemania). Las imgenes fueron
de la PUCE y los adultos de Dendrobates editadas con el programa Adobe Photoshop
auratus provienen de una donacin del CS5 (Adobe Systems Incorporated).
Zoolgico de Atlanta, Georgia de Estados
Unidos. Las ranas fueron mantenidas en la RESULTADOS
mencionada Divisin de Anfibios del Museo Morfologa interna de los embriones
de Zoologa de la PUCE y su programa de de Hyloxalus vertebralis y Dendrobates
mantenimento en cautiverio de ranas, Balsa auratus desde la neurulacin hasta la
de los sapos. Las posturas de estas dos eclosin del renacuajo.- La morfologa
102
interna de la nurula de H. vertebralis (Fig. 1B). En la nurula tarda (estadio 16;

(Fig. 1A-C) y D. auratus (no se muestra) Fig. 1C), se observ el tubo neural resultante
fueron similares. En ambas especies, el de la fusin de los pliegues neurales (Fig.
inicio de la neurulacin estuvo marcado 1C). Durante los estadios de neurulacin se
por la formacin de la placa neural en pudo distinguir el ectodermo que formar
la zona dorsal de la nurula temprana la piel, el endodermo que cubre el techo
(estadio 14). En este estadio (Fig. 1A), en del arquentern y el mesodermo que
los bordes laterales de la placa neural se formar los somitas, ubicado a los lados del
observaron los pliegues neurales elevados notocordio. Una vez finalizado el proceso
y por debajo de la placa neural, en la zona de neurulacin, en los embriones de H.
media, se observ el notocordio (Fig. 1A). vertebralis y D. auratus, se pudo observar los
En la nurula media (estadio 15; Fig. 1B), derivativos de las tres capas embrionarias:
se observ que los pliegues neurales se han ectodermo, mesodermo y endodermo.
acercado en la lnea media del cuerpo
Figura 1. Morfologa interna de

la nurula de H. vertebralis. Las
imgenes en A-C corresponden a
secciones transversas teidas con
el tinte fluorescente Hoechst 33258
para detectar los ncleos celulares.
Las secciones estn orientadas con
la regin dorsal hacia arriba. Los
estadios representados en esta y
las siguientes figuras se muestran
en la esquina superior derecha. (A)
Nurula temprana. Se observan los
pliegues neurales, el notocordio y el
mesodermo presomtico, circundados
por el ectodermo en la regin dorsal
y el endodermo en la regin ventral.
(B) Nurula media. Se observa que los
pliegues neurales se han acercado en
la lnea media del cuerpo. (C) Nurula
tarda. Se observa el tubo neural
cerrado. El notocordio no est presente
en (B) debido a que la seccin es de
una regin caudal del embrin; por el
contrario la seccin que se muestra en
(C) es rostral al inicio del notocordio.
Las barras en A, B y C corresponden
a 100 m. Abreviaturas: e, estadio;
ec, ectodermo; en, endodermo; m,
mesodermo; n, notocordio; pn,
pliegues neurales; tn, tubo neural.
103
La morfologa interna de embriones En el estadio de branquias en desarrollo

ms avanzados se muestra en la figura (Estadio 22; Fig. 2B), se observaron las
2A-D para D. auratus y figura 3A-D para H. branquias primarias y los arcos mandibular e
vertebralis. En los embriones de D. auratus, hioideo. Adems se pudo apreciar las clulas
durante el estadio de los arcos branquiales de yema del embrin (Fig. 2B). Finalmente,
(estadio 18; Fig. 2A) se pudieron observar en el estadio de desarrollo completo de
los pronefros y los somitas, estructuras las branquias (estadio 23; Figs. 2C y D)
que derivan del mesodermo intermedio y se observaron las estructuras mucho ms
paraxial, respectivamente (Fig. 2A). desarrolladas que en estadios anteriores.
Figura 2. Morfologa interna de los embriones en estadios de organognesis de D. auratus. La regin

rostral en todas las imgenes est orientada hacia la izquierda. (A) Seccin horizontal de un embrin
del estadio de arcos branquiales. La seccin fue realizada a travs de los somitas y del notocordio.
Se observan los pronefros y los arcos mandibular, hioideo y branquial. (B) Seccin horizontal de un
embrin del estadio de branquias en desarrollo. La seccin fue realizada a travs de los somitas y
el notocordio. Se observan las branquias primarias y las clulas de yema del embrin. (C) Seccin
horizontal de un embrin del estadio de desarrollo completo de las branquias. La seccin fue realizada
a travs del cerebro embrionario y los somitas. Se pueden observar los ojos y los otocistos del embrin.
(D) Seccin horizontal de un embrin del estadio de desarrollo completo de las branquias. La seccin
fue realizada a travs de las clulas de yema y el notocordio. Se observan los pronefros y los somitas.
Las secciones en las imgenes C y D corresponden al mismo embrin. Las barras en A, B, C y D
corresponden a 500 m. Abreviaturas: ab, arco branquial; ah, arco hioideo; am, arco mandibular;
b, branquias primarias; c, cerebro; e, estadio; ep, epidermis; n, notocordio; o, ojo; ot; otocisto; pf,
pronefros; s, somita; y clulas de yema.
En este estadio se identificaron algunos del embrin. Adems se observ que el

derivativos del ectodermo neural como las ectodermo de piel se haba diferenciado
vesculas cerebrales, los ojos y los otocistos en la epidermis. Durante estos estadios de
104
organognesis, el embrin se ha alargado observar que la parte anterior del tubo neural
para gradualmente adquirir la forma de se haba diferenciado en tres vesculas
un renacuajo (Figs. 2C y D). cerebrales: cerebro anterior, cerebro medio
y cerebro posterior. Adems se observaron
Durante los estadios avanzados de los otocistos (Fig. 3A). Durante el estadio
H. vertebralis, se distinguieron estructuras de branquias en desarrollo (estadio 22; Fig.
similares a las observadas en D. auratus. 3B), se identificaron los ojos y los otocistos.
En H. vertebralis, en el estadio de los arcos Adems se pudo identificar a las branquias
branquiales (estadio 18; Fig. 3A), se pudo primarias y la gran masa de las clulas de
Figura 3. Morfologa interna de los embriones en estadios de organognesis de H. vertebralis. La regin

rostral en todas las imgenes est orientada hacia la izquierda. (A) Seccin horizontal de un embrin
del estadio de arcos branquiales. La seccin fue realizada a travs de los somitas. Se pueden observar
las vesculas cerebrales y los otocistos. (B) Seccin horizontal de un embrin del estadio de branquias
en desarrollo. La seccin fue realizada a travs de las branquias primarias y los somitas. Se observan
los otocistos y las clulas de yema del embrin. (C) Seccin sagital de un embrin del estadio de
desarrollo completo de las branquias. La seccin fue realizada a travs de las clulas de yema y los
somitas. Se observan los ojos, el notocordio y la aleta caudal del embrin. (D) Seccin horizontal de
un embrin a la eclosin. La seccin fue realizada a travs de la yema y los somitas. Se observan
el cerebro, los ojos y los otocistos del embrin. Las barras en A, B, C y D corresponden a 1000 m.
Abreviaturas: ac, aleta caudal; b, branquias primarias; c, cerebro; ca, cerebro anterior; cm, cerebro
medio; cp; cerebro posterior; e, estadio; ep, epidermis; n, notocordio; o, ojo; ot; otocisto; s, somita; y
clulas de yema.
yema (Fig. 3B). En el estadio de desarrollo Adems se detect una gran cantidad
completo de las branquias (estadio 23; de clulas de yema. El embrin se haba
Fig. 3C) y el estadio a eclosin (estadio 25; alargado considerablemente y en la cola se
Fig. 3D) se identificaron la epidermis, los detect la aleta caudal (Figs. 3C y D).
ojos, los otocistos y el cerebro del embrin.
105
Tabla 1.
Miognesis en anuros
Familias y especies Dimetro del Tiempo de Modo de

huevo (mm) a gastrulacin miognesis c
(hrs) b (referencias) d
Pipidae
X. laevis 1.3 14 rc (1, 2)
Bombinatoridae
B. variegata 2.0 25 ic (2)
Hemiphractidae
G. riobambae 3.0 336 ic (3)
Leiuperidae
E. randi 1.1 24 ic (4)
E. coloradorum 1.3 24 ic (4)
Dendrobatidae
E. machalilla 1.6 96 ic (4)
E. anthonyi 2.0 96 ic (4)
E. tricolor 2.0 96 ic (4)
E. boulengeri 2.0 96 ic (5)
H. vertebralis 2.6 96 ic (6)
D. auratus 3.5 96 ic (6)
a De acuerdo con: del Pino et al., 2007; Moya, 2005; Rafinska, 1991.
b Tiempo desde la fertilizacin hasta el final de la gastrulacin
(del Pino et al., 2007; Michael, 1981).
c Abreviaturas: rc, rotacin celular; ic, interdigitacin celular.
dReferencias: 1 = Hamilton, 1969; 2 = Kiebwna, 1981;
3 = Gatherer y del Pino, 1992; 4 = del Pino et al., 2007;
5 = Moya, 2005; 6 = Este estudio.
Morfologa de los somitas de (no se muestra). Este patrn se observ du-

Hyloxalus vertebralis y Dendrobates aura- rante la neurulacin cuando ya se haban
tus.- Las caractersticas de la somitogne- formado los primeros somitas (no se mues-
sis de H. vertebralis (Fig. 4A-C) y D. aura- tra) y se mantuvo en los somitas y meso-
tus (no se muestran) fueron similares. La dermo presomtico del estadio de yema de
morfologa de los somitas de H. vertebralis la cola (Estadio 17; Fig. 4A, A).
se muestra en la figura 4A-C y los esque-
mas correspondientes se muestran en la fi- En el estadio de los arcos branquiales
gura 4A-C. Durante el estadio previo a la (Estadio 18; Fig. 4B, B) se observ
segmentacin de los somitas (estadio 13), diferencias en los somitas de acuerdo
el mesodermo paraxial estaba conformado con su posicin respecto del mesodermo
por clulas redondeadas y desorganizadas presomtico. En secciones horizontales de
106
embriones de este estadio, se observ la mioblastos se haban alargado e interdigitado

presencia de 15 somitas en un embrin de H. pero no alcanzaban la longitud del somita
verterbralis y 12 somitas en uno de D. auratus. (ver somita derecho Fig. 4B-B). Los cinco a
El anlisis de estas secciones demostr que seis somitas ms rostrales contenan clulas
el mesodermo presomtico y los cuatro a que ya se haban alargado y alcanzado la
cinco somitas ms caudales consistieron de longitud del somita y estaban orientadas de
clulas redondeadas y sin ningn arreglo manera paralela con respecto al notocordio
definido como se observ en el estadio 17 (ver somita izquierdo Fig. 4B-B). Todas las
(Fig. 4A, A). En los siguientes tres a cuatro clulas de los somitas fueron mononucleadas
somitas en direccin rostral se detect que los en este estadio (Fig. 4B y B).
Figura 4. Morfologa de los somitas de H. vertebralis. En todas las imgenes la regin rostral est
orientada hacia la izquierda y el notocordio hacia abajo. Las imgenes en A-C corresponden a secciones
horizontales teidas con el tinte fluorescente Hoechst 33258 para detectar los ncleos celulares y las
imgenes A-C son diagramas explicativos de cada imagen. (A-A) Seccin y su diagrama de dos
somitas del estadio de yema de la cola. Se observan las clulas redondeadas y desordenadas que
componen los somitas. (B-B) Seccin y su diagrama de dos somitas del estadio de arcos branquiales.
Se observa que el somita ms rostral contiene clulas mononucleadas que se han alargado y han
alcanzado la longitud del somita. El somita ms caudal contiene clulas que han empezado a alargarse
e intercalarse. (C-C) Seccin y su diagrama de dos somitas del embrin a la eclosin. Se observa que
los somitas contienen miotbulos alargados y multinucleados. Las barras en A, B y C corresponden a
100 m. Abreviatura: e, estadio.
Durante el estadio a la eclosin (estadio las fibras musculares estaban orientadas de

25; Fig. 4C-C) se observ que el miotoma manera parelela con respecto al notocordio.
constaba de fibras multinucleadas, alargadas Las caractersticas de la somitognesis de D.
en sentido rostro-caudal. El tamao de las auratus (no se muestran) fueron similares a
fibras alcanzaba la longitud del somita y las descritas para H. vertebralis (Fig. 4C y C).
107
DISCUSIN Como metodologa alternativa para

Morfologa interna de los embriones, determinar aspectos temporales del
desarrollo neural y formacin de somitas desarrollo en relacin con otros eventos
en Hyloxalus vertebralis y Dendrobates del desarrollo embrionario, se ha utilizado
auratus.- Las especies analizadas en este el pareamiento de eventos de la formacin
estudio presentan notables diferencias en del notocordio con el cerramiento del
relacin con el gran tamao de sus huevos blastoporo, y el avance del desarrollo neural
respecto a otras especies de la familia con el nmero de somitas en seis especies de
Dendrobatidae (Tabla 1). En este estudio se ranas, que incluyen entre otras a E. machalilla
encontr que los procesos de neurulacin y E. tricolor (de la familia Dendrobatidae)
y somitognesis y la morfologa interna de y a X. laevis (Senz-Ponce et al., 2012).
los embriones de H. vertebralis y D. auratus En embriones de especies con desarrollo
corresponden a los patrones descritos para rpido, como X. laevis, el alargamiento del
varias especies de la familia Dendrobatidae notocordio ocurre ms tempranamente
(Venegas-Ferrn et al., 2010; del Pino et respecto al cerramiento del blastoporo en
al., 2007; del Pino et al., 2004; Bentez y del comparacin con las especies de desarrollo
Pino, 2002). Muchos de los eventos de la lento tales como las ranas Dendrobatidae. El
organognesis se encuentran conservados desarrollo de las ramas de la cresta neural
dentro de los vertebrados. En las ranas cranial est acelerado en relacin con la
dendrobtidas estudiadas, la diferenciacin formacin de los somitas en las especies
de las capas embrionarias es similar a los de desarrollo rpido y est retrasado en
eventos descritos para X. laevis y para las ranas cuyo desarrollo es lento. Por el
otros anfibios. Sin embargo, los resultados contrario, el tiempo del cerramiento del tubo
sugieren que existen algunas diferencias en neural no est acoplado con la formacin
H. vertebralis y D. auratus como se detalla de los somitas. Estos cambios parecen ser
ms adelante. Estas diferencias pueden ser el resultado de diferencias temporales en
el resultado de la estrategia reproductiva, el avance de los mdulos del desarrollo,
la tasa de desarrollo y el tamao del huevo que en las especies de desarrollo rpido se
(Tabla 1). Por lo cual es necesario el anlisis inician con el alargamiento del notocordio
comparativo de los eventos de organognesis durante la gastrulacin. Las diferencias
en ranas con diferentes tasas de desarrollo encontradas pueden estar relacionadas con
y tamao de sus huevos. Debido a que los el requerimiento de desarrollar de modo
embriones de las ranas no son transparentes, rpido a los renacuajos de vida libre en
se dificulta determinar la tasa del desarrollo especies de desarrollo acutico consideradas
neural y la formacin de somitas en rpidas (Senz-Ponce et al., 2012).
embriones vivos. Se debe recalcar que para
la mayora de especies analizadas, el bajo El desarrollo neural de H. vertebralis
nmero de embriones disponibles para y D. auratus, concuerda con los patrones
estudio es igualmente un factor limitante. morfolgicos descritos para X. laevis y
108
E. machalilla (Harrington et al., 2009; del de las ranas dendrobtidas (Venegas-Ferrn

Pino et al., 2004). En las especies de anuros et al., 2010; del Pino et al., 2007; del Pino et al.,
estudiados, la neurulacin se inicia con la 2004; Bentez y del Pino, 2002).
formacin de la placa neural y la elevacin
de los pliegues neurales durante la nurula Somitognesis en Hyloxalus verte-
temprana. A medida que avanza el proceso bralis y Dendrobates auratus.- Los proce-
de neurulacin, los pliegues neurales se sos de somitognesis no son conservados en
acercan, se fusionan en la lnea media los anfibios y no se ha encontrado relacin
dorsal y el tubo neural se cierra (Fig. 1). La entre el modo de miognesis y la estrategia
morfologa de la placa neural, los pliegues reproductiva (Tabla 1; Radice et al., 1989).
neurales, el tubo neural y el notocordio de En X. laevis, los somitas se diferencian me-
H. vertebralis y D. auratus es similar a las diante el modo de miognesis denominado
caractersticas morfolgicas descritas para por rotacin celular (Tabla 1; Kiebwna,
E. machalilla y para otros dendrobtidos 1981; Hamilton, 1969). En contraste, en
estudiados (del Pino et al., 2007; del Pino B. variegata, la miognesis ocurre por in-
et al., 2004). La similitud del patrn de terdigitacin celular (Kiebwna, 1981). En
neurulacin en las ranas de la familia las ranas ecuatorianas, que han sido ana-
Dendrobatidae con relacin a X. laevis lizadas de las familias Hemiphractidae,
sugiere que el tamao del huevo no influye Leiuperidae y Dendrobatidae, se ha de-
en el proceso de neurulacin. tectado que el nico patrn de miognesis
es por interdigitacin celular (Tabla 1; del
En los vertebrados, el sistema nervioso Pino et al., 2007; Moya, 2005). La miogne-
central se diferencia a partir del tubo neural sis de H. vertebralis y D. auratus coincide
y la regin anterior dar origen a las partes con el patrn descrito para B. variegata,
del cerebro (Pierani y Wassef, 2009; Gilbert, E. machalilla y otros Dendrobatidae (Fig. 4;
2003). En X. laevis, la diferenciacin del Tabla 1). El presente estudio comparativo
cerebro se inicia en el estadio de yema de demuestra que el patrn de miognesis por
la cola (estadio 17; Youn, et al., 1980). Por interdigitacin celular es comn a seis espe-
el contrario, en H. vertebralis y D. auratus la cies de la familia Dendrobatidae que difie-
diferenciacin del cerebro se detect a partir ren grandemente en el tamao de sus hue-
del estadio de los arcos branquiales (Estadio vos (Tabla 1). La larga historia filogentica
18; Fig. 2 y 3). Estas observaciones sugieren de los anfibios ha permitido la diversidad
un retraso en la diferenciacin cerebral en de programas del desarrollo (Elinson y del
H. vertebralis y D. auratus, con respecto a Pino, 2012). Por esta razn, el estudio com-
X. laevis. Sin embargo, se requieren anlisis parativo permite transparentar la variacin
adicionales, mediante marcadores neurales en los eventos del desarrollo embrionario.
especficos, para determinar diferencias en Adems este trabajo aporta informacin
la expresin de genes neurales, como se ha al conocimiento de las caractersticas del
observado en otros eventos del desarrollo desarrollo de anuros ecuatorianos.
109
AGRADECIMIENTOS del Pino EM, vila M, Prez O, Bentez M,

Se expresa agradecimiento a los Alarcn I., Noboa V y Moya IM. 2004.
colaboradores del Laboratorio de Biologa Development of the dendrobatid frog
del Desarrollo de la PUCE por su ayuda Colostethus machalilla. The International
durante la realizacin de este estudio y en Journal of Developmental Biology, 48:
particular a Andrs Garcs por su ayuda 663670.
con los grficos. Se agradece a los miembros
Elinson RP y del Pino EM. 2012. Develop-
de la Divisin de Anfibios del Museo de
mental diversity of amphibians. Wiley
Zoologa de la PUCE y su programa Balsa
Interdisciplinary Reviews: Developmental
de los sapos por la donacin de posturas
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de H. vertebralis y D. auratus. Este trabajo
recibi el apoyo de becas de investigacin Fan SY, De S RO y Radice GP. 2001.
de la PUCE. A Common Pattern of Somite Cell
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112
Caracterizacin de la actividad amilsica presente en extractos larvarios
de dos polillas plagas de la papa: Tecia solanivora y
Symmetrischema tangolias
Patricia Mora-Criollo, Andrea Rodrguez-Guerra y Carlos A. Soria

Laboratorio de Bioqumica, Escuela de Ciencias Biolgicas, Pontificia Universidad Catlica del Ecuador,
Quito, Ecuador
casoria@puce.edu.ec
RESUMEN.- Las polillas Tecia solanivora y Symmetrischema tangolias (Lepidoptera:

Gelechiidae) ocasionan daos significativos a los tubrculos de Solanum tuberosum. El
objetivo de este estudio fue aislar y caracterizar bioqumicamente las amilasas presentes
en los diferentes estadios larvales de estas polillas. Para efectos comparativos se extrajo
las protenas solubles de estadios larvales criados en el laboratorio para determinar
espectrofotomtricamente diferencias en la concentracin de cada extracto. Se calcul
el peso promedio de cada larva: T. solanivora result ser ms pesada y de ella se obtuvo
ms protena soluble en comparacin con S. tangolias. La actividad amilsica en los
extractos proteicos fue identificada mediante degradacin de almidones. Extractos de los
estadios IV de ambas polillas, incubados a diferentes intervalos de tiempo, presentaron
actividades amilsicas diferentes, aunque resultaron bastante similares cuando se leyeron
los resultados de cada extracto tarde a las 72 h. Mediante electroforesis de los extractos
proteicos de las larvas de las dos especies, migraron alrededor de 11 bandas proteicas
entre 225 y 10 kDa. Entre estas bandas, las amilasas fueron reconocidas en ambas especies
y en los 4 estadios como bandas de 50 kDa. La(s) banda(s) probablemente isofrmicas de
esta enzima aparecieron muy definidas en los estadios I y II, en contraste con las formas
difusas encontradas en los estadios III y IV. La actividad amilsica no estuvo ligada a
las concentraciones proteicas sino a las condiciones de reaccin. El estudio sugiere la
posibilidad de disear formas inditas de biocontrol contra estas plagas.
PALABRAS CLAVES: almidn, amilasa, electroforesis, espectrofotometra, polillas
ABSTRACT.- Tecia solanivora and Symmetrischema tangolias (Lepidoptera: Gelechiidae)

moths cause serious damage to Solanum tuberosum tubercles. The purpose of this study
was to isolate and biochemically characterize amilases present in different larval moth
stages. Soluble proteins were extracted from the larval stages raised in the laboratory.
Differences in protein concentration were determined by spectrophotometry. Average
weight for each larvae was calculated. T. solanivora was heavier and more soluble protein
113
was extracted as compared with S. tangolias. Amilase activity of the different protein
extracts was identified using starch degradation techniques. The amylasic activity of
the IV stage of T. solanivora and S. tangolias incubated at different intervals of time were
found to react different, however the results became similar when the activity of both
extracts was scored after 72 h time reaction. Eleven protein bands between 225 and 10
kDa were identified electrophoretically. Among these bands, amylases were identified in
both species in the 4 different stages in accordance to the molecular weights equivalent to
50 kDa. The protein bands of this enzyme were more defined in the I and II than in the III
and IV stages, where they appeared quite diffused. Amylase activity was not linked to
soluble protein concentrations; instead, it depended on reaction conditions. These results
suggest the possibility of designing new forms of biocontrol against potato moths.
KEYWORDS: amylase, electrophoresis, moths, spectrophotometry, starch
INTRODUCCIN prdidas econmicas importantes entre los

Las polillas Tecia solanivora y cultivadores de papa (Lagnaoui et al., 2000).
Symmetrischema tangolias (Lepidoptera:
Gelechiidae) son plagas capaces de La alimentacin voraz de las polillas
ocasionar daos muy significativos a en su estado larvario, provoca considerables
los tubrculos de Solanum tuberosum. Se daos que se observan a simple vista en
estima que estas polillas, sin un control el tubrculo, por lo cual asumimos que
adecuado, pueden daar hasta un 30 % de cada estadio despliega diferentes grados
los tubrculos del campo y hasta un 50 % de actividad enzimtica, acompaada
de los que se encuentran almacenados en de cambios proteicos estructurales y
bodegas (Domnguez et al., 2009). funcionales que se identifican con el modelo
de infestacin. Algunas clases de insectos
T. solanivora, considerada la ms tienen una dieta rica en almidones los
agresiva de las dos plagas citadas, ha cuales deben ser procesados por enzimas
migrado desde Amrica Central hasta como las amilasas (Kotkar et al., 2012;
Ecuador, e incluso ha sido reportada en Viktorinova et al., 2011;). La a-amilasa (alfa-
las Islas Canarias en Espaa (Trujillo et al., amilasa 1.4-glucan-4-glucanoanhidrasa),
2002), por lo cual es considerada una plaga ha sido descrita en los rdenes: Diptera,
de importancia econmica que podra Coleoptera, Hymenoptera, Lepidoptera y
continuar ampliando su distribucin Hemiptera y tiene la funcin de catalizar la
(Valderrama et al., 2007). La otra especie, hidrlisis de las uniones a-1.4 glucosdicas
S. tangolias es una plaga andina de mayor (Darvishzadeh et al., 2012; Ngernyuang et
distribucin e igualmente ocasiona al., 2010; Kazzazi et al., 2005; Baker, 1983). El
114
CARACTERIZACIN DE LA ACTIVIDAD AMILSICA PRESENTE EN EXTRACTOS
LARVARIOS DE DOS POLILLAS PLAGAS DE LA PAPA: Tecia solanivora Y Symmetrischema tangolias
estudio del funcionamiento de estas enzimas la Pontificia Universidad Catlica del

y la relacin con la estructura y funcin Ecuador. Los adultos, machos y hembras,
proteica del insecto, permiten comprender fueron colocados en cmaras de cpula
los mecanismos de infestacin empleados segn protocolo previamente descrito
por estas plagas en sus diferentes estadios. por Barragn (2005) y Herrera (2010) con
modificaciones importantes. Se usaron
Nuestro objetivo fue aislar protenas tubrculos de la variedad Cecilia, de
larvarias hidrosolubles, separarlas, determi- aproximadamente 40 g de peso cada
nar diferencias entre estadios y entre espe- uno; los huevos ovipositados en pedazos
cies e identificar enzimas como la amilasa en de cartulina (10 aproximadamente), se
cada estadio larvario mediante tcnicas de colocaron sobre la superficie de cada
espectrofotometra, geles de poliacrilamida tubrculo. La cmara experimental de
y medios para determinar la duracin de la infeccin fue incubada a la sombra a 18
actividad amilsica extracelular a diferentes C, donde permaneci por varios das hasta
intervalos de tiempo. el desarrollo del estadio de inters. Las
larvas fueron mecnicamente extradas
MATERIALES Y MTODOS y colectadas aspticamente en el tiempo
Crianza de las polillas.- T. solanivora y requerido para el desarrollo de cada estadio
S. tangolias fueron criadas en el Laboratorio en cada especie, a partir de la puesta del
de Control Biomolecular de plagas de huevo, segn como se indica en la Tabla 1.
Tabla 1
Perodos de desarrollo larvario a partir de la oviposicin (en das, a 18 C)
Symmetrischema
Tecia solanivora
tangolias
Peso y preparacin de los extractos en 0.6 ml (proporcin 1:5 p/v) de tampn

larvarios.- Las larvas colectadas fosfato (pH 7.8) mediante tubos Eppendorf
pertenecientes a un determinado estadio y de 1.5 ml y pistilos estriles para cada especie
especie fueron contadas individualmente, y para cada estadio. Los homogenizados
luego pesadas en una balanza de precisin fueron centrifugados durante 15 min a 13
(Boeco BBI-31) hasta obtener un peso total 000 rpm en una centrfuga Spectrafuge
promedio de 120 mg. Las larvas fueron 24D (Labnet). Se recuper el total de 0.5 ml
maceradas y homogenizadas durante 5 min de los sobrenadantes de cada estadio en
115
cada tubo por separado. Los tubos fueron de Rodrguez-Guerra et al., (2012) con
identificados como extractos de protena algunas modificaciones. Cincuenta ml del
soluble en buffer fosfato los mismos que extracto obtenido de cada estadio fueron
fueron almacenados a 4 C para anlisis incorporados de forma estril en un
posteriores. orificio central (6 mm de dimetro por 4
mm de profundidad) que se cre con un
Cuantificacin proteica total.- Se sacabocados en el medio de cultivo de una
analiz la concentracin proteica soluble caja de Petri. Los halos de actividad que
de cada extracto mediante el uso del kit de se formaron a 18 C fueron analizados,
cuantificacin QuantiProTM BCA Sigma, fotografiados y cuantificados a las 8, 24, 48
con modificaciones implementadas en el y 72 h despus de la inoculacin y despus
laboratorio (Rodrguez-Guerra et al., 2012; de haber sido coloreados con una solucin
Astudillo y Soria, 2011). Los reactivos se oxidante de lugol (2 g de KI, 1 g de I en 100
prepararon mezclando 20 ml de la muestra ml de H2O). Cada experimento se realiz
de extracto diluido 1:100 con 20 ml del por triplicado.
reactivo de cuantificacin (dilucin final
1:200). Los tubos fueron incubados a 60 C Se efectuaron dos comparaciones de
por una hora; posteriormente se procedi la actividad amilsica: la primera, entre
a medir la absorbancia a 562 nm con un diferentes intervalos y el estadio larvario
espectrofotmetro (Nanodrop Thermo (IV) y la segunda, una comparacin entre
Scientific). Las absorbancias de los extractos todos los estadios larvarios y un solo
fueron convertidas a concentraciones intervalo de tiempo (72 h).
proteicas en base a una curva estndar de
albmina de suero bovino (BSA) elaborada Separacin e identificacin de las
mediante concentraciones que fluctuaron protenas solubles por electroforesis.- La
entre 0 hasta 0.5 mg de albmina por ml. caracterizacin proteica de los extractos se
llev a cabo en geles de poliacrilamida con
Determinacin cualitativa de Sodio Dodecil Sulfato (SDS-PAGE), se utiliz
la actividad amilsica.- La prueba se el protocolo estndar con modificaciones
realiz en medio Agar-Papa preparado de Astudillo y Soria (2011), Kazzazi (2005)
con 29 g de papa de la variedad Cecilia, y Campos (1989), para la identificacin de
previamente cocida por 5 min a ebullicin amilasas. Los geles fueron preparados al 12
en 500 ml de agua destilada ms 7.5 g %, las muestras fueron desnaturalizadas
de Agar-Agar (Himedia). El medio fue por 15 min en bao mara a ebullicin. A
autoclavado por 1 h, luego repartido en continuacin, se colocaron 15 ml de estas
cajas de Petri (20 ml por placa) bajo una muestras procesadas en cada pocillo con
cabina de flujo laminar (ESCO Optimair). inclucin de un pocillo de referencia con
El estudio de la actividad amilsica se una escalera molecular Promega V849A
llev a cabo siguiendo la metodologa (10 ml ), que permiti visualizar rangos de
116
pesos moleculares de las bandas proteicas protena soluble total y protena soluble
en kilodaltons (kDa). El proceso se llev a por larva. Adicionalmente, se realiz un
cabo en una cmara de electroforesis Fisher anlisis de correlacin de los datos de la
Scientific FB-VE10-1, a 100 V durante 3 actividad amilsica a las 72 h de actividad y la
horas en tampn 1X de TRIS/HCL, pH concentracin proteica entre las dos especies.
8.3. Las bandas se visualizaron mediante
tincin conteniendo azul de Coomassie RESULTADOS
al 1 %, por 1 min a 92 C seguido de una Peso de las larvas y cuantificacin
agitacin moderada y continua por 10 proteica total.- Se cont un nmero
min. Se fijaron las muestras en bfer de des determinado de larvas de cada estadio
tincin calentado a 92 C por 1 min hasta hasta alcanzar un peso estndar equivalente
que las bandas sean observadas claramente. a 120 mg; se calcul el peso promedio
en mg para las larvas de cada estadio de
Anlisis estadstico.- Se realiz un cada especie (Tabla 2). Las larvas de T.
ANOVA de una va, con diseo aleatorio solanivora resultaron ser progresivamente
para las 3 lecturas de medicin de los halos ms pesadas en cada nuevo estadio, se
de cada uno de los 4 intervalos de tiempo necesitaron menos larvas de T. solanivora
de los estadios larvarios y un ANOVA comparadas con las de S. tangolias para
factorial 2 x 4, de las concentraciones llegar a los 120 mg de peso de cada estadio
proteicas entre las dos especies de para estudios proteicos comparativos.
Tabla 2
Perodos de desarrollo larvario a partir de la oviposicin (en das, a 18 C)
Tecia solanivora Symmetrischema tangolias
s* = desviacin estndar
Se observaron diferencias en las conforme maduraban los estadios

concentraciones proteicas totales de cada larvarios. La menor concentracin proteica
extracto y de cada larva, determinadas soluble se observ en el extracto diluido
por espectrofotometra (Tabla 3 y 4). Los 1:200 (0.072 mg/ml) y en la de cada larva
valores de los extractos proteicos de T. (0.17 mg/larva) del estadio I, en contraste
solanivora aumentaron progresivamente con las concentraciones significativamente
117
mayores (p 0.05) reportadas para el IV diluido 1:200 y 7.33 mg/larva).

estadio (0.220 mg/ml para el extracto
Tabla 3
Concentracin proteica soluble de los extractos de T. solanivora en cada estadio larvario con pesos iniciales
promedio equivalentes a 120 mg por muestra estudiada
Tecia solanivora
* Corresponde al valor en mg de protena soluble extrada por larva. El clculo resulta de multiplicar la concentracin
proteica (mg/ml) de cada extracto por el factor de dilucin 200, dividido para el nmero de larvas y multiplicado por
0.5 ml que es el volumen del extracto.
Resultados similares se registraron en I, en contraste con las concentraciones

S. tangolias, donde el menor valor proteico significativamente mayores (p 0.05)
soluble se encontr en el extracto diluido reportadas para el extracto diluido 1:200
1:200 (0.096 mg/ml) del estadio III y en el (0.199 mg/ml) y para cada larva (3.98 mg/
de cada larva (0.23 mg/larva) del estadio larva) del estadio IV.
Tabla 4
Concentracin proteica soluble de los extractos de S. tangolias en cada estadio larvario con
pesos iniciales promedio equivalentes a 120 mg por muestra estudiada
Symmetrischema tangolias
* Corresponde al valor en mg de protena soluble extrada por larva. El clculo resulta de multiplicar la concentracin
proteica (mg/ml) de cada extracto por el factor de dilucin 200, dividido para el nmero de larvas y multiplicado por
0.5 ml que es el volumen del extracto.
118
Los anlisis estadsticos ANOVA altamente significativos (p=0.000) (Figura

detectaron diferencias altamente signifi-1). Se encontraron diferencias (p=0.000)
cativas, tanto a nivel de protena soluble
entre todos los valores promedio de halos
total del extracto (p= 0.002), como a nivel
medidos a las 8 h (8.2 mm), 24 h (9.43
de concentracin de protena por larva demm), 48 h (12.68 mm) y 72 h (16.58 mm)
cada estadio y especie (p=0.000). de incubacin. El tamao promedio de
los halos reportados para S. tangolias fue
Caracterizacin de la actividad ms pequeo que el de T. solanivora, pero
amilsica.- El anlisis (ANOVA) de igualmente se encontraron diferencias
la actividad amilsica de los extractos significativas (p= 0.000) entre los intervalos
proteicos obtenidos del estadio IV de de incubacin, esto es, a las 8 h (3.33 mm),
T. solanivora y S. tangolias incubados a 24 h (4.29 mm), 48 h (9.42 mm) y a las 72 h
diferentes intervalos de tiempo fueron (11.59 mm), segn se detalla en la Figura 1.
Figura 1. Actividad amilsica de los extractos de larvas del IV estadio de T. solanivora y de S.

tangolias incubados en medio agar papa durante diferentes intervalos de tiempo (0 a 72 h).
De la misma forma, se obtuvieron en cada una de las especies (Figura 2).

diferencias altamente significativas T. solanivora present el menor halo de
(p=0.000) para el anlisis de los halos degradacin del almidn en el III estadio
de degradacin registrados a las 72 h de (9.36 mm), mientras que el mayor halo
incubacin entre los estadios del I al IV, ocurri con el extracto del IV estadio (16.58
119
mm). En los extractos de S. tangolias, el halo No existe una correlacin entre la

de menor degradacin fue observado en la concentracin proteica y la actividad
reaccin del II estadio (8.89 mm) mientras amilsica entre las dos especies, los
que los halos ms grandes ocurrieron resultados arrojaron un R= 0.176 (p=0.677)
con los correspondientes extractos de los (Figura 2).
estadios I y IV (13.42 y 11.54 mm).
Figura 2. Actividad amilsica (halo de inhibicin en mm) de los extractos de larvas de los esta-
dios I, II, III y IV de T. solanivora y de S. tangolias incubados en medio Agar Papa durante 72 h.
Separacin e identificacin de las presentes en los extractos correspondan

protenas solubles por electroforesis.- Se a miosina y anhidrasa carbnica,
pudo distinguir la presencia de al menos 11 respectivamente. La protena de nuestro
bandas proteicas aparentemente similares inters, amilasa, fue identificada en ambas
en los extractos de ambas polillas. Se especies (Figuras 3 y 4) segn el peso
estimaron pesos moleculares para las molecular referencial equivalente a 50 kDa
distintas bandas proteicas presentes en los sugerido y reportado para otros insectos de
extractos, empleando protenas estndares distintos gneros y especies (Ngernyuang
con pesos moleculares entre 225 y 10 kDa. et al., 2010; Valencia-Jimnez et al., 2008;
Basndonos en los pesos moleculares Baker, 1983). Se observ que tanto en T.
calculados, creemos que es probable de solanivora (Figura 3) como en S. tangolias
las bandas proteicas de 250 kDa y 30 kDa (Figura 4), la banda o bandas de alrededor
120
de 50 kDa detectadas en los extractos de los que las reportadas en los estadios III y IV,
estadios I y II, fueron mucho ms definidas donde aparecieron bastante difusas.
I I escalera II II III IV
Figura 3. Electroforesis (SDS PAGE, gel 12 %) de los extractos larvarios de los estadios I, II, III y
IV, de T. solanivora. Se incluye la escalera molecular.
I I II II escalera III III IV IV
Figura 4. Electroforesis (SDS PAGE, gel 12 %) de los extractos larvarios de los estadios I, II, III y
IV, de S. tangolias. Se incluye la escalera molecular.
121
DISCUSIN de los cuatro estadios de S. tangolias, fue de

Con el fin de analizar comparativa- 13 %, 11 %, 8 % y 17 %, respectivamente. Lo
mente los extractos proteicos de los diferentes cual significara que de los estadios I y II de
estadios larvarios de T. solanivora y S. tango- S. tangolias, se extrajo proporcionalmente
lias, se contabilizaron un nmero de larvas ms protena que aquella que se encontr
requeridas para obtener un peso de 120 mg en T. solanivora en los mismos estadios. No
para cada estadio. Los datos obtenidos de- as en el IV estadio de T. solanivora donde
mostraron que los cuatro estadios larvarios la protena soluble extrada fue casi el
de T. solanivora representaban entre 1.5 y 1.9 doble que la reportada para S. tangolias en
veces ms el peso correspondiente a los esta- el mismo estadio. Quizs estos resultados
dios de S. tangolias. Igualmente, se encontr podran ayudar a buscar diferencias en la
que, en ambas especies, el peso del estadio I manera de cmo la larva de cada especie
o III, al llegar al estadio II o IV, aument 1.5 ingresa al tubrculo y a explicar el mayor
veces su peso mientras que las larvas del es- dao que ocasiona T. solanivora en contraste
tadio III pesaron alrededor de seis veces ms con S. tangolias).
que las larvas del estadio II (Tabla 2). Estos
aumentos progresivos pero irregulares de la Se reporta un aumento considerable
masa corporal son indicativos de cambios de casi 16 veces el peso y 43 veces la cantidad
metablicos estructurales y funcionales que de protena soluble extrable cuando T.
acompaan a la singular madurez y a la ca- solanivora madur del estadio I al IV. S.
pacidad infectiva de las polillas (Cadena et tangolias, en cambio, con menores pesos
al., 2005; Herrera, 1998), cambios que pare- y menor cantidad de protena extrable
cen ser diferentes y nicos incluso para cada larvaria (segn anlisis entre estadios o
estadio lo que podra explicar por qu T. por comparacin entre las medias globales
solanivora resulta ser muy agresiva (Vargas de la suma de los valores de los estadios),
et al., 2004) y causa mayores daos que S. solamente mostr un aumento de casi 13
tangolias durante el proceso de infestacin veces el peso y 17 veces la cantidad de
(resultados no reportados). protena soluble extrable cuando la larva
pas del estadio I al IV. Las diferencias
Al relacionar el peso larvario (Tabla 2) significativas (p 0.05) en el peso y en la
con el contenido de protena soluble extrable cantidad de protena, son otros 2 parmetros
de cada estadio y en cada especie estudiada que corroboran las diferencias estructurales
(Tabla 3 y 4), se observ que en T. solanivora y metablicas entre especies as como
la cantidad de protena soluble extrada del la relativa similitud que podra existir
estadio I solamente correspondi al 6 % del para extraer con facilidad una fraccin
peso de la larva, o al 7 %, 17 % y 16 % del peso importante de varias protenas solubles,
de los estadios II, III y IV. De igual forma, el algunas probablemente involucradas en
porcentaje de protena extrable comparada la maduracin de las larvas (Tabla 1) o en
con el peso total de cada larva de cada uno procesos de infestacin nicos para cada
122
una de estas plagas (Darvishzadeh et al., (lvarez, 2003). Observaciones previas (no
2012; Kazzazi et al., 2005). reportadas) sobre el comportamiento de los
extractos en distintos pHs, justificaron el uso
Reportes sobre la voracidad de estas del tampn fosfato (pH 7.8) el cual mantuvo
polillas (Vargas et al., 2004) indican que una la actividad y la estabilidad amilsica de los
sola larva, al transformarse del estadio I al extractos a 18 y a 45 C.
IV en aproximadamente 20 das (Tabla 1)
consume entre 5 a 7 g de sustrato de papa. Adems, la correlacin (R=0.176)
Para procesar esta cantidad de alimento, obtenida cuando comparamos resultados
asumimos que la larva cuenta, entre otros, (p> 0.05)) sugiere que la concentracin
con enzimas como las amilasas, capaces de proteica de los extractos solubles, no guard
desdoblar los almidones en glucosas que se relacin ni geomtrica ni logartmica con
incorporarn al metabolismo celular. la actividad amilsica en agar papa. En
T. solanivora, mientras la protena soluble
El estudio de las amilasas se llev a cabo aument logartmicamente 43 veces del
en los extractos totales de cada estadio y de estadio I al estadio IV (Tabla 3), los halos
cada especie en consideracin a los estudios promedio de degradacin del almidn
de Kotkar et al. (2012) sobre la expresin cambiaron errticamente (Figura 2) en cada
gentica de esta enzima en Lepidptera la uno de los 4 estadios . Algo similar sucede
misma que vara para cada estadio, incluso con S. tangolias, mientras los extractos
en cada tejido comprometido: cabeza, proteicos aumentaron 17 veces (Tabla 4),
cuerpo, vsceras, hemolinfa, donde no los halos de degradacin (Figura 2) casi no
sera raro encontrar isoformas amilsicas cambiaron entre los estadios.
especficas para un tejido determinado
(Ngernyuang et al., 2010). Estos resultados sugieren que la
menor o mayor actividad amilsica medida
Las diferencias significativas en la como halos de degradacin del almidn,
actividad amilsica de los extractos (p 0.05), no est proporcionalmente ligada a las
demostraron que estas enzimas continuaron diferentes concentraciones proteicas de los
su difusin y actividad en el sustrato de extractos, sino que, de acuerdo con estos
almidn an despus de varias horas a 18 C experimentos, ms bien se relacionan con las
y a un pH ptimo de 7.8 (Figura 1). El pH en condiciones del sustrato, pH, temperatura
el cual se mantuvieron los extractos, al igual de reaccin y a la singular expresin gnica
que la temperatura a la cual se realizaron de cada estadio de desarrollo larvario
los experimentos, parecen ser importantes (Ngernyuang et al., 2010; Valencia et al.,
parmetros en la activacin y/o inhibicin 2008; Kazzazi et al., 2005).
de las amilasas (Darvishzadeh et al., 2012;
Valencia et al., 2008) porque afectan la La electroforesis en geles de
conformacin estructural de las mismas poliacrilamida (SDS PAGE), hizo posible
123
la separacin de al menos 11 bandas el insecto (Da Lage et al., 2002). En este

proteicas bastante similares en cada estadio contexto, los resultados sugieren que 1)
de ambas especies. Si bien no es posible la degradacin de almidn aumenta en
identificar protenas basndose nicamente funcin del tiempo de contacto con la
en su patrn de migracin electrofortica, enzima, pero no es independiente de las
creemos que es razonable suponer que concentraciones proteicas totales de los
la banda de 250 kDa, presente en los extractos, 2) que a las 72 h de reaccin es
extractos, corresponde a miosina asociada ms o menos similar en todos los estadios
a la musculatura de cada estadio larvario. de las 2 especies aunque hay un ligero
Asimismo, creemos que otra banda, con un aumento en la actividad en el estadio IV de
peso molecular de aproximadamente 30 T. solanivora, 3) que la banda (s) detectada(s)
kDa, podra corresponder a la anhidrasa en el rango de los 50 kDa en los extractos
carbnica. La banda correspondiente a de los estadios I y II, fue(ron) mucho ms
esta protena en los geles de poliacrilamida definida que las bandas difusas del III y IV
migr una distancia ligeramente menor estadios.
en el gel con extractos de T. solanivora o
ligeramente una mayor distancia en con Se demuestra la presencia de amilasas
extractos de S. tangolias, que el estndar deen los cuatro estadios larvarios de las dos
30 kDa. Estas diferencias pudieran deberse plagas estudiadas. Son necesarios estudios
a la existencia de isoenzimas, lo cual ha sido
complementarios para la caracterizacin
reportado previamente en otros insectos de estas enzimas, que permitan conocer
(Agudelo et al., 2010; Schwartz et al., 1993;las diferencias en la cantidad de protenas
Raymond, 1984; Childress y Sacktor, 1970). extraibles, la regulacin gnica controlada
de las enzimas (Janecek et al., 1997), la
Creemos que la amilasa corresponde estructura proteica o la presencia de
a la banda de 50 kDa en los geles de isoenzimas y el papel que estas desempean
electroforesis, la cual est presente en los en los procesos de asimilacin y digestin
extractos de cada estadio en ambas polillas, de almidones. Dicha informacin podra
(Figura 3 y 4). Dicha masa molecular es abrir las puertas para el desarrollo de
aproximadamente la que se ha reportado nuevas medidas especficas e inditas de
para otros insectos (Darvishzadeh et al., biocontrol para plagas de este tipo.
2012; Ngernyuang et al., 2010; Valencia-
Jimnez et al., 2008 Kazzazi et al., 2005; AGRADECIMIENTOS
Baker, 1991 y 1983). A la Pontificia Universidad Catlica
del Ecuador, por la asignacin de fondos
El polimorfismo enzimtico de las de investigacin PUCE 2012-2013 y al
amilasas, en general, exhibe una interesante Ingeniero Julio Snchez-Otero, por el
variabilidad funcional y se relaciona con apoyo estadstico durante la realizacin de
el ambiente en el cual vive y evoluciona esta investigacin.
124
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127
Diversidad de microalgas y cianobacterias en muestras
provenientes de diferentes provincias del Ecuador, destinadas a una
coleccin de cultivos
Ever Morales1, Vernica Luna2, Luca Navarro2, Vismeli Santana2, Ana Gordillo2 y
Andrs Arvalo3
1
Proyecto PROMETEO-SENESCYT.
Escuela de Bioanlisis, Pontificia Universidad Catlica del Ecuador, Quito, Ecuador.
2
3
Unidad de Biologa, Centro de Ciencias, Universidad Central del Ecuador
evermster@gmail.com
RESUMEN.- El presente trabajo conforma un estudio sobre diversidad, identificacin y

aislamiento de microalgas y cianobacterias a partir de muestras de aguas continentales,
termales, salobres y lodos; colectadas en 74 sitios de 25 sectores de las provincias del
Carchi, Guayas, Imbabura, Pichincha y Santa Elena (Ecuador), entre octubre 2011 y abril
2012, con la finalidad de poder determinar en dichas muestras, su diversidad inicial,
sucesin de estos microorganismos y la estabilidad de los consorcios entre microalgas y
cianobacterias durante la fase de seleccin de muestras y de aislamiento para el establec-
imiento de una coleccin in vitro de cultivos de microorganismos fotosintticos para la
Escuela de Bioanlisis de la Pontificia Universidad Catlica del Ecuador. De 194 muestras
evaluadas, fueron aislados el 43.81 % de microalgas y cianobacterias; donde los taxones
ms susceptibles de ser aislados son: Chlorella, Desmodesmus y Leptolyngbya. En cambio,
se mantuvo el 56.19 % como consorcios o cultivos mixtos de microalgas y cianobacterias.
De estos, se cuantificaron 14 cultivos solo con cianobacterias; 40 solo entre microalgas
y 55 mixtos (31 y 18, taxa de microalgas y cianobacterias; respectivamente). Los taxa
ms frecuentes en los consorcios microalga-microalga fueron: Chlorella sp.>Desmodesmus
sp. >Navicula sp.; en los cianobacteria-cianobacteria: Leptolyngbya sp.> Calothrix sp.>
Nostoc sp. y en los microalga-cianobacteria: Leptolyngbya sp.>Navicula sp.> Chlorella sp.>
Desmodesmus sp.> Calothrix sp. Las muestras obtenidas en la laguna El Salado, San
Gabriel, Carchi presentaron la mayor diversidad. Mientras que, las colectadas en Aguas
Hediondas, Tufio, Carchi mostraron exclusividad de Dictyosphaerium sp., Microspora
sp., y Mougeotia sp. La cianobacteria Leptolyngbya sp., refleja ser altamente competitiva
en cultivos envejecidos y deficientes en nutrientes. Se recomienda ingresar todos los
consorcios a las colecciones, dada su importancia como fuentes de biodiversidad y para
estudios de fisioecologa, biotecnologa ambiental y agrcola.
PALABRAS CLAVES: cianobacteria, coleccin de cultivos, consorcio, Ecuador, microalga
129
ABSTRACT.- We conducted a study on diversity, identification and isolation of microalgae

and cyanobacteria from inland waters, springs, brackish water and slurries collected at 74 sites in
five province: Carchi, Guayas, Imbabura, Pichincha and Santa Elena (Ecuador), between October
2011 and April 2012. The samples were characterized by initial diversity, succession of these
microorganisms, and the stability of microalgae and cyanobacteria consortia during the sample
selection and isolation process. These isolates were used for the establishment of a collection of
in vitro cultures of photosynthetic microorganisms for the School of Bioanalysis of the Pontificia
Universidad Catlica del Ecuador. From the 194 samples tested, 43.81 % of the isolates were single
species of microalgae and cyanobacteria. The taxa more likely to be isolated were the genera,
Chlorella, Scenedesmus and Leptolyngbya. In contrast, 56.19 % of the isolates remained as consortia
or mixed cultures of microalgae and cyanobacteria. Of these, 14 cultures were only cyanobacteria,
40 were microalgae and 55 were mixed cultures (31 and 18 taxa of microalgae and cyanobacteria,
respectively). The most common genera of microalgae in the microalgae consortia were, Chlorella
sp. > Scenedesmus sp. > Navicula sp. The most common genera in the cyanobacteria consortia
were Leptolyngbya sp. > Calothrix sp. > Nostoc sp. The most common genera in the microalgae-
cyanobacteria consortia were Leptolyngbya sp. > Navicula sp. > Chlorella sp. > Scenedesmus sp. >
Calothrix sp. The samples from Laguna El Salado, San Gabriel, Carchi had the highest diversity.
While, those collected in Aguas Hediondas Tufio, Carchi contained only Dictyosphaerium sp.,
Microspora sp. and Mougeotia sp. The cyanobacterium Leptolyngbya sp. was highly competitive
and characterized aged cultures and nutrient deficiencies. It is recommended that all consortia
be entered into culture collections because of their importance as sources of biodiversity. These
consortia can also be important in physiological, ecology and environmental studies and
development of techniques for agricultural biotechnology.
KEYWORDS: cyanobacteria, consortium, culture collection, Ecuador, microalgae
INTRODUCCIN vivo. Estas, constituyen recursos genticos

La importancia que presentan los para estudios de biodiversidad y de
microorganismos fotosintticos como biotecnologa (Friedl y Lorenz, 2012; GBIF,
productores primarios, fuentes de 2009; Ortega, 2009). As como para estudios
compuestos de inters econmico, agentes integrados de bioprospeccin (Castree,
depuradores de aguas residuales, de suelos 2003), relacionados con aislamiento,
contaminados, complemento alimenticio, o identificacin y cultivo, especialmente
como bioindicadores de calidad de aguas, de microorganismos procedentes de
conlleva a establecer estrategias de su ambientes extremfilos, subtropicales,
conservacin ex situ (Lascurin et al., 2009), tropicales, marinos y de otros ambientes.
mediante la creacin de colecciones in Tales estudios representaran una base
130
Ever Morales, Vernica Luna, Luca Navarro, Vismeli Santana, Ana Gordillo y Andrs Arvalo
DIVERSIDAD DE MICROALGAS Y CIANOBACTERIAS EN MUESTRAS PROVENIENTES
DE DIFERENTES PROVINCIAS DEL ECUADOR, DESTINADAS A UNA COLECCIN DE CULTIVOS
para la investigacin de sus caractersticas del germoplasma estos microorganismos

morflogicas, moleculares, metablicas fotosintticos como para todas las
y su posible utilizacin para los diversos colecciones de hetertrofos, se requiere
fines indicados. Al respecto, el Banco la gran labor del curador que asegure la
Espaol de Algas (BEA), con sede en la reserva gentica de estos organismos y
Universidad de Las Palmas de Gran Canaria cuyas tcnicas van desde un crecimiento
de Espaa, contempla permanentemente continuo hasta la aplicacin de estrategias
estudios sobre aislamiento, conservacin y que reducen la velocidad del metabolismo
evaluacin de cepas para su aplicacin en mediante mtodos de criopreservacin
biotecnologa relacionadas con iniciativas o secado por congelamiento (Fernndez-
cientficas e industriales para la produccin Concha et al., 2004).
de biocombustibles y captacin de CO2
(Garca, 2011; Banco Espaol de Algas, En cuanto a las actividades iniciales
2008). para la creacin o adicin de cepas a una
coleccin, es indispensable el conocimiento
Estos lineamientos reflejan la y entrenamiento de las tcnicas de coleccin
necesidad de creacin de las colecciones de muestras, que permitan la preservacin
vivas de microalgas y cianobacterias, para y adecuada manipulacin de las mismas,
investigacin bsica en taxonoma, ecologa, para su posterior anlisis y determinacin
gentica, estructura y biogeografa (Mora, taxonmica (Montes de Oca et al., 2008;
2010; Delgadillo et al., 2009; Lpez-Adrin Stein, 1973). Posteriormente, se pasa a la fase
y Barrientos-Medina, 2005). A travs de de aislamiento mediante el uso de diversos
una coleccin se podr ofrecer una amplia medios de cultivo segn sea la procedencia
coleccin de microalgas y cianobacterias y tipo de microalga y cianobacteria.
que permita la seleccin de cepas como Normalmente las instituciones o laboratorios
fuente de biocombustible, de compuestos de investigacin conservan colecciones
con actividad biolgica, para acuicultura, acreditadas de cultivos, desde donde se
biofertilizantes, etc. pueden obtener las cepas unialgales y
en medios selectivos o genricos para las
Entre otros aspectos, los bancos de especies marinas o dulceacucolas.
germoplasma, destinados al mantenimiento
de cepas aisladas de ambientes naturales Entre las colecciones ms importantes
permiten tener accesibles lneas genticas a nivel mundial, se reporta la coleccin de
particulares de especies o grupos la Universidad de Texas de Estados Unidos
taxonmicos de inters para su estudio, (Starr, 2010); en Australia se cuenta con la
comercializacin o reintroduccin a la Coleccin Nacional de cultivos de algas
naturaleza en forma de poblaciones vivas de Australia (ANACC-CSIRO). Mientras
(Fernndez-Concha et al., 2004; Buitrago et que, en Portugal se destaca la Algoteca
al., 1999). No obstante, para la preservacin de la Universidad de Coimbra (Santos,
131
2008) y en Francia se mantiene el cepario de presentes en una muestra original y como

cianobacterias del Instituto Pasteur (Billard, las condiciones de laboratorio pueden
1987). En relacin con latinoamrica, se modular su poblacin y permanencia
tiene la coleccin de microalgas del Centro durante el proceso de aislamiento. Aun
de Investigaciones Biolgicas del noroeste de cuando el curador debe tratar de aislar
Mxico (Arredondo, 1997); en Argentina la de el mayor nmero posible de especies, en
la Universidad Nacional de la Patagonia San funcin de los medios de cultivos utilizados,
Juan Bosco (Albarracn et al., 2009) y en Chile condiciones de temperatura, nutrientes e
la coleccin de microalgas de la Universidad iluminacin.
de Concepcin (Gonzlez et al., 2008).
Por ello, el presente trabajo pretende
Se resalta en el presente trabajo la demostrar la importancia de registrar
investigacin realizada en el laboratorio la biodiversidad de microalgas y de
de Ficologa de la Pontificia Universidad cianobacterias procedentes de distintos
Catlica del Ecuador (PUCE). Se la inici ambientes geogrficos del Ecuador,
con la colecta de muestras en diferentes as como, la necesidad de reportar la
sectores geogrficos del Ecuador, existencia de los taxa observados, y las
identificacin de cepas y elaboracin de un microalgas y cianobacterias susceptibles
registro de las mismas, mediante una base de ser conservadas en consorcios nativos
de datos, as como tambin, la seleccin procedentes de los sitios de colecta.
de reas geogrficas para bioprospeccin Adems, se hace referencia a la importancia
de microalgas y cianobacterias de inters de promover las colecciones de microalgas
en biotecnologa ambiental, biomedicina y como lnea base para investigacin bsica
agroalimentacin. y aplicada a biotecnologa, ecofisiologa y
taxonoma en el Ecuador.
En relacin con estudio de monitoreo
de muestras colectadas en los diferentes MATERIALES Y MTODOS
ambientes seleccionados para su posterior Sitios de muestreos.- Se realizaron
aislamiento, no se tienen reportes, ni muestreos de campo en las provincias del
informacin en artculos cientficos sobre Carchi, Guayas, Imbabura, Pichincha y
colecciones de microalgas y cianobacterias Santa Elena (Ecuador). La Tabla 1 seala
existentes en el Ecuador. Tampoco, se han las localidades y el nmero de muestras
descrito reportes sobre los diferentes taxa colectadas por estaciones.
132
Tabla 1
Sitios de muestreo (provincias Santa Elena, Guayas, Carchi e Imbabura, Ecuador)
PROVINCIA Localidad
Entre parntesis se indica el nmero de sitios muestreados en cada sector.
Toma de muestra.- Las muestras rocas y piedras fueron colectadas mediante

fueron colectadas en frascos de vidrio, raspados con cepillo en bolsas de polietileno
envases plsticos y en bolsas de polietileno o envases plsticos y luego transportadas
etiquetados a partir de aguas, lodos, hasta el laboratorio. Cada una de las muestras
sedimentos y de superficie de rocas. Para en los diferentes sitios fueron extradas por
la colecta de fitoplancton en la laguna duplicado (Serrano et al., 2004).
de Yahuarcocha y en el lago San Pablo,
Imbabura (Ecuador), se utiliz una red Trabajo de laboratorio.- Para cada
de fitoplancton de 22 m. Las muestras muestra se consignaron los caracteres
de lodos y sedimentos fueron colectadas del hbitat, localidad, fecha, nmero del
manualmente con envases de plstico para colector y pH (Vergara, 2009; Gonzlez
muestras biolgicas y con esptula. Las et al., 1995). A las muestras colectadas en
comunidades de microalgas crecidas sobre zonas marinas se les determin la salinidad
133
mediante el uso de un refractmetro. A una irradiancia de 78 mol quanta.m-1.s-1

partir de cada muestra original, se tomaron en condiciones de laboratorio.
tres submuestras para su observacin
microscpica e identificacin taxonmica. Cada 15 das fueron monitoreados
Para Cyanoprokaryota se utiliz la clave en cultivos, los cambios en cuanto a la
de Anagnostidis y Komrek (1988) y de poblacin y existencia de taxa. Esto se
Komrek y Anagnostidis (1989, 2005); para realizaba sobre todo con los tubos de ensayo
Chlorophyta la de Bourrelly (1981) y Eaton en donde an permanecan los consorcios
et al., 1995 y las de Bacillariophycea segn o mezclas tanto de microalgas como de
Krammer y Lange-Bertalo (1991) y Rumrich cianobacterias. La densidad de poblacin se
et al. 2000. determin por observacin al microscopio
por recuento en cmara de Neubauer. Las
Siembra de muestras en medios de muestras colonizadas por micelio o aquellas
cultivos lquidos y slidos.- Las muestras que por efecto del medio de cultivo y/o
de fitoplancton fueron resuspendidas en de las condiciones del laboratorio perdan
los medios de cultivo F/2 y fertilizante viabilidad, fueron descartadas.
comercial Nitrofoska cuando las muestras
estaban muy enriquecidas con diatomeas. RESULTADOS
En cambio, se utilizaron medio de cultivo A partir de las observaciones
BG11 completo y BG110, sin nitrgeno para realizadas a las muestras colectadas se
las muestras con una poblacin significativa reportan las microalgas y cianobacterias que
de cianobacterias sin heterocitos o con permanecen asociadas en consorcios y las
heterocitos, respectivamente (Serrano et al., aisladas en los diferentes medios de cultivos;
2004). como tambin las que se mantienen en las
muestras originales. Este reporte, permiti
Para el caso de las muestras marinas establecer la estabilidad de las poblaciones
o de aguas termales salobres se utilizaron existentes en los microambientes estudiados
los medios BG11, F/2 y fertilizante foliar con las cuales han sido inoculadas en los
Nitrofoska con ClNa al 3.5 %. Luego, las medios de cultivos.
muestras eran transferidas tanto a medios
lquidos no aireados, como a medios Las localidades con mayor riqueza
slidos para dar inicio al aislamiento tanto especfica de microalgas fueron la
de microalgas como de cianobacterias. Los Comuna El Azcar, Zapotal, Parque La
cultivos en medio lquido BG11 completo, Moya, Recinto Correntoso, Va Daule,
BG110, Nitrofoska se mantuvieron en Amaguaa, laguna Yahuarcocha y lago
volmenes de 10 ml en tubos de ensayos San Pablo; siendo la laguna El Salado,
no hermticamente tapados. Todos fueron San Gabriel, Carchi la ms representativa
colocados bajo iluminacin artificial con 14 taxa, de los cuales 13 corresponden
continua y con lmparas fluorescentes a a las diatomeas: Gomphonema sp., Navicula
134
sp, Niztschia closterium y Synedra sp.; a laboratorio, la riqueza especfica se redujo a

las clorofitas: Spirogyra sp., Staurastrum Navicula sp., y Gomphonema sp., pero con la
sp., Lagerheimia citriformis, Kirchneriella adicin de Pseudanabaena sp. y Leptolyngbya
sp., Tetraedron sp., Oedogonium sp., sp.; lo cual deduce que las clorofitas parecen
Desmodesmus sp., y una no identificada en ser susceptibles a cambios ambientales en
estado palmeloide y a las cianobacterias: condiciones de laboratorio, ya que ninguna
Oscillatoria sp. y Microcystis sp. (Tabla 2a). fue observada en las evaluaciones realizadas
Al trmino de dos meses en condiciones de con posterioridad.
Tabla 2a
Registro de microalgas y cianobacterias (abundancia y observaciones) en muestras colectadas en
varios sitios sectores de la provincia del Carchi
Procedencia Microalga/
muestra cianobacteria Abundancia Observaciones
135
La Tabla 2b presenta los microorganis- microalga colonial Dictyosphaerium sp., y

mos hallados a partir de las muestras colec- acompaada de una menor poblacin de
tadas del balneario de Aguas Hediondas, Anabaena sp., y Cosmarium sp.. En relacin
Tufio. En una de ellas, solo se observ con la presencia de Dictyosphaerium sp.,
un crecimiento exclusivo de Ulothrix sp., poco frecuente en muestras, se caracteriz
y mientras que en otra muestra del sector por mantener su predominio durante cuatro
sorprende la presencia casi exclusiva de la meses en la muestra original.
Tabla 2b
Registro de microalgas y cianobacterias (abundancia y observaciones) en muestras colectadas en varios
sitios del Balneario de Aguas Hediondas, Tufio, Carchi
Muestra/ Microalga/
Procedencia cianobacteria Abundancia Observaciones
Abundancia: recuento estimado de microorganismos, unicelulares, coloniales o filamentos por campo de observacin
al microscopio. Medio NF: fertilizante comercial NITROFOSKA. Valoracin de abundancia: escasa (+), moderada
(desde ++ hasta +++++), abundante (desde ++++++hasta ++++++++++).
136
De un total de 194 muestras abundancia Chlorella sp.>Desmodesmus sp.>

evaluadas, se aisl el 42.27 %, de las cuales Leptolyngbya sp.> Chroococcus sp., con un
23 corresponden a cianobacterias y 68 a las 32 %, 13 %, 13 % y 8 %, respectivamente
microalgas; encontrndose por orden de (Figura 1).
Figura 1. Porcentaje (%) de los principales taxa de microalgas y de cianobacterias aisladas.
En cambio, los consorcios alcanzaron 53 consorcios microalga-cianobacteria, con

el 57.73 %, identificndose 40 muestras con 31 y 19 taxa de microalga y cianobacteria,
consorcios microalga-microalga (37 taxa); respectivamente (Figura 2).
12 cianobacteria-cianobacteria (6 taxa) y
Figura 2. Nmero de muestras en consorcios: microalga-microalga, microalga-cianobacteria y

cianobacteria-cianobacteria y de gneros de microalgas y de cianobacterias aisladas.
137
De acuerdo con el nmero de taxa en diatomeas y por ltimo las euglenofitas,

los consorcios, las clorofitas fueron las ms con 49.0 %; 30.0 %, 17.5 % y 3.2 %,
abundantes, seguido de las cianobacterias, respectivamente (Figura 3).
Figura 3. Porcentaje (%) de taxa de cianobacterias, clorofitas, diatomeas y euglenofitas presentes

en los consorcios.
En los consorcios entre microalgas, las En cambio, en los consorcios entre cianobac-
mayores frecuencias de aparicin estuvo en terias, se distinguieron Leptolyngbya sp. y
el siguiente orden: Chlorella sp.> Navicula Calothrix sp. (Figura 5)
sp.> Desmodesmus sp. (Figura 4).
Figura 4. Diversidad y frecuencia (%) de taxa presentes en consorcio entre microalgas.
138
Figura 5. Diversidad y frecuencia de taxa presentes en consorcios de cianobacterias.
Al evaluar la diversidad y frecuencia otra, parte se observ una baja frecuencia

de gneros en los consorcios microalga- de los taxa: Eunotia sp., Achnanthes sp.,
cianobacteria, se destac una alta Selenastrum sp., Closterium sp., Cosmarium
presencia de Chlorella sp., Desmosdesmus sp., Monoraphidum sp., Gloeocystis sp.,
sp. y Leptolyngbya sp., lo cual confirma el Mougeotia sp., Spirogyra sp., Microcoleus
predomino de estos microorganismos en sp., Trichodesmium sp. y Aphanizomenon sp.;
todas las muestras evaluadas, e incluso en los cuales se incluyen en la Figura 6, como
las aisladas y mantenidas en coleccin. Por otros taxa.
Figura 6. Diversidad y frecuencia de taxa presentes en consorcios mixtos microalgas- cianobacterias. Otros
taxa: Eunotia sp., Selenastrum, sp. Cosmarium sp., Monoraphidum sp., Mougeotia sp., Gloecosytis sp., Spirogyra
sp., Closterium sp., Achnanthes sp., Microcoleus sp., Trichodesmium sp. y Aphanizomenon sp.
139
Se destaca la presencia de significativo en relacin con Anabaena sp.,

Dictyosphaerium sp. (Figura 7), encontrada y Cosmarium sp., en consorcios microalga-
en el sector del balneario de aguas cianobacteria, durante cuatro meses en
termales de Aguas Hediondas, Carchi, condiciones de laboratorio.
debido a que mantuvo con un predomino
Dictyosphaerium sp. (40x)

Figura 7. Dictyosphaerium sp., Ngeli (1849). Observado solo en el sector de Aguas Hediondas, Tufio,
provincia del Carchi, Ecuador.
Dyctiosphaerium sp. Ngeli (1849), se Hediondas, provincia del Carchi y se

caracteriza por su organizacin colonial es- caracteriza por presentar filamentos
frica o irregular, envuelta por una matriz cilndricos uniseriados y no ramificados.
mucilaginosa, con 4-64 clulas esfricas u Su carcter taxonmico sobresaliente,
ovales conectadas por filamentos gelati- corresponde a un engrosamiento diferencial
nizados, las cuales forman una estructura de la pared celular, de modo que su parte
cruciforme de ramificacin dicotmica o prxima al septo transversal es siempre ms
tetracotmica y dispuestas perpendicular- gruesa y se va adelgazando hacia la porcin
mente a la superficie de la colonia. Puede media de la clula. En algunas ocasiones
crecer en una variedad de hbitats de agua ocurre la ruptura del filamento en la parte
dulce, as como en embalses eutrficos y media formndose as, fragmentos de pared
estanques (Krienitz et al., 2012; Krienitz et celular con forma de H. Estn distribuidas
al., 2010). en habitats acuticos, particularmente entre
algas filamentosas en arroyos, riachuelos,
Microspora, Thuret (1850), (Figura acequias y efluentes de minera con pH
8) tambin fue observada en el mismo entre 3-6 (Guiry, 2013).
sector de las aguas termales de Aguas
140
Microspora sp. (40x)

Figura 8. Microspora sp., Rabenhorst L (1868). Observado solo en el sector de Aguas Hediondas, Tufio,
provincia del Carchi, Ecuador.
Tanto Dictyosphaerium sp., como en muchos de los cultivos envejecidos

Microspora sp., fueron observadas solo en (Abazari et al., 2013).
un sitio; ya que aparentemente su hbitat
est asociado a ambientes de ese sector Segn Anagnostidis y Komrek
con abundantes aguas sulfurosas. No (1988), Leptolyngbya se define como un
obstante, entre las cianobacterias se destaca clster comprendido por los gneros
Leptolyngbya sp., por ser la ms distribuida tradicionales: Lyngbya, Phormidium y
en todas las localidades muestreadas Plectonema (LPP grupo B). Las especies de
(Figura 5 y 6), lo cual sugiere su capacidad este gnero (Figura 9) presentan filamentos
adaptativa, incluso en condiciones delgados (0.5 a 3.5 m), tilacoides parietales
estresantes de laboratorio, en cuanto a y con vainas facultativas. Varias especies
limitacin de nutrientes, temperatura e son formadoras de clsteres o biofilms
iluminacin, incluso al llegar a ser exclusiva (Komrek, 2007; Albertano y Kovik 1994).
141
Leptolyngbya sp. (100x)

Figura 9. Leptolyngbya sp., Anagnostidis y Komrek (1988), cianobacteria con mayor frecuencia observada
en consorcios y en cultivos aislados.
DISCUSIN menos, la cepas de Navicula sp., Cymbella

La fase de bioprospeccin de cepas sp., Diyctyosphaerium sp., Microspora sp., y
de microalgas y de cianobacterias para Mougeotia y las cianobacterias: Phormidium
ser incluidas en colecciones o banco de sp. y Leptolyngbya sp., encontradas en aguas
germoplasma, constituye la primera fase termales de San Vicente, Santa Elena y
de exploracin de aquellos ambientes de Aguas Hediondas, Carchi pueden ser
naturales que pueden contener una rica consideradas de ambientes extremos.
biodiversidad o simplemente permite la
deteccin de estos microorganismos en La mayor riqueza especfica observada
sitios nicos como de carcter endmico o en diatomeas y clorofitas parece indicar su
asociados a otros mediante consorcios los posible adaptacin a los distintos nichos
cuales tambin representan un potencial ecolgicos. Mientras que, las cianobacterias
para investigacin desde el punto de vista suelen ser altamente competitivas ante la
ecolgico, taxonmico, biotecnolgico y deficiencia de nitrgeno y otros elementos,
ambiental. como en el caso de Nostoc sp., Calothrix sp.,
Anabaena sp. y Leptolyngbya sp. Adems, de
Algunos de los hbitats analizados presentar elevada capacidad de adaptacin
presentan caractersticas particulares y a ambientes extremos de pH, deficiencia en
condiciona la adaptabilidad de las diversas nutrientes, alta irradiacin solar, condiciones
especies a los mismos. En este caso, al anxicas, aguas sulfurosas, aguas eutrficas
142
y alcalfilas (Vincent, 2007). Entre las un predominio de diatomeas (Navicula sp.,

estaciones de muestreos que presentan Epithemia sp., Diatoma sp., Gomphonema
condiciones extremas de pH, temperatura, sp., Synedra sp., Nitzschia sp. y Melosira
aguas sulfurosas y condiciones anxicas sp.) al inicio de la evaluacin; pero luego
se encontraron en el Balneario de Aguas fueron sustituidas por clorofitas (Chlorella
Hediondas, Carchi y en los baos termales sp., Desmodesmus sp. y Scenedesmus sp.) y
de San Vicente, Santa Elena. en muchos casos por Leptolyngbya. Velasco
et al., (1984), al realizar observaciones
La elevada frecuencia de Chlorella mensuales en un cultivo mixto o en
sp., Desmosdesmus sp. y Scenedesmus sp. consorcio, describen la sucesin de especies
y de Leptolyngbya sp., en condiciones de con un predominio de Niztschia sp., luego
laboratorio, confirma su alta adaptabilidad sucedida por Scenedesmus sp., y por ltimo
fisioecolgica con respecto a otros una preponderancia de Chlorella sp.
microorganismos en consorcios. Adems,
llegaron a mantenerse exclusivas en La competencia se hace ms evidente
muestras cultivadas durante el perodo cuando a los cultivos de coleccin no se les
de estudio, lo cual les confiere la suministra nutrientes peridicamente. Es
susceptibilidad de ser aisladas rpidamente. por ello que se ha demostrado dominancia
Chlorella sp. y Desmosdesmus sp., logran de algunas sobre otras y as pueden aparecer
surgir como organismos aislados a partir completamente aisladas, como producto
de consorcios, probablemente debido a la de estas interacciones competitivas. En un
produccin de compuestos inhibitorios estudio realizado sobre la influencia de la
para otros microorganismos. En cultivo, la deficiencia de N y P en las interacciones
competencia ecolgica de Chlorella vulgaris competitivas entre Chlorella vulgaris y
mediante alelopata sobre Pseudokirchneriella Scenedesmus acutus y de acuerdo con los
subcapitata ha sido descrita lo cual demuestra modelos de competencia de Lotka-Volterra,
el efecto inhibitorio de chlorelina (Fergola se evidenciaron tres situaciones diferentes:
et al., 2007). exclusin competitiva de S. acutus por C.
vulgaris en el tratamiento control; exclusin
Tambin se demuestra que a partir de alguna de las dos y la de coexistencia en
de colectas de diferentes localidades, el tratamiento con deficiencia de fsforo
se establece una sucesin de especies, (Gonzlez, 2010). En contraposicin, en
conforme van cambiando las condiciones otras cepas de clorofitas, puede no ocurrir
de los cultivos en relacin con la el mismo efecto y en este sentido se ha
disponibilidad de nutrientes, temperatura, descrito coexistencia entre Chlorella sp., y
flora bacteriana asociada, iluminacin, Chlorococcum sp., en cultivos limitados en
pH. Se pudo determinar que en muestras N, P y Fe; con lo cual se sugiere que las
colectadas de laguna de Yahuarcocha y interacciones entre ambas especies no es
lago de San Pablo, Imbabura, se observ afectada por ningn factor aleloptico (Dow
143
et al., 2006). Es posible que, el predominio teria con estrategia ecolgica ante altas con-
de las cepas de Chlorella sp., Desmodesmus centraciones de fosfato.
sp. y Scenedesmus sp., observadas, pueda
deberse a la produccin de compuestos As mismo, Van der Grinten et al. (2005),
alelopticos; de tal manera que logren describen el efecto de la luz, temperatura,
excluir a los dems microorganismos pH y nutrientes sobre un biofilm con
existentes previamente en los consorcios. Leptolyngbya foveolarum y Nitzschia perminuta
y encuentran inhibicin del crecimiento de
Tales estudios conllevan recomendar la diatomea por parte de la cianobacteria,
que durante el proceso de mantenimiento tanto a baja como a elevadas intensidades
de consorcios en colecciones se deben luminosas, incremento del pH y limitacin
monitorear peridicamente la riqueza de nutrientes.
especfica en estos, as como seleccionar
medios de cultivos selectivos para Tales resultados, posiblemente,
promover el crecimiento especfico de permitan explicar la elevada frecuencia
cepas seleccionadas en funcin de sus de aparicin de Leptolyngbya tanto en
requerimientos nutricionales. consorcios como en los cultivos donde
result el nico el microorganismo en
En tanto la frecuencia de aparicin de perdurar; mientras no se le adicionaba
Leptolyngbya sp. (13 % de los cultivos aisla- medio de cultivo fresco a las muestras.
dos y en 13.3 % de los consorcios mixtos mi-
croalga-cianobacteria), sugiere tambin un Por lo tanto, se recomienda realizar
elevado nivel competitivo de esta cianobac- estudios sobre la ecofisiologa de las
teria frente a otros microorganismos pre- diversas especies de Leptolyngbya, por
sentes en las muestras. Al respecto, Van cuanto se ha observado crecimiento
der Grinten et al. (2004) al evaluar el efecto de la misma en cultivos masivos de
del fosfato en biofilms constituidos por las microalgas y en cultivos mantenidos en
diatomeas, Melosira varians, Nitzschia per- laboratorio. Adems, podra ser utilizada
minuta, Navicula trivialis y Achnanthes lanceo- para ficorremediacin de efluentes y
lata y por las cyanobacterias, Leptolyngbya para formacin de biofilms o de tapetes
foveolarum y Cylindrospermum stagnale, dede sumo inters para biorremediacin y
mostraron que a diferentes concentraciones acondicionamiento de suelos (Olgun y
(0.5, 5.0 y 50.0m), en condiciones de labo- Snchez-Galvn, 2012; Soltani et al., 2012).
ratorio, L. foveolarum y en menor propor-
cin, Nitzschia perminuta, predominaron a En relacin con Dictyosphaerium sp.
mayor concentracin de fosfato, facilitado y Microspora sp., halladas en las aguas
por el crecimiento expansivo y la excrecin termales de Aguas Hediondas, se destacan
de inhibidores generados por L. foveolarum; por ser exclusivas de la zona y posiblemente
por lo tanto, se postula como una cianobac- Dictyosphaerium sp., an no han sido
144
reportadas para Ecuador (Gallo y Apolo, Microspora sp. y Mougeotia sp.

2012), por lo cual amerita realizar en dicha
rea ms estudios de bioprospeccin de Se demuestra que los consorcios
microorganismos que puedan presentar clasificados en microalga-microalga,
inters en biotecnologa o como bioindicadores cianobacteria-cianobacteria y microalga-
de zonas sulfurosas y/o termfilas. cianobacteria, constituyen microsistemas
biolgicos que deben ser conservados en
Las microalgas y cianobacterias las colecciones de cultivos.
aisladas, as como las mantenidas en
consorcios, conforman un recurso biolgico Chlorella sp. y Desmodesmus sp.,
para investigacin en biodiversidad y fueron las microalgas ms susceptibles
biotecnologa; de all el reto de conservar la de ser aisladas dadas sus capacidades de
coleccin de cultivos de forma sustentable, adaptacin a condiciones de laboratorio.
en medios de cultivo tanto lquidos como Mientras que la cianobacteria Leptolyngbya
slidos, segn las condiciones ptimas de demostr ser altamente competitiva,
luz y temperatura, bien sea en cmaras adaptndose en cultivos deficientes en
de cultivo o a temperatura ambiente nutrientes, envejecidos y deshidratados.
(Belkinova et al., 2002).
AGRADECIMIENTOS
El estudio realizado formaliza la A la Escuela de Bioanlisis de la
metodologa para detectar las diferencias Pontificia Universidad Catlica del Ecuador
en cuanto a riqueza especfica, permanen- por haber facilitado las condiciones para
cia, abundancia, sucesin de taxa, durante el la realizacin de la presente investigacin
proceso de aislamiento; adicionalmente per- y por ser la depositaria de la coleccin de
mite recomendar que las muestras origina- microalgas y cianobacterias. Este trabajo ha
les deben ser mantenidas como fuentes de sido financiado por el Proyecto Prometeo
reclutamiento de microorganismos. de la Secretara Nacional de Educacin
Superior Ciencia, Tecnologa e Innovacin
CONCLUSIONES (Ecuador).
Chlorella sp. y Desmodesmus sp.,
resultaron los taxa ms susceptibles de REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
ser aislados, seguidos de Leptolyngbya sp.
Se identificaron sitios de muestreos con Abazari M, Zarrini G y Rasooli I. 2013. An-
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Laboratorio de Gentica Evolutiva, Escuela de Ciencias Biolgicas, Pontificia Universidad
Catlica del Ecuador, Quito, Ecuador
lunaf3@hotmail.com; vrafael@puce.edu.ec
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y 4 000 m de altitud. Estos ecosistemas se encuentran amenazados por la fragmentacin
debido a la deforestacin. Cuando la fragmentacin aumenta y la cantidad de hbitat
remanente disminuye, se reduce la diversidad del ecosistema. Fueron seleccionados tres
parches de bosque de Polylepis. En cada parche se estableci un transecto de 120 m de
longitud dividido en siete estaciones de muestreo. En total se capturaron 572 individuos
pertenecientes a ocho especies del gnero Drosophila. Uno de los parches present la mayor
abundancia y la mayor diversidad de drosfilas, adems de ser el ms diverso en flora. No se
capturaron especies cosmopolitas en ninguno de los parches, lo cual indic que los bosques
se encuentran en buen estado de conservacin; sin embargo, una posible explicacin podra
ser que las bajas temperaturas del pramo estn actuando como barrera.
PALABRAS CLAVES: biodiversidad, bioindicador, Drosophila, fragmentacin, pramo
ABSTRACT.- This study was conducted in forests of Polylepis located between 3 700
and 4 000 m above sea level. These ecosystems are threatened by fragmentation from
deforestation. As fragmentation increases and the amount of remaining habitat decreases,
the ecosystem diversity may be reduced. We selected three forest patches of Polylepis. In
each patch we established a transect of 120 m divided into seven sampling sites. We
captured 572 individuals belonging to eight species of the genus Drosophila. One of the
patches had the highest abundance and greater diversity of fruit flies and plants. We did
not capture cosmopolitan species in any of the patches, indicating that these forests are in
good condition. However an alternative explanation could be that the low temperatures
of the pramo are acting as a barrier to dispersal of cosmopolitan species from lower
elevations and other locations.
KEYWORDS: biodiversity, bioindicator, Drosophila, fragmentation, pramo
151
INTRODUCCIN geogrfica; en la actualidad existe un

La familia Drosophilidae est mayor inters en los estudios ecolgicos
compuesta por 73 gneros y 3 950 especies mediante Drosophila; por ejemplo varios
descritas y distribuidas en las regiones autores han propuesto al gnero Drosophila
templadas y tropicales del planeta (Brake como bioindicador (Cavasini et al., 2008;
y Bchli, 2008). En la regin Neotropical, Alves da Mata et al., 2008; Gottschalk et al.,
el gnero Drosophila est altamente 2007; Tidon, 2006; Ferreira y Tidon, 2005;
diversificado, con numerosas especies an Van der Linde y Sevenster, 2002).
por descubrirse (Medeiros y Klaczko, 2004).
Las investigaciones sobre la biodiversidad El presente estudio se realiz en
de la flora y fauna en Ecuador, han revelado tres parches de bosques de Polylepis con
que a pesar de ser un pas relativamente influencia antrpica. Polylepis es una
pequeo, es biolgicamente uno de los planta leosa de la familia Rosaceae
ms diversos del planeta (Mittermeier y con distribucin sobre los 3 500 m de
Mittermeier, 1997). altitud. Estos bosques cumplen un papel
central en la ecologa alto-andina, como
La primera referencia sobre el gnero hbitat de muchas especies de plantas y
Drosophila en el Ecuador fue el estudio de animales (Kessler, 2006). Sin embargo,
Becker (1919). Sin embargo, investigaciones estos bosques son uno de los ecosistemas
minuciosas sobre la diversidad del gnero ms amenazados del mundo. La principal
se iniciaron solo a finales de la dcada de amenaza es la fragmentacin por
los aos 80. Durante los ltimos 20 aos se deforestacin. La mayora de los bosques
han obtenido datos sobre la distribucin y andinos tropicales se caracterizan por
taxonoma del gnero, con inclusin de las presentar una distribucin en parches;
descripciones de especies nuevas (ie. Acurio las posibles causas de esta distribucin
et al., 2010; Acurio y Rafael, 2009; Vela y estn an en debate (Cierjacks et al., 2007).
Rafael, 2005; Rafael y Vela, 2000). Hasta el Cuando la fragmentacin aumenta y la
2009, en el Ecuador, se han reportado 112 cantidad de hbitat remanente disminuye,
especies del gnero (Acurio y Rafael, 2009). las poblaciones animales se reducen por
En estudios recientes (Cspedes y Rafael, la emigracin de los individuos o por un
2012; Figuero et al., 2012; Figuero y Rafael, aumento en la mortalidad que afectan la
2011) se descubren 8 nuevas especies ms diversidad del ecosistema (Grez y Zaviezo,
del gnero Drosophila. 2002; Bustamante y Grez, 1995).
A pesar que el gnero Drosophila ha El objetivo de este trabajo fue analizar

sido utilizado como organismo modelo la diversidad del gnero Drosophila y el
en innumerables publicaciones (Mateus estado de conservacin en que se encuentran
et al., 2006), pocas de estas han abordado los parches mediante la ausencia o presencia
el mbito de la ecologa y la distribucin de ciertas especies del gnero Drosophila.
152
DIVERSIDAD DEL GNERO Drosophila (DIPTERA, DROSOPHILIDAE)
EN EL PRAMO DE PAPALLACTA, PICHINCHA, ECUADOR
MATERIALES Y MTODOS sp., una planta arbustiva de la familia

Fueron seleccionados tres parches Asteraceae.
de bosques de Polylepis (denominados
parche A, B y C), en la va Pifo-Pramo de El parche B se sita a 4 014 m de
Papallacta de la provincia de Pichincha, altitud, con coordenadas 781232.1W;
Ecuador (Figura 1). Estos parches se 002009.4S. Este bosque tiene composicin
componen principalmente de rboles mixta de plantas de pramo, en su mayora
del gnero Polylepis, y forman parte de formadas por Polylepis pauta Hieron;
la Reserva Ecolgica Cayambe-Coca y la adems se encuentra una gran variedad de
Reserva Ecolgica Antisana; ubicadas en la especies de la familia Asteraceae.
parte occidental de la cordillera oriental.
El parche C se encuentra a 4 005 m de
El parche A es un remanente ubicado altitud, sus coordenadas son 781242.8W
a 3 731 m de altitud, cuyas coordenadas 001924.8S. Este relicto boscoso presenta
son 781328.1W; 001913.5S. Este una composicin homognea de Polylepis
parche es un relicto boscoso homogneo de pauta, aunque en las cercanas podemos
Polylepis incana Kunth, en cuyo interior se encontrar grandes poblaciones de Gynoxis sp.
encuentran numerosas matas de Gynoxys
Figura 1. Mapa y ubicacin de los tres parches muestreados durante el estudio.
153
En cada parche se estableci un colectaron las plantas de cada estacin

transecto de 120 m de longitud, desde de muestreo de cada transecto en los tres
el borde del parche hacia el interior del parches. La identificacin de las muestras
bosque, dividido en siete estaciones de se realiz con la ayuda de especialistas del
muestreo separadas por una distancia de Herbario QCA de la Pontificia Universidad
20 m. En cada estacin se colocaron cuatro Catlica del Ecuador.
trampas que contenan cebo de pltano y
levadura. Las trampas fueron fabricadas con RESULTADOS
botellas plsticas perforadas para facilitar el Diversidad.- Se capturaron 572
ingreso de las moscas. Las trampas fueron individuos pertenecientes a ocho especies
atadas en rboles a 1 m de altura. Las del gnero Drosophila y dos especies de
recolecciones se realizaron con aspiradores hembras no determinadas (Tabla 1). Cinco
entomolgicos durante los meses de de las especies corresponden a especies
febrero, abril, julio y septiembre del 2009. nuevas; tres de ellas ya descritas (Figuero
et al., 2012; Figuero y Rafael, 2011), Drosophila
Se calcul la diversidad beta de papallacta sp. nov., (en preparacin) y
Whittaker en cada parche que nos indica Drosophila 1 sp. nov. sin publicar.
la tasa de cambio de especies de Drosophila
entre los tres parches. Se calcul con la En el parche A se capturaron 64
siguiente frmula; individuos pertenecientes a cuatro
especies; en el parche B se recolectaron 386
w = (S/ ) -1 individuos, miembros de ocho especies y en
el parche C se encontraron 122 individuos
donde S= nmero total de especies pertenecientes a tres especies del gnero
encontradas en el sistema (diversidad Drosophila (Tabla 1). El parche A present
gama) y = el promedio de la diversidad una diversidad w= 0.86, el parche B, w= 1 y
encontrada (Magurran, 2004). el parche C, w= 0.62.
La identificacin de las especies Las ocho especies capturadas son

del gnero Drosophila se hizo mediante del subgnero Drosophila y pertenecen a
el anlisis de la morfologa externa y seis grupos de especies menos una especie
de la genitalia. Los individuos de las no agrupada. Grupo Drosophila guarani
especies nuevas descritas previamente se representada por D. ecuatoriana Vela y
depositaron en el Museo de Zoologa, seccin Rafael, 2004; grupo D. tripunctata por D.
Invertebrados de la Pontificia Universidad pasochoensis Vela y Rafael, 2001; grupo D.
Catlica del Ecuador, Quito (QCAZ-I). mesophragmatica por D. rucux Cspedes
y Rafael, 2012; grupo D. flavopilosa por
Por ltimo, se realiz una Drosophila 1 sp. nov.; grupo D. onychophora
caracterizacin de hbitat, para ello se por Drosophila yurag y Drosophila yuragshina
154
Figuero y Rafael, 2011; grupo D. asiri por sin agrupar: Drosophila papallacta sp. nov.
Drosophila yanaurcus Figuero et al. 2012 y (en preparacin).
Tabla 1
Especies del gnero Drosophila recolectadas en cada parche y en cada una de las siete
estaciones del transecto
especies Total
A1 (0m.) A2 (20m.) A3 (40m.) A4 (60m.) A5 (80m.) A6 (100m.) A7 (120m.)
(parche A) (parche A)
D. ecuatoriana 4 1 1 6
P
a D. pasochoensis 1 1
r
c
h D. rucux 1 2 1 1 5
e
A D. yanaurcus 10 2 18 7 11 2 2 52
Total
11 6 20 9 13 3 2 64
(parche A)
especies Total
B1 (0m.) B2 (20 m.) B3 (40 m.) B4 (60 m.) B5 (80 m.) B6 (100 m.) B7 (120 m.)
(Parche B) (parhe B)
D.ecuatoriana 2 2
Drosophila 1 sp. nov. 11 23 21 61 1 117
D. papallacta 6 11 1 4 22
P
a
r D. yurag 3 34 8 87 2 11 5 150
c
h
e D. yuragshina 1 7 8
B
D. yanaurcus 29 12 20 16 3 80
no det.1 2 2 2 6
no det.2 1 1
Total
52 69 51 187 6 12 9 386
(parche B)
especies Total
C1 (0m.) C2 (20 m.) C3 (40 m.) C4 (60 m.) C5 (80 m.) C6 (100 m.) C7 (120 m.)
(parche C) (parche C)
P
a Drosophila 1 sp. nov. 1 2 15 18
r
c
h D. papallacta 3 5 2 10
e
C D. yanaurcus 5 3 9 10 14 49 4 94
Total
8 4 9 10 16 69 6 122
(parche C)
155
Los resultados de la diversidad parche B fue el ms diverso en plantas,

vegetal son los siguientes: en el parche A se colectaron 37 especies, 18 de ellas de
se colectaron un total de 25 especies de la familia Asteraceae. En el parche C se
plantas a lo largo de todo el transecto, en colectaron 29 especies de plantas, tambin
su mayora de la familia Asteraceae. El es su mayora asterceas (Tabla 2).
Tabla 2
Especies y porcentajes de plantas encontradas en cada uno de los parches muestreados
especies parche A % especies parche B % especies parche C %
Aetheoleanae sp. 15 ASTERACEAE sp.3 0,28 ASTERACEAE sp.1 1,14

ASTERACEAE sp.1 7,14 ASTERACEAE sp.4 1,14 ASTERACEAE sp.2 0,71
ASTERACEAE sp.5 6,14 Azorella sp. 1 ASTERACEAE sp.8 0,14
Butleja incana 2 Baccharis sp. 0,57 Azorella sp. 0,57
Calamagrostis intermedia 0,14 Calamagrsotis intermedia 2 Carex pichinchensis 0,14
Gunera magenalica 1,14 Daucus sp. 0,14 Diplostephium sp.1 0,42
Hydrocotyle sp. 3,28 Diplostephium rupestre 0,57 ERICACEAE sp.1 1
Hypericum laricifolium 0,14 Diplostephium sp.1 3,14 Galium sp. 0,14
Lachemila orbiculata 13,57 Diplostephium sp.2 6,85 Gynoxis sp.1 0,57
Lachemila sp. 0,85 Diplostephium sp.3 1,57 Gynoxis sp.2 3,71
Luzula gigantea 0,71 Galium canescens 2 Hydrocotyle sp. 14
Pernettya postrata 0,14 Geranium diffusum 3,42 Luzula gigantea 0,71
Polylepis incana 28 Gunnera magellanica 8,14 Miconia sp.1 4,42
Polylepis pauta 0,85 Gynoxis monophylla 1 Miconia sp.2 2,57
Ribes sp. 3,14 Gynoxis sp.2 1,85 Monticalia andicola 1,57
ROSACEAE sp.1 0,71 Gynoxis sp.3 1,85 Polylepis pauta 20,71
Sibthorpia repenes 5,42 Gynoxis sp.4 1,42 Rubus sp. 0,71
Solanum sp.1 4,42 Gynoxis sp.5 2,57 Sibthorpia repenes 33
Solanum sp.2 0,57 Gynoxis sp.6 2,57 Solanum sp.1 1,42
Urtica sp.1 1 Loricaria thuyoides 0,42 Solanum sp.2 2
Urtica sp.2 1,57 Luzula gigantea 2,85 Solanum sp.3 1,42
Urtica sp.3 2 Miconia sp.1 7 Solanum sp.4 0,28
Monina sp. 0,42 Solanum sp.5 0,28
Pernettya sp. 0,42 Stellaria sp. 0,14
Polylepis pauta 27,57 Urtica sp.2 0,28
Rubus sp. 1,57 nodet. 0,28
Sibthorpia repens 0,28
Solanum sp.3 0,57
Solanum sp.5 1,42
Stellaria sp. 1,14
Valeriana microphylla 5,14
Valeriana sp. 6,42
Werneria sp. 0,28
nodet. 0,28
Especies ms abundantes
Especies de la familia ASTERACEAE
156
Distribucin temporal de las En este parche se observa una pequea

especies.- En el parche A, abril fue el mes distribucin temporal de las especies ms
con ms abundancia de individuos y ms abundantes (Tabla 3, Figura 3).
diversidad, mientras que julio fue el mes
de menor captura de individuos (Tabla 3, En el parche C, al igual que en el
Figura 2). parche B, febrero fue el mes en el cual se
recolect el mayor nmero de individuos,
En el parche B, en febrero se capturaron y abril fue el mes en el cual se encontr
ms individuos y ms especies (8 especies); mayor diversidad, mientras que en julio
mientras que julio sigue siendo el mes con se captur el menor nmero de individuos
menor nmero de individuos capturados. (Tabla 3, Figura 4).
Tabla 3
Especies del gnero Drosophila recolectadas en cada parche y en cada mes de muestreo. *mes
de mayor captura
Especie Feb. Abr. Jul. Sep. SubTotal
D. yanaurcus 11 24 2 15 52
D. rucux 1 1 3 5
Parche A
D. pasochoensis 1 1
D. ecuatoriana 5 1 6
Subtotal Parche A 16 *27 3 18 64
D. yanaurcus 38 8 10 24 80
D. yuragshina 1 4 3 8
D. yurag 24 56 9 61 150
D. papallacta 2 8 5 7 22
Parche B
Drosophila 1 sp. nov 94 10 12 1 117
D. ecuatoriana 1 1 2
nodet.2 1 1
nodet.1 1 5 6
Subtotal Parche B *160 86 37 103 386
D. yanaurcus 29 33 1 31 94
Parche C D. papallacta 1 2 7 10
Drosophila 1 sp. nov 15 3 18
Subtotal Parche C *44 37 3 38 122
TOTAL 220 150 43 159 572
157
Figura 2. Diversidad y abundancia de las especies del gnero Drosophila en el parche A, durante los
cuatro meses de colecta.
Figura 3. Diversidad y abundancia de las especies del gnero Drosophila en el parche B, durante los
158
Figura 4. Diversidad y abundancia de las especies del gnero Drosophila en el parche C, durante los
DISCUSIN ningn individuo (com. pers. Cspedes,

Composicin de las comunidades 2011). Por lo tanto se debe considerar que
del gnero Drosophila y caracterizacin de el muestreo realizado en este estudio fue
hbitat.- El nmero de moscas capturadas ptimo. Adems, en estos bosques las
en este pramo es aparentemente bajo (572 condiciones ambientales son extremas,
individuos), en comparacin con otros con temperaturas mximas de hasta 20 C
estudios realizados en los ltimos aos en (entre las 12:00 y 15:00 h) y mnimas de -2
el Ecuador (Acurio y Rafael, 2009; Rafael C (entre las 3:00 y 6:00 h). Las variaciones
y Vela, 2000). Hay que resaltar que los de temperatura extremas tienen efectos
bosques muestreados en el presente trabajo perjudiciales en los ectotermos como los
se encuentran sobre los 3 700 m de altitud. insectos (Dillon et al., 2009) por lo cual
A esta misma altitud en la Quebrada de encontrar especies de Drosophila en estos
Cruz Loma, Pichincha, Cspedes y Rafael lugares resulta extraordinario.
encontraron un total de 11 individuos del
gnero Drosophila, mientras que a 4 000 m de De las ocho especies de Drosophila
altitud en la misma quebrada no capturaron encontradas, cinco son nuevas especies. Tres
159
ya han sido descritas (Figuero et al., 2012; Aragundi y colaboradores (2010); Kessler
Figuero y Rafael, 2011); D. papallacta sp. nov. (2002) y Ellenberg (1979) sugieren que los
se encuentra en preparacin, mientras que bosques de Polylepis, cuando aparecieron,
Drosophila 1 sp. nov. (grupo D. flavopilosa) formaban bosques continuos y no parches
an no se ha publicado debido a que es como los conocemos en la actualidad, lo
una especie muy similar a D. korefae Vela y cual explicara en parte la presencia de las
Rafael, 2004. La nica diferencia que existe mismas especies del gnero Drosophila en
entre las dos especies es que Drosophila 1 varios parches.
sp. nov. presenta pigmentacin en el ala,
mientras que D. korefae no la presenta (obs. Los resultados de la caracterizacin
pers.); esta diferencia no es suficiente para de hbitat muestran que el parche B es ms
aseverar que se trata de especies diferentes, diverso en plantas que los otros dos parches
por lo cual se espera en el futuro se realicen (A= 25 especies de plantas; B= 37 especies y
anlisis moleculares. C= 29 especies). La alta diversidad vegetal
del parche B podra ser considerada como
En conclusin, estos descubrimientos una fuente nutricional importante para las
indicaran la existencia de numerosas drosfilas, lo cual explicara la presencia de
especies nuevas del gnero Drosophila en los las ocho especies del gnero Drosophila. Dos
bosques de Polylepis y del alto endemismo de las especies de Drosophila pertenecen al
que potencialmente pueden existir en los grupo de especies D. onychophora, grupo
pramos del Ecuador. Por consiguiente asociado a flores de la familia Asteraceae
se deben considerar como prioritarios a (Figuero y Rafael, 2011), familia abundante
estos ecosistemas para futuros estudios de en el parche B. Asimismo este parche
diversidad. present la diversidad beta ms alta (w
(de B)= 1) en comparacin con los parches A
Drosophila yanaurcus se encuentra y C. Esto nos indica que el parche B es el

distribuida en los tres parches, mientras ms heterogneo en cuanto a la comunidad
que el parche B y C comparten a Drosophila de especies de Drosophila; por lo tanto
1 sp. nov., y Drosophila papallacta sp. nov. este relicto boscoso tan diverso debe ser
(en preparacin). Estos resultados estaran prioritario en programas de conservacin.
sugiriendo que las tres especies estn mejor
adaptadas a los ecosistemas de altura como Distribucin temporal.- Febrero fue
son los bosques de Polylepis que el resto el mes donde se recolect el mayor nmero
de especies encontradas. Sin embargo, de individuos (220), mientras que julio fue
Cmo se explicara que los tres parches el mes con menor nmero de individuos
muestreados comparten las mismas especies recolectados. Los datos del INAMHI, de la
de Drosophila si se conoce que las moscas de estacin AMAZNOR (Papallacta), para el
altura seguramente tengan poca capacidad 2009 indican al mes de febrero como uno
de vuelo? (Dillon y Frazier, 2006; obs. pers.) de los ms secos (57.3 mm) mientras que
160
julio es uno de los meses ms lluvioso del

bioindicadores del estado de conservacin
ao (155.2 mm) (INAMHI, 2009), adems dede los ecosistemas, como las mariposas,
ser un mes con vientos fuertes (obs. pers.),
las hormigas y los macroinvertebrados
estas variaciones ambientales pueden ser la
entre otros (Bonada et al., 2006; Meyer y
causa que se recolectaron ms individuosSisk, 2001; Andersen, 1997). Las especies
de ciertas especies que otras segn el mes, lo
cosmopolitas del gnero Drosophila,
cual indicara una distribucin temporal de
como algunos miembros del grupo D.
las poblaciones de las diferentes especies. Por
melanogaster, indican alteraciones en el
ejemplo Drosophila 1 sp. nov., es abundante
ecosistema y podran estar favorecidas
en el parche B y C en febrero mientras que
por la fragmentacin, mientras que las
casi no se encuentra en septiembre. Otroendmicas, indican la existencia de factores
caso es Drosophila yurag que se encuentra
ecolgicos excepcionales y un ecosistema
en el parche B; esta especie declina su nico (Vela y Rafael, 2003). Al contrario
poblacin en el mes de julio y se recupera en
de los resultados obtenidos por Acurio y
septiembre. Por ltimo, Drosophila yanaurcus
colaboradores (2010), quienes encuentran
disminuye su poblacin en julio en todosuna elevada tasa de drosfilas invasoras
los parches, pero reaparece en septiembre.
en lugares con influencia antrpica; en el
Los meses en que declinan las poblaciones
Bosque Tropical Yasun (Ecuador), en el
podran corresponder a estadios larva/ presente estudio no se encontr ninguna
pupa de las especies. Las moscas de altura
especie del gnero Drosophila en calidad de
presentan ciclos de vida largos debido a las
cosmopolita en los bordes de los parches de
bajas temperaturas (aproximadamente 3 Polylepis, a pesar de su cercana a lugares
meses), por ejemplo D. yanaurucs (Figuero
con actividad antrpica. Estos resultados
et al., 2012). Existen otros estudios sobre
son alentadores en cuanto al estado de
los ciclos biolgicos de especies del gnero
conservacin de los bosques de Polylepis.
Drosophila en relacin con la temperatura
Una de las razones principales para que no
(James et al., 1997; Shorrocks, 1972). Estos
se hayan encontrado especies cosmopolitas
estudios permiten afirmar que las moscaspuede ser las bajas temperaturas del
de altura se pueden encontrar en estadios de
pramo. Existen estudios que confirman
larva/pupa durante tres meses. Este tiempo
la poca adaptabilidad de las especies
podra corresponder a las pocas en que las
cosmopolitas a las bajas temperaturas, como
poblaciones de Drosophila de los parches A,
es el caso de D. melanogaster Meigen, 1830
B y C de los bosques de Polylepis decrecen.
(Hoffmann, 2010; Dillon y Frazier, 2006).
Otro ejemplo es el caso de D. malerkotliana
Estado de conservacin de los Parshad y Paika, 1965, especie del grupo D.
bosques.- La abundancia y composicin melanogaster, que fue capturada en el parche
de la poblacin de un determinado B en el ao 2004 (Rafael, 2007). Durante
taxn puede indicarnos la calidad de un el presente estudio no se captur ningn
ecosistema. Existen grupos de insectos individuo de esta especie; esto corroborara
161
que las poblaciones de D. malerkotliana REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

llegaron al pramo accidentalmente pero
no se establecieron, probablemente debido Acurio A, Rafael V y Dangles O. 2010.
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165
REVISION DE TRABAJOS CIENTFICOS
Integrones: plataformas bacterianas de recombinacin gentica y su
influencia en la resistencia bacteriana
David Ortega-Paredes1 y Jeannete Zurita1,2,3

1
Unidad de Investigaciones en Biomedicina. Zurita&Zurita Laboratorios. Quito, Ecuador
daortegap@gmail.com
2
Facultad de Medicina. Pontificia Universidad Catlica del Ecuador, Quito, Ecuador
3
Servicio de Microbiologa y Tuberculosis, Hospital Vozandes, Quito, Ecuador
RESUMEN.- La gran plasticidad de los genomas bacterianos ha permitido su adaptacin

frente a la presin selectiva ejercida por la terapia con antibiticos; esta versatilidad se
encuentra mediada por elementos genticos que permiten la reorganizacin de genes y la
diseminacin de determinantes de resistencia por transferencia horizontal. Dentro de este
contexto, los integrones juegan un papel importante al ser plataformas de recombinacin
sitio-especfica con capacidad de incorporar y expresar genes en casete. Se han descrito
gran nmero de genes en casete con capacidad de conferir resistencia a diversas familias
de antimicrobianos. Dichas estructuras genticas pueden incorporarse en los integrones y
formar colecciones de genes que confieren multiresistencia a antibiticos. Los integrones
se encuentran frecuentemente asociados a estructuras genticas mviles como plsmidos
y transposones lo cual los convierte en actores fundamentales para la dispersin horizontal
intra e interespecfica de genes. Muchos de los arreglos de genes en casete descritos en
Amrica del Sur se relacionan con resistencia a familias de antibiticos de amplio uso
clnico como -lactmicos, quinolonas y aminoglucsidos lo cual produce un marcado
incremento en el fracaso teraputico, al proporcionar a los patgenos bacterianos una
combinacin de genes de resistencia a los compuestos ms empleados en el tratamiento
de infecciones bacterianas.
PALABRAS CLAVES: antibiticos, Amrica del Sur, genes en casete, Integrones,

resistencia bacteriana
ABSTRACT.- The plasticity of bacterial genomes drives their adaptation under antibiotic
167
selective pressure. Diverse genetic elements allow genes rearrangement and horizontal
transfer. On this view, integrons play an important role, because they are able to carry
out a site-specific recombination; capture and express gene cassettes. To date, we know
a variety of gene cassettes that confer resistance to multiple antibiotic families. The gene
cassettes can be inserted into integrons like resistance gen collections, organized in
diverse arrays which are important factors present in multi-drug resistant organisms.
Additionally, integrons are frequently associated to mobile genetic elements such as
conjugative plasmids and transposons; this association leads the horizontal intra and
inter-specific transfer of resistant determinants. Many of the gene cassettes arrays
described in South America confer resistance to therapeutic antibiotics such -lactamics,
quinolones and aminoglycosides. These gene arrays produce an increase of therapeutic
failure, because they provide bacterial pathogens with a battery of resistant genes against
common used antimicrobials.
KEYWORDS: antibiotics, bacterial resistance, gene cassette, integrons, South America
INTRODUCCIN Situacin que amenaza nuestra capacidad

La incorporacin de los antibiticos de combatir las enfermedades infecciosas.
en el tratamiento de infecciones bacterianas
increment de manera drstica la esperanza La adquisicin de resistencia a
de vida de la poblacin, por lo cual se los antibiticos se debe a la excepcional
considera a los antibiticos como uno de los capacidad adaptativa de las bacterias, que
mayores avances de la medicina del siglo modifican su informacin gentica en eventos
XX, incluso se lleg a postular la erradicacin de mutacin, que resultan en variantes de
de las enfermedades infecciosas gracias a genes preexistentes, capaces de conferirles
su aplicacin mdica. Sin embargo, al poco resistencia a presiones selectivas, tales como
tiempo de su introduccin, la efectividad el uso de antibiticos, lo cual genera cepas
de estos compuestos se redujo, debido a la resistentes a la terapia antibitica. Estos
seleccin de cepas resistentes a la terapia eventos adaptativos, se ven potenciados
antibitica, para dar inicio a la carrera por por la formidable plasticidad del genoma
descubrir y sintetizar nuevas molculas con bacteriano, liderada por un conjunto de
actividad contra organismos resistentes. elementos genticos mviles (plsmidos,
Dichos compuestos, finalmente, han bacterifagos y ADN libre) y elementos de
perdido su efectividad para el tratamiento recombinacin gentica (transposones e
de infecciones. En la actualidad se han integrones) que permiten la transferencia
registrado organismos resistentes a todos los horizontal y la reorganizacin de sus
compuestos usados en la prctica mdica. determinantes genticos (Figura 1). De esta
168
David Ortega-Paredes y Jeannete Zurita
INTEGRONES: PLATAFORMAS BACTERIANAS DE
RECOMBINACIN GENTICA Y SU INFLUENCIA EN LA RESISTENCIA BACTERIANA
manera, las bacterias pueden adquirir bajo presin selectiva de manera intra o
genes y colecciones de genes seleccionados interespecfica.
Figura 1. Esquema jerrquico y funcional de los elementos genticos mviles relacionados

con integrones. Los genes en casete se recombinan en la regin variable del integrn, el
cual puede estar dentro de un transposn que le permite movilizarse entre secuencias de
ADN. Los transposones que contienen integrones pueden encontrarse y movilizarse entre
plsmidos y en el cromosoma bacteriano. La accin colaborativa de estas plataformas de
recombinacin y elementos genticos mviles juegan un papel crucial en la adaptacin
bacteriana a presiones selectivas. El esquema no es proporcional.
Dentro de este contexto, los Adicionalmente, los integrones, por lo

integrones juegan un importante papel en general, encuentran asociacin a elementos
la diseminacin de genes de resistencia a mviles o de recombinacin, lo cual permite
antibiticos, al ser plataformas genticas que toda la plataforma pueda movilizarse
capaces de capturar genes e integrarlos de forma estable dentro del genoma de
en un medio que asegura su expresin. la misma bacteria o hacia otros genomas.
169
Procesos que finalmente determinan la dinmicos que contienen los determinantes

aparicin de cepas resistentes a mltiples genticos de un sistema de recombinacin
familias de antibiticos o multiresistentes. sitio-especfica que reconoce, captura y
Esta revisin se ha enfocado en los expresa genes en casete.
integrones clnicamente ms significativos
(Integrones clase 1, 2 y 3), en base a La estructura bsica que define al
su asociacin con la multiresistencia integrn consiste en un gen IntI que codifica
bacteriana. Adicionalmente, discutiremos una integrasa de la familia de las tirosina
las caractersticas de estas plataformas recombinasas, encargada de catalizar la
implicadas en la epidemiologa de la insercin/escisin especfica de genes en
resistencia mediante estudios realizados en casete (Hall et al., 1991). La integracin
Amrica del Sur. ocurre en un segundo elemento gentico
adyacente al gen IntI, conocido como, el
Estructura de los integrones. Los sitio primario de recombinacin attI (Collis
integrones fueron reconocidos inicialmente et al., 1993). Finalmente, Para asegurar
como elementos genticos mviles la expresin de los genes insertados, un
codificadores de una variedad de genes integrn funcional contiene uno o dos
de resistencia a antimicrobianos, con promotores, embebidos en el gen de la
capacidad de realizar una recombinacin integrasa o la secuencia attI, orientados
sitio-especfica de genes en casete y dotarlos hacia el sitio de recombinacin (Jove et
de un promotor encargado de su expresin. al., 2010; Collis y Hall, 1995) (Figura 2a).
Esta capacidad les permita adquirir varios Adems, los casetes gnicos son elementos
genes en diferentes conformaciones y mviles de ADN circular que se encuentran
existir en diferentes formas que diferan libres en el citoplasma. Su estructura consta
entre s por el nmero y naturaleza de los de dos elementos funcionales: un marco de
casetes insertados. Por este motivo, Stokes lectura abierto (open reading frame, orf),
y Hall, 1989, propusieron para designarlos que frecuentemente carece de promotor, y
con el nombre de elementos de integracin un sitio de recombinacin attC o elemento
de ADN o integrones. 59 pb, de tamao y secuencia variables,
que contiene dos secuencias palindrmicas
Trabajos posteriores como el de imperfectas, las cuales son reconocidas por
Recchia y Hall, 1995, demostraron que la integrasa para iniciar la recombinacin
los integrones no son elementos genticos (Collis y Hall, 1992) (Figura 2b).
mviles, son los genes en casete integrados
en estos sistemas quienes presentan la Los casetes insertados constituyen
capacidad de movilizarse. En la actualidad, la parte variable del integrn (Regin
el concepto ms difundido de integrn es Variable, RV) y en principio se pueden
el propuesto por Hall y Collis, 1995, que insertar un nmero indefinido de genes en
se refiere a los integrones como: elementos casete en la regin variable de un integrn.
170
Sin embargo, la expresin de los casetes un plsmido conjugativo (Naas et al.,

disminuye conforme se van alejando de la 2001). Adems, existen los llamados
regin promotora (Figura 2). Es decir, los superintegrones que contienen docenas
casetes que se expresan en mayor medida de genes en su regin variable; este tipo
son los ltimos que fueron insertados. En de integrones son cromosmicos, han sido
aislados clnicos se ha descrito un mximo descritos en una variedad de especies y
de ocho casetes insertados en un integrn raramente codifican genes de resistencia a
de clase 1, dentro de un transposn en antibiticos (Fluit y Schmitz, 2004).
Figura 2. Estructura bsica de los integrones, casetes gnicos y esquema de la

recombinacin sitio-especfica. a) Las plataformas de recombinacin sitio-especfica
(integrones) presentan en su estructura un gen intI que codifica una integrasa y su
promotor Pint, un sitio de recombinacin attI y uno o dos promotores Pc, P2; b) los casetes
gnicos son elementos mviles de ADN circular compuestos por un marco de lectura
abierto y un sitio de recombinacin attC. La integrasa codificada por el gen intI reconoce
el sitio attC en el casete gnico y cataliza su recombinacin en el sitio attI, de esta manera
el ltimo casete insertado en la plataforma se encuentra en la regin ms prxima al gen
intI. Todos los genes insertados en la regin variable del integrn se expresan gracias a
los promotores localizados en el gen intI o el sitio attI. Las flechas indican la direccin de
la transcripcin, el esquema no es proporcional (Figura basada en Cambray et al., 2010).
171
Existe una gran diversidad de casetes estructura de las regiones conservadas, en

genticos de resistencia (alrededor de 130), especial 3CS puede presentar variabilidad.
los cuales difieren entre s por la secuencia
del orf que presentan, muchos de los cuales Integrones clase 1.- Los integrones
codifican determinantes de resistencia a clase 1 han sido reconocidos en diferentes
antibiticos -lactmicos, aminoglucsidos, sitios en plsmidos y transposones no
quinolonas, trimetoprima, sulfonamidas, relacionados, as como en cromosomas
lincosaminas, macrlidos, rifampicina, bacterianos, que contienen variedad de
macrlidos, fosfomicina, desinfectantes genes de resistencia en diferentes arreglos.
y metales pesados (Partridge et al., 2009; Este tipo de integrones se encuentran
Mazel, 2006, Fluit y Schmitz, 2004). con frecuencia en aislados clnicos y su
presencia se ha correlacionado con la
Clases de integrones.- Inicialmente multirresistencia. Su estructura consta de
los integrones fueron agrupados en clases una regin variable flanqueada por dos
basadas en la identidad nucleotdica de segmentos conservados. El segmento 5
su integrasa. Sin embargo, debido a la conservado o 5CS incluye al gen de la
variedad de integrasas descritas se han integrasa (IntI1), uno o dos promotores
propuesto otras alternativas de clasificacin que aseguran la expresin de los genes
como: integrones de resistencia o en la regin variable y el sitio adyacente
integrones mviles y superintegrones. de recombinacin attI1. El segmento 3
Debido a su relevancia clnica, en esta conservado o 3CS, frecuentemente,
revisin consideraremos a los integrones incluye al gen qacED1, que codifica
mviles de clases 1, 2 y 3. A continuacin, resistencia a compuestos de amonio
revisaremos la estructura de estos tres tipos cuaternario; sul1, gen de resistencia a
de integrones mediante el empleo de las sulfonamidas y un marco de lectura
estructuras ms frecuentemente descritas. abierto, orf5, con funcin desconocida
No obstante, es importante recalcar que la (Mazel et al., 2006) (Figura 3a).
172
Figura 3. Estructura de integrones clnicamente ms relevantes. a) integrn clase 1; b)

integrn clase 1 complejo o inusual; c) Integrn clase 2; d) Integrn clase 3; intI, gen que
codifica la integrasa; attI, sitio de recombinacin del integrn; attC, sitio de recombinacin
del gen en casete; 5CS, regin conservada en 5; 3CS, regin conservada en 3; RV, regin
variable; tns, mdulo de trasnposicin, qacE1, gen que codifica resistencia a compuestos
de amonio cuaternario; sul1, gen que codifica resistencia a sulfonamidas; orf, marco de
lectura abierto. El esquema no es proporcional.
Integron clase 1 inusual.- Los seguida de una segunda regin variable

integrones clase 1 inusuales, fueron con uno o ms casetes insertados y una
caracterizados por primera vez en 1990 por segunda regin 3 conservada 3CS2, donde
Hall y Stokes. Estos integrones tienen el encontramos un gen qacED1, en ocasiones
inicio 5 de un integrn clase 1 tpico con fusionado con un orf3 (orf3:qacED1) y
uno o varios casetes gnicos insertados seguido de un gen sul1 (Figura 3b).
entre sus regiones 5CS y 3CS, por lo cual
se le conoce como primera regin variable Integrones Clase 2.- Los integrones
(RV1). Sin embargo, en la primera regin de clase 2, al igual que los integrones de
3CS1 nicamente la primera parte de la clase 1, presentan una regin 5CS, donde
secuencia coincide con una regin 3CS se localiza el gen IntI2, que codifica una
tpica ya que presenta una secuencia de integrasa 2; secuencias promotoras y el
insercin ISCR a continuacin del gen sul1, sitio de recombinacin attI2. Usualmente
173
en el segmento 3CS se encuentran uno o un sitio de recombinacin attI3 y una

varios genes involucrados en procesos regin variable, actualmente se desconocen
de transposicin tnsA, tnsB, tnsC, tnsD y los detalles de su regin 3 (Correia et al.,
tnsE (Figura 3c) (Hansson et al., 2002). En 2003; Arakawa et al., 1995) (Figura 3d).
integrones clase 2 de muestras clnicas se
han descrito pocas combinaciones de genes Integrones y diseminacin de genes
en la regin variable, la ms frecuentemente de resistencia a antibiticos en Amrica de
reportada esdfrA1sat2aadA1. La Sur.- Mediante una bsqueda en la base de
cual confiere resistencia a trimetoprima, datos para integrones INTEGRALL (www.
estreptomicina y espectinomicina (Dubois integrall.bio.ua.pt) hemos identificado los
et al., 2007). genes en casete (Tabla 1) y arreglos de genes
en casete (Tabla 2) descritos en Amrica
Integrones clase 3.- Fueron descritos del Sur. En esta seccin emplearemos la
en un aislados de Serratia marscescens informacin obtenida en esta bsqueda
resitente a carbapenmicos (antibitico para discutir algunas de las caractersticas
-lactmico de ltima generacin) con un ms importantes de los integrones, desde
arreglo que incluye un gen blaIMP (Arakawa el punto de vista epidemiolgico en la
et al., 1995). Presentan una integrasa intI3, Regin.
Tabla 1
Casetes gnicos reportados en Amrica del Sur (base de datos INTEGRALL)
174
Tabla 2
Arreglos de genes en la regin variable de integrones descritos en Amrica del Sur
(base de datos INTEGRALL)
INTEGRONES CLASE 1
ESPECIE ACCESIN ARREGLO REFERENCIA
Acinetobacter baumannii AM283490 IntI1 blaIMP-1b aacA31 aadA1 qacE 1 Mendes et al., 2007
A. baumannii GU304661 Int I1 5CS dfrA12 orfF aadA2 3CS Accesin directa
A. baumannii AJ640197 Int I1 blaVIM-1 aacA31 aadA1 qacE 1 Accesin directa
Citrobacter freundii AM412777 IntI1 blaOXA-101 aacA4 Porto et al., 2010
Escherichia coli AM295980 aadB catB3 qacE 1 Castanheira et al., 2007
E. coli GQ466184 IntI1 aacA7 aadB aadA4 orf blaOXA-2 orfD Accesin directa
Klebsiella pneumoniae EF219164 IntI1 blaGES-7 Dropa et al, 2010
K. pneumoniae AJ968952 IntI1 dfrA23 Penteado et al., 2009
K. pneumoniae EF660563 IntI1 arr5 da Fonseca et al., 2008
K. pneumoniae DQ902344 IntI1 blaGES-5 aacA3 blaOXA-17 transposasa qacE 1 sul1 da Fonseca et al., 2007
K. pneumoniae EF219163 IntI1 blaGES-1 Castanheira et al., 2004
K. pneumoniae FJ976897 IntI1 dfrA22 Accesin directa
K. pneumoniae FJ976898 IntI1 aadA1 Accesin directa
K. pneumoniae FJ985262 IntI1 blaOXA-2 Accesin directa
K. pneumoniae GQ139471 IntI1 blaGES-5 aacA4 blaOXA-17 dfrA21 catB3 qacE 1 sul1 Accesin directa
Pseudomonas aeruginosa EF660562 IntI1 aacA7 catB3 arr4 da Fonseca et al., 2008
P. aeruginosa DQ236170 IntI1 orf126 blaGES-1 aacA4 da Fonseca et al., 2007
P. aeruginosa DQ236171 IntI1 blaGES-5 aacA4 da Fonseca et al., 2007
P. aeruginosa AY605049 IntI1 blaVIM-11 Pasteran et al., 2005
P. aeruginosa AJ584652 IntI1 blaIMP-16 aacA33/aacA4 aacA4 aadA1 qacE 1 sul1 Mendes et al., 2004a
P. aeruginosa AJ586617 IntI1 blaVIM-2 qacE 1 sul1 Mendes et al., 2004b
P. aeruginosa AJ628983 IntI1 blaVIM-11 aacA35 qacE 1 sul1 Accesin directa
P. aeruginosa AM931299 IntI1 blaVIM-13 aacA4 Accesin directa
P. aeruginosa DQ176869 IntI1 dfrA1 sat2 aadA1 Accesin directa
P. aeruginosa AY660529 IntI1 aacA4 blaOXA-56 aadA7 orf1 Accesin directa
P. aeruginosa AY913771 IntI1 aadB aacA4 blaCARB-4 Accesin directa
P. aeruginosa AY913772 IntI1 aacA4 dfr15b blaCARB-4 Accesin directa
P. aeruginosa DQ139276 IntI1 aacA4 blaOXA-2 orfD Accesin directa
P. aeruginosa DQ139277 IntI1 aadB Accesin directa
P. aeruginosa DQ139278 IntI1 dfrB5 aacA4 Accesin directa
P. aeruginosa DQ139279 IntI1 dfrB5 aacA4 blaOXA-2 Accesin directa
P. aeruginosa DQ139280 IntI1 aacA4 Accesin directa
P. aeruginosa DQ139281 IntI1 aadB aadA6 Accesin directa
Pseudomonas putida AM283489 IntI1 blaVIM-1 aacA31 aadA1 qacE 1 Mendes et al., 2007
P. putida GQ857074 IntI1 blaVIM-2 aacA4 tniC Accesin directa
P. putida JF922882 IntI1 dfrA15b Accesin directa
Salmonella entrica subsp.

AJ809407 IntI1 aadA23 Michael et al., 2005a
Enterica
175
Cont. tabla 2
S. entrica subsp. Enterica AJ867237 IntI1 dfrA15b cmlA4 aadA2 Michael et al., 2005a
S. entrica subsp. Enterica

DQ267940 IntI1 dfrA25 Peirano et al., 2006
serovar Agona

DQ278189 IntI1 orfD aacA4 blaOXA-1/IS1 aadA1 Peirano et al., 2006
serovar Agona

AM237807 IntI1 blaIMP dfrA7 orf aac8 blaOXA-2 Accesin directa
serovar Anatum

AM932669 IntI1 dfrA21 blaOXA-129 aadA1 group II intron-like element Michael et al., 2008
serovar Bredeney

AM932670 IntI1 dfrA1 sat2 aadA1 Michael et al., 2008
serovar Bredeney
S. entrica susbp. Enterica

AM087143 IntI1 aadA2 Michael et al., 2005b
serovar Derby

FN252410 IntI1 aadA2 Accesin directa
serovar Derby

DQ278190 IntI1 orf2 dfrA5 orfD Peirano et al., 2006
serovar Enteritidis

DQ278188 IntI1 aacA orf Peirano et al., 2006
serovar Infantis

FN252408 IntI1 dfrA25 Accesin directa
serovar Senftenberg
S. entrica subsp. entrica

AJ496285 IntI1 aadA1 Accesin directa
serovar Typhimurium

FN252409 IntI1 aadA23 Accesin directa
serovar Typhimurium
INTEGRONES CLASE 1 COMPLEJOS

C. freundii EU091084 IntI1 aacA4 aadA1 qacE 1 sul1 ISCR1 sapC-like sapB-like qnrB10 Quiroga et al., 2007
C. freundii AY162283 IntI1 aacA4 blaOXA-4 qacE 1 sul1 ISCR1 dfrA3b orf105 sul1 Arduino et al., 2003
Enterobacter cloacae EU052800 IntI1 aacA4 aadA1 qacE 1 sul1 ISCR1 sapC-like sapB-like qnrB10 qacE 1 Quiroga et al., 2007
K. pneumoniae EU780013 IntI1 dfrA12 orf F aadA2 qacE 1 sul1 ISCR1 blaCTX-M-2 orf 3 qacE 1 sul1 Mrques et al., 2008
IntI1 aacA4-CR blaOXA-1 catB3 arr2 qacE 1 sul1 ISCR1 sapB-like sapB-
K. pneumoniae EF636461 Quiroga et al., 2007
like qnrB6 qacE 1 sul1
K. pneumoniae AM040450 ISCR1 blaCTX-M-2 orf 3/qacE 1 Vignoli et al., 2006
K. pneumoniae AM040449 IntI1 aacA4 blaOXA-2 orfD qacEdelta1 sul1 ISCR1 blaCTX-M-2 Vignoli et al., 2006
K. pneumoniae EU622037 IntI1 aacA aadA1 qacE 1 sul1 ISCR1 blaCTX-M-2 orf 3/qacE 1 Accesin directa
K. pneumoniae EU622856 IntI1 dfrA15b clmA4 aadA2 qacE 1 sul1 ISCR1 blaCTX-M-59 orf 3/qacE 1 Accesin directa
K. pneumoniae EU622038 IntI1 aadA2 qacE 1 sul1 ISCR1 blaCTX-M-2 orf 3/qacE 1 Accesin directa
K. pneumoniae EU597467 IntI1 aacA4 blaOXA-2 orf D qacE 1 sul1 ISCR1 blaCTX-M-2 orf 3/qacE 1 Accesin directa
K. pneumoniae EU622039 IntI1 dfrA21 qacEdelta1 sul1 ISCR1 blaCTX-M-2 orf 3/qacE 1 Accesin directa
K. pneumoniae EU622040 IntI1 aadA1 qacEdelta1 sul1 ISCR1 blaCTX-M-2 orf 3/qacEdelta1 Accesin directa
K. pneumoniae EU622041 IntI1 dfrA22 qacEdelta1 sul1 ISCR1 blaCTX-M-2 orf 3/qacE 1 Accesin directa
K. pneumoniae EU117158 IntI1 aacA7 blaOXA-2 orf D qacEdelta1 sul1 ISCR1 blaCTX-M-2 orf 3/qacE 1 Accesin directa
Morganella morganii AJ621187 IntI1 aacA4 blaOXA-2 orf 2 qacE 1 sul1 ISCR1 blaCTX-M-2 orf 3/qacE 1 Power et al., 2005
IntI1 orf102 aacA4 blaOXA-56 aadA7 tnpA quaE 1 sul1 ISCR14 rmtD
P. aeruginosa DQ914960
orfA groEL ISCR14 sul1 orf cmxA da Fonseca et al., 2008
S. entrica susp. Enterica

serovar Infantis AJ311891 IntI1 aacA4 blaOXA-2 orfD qacE 1 sul1 ISCR1 blaCTX-M-2 orf3/qacE 1 Accesin directa
176
Cont. tabla 2
INTEGRONES CLASE 2
Vibrio cholerae GU570569 IntI2 sat2 aadA1 ybeA da Fonseca et al., 2011
V. cholerae GU570570 IntI2 dfrA1 sat2 aadA1 ybeA da Fonseca et al., 2011
A. baumannii DQ176450 IntI2 sat2 aadB catB2 dfrA1 sat2 aadA1 Ramrez et al., 2005a
A. baumannii DQ176451 IntI2 dfrA1 sat2 aadA1 Accesin directa
A. baumannii FJ785524 IntI2 sat2 aadA1 Ramrez et al., 2010
A. baumannii FJ785525 IntI2 dfrA1 sat2 aadB catB2 dfrA1 blaCARB-4 aadA1 ybeA Ramrez et al., 2010
A. baumannii FJ785526 IntI2 dfrA1 Ramrez et al., 2010
A. baumannii FJ785527 IntI2 dfrA1 sat2 Ramrez et al., 2010
A. baumannii FJ792804 IntI2 dfrA1 sat2 aadA1 Ramrez et al., 2010
Burkholderia cenocepacia DQ082896 IntI2 sat2 Ramrez et al., 2005b
E. cloacae EF042190 IntI2 insB dfrA1 sat2 aadA1 Ramrez et al., 2010
E. cloacae DQ268533 IntI2 dfrA1 sat2 aadA1 Accesin directa
Morganella morganii AJ938161 IntI2 dfrA1 sat2 aadA1 Accesin directa
Raoultella terrgena DQ275532 IntI2 dfrA1 sat2 aadA1 ybeA ybfA ybfB ybgA Accesin directa
aac8, elemento del grupo II intron-like; groEL, protena chapern; InsB,Transposasa S1; intI1,integrasa clase
1; intI2, integrasa clase 2; ISCR1; orf, marco de lectura abierto con funcin no determinada; qacEdelta1,
resistencia a compuestos de amonio cuaternario; sul1, resistencia a sulfonamidas; tnpA, transposasa de
Tn501.
Diversos trabajos han registrado arreglos de genes en su regin variable.

la presencia de integrones con genes Tal es el caso de cepas de Pseudomonas
insertados que codifican resistencia a aeruginosa sensible nicamente a colistina
antimicrobianos de importancia clnica. Es (Colistin only sensitive, COS), en las cuales
el caso de blaCTX-M-2, que confiere resistencia se detect la presencia de blaGES-5 en la regin
a cefalosporinas de tercera generacin variable de un integrn clase 1 (da Fonseca
mediante -lactamasas de espectro et al., 2007) y la localizacin de los genes
extendido (BLEE), localizado en la segunda blaVIM-11 y blaGES-1 en diferentes integrones de
regin variable de integrones inusuales P. aeruginosa resistente a carbapenmicos
(Vignoli et al., 2006; Arduino et al., 2002). (Pasteran et al., 2005).
Quiroga y colaboradores, 2007, describen
integrones inusuales que portan el gen Los integrones se encuentran
aac6Ib-cr, el cual, gracias a la mutacin frecuentemente relacionados con elementos
cr, ha extendido su perfil, no solo como genticos mviles, los cuales les confieren la
degradador de aminoglucsidos, sino capacidad de movilizarse de forma intra o
como degradador de quinolonas. Se ha interespecfica, para facilitar la dispersin
documentado ampliamente la relacin entre de arreglos de genes en casete responsables
la emergencia de cepas multirresistentes de la multirresistencia. Esta caracterstica
con limitadas alternativas teraputicas y ha sido documentada en varios trabajos
la presencia de integrones con diferentes que confirman este fenmeno. Porto y
177
colaboradores, 2010, identificaron el gen La capacidad de las bacterias no

blaOXA-101 que formaba parte de un integrn fermentadoras para adquirir y diseminar
clase I en un plsmido conjugativo de elevadogenes de resistencia a antibiticos de
peso molecular en tres diferentes especies importancia clnica, qued ilustrada en el
de la familia enterobacteriaceae (Citrobactertrabajo de Mendes y colaboradores, 2007,
freundii, Escherichia coli y Enterobacter donde se caracteriza un integrn clase 1 con
cloacae), lo cual confirma la diseminacin el gen blaIMP-1 en un plsmido conjugativo
de la resistencia a antibiticos -lactmicosen aislados no relacionados genticamente
de forma inter-especfica, gracias a la de Acinetobacter sp. y un aislado de P.
asociacin del gen con un integrn y este putida. El integrn denominado In86 se
con un plsmido conjugativo. identific como la causa del aislamiento
frecuente de cepas de A. baumanii y P.
Tambin se ha demostrado la trans- aeruginosa resistentes a carbapenmicos. El
ferencia interespecfica de integrones en- trabajo de Penteado y colaboradores, 2009,
tre grupos menos relacionados. Marchiaro registr el integrn In86 en K. pneumoniae,
y colaboradores, 2010, describieron en su con una secuencia corriente arriba idntica
artculo un aislado de Pseudomonas pu- a la identificada en P. putida, por lo cual,
tida portador de un plsmido mvil que propone a esta especie como la fuente del
contena un integrn de clase 1, con los integrn adquirido por K. pneumoniae.
genes blaVIM (resistencia a carbapenmi-
cos mediada por metalo--lactamasas) El estudio de Power y colaboradores,
y aacA4 (resistencia a aminoglucsidos), 2005, caracteriza un aislado de Morganella
que carece de regin 3CS, pero con un morganii resistente a cefalosporinas de
mdulo de transposicin tni completo. La tercera generacin (-lactmicos de amplio
identidad nucleotdica de la integrasa y espectro), donde se detectaron los genes
los casetes insertados es completa con los blaCTX-M-2 y blaOXA-2 en coexistencia en la
genes homlogos de P. aeruginosa, en tanto regin variable de un integrn inusual
que los mdulos de trasposicin coinciden dentro de un plsmido conjugativo. Este
con sus homnimos de Klebsiella aerogenes. trabajo evidencia el origen del gen blaCTX-M-2,
Experimentos de conjugacin demostraron encontrado en el integrn, en el cromosoma
que el plsmido portador del integrn tiene de Klebsiella ascorbata, en base a la identidad
la capacidad de transferirse de E. coli a P. nucleotdica de las secuencias que
aeruginosa. Este artculo tambin arroja flanquean a blaCTX-M-2 en la regin variable.
evidencia acerca de la funcin de algunas Este resultado muestra la capacidad de
especies, como P. putida, raramente relacio- adquisicin de genes cromosmicos por
nada con infecciones humanas, como reser- elementos gentico mviles, adems de su
vorios y agentes diseminadores de resisten- capacidad de mutar bajo presin selectiva
cia a antimicrobianos. hacia una variante clnicamente relevante y
el papel de los integrones como plataformas
178
que adquieren arreglos de genes en casete de 41 kb confiere a la cepa resistencia a

y actan coordinadamente con plsmidos fluoroquinolonas y -lactmicos y gracias
conjugativos para su diseminacin. a la presencia de un integrn clase 1,
resistencia a aminoglucsidos y cloranfenicol,
La incorporacin de integrones clase adems de mantener una plataforma activa
1 y 2 en el genoma bacteriano es evidente para la integracin de genes de resistencia
en trabajos como el de Crowley y colabo- adicionales.
radores, 2002, que identifica genes de re-
sistencia en integrones clase 1 en el genoma La presencia de elementos que
de Burkholderia cenocepacia con regiones de codifican simultneamente determinantes
contenido G/C que corresponden a los de resistencia a diferentes familias de
encontrados en enterobacterias. Ramrez y antibiticos, permite la seleccin de cepas
colaboradores, 2005b, evidenciaron la incor- multirresistentes, debido a la capacidad de
poracin de integrones clase 2 localizados en mantenerse en la poblacin bajo distintas
transposones de la familia Tn7 en genomas presiones selectivas. Este fenmeno es
bacterianos. La incorporacin de integrones ejemplificado por la presencia de regiones
en el genoma da una nueva dimensin al variables de integrones clase 1 que
problema, ya que su localizacin cromos- codifican resistencia a carbapenmicos
mica permite la transferencia vertical de la y aminoglucsidos, los cuales han sido
resistencia sin comprometer la transferencia aislados de bacterias no fermentadoras y se
horizontal, ya que mantiene su capacidad han relacionado con la seleccin y dispersin
de transposicin a elementos mviles. de resistencia a carbapenmicos bajo una
terapia con aminoglucsidos (Mendes et al.,
Es importante considerar que al 2004a y Mendes, 2007).
transferirse un integrn que se encuentra
embebido en un plsmido, la resistencia Adems, los integrones asociados a
que adquiere la bacteria receptora es el plsmidos conjugativos juegan el papel
resultado, tanto de los genes codificados en el de reservorios ambientales de resistencia,
integrn, como de los genes que se encuentran como lo evidencian varios trabajos (Michael
tanto en el plsmido como en el cromosoma et al., 2008; Peirano et al., 2006; Michael et al.,
bacteriano. Un ejemplo representa el aislado 2005a, b), en los cuales se describe la presen-
multirresistente con el cual se realiz el cia de genes de resistencia a cloranfenicol,
primer reporte de qnrA1 (resistencia a tetraciclinas, sulfonamidas, aminogucsi-
quinolonas) en Amrica Latina. Castanhira dos, trimetoprim y -lactmicos en cepas
y colaboradores, 2007, analizaron una cepa de Salmonella entrica aisladas de cerdos
de E. coli con un plsmido conjugativo aparentemente sanos. Los cuales cumplen
que contiene las secuencias de los genes la funcin de portadores asintomticos
qnrA1 y blaFOX-5, Adems de un integrn que, en su flora comensal, mantienen y dis-
con los genes aadB y CatB3. Este plsmido persan genes de resistencia al ambiente.
179
La adquisicin y diseminacin de Psedomonas aeruginosa colectados en

de resistencia se ve favorecida por la Quito-Ecuador (Yauri et al., 2010). Al
estructura de genes en casete que confieren momento la Unidad de Investigaciones en
resistencia a antibiticos. Este tambin es Biomedicina. Zurita&Zurita Laboratorios,
un proceso dinmico que puede ocurrir en colaboracin con el Laboratorio de
tanto por pequeas mutaciones, en casetes Microbiologa de la Pontificia Universidad
existentes, que modifican el espectro de Catlica del Ecuador, se encuentran
resistencia, como por un evento evolutivo profundizando los estudios en integrones
independiente. Da Fonseca y colaboradores, de aislados clnicos en distintas especies de
2008, demostraron este fenmeno, mediante bacterias patgenos humanas, con el fin de
el anlisis de la identidad nucleotdica de proveer informacin antes no disponible
los sitios attC de los casetes arr-2 y arr-3 til para una mejor comprensin de la
(que confieren resistencia a rifampina), para dinmica de la resistencia en el Ecuador.
llegar a la conclusin que el casete arr-3
es el mismo que arr-2 con dos mutaciones CONCLUSIN
puntuales en el gen arr-2, en tanto que arr-4 y La emergencia de bacterias
arr-5 son casetes distintos que evolucionaron multirresistentes debida al aparecimiento
independientemente. y diseminacin de genes de resistencia
es el resultado de una combinacin entre
En Amrica del Sur se han descrito pocas la generacin de variantes con mayor
combinaciones de genes en la regin variable capacidad adaptativa, la transferencia
de integrones clase 2 de muestras clnicas, horizontal de esos variantes por elementos
los genes en casete reportados con mayor genticos mviles y la seleccin de clones
frecuencia son dfrA1, sat2 y aadA1. Los con alta capacidad de transmisin y/o
cuales confieren resistencia a trimetoprim, mantenimiento de estos genes. El estudio
estreptomicina y espectinomicina (Dubois de dinmica de los genes de resistencia y
et al., 2007). En muestras ambientales y sus plataformas genticas de diseminacin
clnicas se ha reportado su asociacin a son esenciales para establecer estrategias
diferentes combinaciones de genes tns y se eficaces de control de infecciones, identificar
ha postulado que la evolucin de integrones o replantear alternativas teraputicas
clase 2 y los transposones asociados podra y facilitar una visin integrada de los
deberse a eventos independientes (Ramrez mecanismos evolutivos que permiten la
et al., 2010). As como, la adquisicin de genes Biologa adaptativa de los microorganismos.
de resistencia por eventos de recombinacin
ilegtima (Ramrez et al., 2010). REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
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grupo ha registrado, la presencia de los H, Wacharotayankun R, Ohsuka
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185
Gestin e inventario de la coleccin faunstica de los Centros de
Tenencia y Manejo de Fauna Silvestre de la provincia de Pastaza
Karen Noboa
Escuela de Biologa Aplicada, Universidad Internacional del Ecuador, Quito, Ecuador
karem_ivo2004@hotmail.com
RESUMEN.- En la provincia de Pastaza, ubicada en el Oriente de Ecuador, se evalu la

gestin y se realiz el inventario faunstico en tres zoolgicos, seis centros de rescate, un
zoocriadero, un museo y un centro que funciona sin patente ministerial. En los centros
evaluados no se desarrollaban programas de conservacin ex situ, debido a que la mayora
de ellos son receptores de animales rescatados del trfico ilegal. En la mayora de estas
unidades de manejo, se ha evidenciado que no se mantienen las colecciones faunsticas
bajo criterios tcnicos adecuados. Para este estudio se aplicaron dos instrumentos de
evaluacin, uno para evaluar las instalaciones de los centros de manejo de vida silvestre
(recintos, zona de cuarentena, zona de arribo, enriquecimiento ambiental, dietas,
sistemas de registros) y otro para evaluar las actividades, personal tcnico que labora,
patentes de manejo, cercana a reas pobladas, procedencia de los animales de los centros
evaluados, entre otras. Los resultados obtenidos permitieron conocer que los grupos de
animales ms representativos en cautiverio son: Psitacidos (Aves), Primates (Mamferos)
y Testudines (Reptiles) en la provincia de Pastaza. Las principales falencias son: falta de
infraestructura adecuada, falta de personal tcnico que labore a tiempo completo, falta
de protocolos de manejo estandarizados, incumplimiento de los objetivos planteados en
los planes de manejo e incumplimiento de las leyes ambientales vigentes en el Ecuador.
PALABRAS CLAVES: centros de rescate, conservacin ex situ, leyes ambientales, tratados

internacionales, zoolgicos
ABSTRACT.- In Pastaza province, located in the east of Ecuador, evaluations and

a fauna inventories of 3 zoos, 6 rescue centers, 1 breeding center, 1 museum and 1
center which operates without official permission were conducted. Programs of ex situ
conservation have not been well developed in the centers evaluated. These centers have
been recipients of animals from illegal traffic and have failed to keep the fauna under
appropriate technical criteria. Two instruments were applied, one to assess the facilities
187
and their ability to maintain the animals (enclosures, quarantine zone, zone of arrival,
environmental enrichment, diets, and registration systems); the second to evaluate
activities, technical staff workers, permits for animal handling, proximity to populated
areas, origin of the animals and others. The most representative group of animals in
captivity are: Psittacidae (Birds), Primates (Mammals) and Testudinidae (Reptiles) at
the Pastaza province. The main weaknesses were: lack of adequate infrastructure, lack
of full-time technical staff, lack of standardized handling protocols, failure to meet the
objectives set out in the management plans and lack of compliance with environmental
laws inforced in Ecuador.
KEYWORDS: rescue centers, ex situ conservation, environmental laws, international

treaties, zoos
INTRODUCCIN El nmero de especies de flora y fauna

Los seres humanos a lo largo del tiempo que se encuentran en peligro de extincin
han manipulado la fauna silvestre princi- aumenta cada da a nivel mundial (Myers
palmente para satisfacer sus necesidades et al., 2000). El Ecuador a travs del tiempo
alimenticias y de vestimenta. La historia de ha enfrentado extinciones de especies
Amrica Latina distingue varias etapas en causadas principalmente por actividades
la relacin ser humano-fauna; la primera es humanas como la cacera indiscriminada,
la etapa cazador- recolector en donde se uti- la introduccin de especies exticas y
lizaba la fauna para cubrir las necesidades la prdida y fragmentacin de hbitats
diarias, la etapa de la agricultura en donde (Tirira, 2011). El trfico ilegal de animales
se produjo la domesticacin de algunos ani- es la mayor amenaza para la diversidad
males y se elimin la dependencia diaria de biolgica (Flores y Valencia, 2007). La fauna
la fauna silvestre, la etapa cazador pionero silvestre ha sido utilizada durante milenios
en donde los conquistadores se apoderaron por los seres humanos para obtener
de grandes territorios y depredaron sin alimento, pieles, combustible y adornos
lmites a la fauna silvestre a travs de mto- (Mancera y Reyes, 2008). El trfico ilegal de
dos sofisticados como las armas de fuego y la fauna y flora silvestre es el tercer negocio
etapa del proteccionismo en donde se valora ilegal ms lucrativo despus de la venta de
por primera vez a la fauna silvestre y se to- drogas y armas. Se estima que 25 000 a 30 000
man medidas proteccionistas para evitar la primates, de 2 a 5 millones de aves, de 2 a 3
cacera indiscriminada de especies. Sin em- millones de reptiles y de 500 a 600 millones
bargo recin a principios del siglo XX surge de peces ornamentales son traficados por
en Estados Unidos la disciplina del manejo ao para estudios mdicos, para formar
de la fauna silvestre (Ojasti y Dallmeier, 2000). parte de colecciones de zoolgicos y para
188
Karen Noboa
GESTIN E INVENTARIO DE LA COLECCIN FAUNSTICA DE LOS CENTROS
DE TENENCIA Y MANEJO DE FAUNA SILVESTRE DE LA PROVINCIA DE PASTAZA
ser utilizados como mascotas (Manel et al., falencias en el manejo tcnico de los espec-
2002). Por el aumento del trfico ilegal de menes, falta de personal tcnico capacitado,
especies silvestres, los Centros de Tenencia infraestructura inadecuada y falta de finan-
y Manejo de Fauna Silvestre (zoolgicos, ciamiento (Ministerio de Ambiente, 2008).
zoocriaderos, centros de rescate y museos) Para el desarrollo de programas integrales y
de Amrica Latina se han convertido en los exitosos de conservacin ex situ de especies
ltimos aos, en receptores de animales silvestres en peligro de extincin en el Ecua-
decomisados (Bueno, 2003). dor, es importante conocer las colecciones
faunsticas que forman parte de los zoolgi-
La conservacin ex situ es una cos, centros de rescate y zoocriaderos.
herramienta que permite mantener a las
especies de flora y fauna fuera de su hbitat La evaluacin de los centros de ma-
natural (Herrera y Rodrguez, 2004). El nejo y tenencia de vida silvestre de la pro-
objetivo principal de la conservacin ex situ vincia de Pastaza permitir, conocer las
es: propagar a largo plazo especies raras principales debilidades que tienen zoolgi-
y en peligro de extincin como parte de cos, centros de rescate y zoocriaderos que
los programas de sostenibilidad (Valds, manejan fauna silvestre de esta manera se
2007). Las modalidades de la conservacin podrn tomar las medidas preventivas y
ex situ son: bancos de germoplasma donde correctivas adecuadas que permitan man-
se conservan especies para la alimentacin, tener a los animales en las mejores con-
conservacin y la agricultura, centros diciones posibles y fortalecer a todos los
de fauna como: zoolgicos, centros de centros de fauna de Ecuador a travs de la
rescate, zoocriaderos y museos, y centros aplicacin de polticas de manejo contem-
de flora como: jardines botnicos, viveros pladas en las leyes ambientales nacionales
y herbarios (Herrera y Rodrguez, 2004). vigentes y en los tratados internacionales
En las ltimas dcadas con el aumento de de los cules el Ecuador es signatario.
las extinciones de especies y la prdida de
la variabilidad gentica, la conservacin Los Centros de Tenencia y Manejo de
ex situ y la conservacin in situ se han Fauna Silvestre del Ecuador deben basar su
centrado en preservar la diversidad manejo de las especies en los cinco pilares
de genes de plantas y animales a nivel fundamentales del bienestar animal:
mundial (Gepts, 2006). Los programas de espacio fsico (libertad de incomodidad,
conservacin ex situ permiten preservar: la enriquecimiento ambiental (libertad para
diversidad de especies, sistemas ecolgicos expresar sus comportamientos naturales),
y procesos evolutivos de la naturaleza alimentacin (libertad de hambre y
(Miller et al., 2004). sed), manejo del ser humano (cuidados
veterinarios) (libertad de enfermedad) y
Los centros de fauna silvestre estu- libertad de miedo y angustia.
diados presentan los siguientes problemas:
189
MATERIALES Y MTODOS de aves, de las cuales cinco especies son

rea de estudio.- El estudio se llev a endmicas para la zona de Los Andes
cabo en la provincia de Pastaza, que tiene en Orientales de Ecuador y Per (Freile y
su territorio al Parque Nacional Llanganates Santander, 2005). Se evaluaron a 12 Centros
y el Parque Nacional Yasun que son de Tenencia y Manejo de Fauna Silvestre, de
considerados sitios de alta biodiversidad. los cuales seis tienen la categora de centro
Existen 195 plantas endmicas en la cuenca de rescate, tres tienen la de zoolgico, uno
del Pastaza, de las cuales 91 son orqudeas, de zoocriadero, uno de museo faunstico y
101 especies de mamferos y 242 especies uno centro sin categora (Tabla 1).
Tabla 1
Ubicacin y categoras de los Centros de Tenencia y Manejo de Vida Silvestre de la provincia de Pastaza
evaluados
Formacin Altitud Coordenadas

Nombre Categora Vegetal Cantn (msnm) UTM
190
Karen Noboa
Metodologa.- Los datos fueron Biolgica Pindo Mirador debido a que es

recolectados desde el 19 de octubre al 17 un museo faunstico y tiene ejemplares
de diciembre de 2011. El levantamiento de disecados.
la informacin se realiz en los 12 Centros
de Tenencia y Manejo de Fauna Silvestre Para la evaluacin de la gestin de
registrados por el Ministerio del Ambiente los centros seleccionados, se disearon
para la provincia de Pastaza. dos matrices: matriz de datos generales
basada en un estudio anterior realizado
El inventario faunstico de los por el Ministerio de Ambiente en el ao
Centros de Tenencia y Manejo de Fauna 2008 y la matriz de estndares de calidad
Silvestre de la Provincia de Pastaza se y funcionalidad de las instalaciones de los
realiz a travs de la identificacin de centros; esta matriz es la utilizada en el
las especies con la colaboracin de los Zoolgico de Quito en Guayllabamba para
tcnicos de la Unidad de Vida Silvestre de evaluar las instalaciones de los cndores
la provincia de Pastaza del Ministerio del en cautiverio, la cual fue modificada
Ambiente, y por medio del uso de libros acorde con las necesidades de los centros
de identificacin de mamferos, aves, de Pastaza (ANEXOS 1, 2, 3). En los
reptiles y peces. Los especmenes fueron siguientes centros de fauna silvestre, no se
clasificados taxonmicamente por: clase, aplic la matriz de estndares de calidad
orden, familia, gnero y especie y adems y funcionalidad: Zoocriadero Dedalma
se aadi su estado de conservacin segn: debido a que producen lepidpteros y la
CITES, UICN y los libros rojos de Ecuador. Estacin Pindo Mirador debido a que es un
El inventario del Zoocriadero Dedalma se museo faunstico.
realiz por familias. Se excluy a la Estacin
191
Anexo 1
Matriz de datos generales
INFORMACIN GENERAL
Nombre del Centro de Manejo E mail/ Pgina web
Telfono Altura (m) Extensin (rea)
Nombre del propietario Identificacin: CI/pasaporte Telfono E- mail

Fecha de creacin de la U MVS Provincia Cantn Parroquia
S Agua
No Luz
Direccin Patente Caducada Posee servicios bsicos? Telfono
S S Cercanas e interacciones con reas Colinda
Plan de manejo No Plan de contingencia No poblados No colinda
Va asfaltada Cercana a reas S Cul?
Tipo de acceso Va de 2 orden Referencia de ubicacin Protegidas No
Inundacin
Ceniza Vivienda
192
Derrumbe
Riesgos Naturales Vientos Actividades adicionales en la UMVS Turstica Otras (indique
ACTIVIDADES QUE REALIZAN EN LAS UMVS
Recepcin Liberacin Educacin Ambiental Productivo Investigacin
Entrenamiento Rehabilitacin Exhibicin Comercio Coleccin privada Voluntariado
FINAN CIAMIENTO
Donaciones Entradas Proyectos
Voluntariado Comercio Autofinanciamiento Otro Cul? Ingreso anual Visitantes por ao
PERSONAL TCNICO DE LA UMVS
Ing. En Recursos
Bilogo Veterinario Zootecnista Ing. Ambiental Naturales Ecoturista Otro Cul?
No. de tcnicos
GENERALIDADES DEL PERSONAL DE APOYO
S S S
Uniforme No Equipo de seguridad No Vacunas No Cul?
CAPACITACIN DEL PERSONAL DE APOYO
S S Protocolos S S
Taxonoma bsica No Primeros auxilios No y normas No Nutricin No
PROCEDENCIAS ANIMALES
Entrega voluntaria Entrega polica Entrega MAE Traslados Intercambio Donacin
Nacimiento Compra Rescate Otros
Anexo 2
Matriz de datos generales Matriz de evaluacin para los Centros de Rescate
FICHAS DE EVALUACIN DE INSTALACIONES DE LOS CENTROS DE MANEJO Y TENENCIA DE VIDA SILVESTRE

Nombre de la UMVS Fecha
Estndares de Funcionalidad Estndares de Calidad
Concepto 2 Puntos 0 Puntos 2 Puntos 1 Puntos 0 Puntos
Recepcin Zona de recepcin Tiene No tiene Cumple con todos los requerimientos Cumple parcialmente No cumple
Cumple con todos los requerimientos Cumple parcialmente No cumple
Cuarentena Zona de cuarentena Tiene No tiene
Veterinaria rea clnica Tiene No tiene Cumple con todos los requerimientos Cumple parcialmente No cumple
Rota o con riesgo
Integra y sin desperdicios Con desperfectos y remiendos
Cerca Cerca o barrera Funcional No Funcional a romperse
Ausencia de cubil, Higiene dificultosa, espacio limitado, Espacio limitado,

Existencia de cubil, recinto o jaula de Facilidad de higiene, espacio,
Refugio recinto o jaula de infraestructura daada y / difcil de limpiar, sin
manejo infraestructura
manejo o ventilacin daada ventilacin
Existe solo una No funcionan y hay

Accesos Existe doble puerta Las puertas estn funcionales Funcionan con desperfectos
puerta riesgos de escape
Manejo y seguridad
Puerta sin chapas /
Seguridad Puerta con chapas / candados Chapas / candados funcionales Funcionan con desperfectos No funcionan
candados
Ausencia de toma
Toma de agua Existencia de toma de agua Toma funcional Funciona con desperfectos No funciona
de agua
Con fosa de agua Sin fosa de agua Impermeable Permeable Rota/ inservible
Fosa de agua
Sucia o con Se la limpia 1 vez
Fosa limpia y sin residuos Se le limpia 2 o 3 veces por semana Se la limpia 1 vez por semana
residuos cada 15 das
193
Ausencia de
Drenajes Existencia de drenajes Drenaje limpio Drenaje obstruido Roto/ daado
drenajes
Utensilios de Existencia de utensilios propios Ausencia de No estn completos o estn con

Utensilios funcionales No funcionan
Limpieza, sanidad y riego

limpieza (escoba, manguera y recogedor) utensilios desperfectos
Limpieza de Recinto externo

Reciento externo limpio Se limpian 4 o 5 veces por semana Se la limpia 1 vez cada 15 das Se limpia 1 vez al mes
recintos sucio
Sin comedero o al Comedero no
Comederos Existencia de comedero Comedero funcional y limpio Comedero con desperfectos o sucio
piso funciona
La frecuencia de alimentacin es La frecuencia de alimentacin no es
Recibe cualquier Dieta igual para todos
Alimentacin Recibe alimentos sanos y seguros adecuada y la dieta va acorde a las adecuada y las dietas no son
alimento los grupos
necesidades de cada grupo balanceadas
Alimentacin
Recibe agua turbia Se la cambia 1 vez
Agua Recibe agua limpia y fresca Se la cambia a diario Se la cambia 1 vez por semana
o guardada cada 15 das
rea de preparacin La instalacin es adecuada para La instalacin tiene desperfectos y no Instalacin no

Tiene No tiene
de alimentos manipular alimentos. El lugar es aseado est muy limpia funciona y/ o sucia
Sin escondites,
Presencia de escondites, cuevas, No usan los
Ambiente cuevas, perchas o Son usados frecuentemente Siempre o poco los usan
descansos o perchas escondites
descansos
Excesivo, inadecuado
Sustrato Con sustrato vivo (pasto, paja) Sin sustrato Sustrato adecuado, suave y seguro Presenta inconvenientes
y peligroso
Ambiente
No hay irradiacin Irradiacin a travs de vidrio o
Irradiacin solar Hay irradiacin solar Irradiacin controlada Sin irradiacin
solar lmpara o irradiacin no controlada
Los animales no
Sistemas de Los animales tienen identificacin
Marcaje Tiene No tiene Los animales tienen microchips tienen ninguna
marcaje por rasgos
identificacin
Karen Noboa
No llevan registros de
Sistemas de Poseen una base de datos Poseen fichas manuales, no
Registros Cuenta con registro No cuenta ninguno de los
registro computarizada y estandarizada estandarizadas
animales
Anexo 3
Matriz de evaluacin de las instalaciones para Zoolgicos
FICHAS DE EVALUACIN DE INSTALACIONES DE LOS CENTROS DE MANEJO Y TENENCIA DE VIDA SILVESTRE

Nombre de la UMVS Fecha
Estndares de Funcionalidad Estndares de Calidad
Concepto 2 Puntos 0 Puntos 2 Puntos 1 Puntos 0 Puntos
Cumple con todos los
Cumple parcialmente
Recepcin Zona de recepcin Tiene No tiene requerimientos No cumple
Cumple parcialmente No cumple
Cuarentena Zona de cuarentena Tiene No tiene requerimientos
Cumple parcialmente No cumple
Veterinaria rea clnica Tiene No tiene requerimientos
Rota o con riesgo a
Integra y sin desperdicios Con desperfectos y remiendos
Cerca Cerca o barrera Funcional No Funcional romperse
Higiene dificultosa, espacio
Ausencia de Espacio limitado,
Existencia de cubil, recinto o jaula Facilidad de higiene, espacio, limitado, infraestructura
Refugio cubil, recinto o difcil de limpiar, sin
Manejo y seguridad
de manejo infraestructura daada y / o ventilacin

jaula de manejo ventilacin
daada
Existe solo una No funcionan y hay
Accesos Existe doble puerta Las puertas estn funcionales Funcionan con desperfectos
puerta riesgos de escape
Puerta sin
Seguridad Puerta con chapas / candados chapas/ Chapas funcionales Funcionan con desperfectos No funcionan
candados
Ausencia de
Toma de agua Existencia de toma de agua Toma funcional Funciona con desperfectos No funciona
toma de agua
Con fosa de agua Sin fosa de agua Impermeable Permeable Rota/ inservible
Limpieza, sanidad y riego
Llave y tubera en mal estado

Fosa de agua Sin control Llave y tubera en buen estado.
Control externo de agua y vieja. Ubicacin inadecuada Sin agua
externo de agua Ubicacin adecuada de la llave
de la llave
Sucia o con Se le limpia 2 o 3 veces por Se la limpia 1 vez
Fosa limpia y sin residuos Se la limpia 1 vez por semana
residuos semana cada 15 das
Ausencia de
Drenajes Existencia de drenajes Drenaje limpio Drenaje obstruido Roto/ daado
drenajes
Existencia de utensilios propios Ausencia de No estn completos o estn
Utensilios de limpieza Utensilios funcionales No funcionan
(escoba, manguera y recogedor) utensilios con desperfectos
Recinto externo Se limpian 4 o 5 veces por Se la limpia 1 vez cada 15 Se limpia 1 vez al
Limpieza de recintos Recinto externo limpio
sucio semana das mes
Sin comedero o Comedero con desperfectos Comedero no

Comederos Existencia de comedero Comedero funcional y limpio
al piso o sucio funciona
Alimentacin
Recibe La frecuencia de alimentacin es La frecuencia de alimentacin

adecuada y la dieta va acorde con Dieta igual para
Alimentacin Recibe alimentos sanos y seguros cualquier no es adecuada y las dietas no
las necesidades de cada grupo todos los grupos
alimento son balanceadas
Recibe agua
Se la cambia 1 vez por Se la cambia 1 vez
Agua Recibe agua limpia y fresca turbia o Se la cambia a diario
semana cada 15 das
guardada
La instalacin es adecuada para La instalacin tiene
rea de preparacin de Instalacin no
Tiene No tiene manipular alimentos. El lugar es desperfectos y no est muy
alimentos funciona y/ o sucia
aseado limpia
Sin escondites,
Presencia de escondites,cuevas, No usan los
Ambiente cuevas, perchas Son usados frecuentemente Siempre o poco los usan
descansos o perchas escondites
o descansos
Ambiente
Excesivo,
Sustrato adecuado, suave y
Sustrato Con sustrato vivo (pasto, paja) Sin sustrato Presenta inconvenientes inadecuado y
seguro
peligroso
Irradiacin a travs de vidrio
No hay
Irradiacin solar Hay irradiacin solar Irradiacin controlada o lmpara o Irradiacin no Sin irradiacin
irradiacin solar
controlada
Los animales no
Sistemas de Los animales tienen
Marcaje Tiene No tiene Los animales tienen microchips tienen ninguna
marcaje identificacin por rasgos
identificacin
No llevan registros
Sistemas de Poseen una base de datos Poseen fichas manuales, no
Registros Cuenta con registro No cuenta de ninguno de los
registro computarizada y estandarizada estandarizadas
animales
La sealizacin de los senderos
La sealizacin es poco La sealizacin es
Sealizacin Tiene No tiene y reas del centro es adecuada
adecuada para los visitantes nula.
Sealizacin e para los visitantes
informacin de Las fichas de las especies Las fichas de las especies son Las fichas solo
especies Fichas informativas de proveen de informacin poco claras, poco objetivas y tienen el nombre
Tiene No Tiene
especies objetiva, clara y cientfica a los no se basan en datos comn y cientfico
visitantes cientficos. de las especies
194
Karen Noboa
La matriz de evaluacin de los El mtodo de calificacin aplicado fue el

estndares de calidad y funcionalidad de las siguiente: a cada parmetro evaluado se le
instalaciones fue valorada sobre 92 puntos asign un valor numrico segn si cumpli
para centros que tienen categora de centro o no con los parmetros sugeridos (Tabla 2).
de rescate y 100 puntos para zoolgicos.
Tabla 2
Sistema de calificacin de la matriz de evaluacin de las instalaciones de los Centros
de Tenencia y Manejo de Vida Silvestre
El puntaje obtenido se transform en centro no es adecuada y se necesitar la

porcentaje, con lo cual, la calificacin de ayuda de personal tcnico del Ministerio
excelente, se le asigna los centros de fauna del Ambiente, para mejorar el desempeo
silvestre que obtuvieron del 90 % al 100 % y y que debe revisar los objetivos de su
que significa que cumplen de manera eficaz plan de manejo, implementarlos y luego
y eficiente con el manejo de los animales en reportarlos a la Direccin Provincial del
cautiverio de acuerdo con los estndares Ministerio del Ambiente a travs de un
de calidad y funcionalidad sugeridos. La informe semestral para su correspondiente
calificacin Muy Buena se le asigna a los supervisin. Del 0 % a 38 %, Muy Malo
que obtuvieron del 79 % al 89 % y que significa que el centro no cumple con los
significa que los centros se desempean requisitos mnimos de manejo de fauna
bien; sin embargo necesita tomar medidas silvestre y que necesita presentar un nuevo
preventivas. Del 60 % al 78 % Buena, plan de manejo y replantear sus objetivos
significa que el desempeo es aceptable; y en general todo lo que incluya manejo de
sin embargo tiene falencias en el manejo animales en cautiverio; estos centros tiene
que estn afectando a los animales, para lo el plazo de tres meses para mejorar su
cual se deben tomar medidas correctivas manejo y debern presentar informes de
y preventivas. Del 39 % al 59 % o Malo, su desempeo trimestralmente (Tabla 3).
significa que la forma en que se maneja el
195
Tabla 3
Tabla de rangos y calificaciones de la evaluacin a las instalaciones de los Centros de Tenencia y
Manejo de Vida Silvestre de la provincia de Pastaza
RESULTADOS rdenes ms representativos de las aves

Los resultados obtenidos del son: Psittaciformes (238 especmenes),
inventario de la coleccin de fauna de Anseriformes (40 especmenes) y
los 11 Centros de Tenencia y Manejo de Galliformes (38 especmenes) y los rdenes
Fauna Silvestre de la provincia de Pastaza, menos representativos son: Strigiformes
nos indican que existen 1180 especmenes y Pelecaniformes con un espcimen por
de vertebrados y 3426 especmenes de orden. Encontramos en los centros de fauna
invertebrados en cautiverio. Dentro de de Pastaza 11 rdenes de aves de los 22
los vertebrados la clase Reptilia es la que rdenes de Ecuador (Ridgely y Greenfield,
tiene el mayor nmero de especmenes en 2006). El orden ms representativo dentro
cautiverio con 433 especmenes, seguida de los reptiles es el de los Testudines con
por la clase Aves con 353 especmenes 390 especmenes y el orden Serpentes
en cautiverio y en tercer lugar la clase es el menos representativo con cinco
Mammalia con 344 especmenes en especmenes.
cautiverio; y la clase que presenta el menor
nmero de especmenes en cautiverio es la De las 50 familias de mamferos pre-
clase Peces con 50 especmenes. sentes en el Ecuador, 14 se encuentran en
cautiverio en la provincia de Pastaza. Las
Los rdenes de mamferos familias ms representativas son: Cebidae
ms representativos son: Primates (126 especmenes), Tayassuidae (67 espec-
(183 especmenes), Artiodactyla (67 menes) y Atelidae (50 especmenes); la fa-
especmenes) y Carnvora (51 especmenes) milia con la menor representatividad es la
y el orden menos representativo es el orden Aotidae (un espcimen). Las familias ms
Pilosa (dos especmenes). De los 14 rdenes representativas de aves son: Psittacidae
de mamferos presentes en el Ecuador, (238 especmenes), Cracidae (38 espec-
seis rdenes son parte de las colecciones menes) y Anatidae (36 especmenes); las
faunsticas de los zoolgicos y centros de menos representativas son: Falconidae,
rescate de la provincia de Pastaza. Los Anhingidae, Turdidae y Strigidae, cada
196
Karen Noboa
una con un espcimen. En los zoolgicos y (53 % del total), Brassolidae con 1030 indi-
centros de rescate de Pastaza encontramos viduos (30 % del total), Ninphalidae con
17 familias de aves de las 82 familias que 429 individuos que hace el 12 % del total,
existen en Ecuador (Ridgely y Greenfield, Papilionidae con 88 individuos que es el 3
2006). Dentro de los reptiles encontramos % del total y Heliconidae con 77, equiva-
ocho familias de las 29 reportadas (Carrillo et lentes al 2 % de la poblacin total.
al., 2005). Las familias ms representativas
son: Podocnemididae (274 especmenes), Existen 33 especies de mamferos de
Testudinidae (107 especmenes) y Croco- las 421 especies de Ecuador, las especies
dylidae (38 especmenes); las familias ms representativas son: pecar de collar
Kinosternidae y Geoemydidae cuentan (Pecari tajacu) con 61 especmenes, machn
con un solo representante. El zoocriadero blanco (Cebus albifrons) con 48 especmenes
Dedalma tiene un nmero de 3426 espec- y mono ardilla (Saimiri sciureus) con
menes del orden Lepidoptera represen- 41 especmenes; las especies menos
tadas por cinco familias de la siguiente representadas cuentan con un espcimen
manera: Morphidae con 1802 individuos (Tabla 4).
Tabla 4
Abundancia y riqueza de especies de mamferos en los Centros de Manejo y Tenencia de Vida Silvestre
de la provincia de Pastaza
197
Dentro de las aves las especies ms especmenes y amazona harinosa (Amazona

representativas son: lora cabeciazul (Pionus farinosa) con 33 especmenes y las especies
menstruus) con 59 especmenes, amazona de aves menos representativas tienen un
alinaranja (Amazona amazonica) con 37 espcimen (Tabla 5).
Tabla 5
Abundancia y riqueza de las especies de aves en los Centros de Manejo y Tenencia de Vida Silvestre
198
Karen Noboa
Existen 14 especies de reptiles de las tortuga motelo (Chelonoidis denticulata)

422 reportadas para el Ecuador (Carrillo con 107 especmenes y charapa grande
et al., 2005), las especies de reptiles con (Podocnemis expansa) con 70 especmenes
mayor abundancia son: charapa pequea y las especies con menos representativas
(Podocnemis unifilis) con 204 especmenes, tienen un espcimen (Tabla 6).
Tabla 6
Abundancia y riqueza de especies de reptiles de los Centros de Tenencia y Manejo de Vida Silvestre
De las 33 especies de mamferos cuatro vulnerables, es decir el 15 % del total

en cautiverio en los centros de fauna de de mamferos en cautiverio.
Pastaza, 13 especies se encuentran dentro
de alguna categora de amenaza en el Libro Dentro de las aves encontramos que
Rojo de Mamferos de Ecuador, lo cual ocho especies se encuentran amenazadas
significa que el 39 % de las especies que segn el Libro Rojo de Aves de Ecuador,
forman parte de las colecciones faunsticas de las 58 que encontramos en los centros de
de los centros estudiados tienen alguna fauna de Pastaza, dos especies en peligro y
categora de amenaza: seis especies se seis vulnerables, es decir el 14 % del total.
encuentran en peligro y siete especies Segn la Lista Roja de la UICN dos especies
vulnerables. Con respecto a la Lista Roja estn amenazadas (una en peligro crtico y
de la UICN cinco especies estn en alguna una vulnerable), es decir el 3 % del total.
categora de amenaza: una en peligro y
199
Dentro de los reptiles siete especies categora vulnerable es decir el 7 % del total.
estn citadas en las categoras de amenaza
segn el Libro Rojo de Reptiles de Ecuador, En la evaluacin que se realiz a
dos especies estn en peligro y cinco travs de la matriz de instalaciones, las
especies vulnerables, es decir el 50 % de las calificaciones obtenidas fueron desde
especies en cautiverio. En la Lista Roja de Excelentes hasta Muy Malas (Tabla 7).
UICN encontramos que una especie est en
Tabla 7
Puntajes, porcentaje de cumplimiento y calificacin de las instalaciones de los Centros de Tenencia y
Manejo de Vida Silvestre de la provincia de Pastaza
De la aplicacin de la matriz de educacin ambiental, el 17 % lo hacen en

datos generales a los 12 Centros de actividades productivas, el 75 % de los
Tenencia y Manejo de Fauna Silvestre se centros de fauna realizan investigaciones,
obtuvieron los siguientes resultados. El el 17 % condicionan (entrenan) a la fauna
67 % de los Centros de Tenencia y Manejo silvestre, el 58 % rehabilitan animales, el
de la provincia de Pastaza tienen patente 75 % exhiben los animales al pblico, el
de manejo, el 25 % de los centros tiene 25 % de los centros realizan actividades
caducada la patente y el 8 % de los centros de comercio, un 25 % tienen colecciones
no tiene patente. El 92 % de los Centros de fauna que son de carcter privado y el
de Tenencia y Manejo de Fauna Silvestre 50 % reciben voluntarios. El 33 % de los
de la provincia de Pastaza tienen plan de centros evaluados se financian a travs de
manejo y el 8 % de los centros no presenta donaciones, el 50 % se financian a travs
plan de manejo. El 75 % de los centros de de programas de voluntariado, el 75 %
fauna liberan animales, el 100 % de los a travs del cobro de entradas, el 33 % a
centro de fauna realizan acctividades en travs de actividades de comercio y el 83 %
200
Karen Noboa
se autofinancian. El personal tcnico de los azul) es la ms representativa en cautiverio

centros de fauna de Pastaza es el siguiente: dentro de las aves; sin embargo no coincide
nueve bilogos, doce veterinarios, cinco con la especie de mamferos y reptiles ya
zootecnistas, un Ingeniero Ambiental y que en los centros de Pastaza el mamfero
un Ingeniero en Recursos Ambientales. con mayor abundancia es el pecar de
La procedencia de los animales de las collar (Pecari tajacu) y dentro de los reptiles
colecciones faunsticas de los centros de la charapa pequea (Podocnemis unifilis).
fauna es la siguiente: el 92 % de los centros Esta variacin en los resultados obtenidos
evaluados (11 de los 12 centros) obtienen podra deberse a que la muestra escogida
animales por entregas voluntarias, el en el estudio realizado por el Ministerio
50 % (5 de los 12 centros) por entregas de del Ambiente (2008), abarc se evaluaron
la Polica Ambiental, el 83 % (10 de los 12 centros de rescate y zoolgicos a nivel
centros) por entregas del Ministerio de nacional, mientras que en este estudio solo
Ambiente, el 58 % (7 de los 12 centros) por se centr en una provincia.
traslados, el 25 % (3 de los 12 centros) por
intercambios, el 33 % (4 de los 12 centros) Las familias ms representativas
por donaciones, el 92 % (11 de los 12 de los Centros de Tenencia y Manejo de
centros) por nacimientos, el 8 % (1 de los 12 Fauna Silvestre de los Centros de Tenencia
centros) por compra y el 50 % (6 de los 12 y Manejo de Fauna Silvestre de Ecuador
centros) por rescates. son la Psittacidae (loros y guacamayos),
Tayassuidae (pecares) y Testudinidae
DISCUSIN (motelos) segn un estudio realizado en
La mayora de especies de la fauna 1998 (Instituto de Ecologa Aplicada, 1998).
silvestre que se encuentra en cautiverio La familia de aves representativa coincide
en los Centros de Tenencia y Manejo de con el estudio realizado en los centros de
Fauna Silvestre de la provincia de Pastaza fauna de Pastaza; sin embargo difiere de las
proviene del trfico ilegal de especies. En familias ms representativas de mamferos
el 2008, la mayor abundancia de especies y reptiles, ya que en el caso de la provincia
estuvo representada por las siguientes: de Pastaza es la familia Cebidae (mamferos)
lora de cabeza azul (Pionus menstruus) con y la familia Podocnemidae (reptiles). Es
255 especmenes, mono ardilla (Saimiri por este motivo que se debera realizar un
sciureus) con 1 053 especmenes y tortuga estudio de las poblaciones en sus hbitats
motelo (Chelonoidis denticulata) con 556 naturales de los grupos ms representativos
especmenes (Ministerio de Ambiente, que se encuentran en cautiverio para conocer
2008). Los resultados obtenidos de los 12 si sus poblaciones se mantienen estables. Los
Centros de Tenencia y Manejo de Fauna estudios realizados tanto por el Instituto de
Silvestre de la provincia de Pastaza coincide Ecologa Aplicada de la Universidad San
con el estudio realizado en el 2008, en que Francisco en 1998, Ministerio del Ambiente
la especie Pionus menstruus (lora cabeza 2008 y el presente estudio revelan que
201
la mayor representacin de animales en que estimulen comportamientos naturales a

cautiverio est dada por especies silvestres travs de la recreacin de hbitats naturales
que provienen de la Amazona ecuatoriana, o la colocacin de estmulos sensoriales.
en donde los grupos ms representativos El manejo de los centros evaluados carece
son los Psitcidos (loros y guacamayos), de garantas tcnicas, debido a que la
Primates y Testudines. mayora de especialistas que laboran en
estos centros no estn a tiempo completo,
Al evaluar 23 Centros de Manejo y lo cual genera vacos y malas prcticas en
Tenencia de Vida Silvestre del Ecuador el momento de manipular y alimentar a
se detectaron las siguientes falencias: las especies cautivas; esta problemtica no
falta de personal tcnico especializado, solo se presenta en el Ecuador sino tambin
instalaciones inadecuadas para el manejo de en la mayora de pases latinoamericanos.
fauna silvestre, falta de objetivos especficos,
En Panam la principal falencia de los
falta de protocolos y normas para el manejo centros de fauna es la falta de especialistas
de fauna silvestre, falta de financiamiento en manejo de fauna silvestre (Valds,
y falta de manejo tico (Ministerio de 2007) y este problema es similar al de
Ambiente, 2008). Estas falencias son similares Ecuador. La mayora de centros evaluados
a las encontradas en el presente estudio, presentan problemas para proveer una
en los zoolgicos, centros de rescate y dieta balanceada segn los requerimientos
zoocriaderos de Pastaza. Los centros de nutricionales por especie y por etapa de
fauna silvestre presentan falencias de tipo desarrollo, lo cual ocasiona atrasos en el
fsico, tcnico y organizacional; los encierroscrecimiento y enfermedades relacionadas
no son los adecuados para mantener a las con la mala nutricin. Otro problema que
especies, muchos de estos se encuentran se presenta en los Centros de Tenencia y
en condiciones precarias y no fueron Manejo de Fauna de Pastaza, es la falta de
construidos con materiales apropiados sistemas de marcaje y sistema de registros,
para un ptimo desarrollo de los animales en el mejor de los casos los animales son
cautivos, el tamao de las jaulas no se identificados a travs de rasgos fsicos; el
ajusta a los requerimientos bsicos que sistema de registros de los animales no est
estimulen comportamientos naturales, en estandarizado y en la mayora de los centros
muchos centros el sustrato de las jaulas no no se cuenta con actas de nacimiento,
es el adecuado. El tipo de sustrato influye actas de defuncin, actas de traslados de
negativa o positivamente en los niveles de animales, actas de intercambio de animales,
estrs de los animales cautivos (Morgan lo cual ocasiona vacos en la informacin
y Tromborg, 2007). El enriquecimiento que tiene el Ministerio del Ambiente.
ambiental es un factor importante para
evitar conductas anormales en las especies Sin embargo, cabe destacar que
cautivas; sin embargo la mayora de centros algunos centros evaluados tienen un
evaluados no ejecutan programas integrales desempeo adecuado como el Centro de
202
Karen Noboa
Rescate Merazonia y Zoolgico Tarqui Milenium, UICN-Sur, UICN-

los cules tienen un manejo tcnico de los Comit Ecuatoriano, Ministerio de
especmenes, cuentan con especialistas en Educacin y Cultura. Serie Proyecto
fauna silvestre, realizan rehabilitaciones, PEEPE. Quito-Ecuador.
la infraestructura y el enriquecimiento
ambiental son adecuados lo cual estimula Flores A y Valencia S. 2007. Local illegal
comportamientos naturales en las especies trade reveals unknown diversity
y baja su nivel de estrs; adems, cuentan and involves a high species richness
con sistemas de registros adecuados. of wild vascular epiphytes. Biological
Conservation, 136: 372387.
En el Ecuador no se desarrollan
verdaderos programas de conservacin ex Freile J y Santander T. 2005. reas impor-
situ de fauna silvestre, a pesar que formamos tantes para la conservacin de las
parte del Convenio de Biodiversidad aves en Ecuador. En: BirdLife Inter-
Biolgica, de algunos tratados internacionales nacional y Conservation Internacio-
sobre la conservacin de especies silvestres nal. 2005. reas Importantes para
y tenemos leyes que regulan el manejo y la Conservacin de las Aves en Los
tenencia de vida silvestre; sin embargo, Andes Tropicales: Sitios Prioritarios
seguimos tratando a los animales en para la Conservacin de la Biodi-
cautiverio como objetos, que sirven para la versidad. BirdLife Internacional. Serie
recreacin y no como sujetos de derecho, de Conservacin de BirdLife No. 14.
a los cuales se les debe proporcionar una Ecuador.
vida digna, que les permita desarrollar sus
comportamientos naturales. Gepts P. 2006. Plant genetic resources
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204
NOTAS CIENTFICAS
Asociacin entre los polimorfismos -308 y -238 del gen TNF- y la artritis
reumatoide (datos preliminares)
Carlos Mestanza1,2, Camilo Zurita-Salinas2,3, Estefana Espn2, David Ortega-Paredes2,
Marcelo Mora2, Carlos Vallejo4, Rmulo Villacs5 y Maril Mestanza-Peralta6

1
Facultad de Ciencias Qumicas. Universidad Central del Ecuador. Quito, Ecuador
2
Unidad de Investigaciones en Biomedicina. Zurita&Zurita Laboratorios. Quito, Ecuador
camiloszuritas@zuritalaboratorios.com
3
Ctedra de inmunologa. Universidad Central del Ecuador. Quito, Ecuador
4
Centro de Artritis. Quito, Ecuador
5
Hospital Carlos Andrade Marn. Departamento de Reumatologa. Instituto Ecuatoriano de Seguridad
Social. Quito, Ecuador
6
Fundacin para las Enfermedades Reumticas (FUNDARVI). Quito, Ecuador
RESUMEN.- La Artritis Reumatoide (AR) es una enfermedad inflamatoria sistmica que

afecta del 0.5 hasta el 2 % de la poblacin mundial. En el Ecuador, la prevalencia repor-
tada es del 0.9 %. Recientemente se han estudiado los polimorfismos en varios genes
con el fin de encontrar su relacin con la enfermedad. Dos de los polimorfismos ms es-
tudiados son el -308 y el -238 del gen TNF-. Nosotros analizamos la presencia de estos
polimorfismos en cuarenta individuos previamente diagnosticados con AR y vein-
ticinco individuos sanos mediante la RCP-TR (endpoint genotyping). Se emple ELISA
para medio los niveles de marcadores de AR. La actividad de la enfermedad fue medida
mediante DAS 28. Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con la declaracin
de Helsinki. No se establecieron diferencias significativas entre las frecuencias de ambos
polimorfismos entre los individuos sanos y los pacientes con AR. El 69 % de los indi-
viduos con el polimorfismo -238GA presentaron una baja actividad de la enfermedad
(SB DAS 28), mientras que el 67 % y 57 % de individuos con los polimorfismos -238GG y
-238AA respectivamente, presentaron una actividad media (SM DAS 28). Nuestro trabajo
es el primero que relaciona AR y polimorfismos genticos que se realiza en el Ecuador.
Nuestros resultados sugieren que hay una asociacin de -238GG con una mayor activi-
dad de la enfermedad, que ha sido reportado previamente.
205
PALABRAS CLAVES: artritis reumatoide, DAS 28, HLA, polimorfismos, TNF-
ABSTRACT.- Rheumatoid Arthritis (RA) is a systemic inflammatory disease that affects

0.5 to 2 % of the global population. In Ecuador the reported prevalence of the disease is
0.9 %. Recently, an increase number of polymorphisms have been studied in order to find
a relationship between the disease and genetic polymorphisms. Two of the most studied
polymorphisms are -308 and -238 of the tumor necrosis factor (TNF-) gene. Forty
individuals with previous diagnosis of RA and twenty five healthy individualswere
analyzed for the presence of the polymorphisms -238 and -308 using RT-PCR (endpoint
genotyping). Additionally, levels of RA markers were assessed using ELISA. Disease
activity was measured according to clinical data using DAS 28. The study was carried
out according to Helsinki declaration standards. No differences were found in genotype
frequencies between healthy and RA individuals in both polymorphisms. Results showed
that most -238GA individuals (69 %) had low disease activity according to DAS28 (SB
DAS28); in contrast to -238GG and -238AA polymorphisms in which most individuals
(67 % and 57 %) had medium disease level (SM DAS 28) .This is the first study on
relationship between RA and genetic polymorphisms carried out in Ecuador. Our results
suggest the association between -238GG polymorphism and a higher progression of the
disease, reported previously.
KEYWORDS: DAS 28, HLA, polymorphisms, rheumatoid arthritis, TNF-
INTRODUCCIN La artritis reumatoide presenta una

La artritis reumatoide (AR) es una fuerte predisposicin gentica para el
enfermedad inflamatoria sistmica que desarrollo y actividad de la enfermedad,
afecta principalmente a las articulaciones, calculado entre el 40 y 60 % (MacGregor et
pero puede afectar rganos y tejidos. Es al., 2000). Con esta premisa, se han llevado
una condicin dolorosa que en casos graves a cabo varios trabajos de mapeo gentico,
conduce a una importante prdida de las realizados en diversas poblaciones
funciones motrices en el paciente (Majithia humanas, en las cuales se ha identificado
et al., 2007). A nivel mundial, la AR afecta a la regin gentica de los Antgenos
del 0.5 hasta el 2 % de la poblacin (Silman Leucocidarios Humanos, HLA (Human
y Pearson, 2002; Nepom, 2001) y en el Leukocyte Antigen), como la nica regin en
Ecuador, la prevalencia reportada es del el genoma humano aparentemente ligada a
0.9 %. (Mestanza et al., 2006). la artritis reumatoide (Tamiya et al., 2005;
Osorio et al., 2004; John et al., 2004).
206
Carlos Mestanza, Camilo Zurita-Salinas, Estefana Espn, David Ortega-Paredes, Marcelo Mora,
Carlos Vallejo, Rmulo Villacs y Maril Mestanza-Peralta
ASOCIACIN ENTRE LOS POLIMORFISMOS -308 Y -238 DEL
GEN TNF-a Y LA ARTRITIS REUMATOIDE (DATOS PRELIMINARES)
La regin HLA, tambin 1989, concluyen que las molculas de HLA

conocida como complejo mayor de de clase II contribuyen al efecto gentico
histocompatibilidad, MHC (Mayor solo en un 30 %, por lo cual, polimorfismos
Histocompatibility Complex), se encuentra de genes en otras regiones, como el gen
compuesta por tres regiones: HLA de clases codificante del factor de necrosis tumoral
I, II y III, las cuales comprenden grupos de alfa, TNF- (Tumor Necrosis Factor alpha),
genes relacionados con la respuesta inmune han sido estudiados por su posible
(Figura 1). El locus HLA de clase II, ha sido contribucin a la susceptibilidad y el
reconocido como el principal factor de progreso de la artritis reumatoide.
riesgo gentico. Deighton y colaboradores,
Figura 1.- Esquema de la ubicacin del gen TNF- en la regin gentica de los Antgenos
Leucocidarios Humanos, HLA (Human LeukocyteAntigen). El factor de necrosis tumoral, TNF-, se
encuentra dentro de la regin HLA del genoma humano en el grupo de genes de HLA de clase III,
en el brazo corto del cromosoma 6, posicin 6p21.3.
El gen TNF- se encuentra dentro En muchos de los individuos con AR

del grupo de genes de HLA de clase III, en se detecta una alta expresin del gen TNF-
el brazo corto del cromosoma 6, posicin en las articulaciones afectadas, adems
6p21.3. Este gen codifica una citocina de tener el factor de necrosis tumoral y
multifuncional pro-inflamatoria envuelta factor reumatoide (FR) elevados en plasma
en la regulacin de un amplio espectro de (Kawane et al., 2006). Nemec et al., 2008
procesos biolgicos, los cuales incluyen: comenta en su trabajo el importante papel
proliferacin y diferenciacin celulares, que juega TNF- en el aparecimiento y
as como apoptosis. Esta citoquina ha sido actividad de la artritis reumatoide y que los
implicada en una variedad de desrdenes elevados niveles de TNF- en el plasma y
autoinmunes, como la artritis reumatoide. lquido sinovial de pacientes con AR, pueden
207
estar relacionados con polimorfismos en la fueron veinticinco individuos sin AR. Los
regin promotora del gen. En los ltimos criterios de inclusin, fueron: edad mayor
aos, varios polimorfismos en esta regin a 18 aos, no hayan tenido transfusiones
promotora han sido estudiados (tales como sanguneas en los 6 meses previos al
TNF- -308 y -238) y se ha hipotetizado su estudio y que tengan un marcador de
papel en el incremento de la predisposicin artritis positivo. Cada participante firm
o actividad de la enfermedad, resistencia un consentimiento informado donde se
al tratamiento con inhibidores de TNF le explic todo lo concerniente al estudio.
o una mayor incidencia, posiblemente Adems, se incluy un cuestionario con
debido a un desbalance de los niveles de datos clnicos de cada participante con el
la protena TNF- que podra favorecer objetivo de calcular el ndice DAS 28.
el aparecimiento o la actividad de la AR
(ORielly et al, 2009; Rezaieyazdi et al, 2007; El factor reumatoide (FR) se
Cuenca et al, 2001). determin mediante la tcnica de micro-
ELISA, con el procedimiento descrito por
Sin embargo, los resultados el kit comercial DIAMEDIX (Miami, USA)
obtenidos siguen siendo controversiales. (valor positivo > 20.0 IU/ml, valor negativo
Al momento no existe bibliografa clara < 16 IU/ml). Protena C reactiva (RCP) se
en relacin con la presencia de estos determin con el uso del equipo Vitros DT60
polimorfirmos y la AR, Sin embargo, II Chemistry system (Johnson & Johnson),
varios estudios los han relacionado con (valor positivo > 4.5 mg/L). Los anticuerpos
la susceptibilidad a la enfermadad en anti-Pptido citrulinado cclico (anti-CCP),
distintos grupos de pacientes y en algunos se realizaron mediante el kit de HUMAN
casos con implicaciones tnicas (Cuenca (Wiesbaden, Alemania) (valor normal hasta
et al., 2003; Yen et al., 2001; Vinasco et al., 25 U/ml) y la prueba para medir el factor
1997). de necrosis tumoral (TNF-), se realiz con
el mtodo descrito en el kit comercial de la
Con estos antecedentes, el objetivo de casa IBL (Hamburgo, Alemania), con valor
este estudio preliminar fue determinar la negativo < 3.8 pg/ml.
relacin entre los polimorfismos -308 y -238
en el promotor del gen TNF- y la presencia La extraccin de ADN genmico
y actividad de la artritis reumatoide. se realiz a partir de 200 l de sangre
total-EDTA, con el uso del kit HighPure
MATERIALES Y MTODOS PCR template preparation (Roche).
El modelo del estudio fue de caso La deteccin de los polimorfismos se
y controles. Al ser un proyecto piloto, realiz mediante reaccin en cadena de la
se incluyeron en la poblacin cuarenta polimerasa en tiempo real (RCP-RT) con el
pacientes con diagnstico de Artritis mtodo (endpoint genotyping) del sistema
Reumatoide (ACR 1987) y los controles Lightcycler 2.0 (Roche). La mezcla de
208
reaccin se prepar en un volumen final HybProbe (Roche), 0.2 M 0.4 M (Roche)

de 20 l, con el empleo de los iniciadores de cada iniciador (Tabla 1) y 5 l de ADN
descritos por Azmy y colaboradores, 2004 genmico (50100 ng).
(Tabla 1). Se colocaron 4 l de Master Plus
Tabla 1
Iniciadores descritos por Azmy et al., 2004
*Concentracin
Indicadores Secuencia (5 - 3)
final
*Se destaca la concentracin de iniciadores usada en este estudio
El perfil trmico usado fue de 95 C Donde: NAD es el nmero de articulaciones

por 10 minutos, para la denaturacin inicial, dolorosas, NAT es el nmero de
45 ciclos de 95 C por 15 segundos, para la articulaciones dolorosas y tumefactas y
denaturacin, 61 C por 10 segundos para PCR representa la protena C reactiva. Los
el anillamiento, y 72 C por 15 segundos, datos obtenidos fueron categorizados como
para la extensin. La adquisicin de Remisin < 2.3; actividad Leve (SB DAS 28)
fluorescencia (nica) se realiz en el paso < 2.7; actividad moderada (SM DAS 28) > 2.7
de anillamiento de los ciclos. y 4.1; actividad severa (SA DAS 28) > 4.1.
Para medir la actividad de la artritis Se realiz un clculo de Kruskal

reumatoide emple el ndice DAS 28 (Inoue Wallis (P < 0.05) entre los casos y controles.
et al, 2007) que incluye la evaluacin del Adicionalmente, se realiz el mismo test
dolor e inflamacin en 28 articulaciones y para los polimorfismos genticos y la
el resultado de la prueba de la protena C actividad de la enfermedad.
reactiva (28-joint disease activity score) con la
frmula:
DAS28 (3)= [0.56 NAD28 + 0.28 NAT28+
0.36 ln (PCR+1)] (1.10+1.15).
209
RESULTADOS Y DISCUSIN El nmero de participantes limit

De los 40 pacientes, el 57.5 % tiene la bsqueda de asociaciones especficas
actividad baja de la enfermedad, 40 % entre los genotipos de cada polimorfismo y
moderada y nicamente 2.5 % actividad caractersticas definidas de la enfermedad.
alta, segn los valores de DAS 28 (Tabla Sin embargo, el mayor porcentaje (69 %)
2). La relacin entre los polimorfismos de individuos con polimorfismo -238GA
estudiados en el grupo control y los tuvieron baja actividad de la enfermedad
participantes con artritis, as como la (segn DAS 28), lo cual indica su posible
actividad, de la enfermedad no indicaron asociacin. Mientras que, la mayora de
significacin estadstica mediante el test de individuos con los polimorfismos -238AA
Kruskal-Wallis (P > 0.05). Este resultado fue (57 %) y -238GG (67 %) presentaron
previsible de acuerdo con la bibliografa y actividad media (Tabla 2). Este resultado
por el tamao de la poblacin incluida concuerda con el trabajo de Brinkman et
en el estudio, por lo cual concuerda con al., 1997, donde se sugiere que el genotipo
otros estudios (Rezaieyazdi et al., 2007, -238GG en coordinacin con otros factores,
Brinkman et al., 1997) y sugiere que son tales como varios genes del complejo
factores distintos a los incluidos en el mayor de histocompatibilidad se encuentra
estudio los que se encuentran relacionados relacionados con un mayor grado de la
con la predisposicin y la actividad de la enfermedad.
enfermedad.
Tabla 2
Frecuencias fenotpicas de pacientes con Artritis reumatoide (AR) y participantes control, Porcentajes de
DAS 28 de pacientes con AR y promedio de datos clnicos de pacientes con AR
AR, artritis reumatoide, TNF-, factor de necrosis tumoral; CCP, protena anticitrulinada; FR, factor
reumatoide; CRP, Protena C reactiva.*DAS 28, ndice de actividad de la artritis reumatoide en base al
dolor y la inflamacin en 28 articulaciones y el resultado de la prueba de protena C reactiva; SA DAS 28,
actividad alta; SM DAS 28, actividad media; SB DAS 28, actividad baja. Las pruebas genotpicas fueron
realizadas por RCP en tiempo real por el mtodo de endpoint genotyping. Las pruebas inmunolgicas fueron
realizadas por el mtodo de ELISA.
210
Adems, los datos de los y otros genes (Silman y Pearson, 2002). En

polimorfismos -308, no sugieren un patrn este contexto, es importante continuar la
similar al -238, El genotipo -308GG mostr bsqueda de mltiples factores asociados
un promedio mayor que otros genotipos con esta patologa y ver como se relacionan
(-308GA y -308AA) en los tres marcadores entre ellos.
de artritis (RF, CCP y CRP). Sin embargo,
al correlacionar los datos clnicos con la Los resultados de este estudio se
presencia de los genotipos no se demost presentan de manera preliminar, debido a
significacin estadstica (Tabla 2). De la necesidad de considerar factores tanto
manera congruente con otros estudios genticos como ambientales (Silman y
(Rezaieyazdi et al., 2007; Pawlik et al., 2005;
Pearson, 2002) e integrar nuevas variables
Brinkman et al., 1997), estos resultados en una poblacin mayor, para alcanzar un
proponen que el polimorfismo -308 no es resultado concluyente que nos permita
un factor determinante para la actividad a comprender las diferencias en la progresin
la artritis reumatoide. y susceptibilidad de los pacientes a la artritis
reumatoide. En este sentido, continuaremos
Un factor importante que no fue con el anlisis de pacientes con AR e
analizado en el presente estudio, fue la individuos control para los polimorfismos
posible asociacin entre los polimorfismos -308 y -238 en el promotor del gen TNF-
del gen TNF- y alelos especficos y adicionaremos el estudio de la regin
de los genes del complejo mayor de HLA-DR4, al igual que los polimorfismos
histocompatibilidad. Algunas variantes de Asp299Gly y Thr399Ile del gen Toll4, con
genes de clase II de este complejo, han sido el fin de correlacionar esta informacin
asociadas con actividad o susceptibilidad a gentica con los datos clnicos de individuos
enfermedades autoinmunes. Por ejemplo, de una poblacin de estudio ms grande a fin
los alelos del gen HLA-DRB1 que comparten de poder establecer el perfil de distribucin
la secuencia de aminocidos (QKRAA, de frecuencias de estos polimorfismos en la
QRRAA or RRRAA) en la posicin 70-74, poblacin ecuatoriana.
han sido reportados entre los principales
factores de riesgo gentico para artritis REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
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progresin de la enfermedad de algunos (-308 and -238) in breast cancer
genes, puede estar relacionada con un susceptibility and severity. Breast
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214
Diversidad del gnero Drosophila (Diptera, Drosophilidae) en la
quebrada de Cruz Loma, Pichincha, Ecuador
Diego Cspedes y Violeta Rafael

Laboratorio de Gentica Evolutiva, Escuela de Ciencias Biolgicas, Pontificia Universidad Catlica
del Ecuador, Quito, Ecuador
diego_cesp@hotmail.com; vrafael@puce.edu.ec
RESUMEN.- La quebrada de Cruz Loma, situada en el lado oriental del volcn Pichincha,
provincia de Pichincha, fue muestreada durante el ao 2008 y comienzos del 2009 con la
finalidad de poder determinar la composicin de las especies del gnero Drosophila. Se
fijaron 13 puntos de colecta, y se utilizaron trampas de banana-levadura. Los muestreos
se realizaron desde los 3 100 hasta 4 000 m de altitud. Los ecosistemas muestreados fueron
el pramo propiamente dicho (3 5004 100 m) cubierto por los gneros Calamagrostis y
Festuca y el subpramo (3 0003 500 m) compuesto en su mayor parte por vegetacin
arbustiva. Un total de 713 individuos de diferentes especies del gnero Drosophila fueron
capturados. No se recolectaron especmenes sobre los 3 850 m. La mayor cantidad de
individuos y especies se registraron a 3 100 m (12 especies). Los meses con mayor nmero
de capturas fueron julio (239 especmenes) y octubre (236 especmenes). As mismo, en
octubre se recolectaron 14 especies. Las especies ms abundantes fueron Drosophila rucux,
con 193 individuos capturados a lo largo del ao, desde los 3 100 hasta los 3 775 m, y
Drosophila ecuatoriana con 129 individuos capturados desde los 3 100 hasta los 3 550 m de
altitud. Adems y por primera vez en Ecuador se colectaron especmenes de Drosophila
hyalipennis Duda (1927) a 3 325-3 400 m.
Palabras claves: Cruz Loma, diversidad, Drosophila, nuevo registro
ABSTRACT.- The Cruz Loma gorge on the eastern slope of the Pichincha volcano in the
province of Pichincha , was sampled during 2008 and early 2009, in order to determine
the composition of the genus Drosophila. Thirteen collection points were determined.
Traps with banana and yeast were used. Samples were taken from 3 100 to 4 000 m
altitude. Ecosystems sampled were the pramo (3 500-4 100 m) covered by the genera
Calamagrostis and Festuca and subpramo (3 000-3 500 m) composed mainly of shrub
forest. A total of 713 individuals of different species of Drosophila were captured.
215
No specimens were collected over 3 850 m. Most individuals and species were recorded
at 3 100 m (12 species). The months with the larger amounts of captured flies were July
(239 specimens) and October (236 specimens). October was the month where the greatest
number of species (14) were captured. Most abundant species were Drosophila rucux, (193
individuals captured throughout the year, from 3 100 up to 3 775 m), and Drosophila
ecuatoriana (129 individuals captured from 3 100 up to 3 550 m altitude). Also, Drosophila
hyalipennis Duda (1927) was also found for the first time in Ecuador at 3 325-3 400 m.
KEYWORDS: Cruz Loma, diversity, Drosophila, new record
Introduccin Drosophila (Vela & Rafael, 2003). As mismo,

La familia Drosophilidae consta de 73 en una colecta realizada en el pramo de
gneros y ms de 3 950 especies actualmente La Virgen a 4 100 msnm (bosque de
descritas, de las cuales la mayora se Polylepis) se han capturado drosfilas y
encuentran en la Regin Tropical (Brake entre ellas D. malerkotliana considerada
y Bachli, 2008). El gnero Drosophila es como una especie invasiva (Rafael, 2007);
el ms abundante dentro de la familia y adems de varias especies endmicas como
comprende alrededor del 53 % del total de las reportadas por Figuero et al, 2012.
especies; de ellas algunas son endmicas
otras subcosmopolitas y varias poseen una Las especies para poder mantener
distribucin cosmopolita (Mateus et al., 2006). poblaciones viables en las altas montaas,
deben localizar comida, ser una pareja
Las especies del gnero Drosophila reproductiva y evadir a los depredadores,
tienen una distribucin altitudinal muy mientras enfrentan condiciones como: baja
amplia, ya que, se puede encontrar desde temperatura, baja concentracin de oxgeno
el nivel del mar hasta ms all de los 3 000 y otros factores que reducen la efectividad en
msnm (Dillon & Frazier, 2006). Dobzhansky la locomocin de estos insectos ectotrmicos
(1956) utiliz en sus investigaciones a D. (Dillon y Frazier, 2006).
pseudoobscura recolectada a 3 200 msnm
junto con D. persimilis y D. occidentalis.
El objetivo del presente estudio, fue
Adems, D. ananassae se ha logrado
analizar la variacin de la diversidad del
capturar a una altitud de 5 123 msnm en
gnero Drosophila a lo largo de un gradiente
las laderas de Los Himalayas (Khare et al.,
altitudinal (3 100 a 4 000 msnm) de la
2002). En el Ecuador, estudios realizados
quebrada de Cruz Loma (sector norte del
en El Refugio de Vida Silvestre Pasochoa
Telefrico de Quito) del Bosque Protector
a 3 200 msnm han revelado la existencia
Pichincha.
de numerosas especies nuevas del gnero
216
EN LA QUEBRADA DE CRUZ LOMA, PICHINCHA, ECUADOR
MATERIALES Y MTODOS capturados con un aspirador entomolgico

El rea de estudio est ubicada en y colocados en tubos con medio de cultivo;
el Bosque Protector Pichincha situado mientras que, los muertos fueron retirados
en el flanco oriental de la cordillera de las trampas y guardados en tubos con
occidental de Los Andes y corresponde a la etanol al 70 %.
quebrada y loma denominada Cruz Loma
(783117.2W 01122S). El rea de colecta Los individuos capturados vivos
comprendi un rango altitudinal entre los fueron separados por sexo. Los machos
3 100 y los 4 000 msnm. fueron utilizados para la identificacin
taxonmica, y con las hembras se fundaron
En esta quebrada se encuentran isolneas para obtener descendencia.
varios tipos de vegetacin: 1) El pramo La identificacin taxonmica se realiz
propiamente dicho se encuentra ubicado mediante el anlisis de la genitalia interna
aproximadamente desde los 3 500 hasta y externa. Para obtener las estructuras
los 4 100 msnm y posee una vegetacin de de la genitalia tanto del macho como
pajonal dominada principalmente por los de la hembra, se separaron los ltimos
gneros Calamagrostis y Festuca (Luteyn, segmentos abdominales y se hirvieron
1999); 2) el subpramo es una zona de durante 10 minutos en una solucin de
transicin situada entre los 3 000 y 3 500 KOH al 10 %; luego se realiz la diseccin;
msnm compuesta en su mayor parte por el falo, epandrio e hipandrio del macho
vegetacin arbustiva (Luteyn, 1999); 3) el fueron colocados en glicerol y observados
bosque altoandino comprendido entre los al microscopio. En las hembras se separ el
3 400 y 4 300 msnm se encuentra compuesto ovipositor y las espermatecas que fueron
por rboles de 3 a 10 metros de alto e colocados en glicerol al 60 %.
interrumpido por grandes extensiones de
pajonales. RESULTADOS
Se colectaron un total de 713
La recoleccin de individuos se realiz individuos del gnero Drosophila que
durante el ao 2008 e inicios del 2009. Para el pertenecen a 16 especies distribuidas en
muestreo se utilizaron trampas hechas con siete grupos de especie.
una botella plstica de 500 ml con agujeros
en la parte superior y con una cubierta Aunque el muestreo se realiz hasta
plstica para protegerla de la lluvia. Como los 4 000 msnm, no se logr colectar
cebo se utiliz pltano fermentado con una individuos a partir de los 3 850 msnm en
solucin de levadura al 10 %. Se colocaron ninguno de los meses en los cuales se llev
un total de 78 trampas a lo largo de la a cabo las colectas.
ladera y la colecta se realiz luego de 14
y 21 das de haber colocado las trampas En relacin con el nmero de especies
en el campo. Los individuos vivos fueron en cada una de las estaciones, se observa
217
que en la estacin ubicada a los 3 100 (12 especies) la cual se reduce hasta llegar
msnm se encuentra la mayor diversidad a cero especies a los 3 850 msnm (Tabla 1).
Tabla 1
Nmero total de individuos del gnero Drosophila capturadas en las diferentes
altitudes de la Quebrada de Cruz Loma, Provincia de Pichincha, Ecuador
3100
3175
3250
3325
3400
3475
3550
3625
3700
3775
3850
3925
4000
Especies TOTAL
Grupo asiri
D. asiri Vela & Rafael, 2005 - - - 1 - - - - - - - - - 1
D. yuragyacum Figuero et al., 2012 - - - - - - 7 - - - - - - 7
Grupo busckii
D. busckii Coquillett, 2001 1 - - - - - - - - - - - - 1
Grupo flavopilosa
D. korefae Vela & Rafael, 2004 2 5 - 1 - - - - - - - - - 8
D. ogradi Vela & Rafael, 2004 29 1 - - - - - - - - - - - 30
Grupo guarani
D. ecuatoriana Vela & Rafael, 2004 57 41 18 3 4 4 2 - - - - - - 129
Grupo mesophragmatica
D. amaguana Vela & Rafael, 2004 69 5 4 - - 3 1 - - - - - - 82
D. mesophragmatica Duda, 1927 1 17 2 50 19 11 - - 1 - - - - 101
D. rucux Cspedes & Rafael, 2012 1 1 9 96 31 14 2 27 10 2 - - - 193
D. yanayuyu Cspedes & Rafael, 2012 2 - - - - 4 - - - - - - - 6
Grupo onychophora
D. hyalipennis Duda, 1927 - - - 2 1 - - - - - - - - 3
Grupo tipunctata
D. ninarumi Vela & Rafael, 2005 23 2 1 - - - - - - - - - - 26
D. pasochoensis Vela & Rafael, 2001 18 4 4 - 2 - - - - - - - - 28
D. condorhuachana Cspedes & Rafael, 2012 73 4 13 1 1 - - - - - - - - 92
Especies no agrupadas
D. apag Vela & Rafael, 2005 3 - - - - - - - - - - - - 3
D. condormachay Vela & Rafael, 2005 - - - 2 1 - - - - - - - - 3
TOTAL DE INDIVIDUOS 279 80 51 156 59 36 12 27 11 2 - - - 713
De los cuatro meses en los cuales Las especies mejor representadas por
se realizaron las colectas, julio y octubre nmero de individuos y que estn presentes
fueron los meses de mayor captura, 239 y en gran parte de el gradiente altitudinal
236 individuos respectivamente; as mismo, son: Drosophila rucux, con 193 individuos
octubre fue el mes en el cual ms especies a lo largo del ao (Tabla 1), distribuidos
se registraron (14 especies). Adems, en desde los 3 100 hasta los 3 775 msnm y D.
enero se recolect un menor nmero de ecuatoriana con 129 individuos colectados
individuos; a pesar de ello, el nmero de desde los 3 100 hasta los 3 550 msnm.
especies presentes es similar al de los otros
meses (Tabla 2).
218
Tabla 2
Especies del gnero Drosophila capturadas en la Quebrada de Cruz Loma en cada mes de colecta
Especies Meses
Grupo asiri Abril Julio Octubre Enero

D. asiri - - 1 -
D. yuragyacum - 6 1 -
Grupo busckii
D. busckii 1 - - -
Grupo flavopilosa
D. korefae - - 8 -
D. ogradi - 14 15 1
Grupo guarani
D. ecuatoriana 68 26 28 7
Grupo mesophragmatica
D. amaguana 3 34 39 6
D. mesophragmatica 21 34 44 2
D. rucux 75 50 58 10
D. yanayuyu 2 - 1 -
Grupo onychophora
D. hyalipennis 3 - - -
Grupo tipunctata
D. ninarumi - 3 17 6
D. pasochoensis 4 15 8 1
D. condorhuachana 20 57 9 6
Especies no agrupadas
D. apag - - 3 -
D. condormachay - - 4 2
No. de especies 9 9 14 9
Total de individuos 197 239 236 41
219
De un total de 16 especies del gnero Como se esperaba, la mayor cantidad

Drosophila capturadas en la quebrada de de especies y de individuos se encuentran
Cruz Loma, D. hyalipennis es el nico nuevo presentes en el punto de muestreo ms
registro para el Ecuador. bajo del estudio (3 100 msnm). El nmero
desciende rpidamente hasta llegar a cero a
DISCUSIN los 3 850 m en donde el rea de muestreo se
En la quebrada de Cruz Loma se caracteriza principalmente por la presencia
capturaron 713 individuos pertenecientes de pajonal y un nmero muy reducido de
a 16 especies del gnero Drosophila de los arbustos; estas condiciones dificultaran el
subgneros, Dorsilopha y Drosophila. establecimiento de poblaciones debido a
la ausencia de un refugio contra el viento
Dentro del subgnero Dorsilopha la y la lluvia que es necesario para combatir
nica especie que se encontr fue Drosophila el fro, obtener comida y tener lugares de
busckii; esta especie es considerada segn ovoposicin y cpula.
Patterson y Stone (1952) como una de las ocho
especies de Drosophila que son cosmopolitas Aunque se realizaron varios anlisis
junto con D. ananassae, D. hydei, D. immigrans, estadsticos (ANOSIM, SIMPER, GLM,
D. malerkotliana, D. melanogaster, D. repleta entre otros), no fue posible encontrar una
y D. simulans. Las especies cosmopolitas relacin directa entre la distribucin de
se encuentran presentes comnmente en especies a lo largo de la quebrada y las
lugares que han tenido influencias antrpicas; condiciones biticas y abiticas presentes
sin embargo, especies como D. simulans, en la misma. Probablemente debido al
D. inmigrans y D. ananassae se las puede gran nmero de ausencias registradas en
encontrar en lugares sin ningn disturbio los puntos de mayor altitud. Sin embargo,
pero en densidades muy bajas (Ferreira & mediante observacin directa, se puede
Tidon, 2005). En este caso se encontr un afirmar que ciertas especies muestran
solo individuo de D. busckii en el punto de preferencia por distintos factores; por
colecta ms bajo del estudio (3 100 msnm); ejemplo: D. amaguana es una especie
este lugar es el ms cercano a la estacin base de gran tamao que se la encuentra
del Telefrico de Quito, por lo cual, se podra principalmente en lugares con vegetacin
pensar que existe alguna influencia antrpica. alta, con poca luminosidad y alta humedad;
Por lo tanto, el hecho de haber encontrado a D. mesophragmatica ha sido capturada en
Drosophila busckii en el rea de estudio, no lugares con vegetacin de tipo arbustiva
significa necesariamente que se trate de un y con luz solar fuerte. Especies como
lugar intervenido pues la densidad de esta D. ecuatoriana cuya abundancia decrece
especie es sumamente baja; adems es posible cuando la altitud se incrementa, sugiere
considerar una contaminacin del tubo de que la temperatura es el factor limitante de
colecta en el laboratorio en el momento del su distribucin. Para otras especies es difcil
anlisis. determinar las condiciones favorables para
220
su establecimiento debido a su distribucin Khare PV, Burnabas RJ, Kanojiya M,

muy restringida como D. asiri y D. apag o Kulkarni AD y Yoshi DS. 2002.
por el contrario especies con distribuciones Temperature dependent eclosion
amplias como D. rucux. rhythmicity in the high altitude hima-
layan strains of Drosophila ananassae.
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221

REVISTA ECUATORIANA DE MEDICINA Y CIENCIAS BIOLGICAS
La Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biolgicas (REMCB) publica las

investigaciones cientficas originales en el campo de las Ciencias Biolgicas, Qumicas,
Bioqumicas, Ciencias Biomdicas, Biotecnologa, Conservacin y Manejo de Recursos.
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Ttulo, Autor(es), Afiliacin institucional, correo electrnico del autor principal, RESUMEN.-,
PALABRAS CLAVES:, ABSTRACT.-, KEYWORDS: (escritos en ingls), INTRODUCCIN,
MATERIALES Y MTODOS, RESULTADOS, DISCUSIN, CONCLUSIONES (opcionales),
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investigativos experimentales. Las notas cientficas constarn de las siguientes partes: Ttulo,
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MATERIALES Y MTODOS, RESULTADOS Y DISCUSIN (unidos), AGRADECIMIENTOS
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Hojas de vida y Reseas Institucionales (opcional para la revista) (hasta 1500 palabras) de un
tema especfico relacionado con los objetivos de la revista. Los ensayos y comentarios tendrn
un formato personalizado por sus autores, pero es obligatorio el uso de las siguientes secciones:
Ttulo, Autor(es), Afiliacin institucional, correo electrnico del autor principal, el texto y
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS.
Formato del manuscrito

1. Los manuscritos deben ser presentados, en idioma espaol o en ingls, en papel
A4, en formato de columna normal, con los cuatro mrgenes de 2.5 cm, tipo de letra
Times New Roman 12 puntos, doble espacio, justificado y pginas numeradas.
2. Ttulo en minsculas, con una extensin mxima de 18 palabras, negrita, centrado,

14 puntos.
Ejemplo: Preferencia de estratos boscosos en la alimentacin de
Turdus fuscater del Pasochoa
223
3. Autor o autores: Nombre(s), Apellido(s), en negrita, centrado, 12 puntos. Ejemplo:
Juan Eduardo Pueblo P1 y Estelita Estrella2
4. Afiliacin institucional: institucin, ciudad, pas, correo electrnico del autor

encargado de la correspondencia; si los autores representan a diferentes instituciones
indicar con un numeral, el texto en 10 puntos, centrado. Ejemplo:
1
Centro de Investigaciones Cientficas del IASA, Facultad de Ciencias Agropecuarias, ESPE, Sangolqu,
Ecuador. j_salazar@espe.edu.ec
2
Departamento de Zoologa, Escuela de Biologa, Universidad Amaznica del Uruguay.
5. Para los nombres genricos y especficos usar itlicas y al ser citados por primera
vez en el texto, se debe incluir el nombre del/los autor(es) de la descripcin original
de la especie. Ejemplo: en este trabajo se reportan los resultados del anlisis de los
cromosomas metafsicos de Drosophila chorlavi Cspedes & Rafael, 2012.
6. En los trabajos que as lo requieran es necesario presentar el listado del material

examinado, con las coordenadas de las localidades muestreadas dentro de lo posible.
7. Asimismo, citar las instituciones depositarias de los especmenes. Ejemplo:
Material examinado: holotipo (disectado y guardado en microtubo), etiquetado

D. quillu holotipo DVela det. 2003/Pasochoa, Pichincha, Ecuador DVela col., mar.
2001. Ocho paratipos (disectados y guardados en microtubos), etiquetados D. quillu
paratipo DVela det. 2003 / Pasochoa, Pichincha, Ecuador DVela col., abr. 2002.
Holotipos y paratipos depositados en el QCAZ.
8. RESUMEN.- Seguido, con una extensin mxima de 200 palabras. PALABRAS

CLAVES: cinco palabras separadas por coma y en orden alfabtico.
9. ABSTRACT.- Seguido, resumen en ingls. KEYWORDS: cinco palabras claves en

ingls.
10. Los ttulos de las secciones van en maysculas, negrita, 12 puntos. Si se requiere un
subttulo, este va en el mismo prrafo con minsculas, negrita, separado del texto
por punto y raya.
11. Representacin de numeracin y simbologa de datos.- Los decimales debern ser

representados con punto como en el ejemplo, 0.007 o 1.005 y con un mximo de
224
hasta 3 decimales. Los miles debern ser representados con un espacio entre los
nmeros como en el ejemplo, 1 958; 32 485; 105 896. Las coordenadas debern ser
representadas as, 783117.2 W 01122S. Para citar los grados de temperatura
estos deben citarse de la siguiente manera, 32 C, 115 F. En el caso de existir un
smbolo o abreviatura de unidad despus de un nmero este debe tener un espacio
entre los dos mencionados como en el ejemplo, 32 %, 32 ml, 88 g. La escritura de
palabras compuestas se sujetar a las reglas ortogrficas correspondientes, pues se
deben emplear con guin o sin l segn los casos, como en los siguientes ejemplos:
fsico-qumico, terico-prctico, cirujano-anestesista, seudotumor, neurorradiologa,
intracraneal. Los rangos de nmeros arbigos deben ser separados con el tipo de
smbolo Word en dash (). Ejemplo 1: Dyke FG, Broke RH y Shaw HG. 1986.
Use of road track count as indices of mountain lions presence. Journal of wildlife
Management, Bethesda, 50(1): 102109.
12. Las Figuras (esquemas, diagramas, dibujos, grficos, fotografas y mapas), deben
presentarse con el ttulo en la parte inferior, de un modo conciso y explicativo, en 10
puntos. Deben iniciar con la palabra Figura y el nmero arbigo correspondiente en
negritas, por ejemplo:
Figura 1. Deben ser preparadas en formato JPG o TIFF, y presentarse en hoja aparte, segn el
criterio de rigurosa economa de espacio y considerar el rea til de una pgina A4. La posible
ubicacin de las figuras debe sealarse en el texto del manuscrito con una cita en parntesis
y resaltado amarillo. Ejemplo (Figura 1, aqu). Las figuras debern ser informativas, de
alta calidad y resolucin para ser incorporadas en el texto. El comit editorial se reserva el
derecho de ubicar las figuras, en funcin del espacio disponible, o solicitar de los autores
efectuar los cambios correspondientes para obtener una mejor resolucin de las mismas.
13. Las tablas deben presentarse con el ttulo en la parte superior, de un modo conciso
y explicativo, en 10 puntos. Las tablas estarn construidas, en lo posible, solo
con lneas horizontales. Deben iniciar con la palabra Tabla y el nmero arbigo
correspondiente en negritas, por ejemplo Tabla 1. Deben ser preparadas en formato
XLS (EXCEL), y presentarse en hoja aparte, segn el criterio de rigurosa economa
de espacio y considerar el rea til de una pgina A4. La posible ubicacin de
las tablas debe sealarse en el texto del manuscrito con una cita en parntesis y
resaltado amarillo. Ejemplo (Tabla 1, aqu). El Comit Editorial se reserva el derecho
de ubicarlas en funcin del espacio disponible, o solicitar de los autores efectuar los
cambios correspondientes para obtener una mejor resolucin de las mismas.
225
14. CONCLUSIONES es una parte opcional del texto, deben ser sintticas y consistentes
con los resultados y la discusin; se deben separar con vietas de crculo, por ejemplo:
Las especies ecuatorianas D. chorlavi y D. rucux comparten el nmero cromosmico
2n = 10 con las especies que conforman el grupo de especies D. mesophragmatica.
D. chorlavi y D. rucux difieren entre ellas en el tamao y morfologa del cromosoma 5.
15. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS sern citadas en orden alfabtico segn

el apellido del primer autor; si existen varios artculos del mismo autor, estos
sern citados en orden cronolgico del ms reciente al ms antiguo, con formato
de Word de sangra especial francesa. Se prefieren citas bibliogrficas recientes
que provengan de artculos publicados en revistas cientficas indexadas, libros
especializados, tesis de doctorado, maestra o pregrado. Se sugiere evitar el uso
repetitivo de comunicaciones personales; estas no formarn parte de la bibliografa.
Ejemplos de citaciones en referencias bibliogrficas:
a. Artculo de revista cientfica: los nombres de las revistas debern ser

escritos en su forma completa y con cursiva:
Rodrguez-Guerra A, Barnes CW, Ordez MC, Salazar A y Soria CA. 2012. Identificacin
y evaluacin de algunos hongos con actividad celulsica aislados en Ecuador.
Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biolgicas, 33(1 y 2): 65-81.
Duchicela EJ. 2004. Diversidad funcional de las micorrizas arbusculares asociadas a
Brosimun utile en condiciones naturales. Ciencia, 7(8): 6577.
Staikou A y Lazaridou-Dimitriadou M. 1991. The life cycle, population dynamics, growth and
secondary production of the snail Xeropicta arenosa Ziegler (Gasteropoda: Pulmonata)
in northern Greece. Zoological Journal of Linnean Society, London, 101: 179188.
b. Captulo de libro
Eisenberg JF. 1979. Habitat, economy and society: some correlations, and hypotheses for
the Neotropical primates. En: Bernsteind IS y OE Smiths (eds) Primates ecology and
human origins: ecologycal influences on social organization: 215262. Granland
STPM Press. New York y London.
c. Tesis de grado
Astudillo Y. 2009. Identificacin, caracterizacin y diferenciacin de carbohidratos y
protenas en la secrecin de dorso y pie de la babosa terrestre Limas flavus (Mollusca:
Gastropoda). Tesis de Licenciatura en Ciencias Biolgicas, Pontificia Universidad
Catlica del Ecuador. Quito, Ecuador.
d. Libros enteros
226
Gumport RI, Deis FH, Gerber N y Koeppe RE. 2006. Biochemistry. Sexta edicin. Freeman
and Company. USA. 627 pp.
e. Informacin proveniente de internet
Ciertas pginas que tengan informacin cientfica relevante pueden citarse as:
Di Fiore A. 2001. Proyecto Primates Ecuador. Pgina de Internet: www.nyu.edu/projects/
difiore Consultada 13-enero-2006.
16. CitaS en el texto: use el siguiente formato para la citacin de literatura en el

texto, la cual debe tener un orden cronolgico: (Salceda, 2011; Montenegro y del
Pino, 2010; Barba et al., 2009).
17. Encabezado (Running head): para las versiones digitales, proporcionar

una versin corta de ttulo con un mximo de 10 palabras. Ejemplo: ttulo original
del manuscrito: Palmeras aceiteras del Ecuador: estado del arte en la investigacin
de nuevos recursos oleaginosos provenientes del bosque tropical; ttulo corto o
encabezado: Palmeras aceiteras del Ecuador.
18. ENVO DE MANUSCRITO: el autor principal deber enviar el manuscrito original

en versin electrnica va e-mail a la direccin, revecuatorianamedycb@gmail.com
o en la seccin de contacto en la pgina web www.puce.edu.ec/revistaciencia, bajo
el formato Word 2010 o inferior, acompaado de una carta dirigida al Editor de
la Revista. En dicha carta debe indicar la originalidad del trabajo y el aporte de la
investigacin. Los manuscritos sern revisados por rbitros annimos asignados
por el editor; su aprobacin estar sujeta al contenido cientfico, respaldado por
el parecer de los rbitros y la resolucin del Editor, el mismo que solicitar de los
autores realizar los cambios y sugerencias pertinentes mediante la devolucin
del documento electrnico (o del manuscrito), acompaadas de las sugerencias
respectivas.
19. informacin sobre la revista: informacin sobre la revista e instructivo

para publicacin, en el portal de la Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias
Biolgicas (REMCB) http://www.puce.edu.ec/revistaciencia.
227

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VOLUMEN XXXIV - N 1 y 2 - OCTUBRE 2013

Pontificia Universidad Catlica del Ecuador

Correccin de estilo: Alfonso Snchez

QualityPrint Ca. Ltda., Quito, Ecuador

Fotografa portada (Noche en la Estacin Cientfica Yasun): Rubn D. Jarrn E.

Pontificia Universidad Catlica del Ecuador

Rector: Dr. Manuel Corrales Pascual, S.J.

Casa de la Cultura Ecuatoriana Benjamn Carrin

Presidente: Sr. Ral Prez Torres

Sociedad Ecuatoriana de Ciencias Biolgicas, Ncleo de Pichincha

Presidente: Dr. Jaime Costales Cordero

Dr. Carlos A. Soria Proao1 (Ciencias Naturales)

Dr. Sergio Barba 1,2,3 (Medicina)

2Universidad Central del Ecuador; 3Centro mdico AXXIS, Quito

La Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biolgicas (REMCB) (ISSN 0034-9313) es un

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Estudio de gentica poblacional de Polylepis pauta y Polylepis sericea en

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Inhibicin de enterobacterias portadoras de carbapenemasas con

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INSTRUCTIVO PARA AUTORES

Instructivo para autores

El editor cientfico de la Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biolgicas quien

El volumen actual XXXIV 2013 incluye materiales relacionados con la caracterizacin

El estudio de la artritis reumatoide asocia ciertos polimorfismos genticos con la

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Dmaris P. Intriago-Balden, Mara de Lourdes Torres,

Venancio Arahana y Jos Tobar

Recibido: 24, 06, 2013; aceptado: 19, 09, 2013

Palabras claves: Capul, Prunus serotina subsp. capul, microsatlites, variabilidad

Introduccin de moscas (Orden Diptera), una especie

que las variedades cultivadas en Amrica P. serotina tiene un potencial

Los microsatlites o Short Tandem Materiales y mtodos

A cada muestra se le asign un originalmente diseados para genomas de

PceGA34 F:GAACATGTGGTGTGCTGGTT Cereza agria 10 60

(Downey e Iezzoni, 2000) R:AGCACCAGATGCACCTGA ("Sweet Cherry")

(Downey e Iezzoni, 2000) R:CAACCTGTGATTGCTCCTATTAAAC

(Testolin et al., 2000) R:TTTATGCAGTTTACAGACCG

(Testolin et al., 2000) R:TGCCATAAGGACCGGGATGT

*Este nmero se refiere a los alelos encontrados en este estudio

Anlisis de datos.- Los alelos de principales (PCoA) que permite ver la

En los 88 individuos, provenientes se agrupan de forma estricta de acuerdo

0,60 0,67 0,75 0,82 0,90

Figura 1. Dendrograma de similitud UPGMA que muestra el agrupamiento de los individuos de P.

El anlisis de coordenadas principales mayora de los individuos de Pichincha

Segn los parmetros de interpretacin En seis de los ocho pares de primers

El dendrograma de similitud UPGMA En esta investigacin se encontr