Instrucciones de Uso

TNF-alpha ELISA
Inmunoensayo enzimtico para la determinacin cuantitativa de factor
de necrosis tumoral- humano (TNF-) en suero, plasma y
sobrenadantes de cultivo celular humanos.

BE55001
96

2-8C

I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H
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INFORMACIN Y MANUAL DEL PRODUCTO

1. USO PROPUESTO 2
2. RESUMEN 2
3. PRINCIPIO DEL ENSAYO 4
4. REACTIVOS SUMINISTRADOS 5
5. INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO 5
6. TOMA DE LAS MUESTRAS Y INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO 5
7. MATERIAL REQUIRIDO PERO NO SUMINISTRADO 6
8. PRECAUCIONES DE USO 6
9. PREPARACIN DE REACTIVOS 7
10. PROTOCOLO DE ENSAYO 9
11. CALCULO DE RESULTADOS 11
12. LMITES 13
13. PRUEBAS FUNCIONALES 13
14. INFORMACIN DE PEDIDOS 16
15. RESUMEN PREPARACIN DE REACTIVOS 16
16. RESUMEN DEL PROTOCOLO 17
17 REFERENCIAS SOBRE EL PRODUCTO 18

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1. Uso Propuesto
El ELISA TNF- humano total es un inmunoensayo enzimtico para la deteccin cuantitativa del TNF-
humano.
El ELISA TNF- humano total es para el diagnstico in vitro. No debe utilizarse en los
procedimientos teraputicos.

2. Resumen
TNF- es una citocina multifuncional involucrada en distintos pasajes, en la homeostasis y en la
patofisiologa de los mamferos. Puede demostrar efectos biolgicos opuestos que sugieren mecanismos
regulatorios complejos. TNF- se detect por primera vez como un factor citotxico que produce la lisis de
ciertas clulas tumorales. El gen de TNF- es miembro 2 de la superfamilia de TNF (que consta de, al
menos, 20 miembros distintos).
La liberacin de TNF- se desencadena, principalmente, por infecciones virales y endotoxinas,
lipopolisacridos u otros componentes bacterianos, mediante el dao del tejido, el dao del ADN y por IL-1,
PDFG y el mismo TNF-. Se expresa, principalmente, en los macrfagos, pero tambin en monocitos,
neutrfilos, linfocitos citolticos naturales, mastocitos, clulas endoteliales y linfocitos activados. La
expresin de TNF- en las clulas endoteliales y los fibroblastos puede ser producida por la IL-17.
La expresin de otras citocinas, quimiocinas, intermediarios reactivos de oxgeno, xido de nitrgeno y
prostaglandinas se estimula mediante TNF-. TNF- inicialmente unido por membrana se divide en forma
enzimtica mediante TACE (= ADAM17). Los monmeros solubles se suman a los homotrmeros y se
secretan en la sangre y otros lquidos biolgicos. La forma unida por membrana y la forma soluble son
biolgicamente activas y se unen a los receptores de TNF TNFR1 ( = TNFRSF1A, p55-60) y TNFR2 ( =
TNFRSF1B, TNFBR2, p75-80).
Una vez unidos los ligandos, los receptores forman trmeros que producen cambios en su conformacin,
disociacin de protenas (SODD = silenciador de los dominios de muerte, BAG4, atangeno 4 asociado a
Bcl2) y asociacin de protenas (TRADD = la protena del dominio de muerte asociada a TNF-R1) y que
producen las siguientes actividades biolgicas:

- transcripcin de factores y protenas anti-apoptsicos involucrados en la proliferacin y la inflamacin de

las clulas a travs de la unin de TRAF2 (factor 2 asociado a TNF-R) y RIPK1 (cinasa de serina-
treonina 1 que interacta con TNF-R) y activacin del factor NF-B de la transcripcin.
- proliferacin y diferenciacin de las clulas, pero tambin apoptosis a travs de la unin de TRAF2, la
activacin de cinasas, la activacin de c-Jun y ATF2 (pasaje de JNK-MAPK).
- apoptosis a travs de la unin de FADD (protena asociada a Fas con el dominio de muerte) con
TRADD y la activacin de caspasas (incluida caspasa 8 = FLICE).
- necrosis, una muerte celular independiente de las caspasas, con mediacin de oxidasas NADPH, que
forman un complejo con TRADD y RIPK1, que produce la generacin de especies de oxgeno.

TNF-R2 no contiene dominio de muerte, pero muestra su funcin a travs de la unin directa de TRAF. En
consecuencia, las distintas funciones biolgicas de TNF- estn compuestas por la proliferacin y la
diferenciacin celular, la oncogenia, la apoptosis o muerte celular necrtica (que incluye ciertas lneas de
clulas tumorales), las actividades inmunorregulatorias, el metabolismo lipdico, la coagulacin y la funcin
endotelial. Promueve la inflamacin local o generalizada (TNF- es un pirgeno potente) y estimula la
respuesta en la fase aguda. Expresiones muy altas de TNF- despus de una infeccin pueden producir
choque septicmico (TNF- es altamente citotxico), mientras que los bajos niveles sostenidos producen
caquexia e inflamacin.

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La desregulacin de TNF- es parte de muchas enfermedades:

Cncer: Se han descrito diversas funciones de TNF- en el cncer, segn el tipo de tumor, el microentorno
tumoral y los niveles de expresin general de TNF- y la cintica de la expresin. Se propuso un modelo,
en los que niveles nicos y muy altos de TNF- causan regresin del tumor y los niveles crnicos de dosis
baja se asocian con una progresin del tumor.
Lupus eritematoso generalizado: Los modelos murinos de lupus eritematoso generalizado muestran efectos
contradictorios de TNF-: efecto anti-autoinmunitario a bajos niveles de TNF- (la administracin de TNF-
lleva a una atenuacin de los sntomas y el bloqueo de TNF- a la generacin de los sntomas de lupus
eritematoso generalizado), el efecto proinflamatorio a altos niveles de TNF- (el bloqueo de TNF- redujo la
enfermedad).
La inflamacin intestinal crnica (enfermedad de Crohn, enteropata inflamatoria, colitis ulcerosa): Se
demostr un efecto esencial de la actividad de TNF-/TNF-R1 sobre la induccin de la inflamacin intestinal
crnica. Se ha descrito una sobreexpresin de enteropata inflamatoria de TNF- en los
monocitos/macrfagos del tejido intestinal.
Psoriasis: En los pacientes con psoriasis, se demostr que TNF- aumenta en forma generalizada y en el
tejido cutneo. La expresin de TNF- en las clulas mononucleares perifricas de la sangre era muy
elevada en pacientes en fase activa de la enfermedad y elevada en el caso de la psoriasis crnica. En un
modelo animal, se demostr que la activacin dependiente de TNF- de los linfocitos T residentes era
fundamental para el desarrollo de la psoriasis.
Trastornos pulmonares (fibrosis qustica, asma): En la fibrosis qustica, se observaron altos niveles de TNF-
. TNF- se sobre expresa en un asma grave y persistente. En el asma alrgica, con una exposicin
reducida al antgeno, TNF- contribuye a la liberacin elevada de histamina. En un modelo de ratones para
estudiar el asma, la inflamacin de las vas areas se produce por la activacin mediada de TNF- de la
fosfolipasa A2.
Artritis reumatoidea, espondilitis anquilosante: TNF- tiene efectos estimulantes sobre las proteinasas que
degradan la matriz (metaloproteinasas de la matriz), la renovacin del tejido y los osteoclastos, que causan
la reabsorcin sea que produce la erosin de las articulaciones. En un modelo de ratones para estudiar la
artritis reumatoidea, se observaron niveles elevados de TNF- en la mdula sea. Las citocinas,
sintetizadas por las clulas sinoviales activadas por TNF- demostraron que provocan la artritis
reumatoidea. En los pacientes con espondilitis anquilosante, se demostr que la concentracin de TNF-
era elevada en la articulacin sacroilaca.
Trasplante (enfermedad de injerto contra el anfitrin, rechazo de aloinjerto): La medicin de los niveles de
TNF- demostr ser til en la investigacin sobre trasplantes. Se vio que TNF- era significativamente
elevado en el rechazo de aloinjerto renal. Se presentaron pruebas sobre un aumento en los niveles de
TNF- en los trasplantes de mdula sea. Los pacientes de trasplante de mdula sea que sufrieron
complicaciones relacionadas con el trasplante, como pneumonitis intersticial y enfermedad aguda del injerto
contra el anfitrin, mostraron niveles significativamente elevados de TNF- .
Ateroesclerosis, calcificacin arterial: El mayor riesgo de sufrir infarto de miocardio recurrente,
engrosamiento ateroesclertico de la ntima-media carotdea, trastornos en homeostasis de glucosa y
triglicridos y ateroesclerosis relacionada con la edad se ha relacionado con los niveles circulantes de
TNF-. Los mecanismos inducidos por TNF- causan mayor acumulacin de calcio artico en animales con
diabetes mellitus tipo 2.
Resistencia a la insulina y obesidad: En el tejido adiposo de modelos de roedores para estudiar la obesidad
y en personas con tejido adiposo, se observ el aumento de la expresin de TNF-. En el tejido adiposo y
en la resistencia a la insulina, se observ inflamacin crnica de bajo grado. Los mayores niveles de TNF-
afectan la regulacin del pasaje de insulina.
Enfermedades neurodegenerativas (esclerosis mltiple, enfermedad de Alzheimer, enfermedad prinica,
Parkinson): TNF- se produce a partir de microgliocitos activados y causa degeneracin neuronal,
apoptosis del tejido neuronal y mayor inflamacin. La administracin de TNF- caus la muerte de los
oligodendrocitos - un sntoma de la esclerosis mltiple en cocultivos con astrocitos y microglia.

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3. Principio de Ensayo
Figura 1
Los pocillos de la microplaca son recubiertos con anticuerpos
anti-TNF- humano. Micropocillos Recubiertos

Anticuerpo para el Recubrimiento

Figura 2
Primera Incubacin
El TNF- humano presente en la muestra o el estndar se une a
los anticuerpos adsorbidos en los micropocillos. Se agrega un
anticuerpo anti-TNF- humano conjugado a biotina que se une al
TNF- humano capturado por los primeros anticuerpos.

Estndar o Muestra

Conjugado Biotina

Figura 3
Segunda Incubacin
Despus de la incubacin se elimina el anticuerpo anti-TNF-
humano conjugado a biotina no unido mediante una etapa de
lavado. Se agrega una solucin de estreptavidina-peroxidasa de
rbano qui se une al anticuerpo anti-TNF- humano conjugado a
biotina.

-
Estreptavidina-HRP

Figura 4
Tercera Incubacin
Despus de la incubacin se elimina la estreptavidina-HRP no
unida mediante una etapa de lavado y se agrega una solucin de
Substrato reactiva a Enzima Peroxidasa a los pocillos.

Substrato

Figura 5
Se forma un producto de color proporcional a la cantidad del
TNF- presente en la muestra o el estndar. La reaccin es
terminada por la adicin de cido y la absorbancia se mide a
450 nm. Se prepara una curva estndar a partir de 7 diluciones
estndar de TNF- humano y se determina la concentracin de
TNF- humano en la muestra.
Substrato Reaccionado

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4. Reactivos Suministrados
1 bolsa de aluminio con una Placa de Micropocillos recubiertos con anticuerpos monoclonales
anti-TNF- humano.
1 vial (70 L) de Conjuguado de Biotina (anticuerpos policlonales anti-TNF- humano)
1 vial (150 L) con Estreptavidina-HRP
2 viales de Estndar TNF- humano liofilizados, 3000 pg/mL despus de la reconstitucin
1 vial del Control alto, liofilizado
1 vial del Control bajo, liofilizado
1 vial (12 mL) de Diluyente de Muestras
1 vial (5 mL) de Solucin Buffer de Ensayo Concentrado 20x
(PBS con 1 % de Tween 20 y BSA al 10 %)
1 frasco (50 mL) de Solucin Buffer de Lavado Concentrado 20x
(PBS con 1 % de Tween 20)
1 vial (15 mL) de Solucin de Substrato (tetrametil-benzidina)
1 vial (15 mL) de Solucin de Parada (1M Acido Fosfrico)
4 Tapas para placas, Adhesivas

5. Instrucciones de Almacenamiento
Conservar los reactivos del juego de reactivos a una temperatura comprendida entre 2 C y 8 C. Conservar
los controles liofilizados a -20 C. Inmediatamente despus de utilizarlos deber volver a conservar los
reactivos a dicha temperatura fra (2 C y 8 C) y los controles a -20 C. En las etiquetas figuran las fechas
de caducidad del juego de reactivos y de los reactivos.
Slo se podr garantizar la fecha de caducidad de los componentes del juego de reactivos si se le
conservan adecuadamente y si, en caso de uso reiterado de un mismo componente, el reactivo no queda
contaminado en la primera manipulacin.

6. Toma de las Muestras y Instrucciones de Almacenamiento

Sobrenadantes de cultivos celulares, suero y plasma (EDTA, citrato, heparina) fueron probados con este
ensayo. Otras muestras biolgicas pueden ser adecuadas para su uso en el ensayo. Separar el suero o
plasma del cogulo o de las clulas lo antes posible despus de la coagulacin y separacin.

Prestar atencin a un "Efecto Gancho" posible debido a la alta concentracin de las muestras
(ver captulo 11).

Las muestras que contienen un precipitado visible deben ser aclararadas antes de su uso en el ensayo. No
utilizar muestras altamente hemolizadas o lipmicas.

Las muestras deben ser alcuotadas y se debe congeladar a -20 C para evitar la prdida de TNF-
humano bioactivo. Si se van a usar las muestras dentro de las 24 horas, se pueden almacenar ente 2 C y
8 C (para la estabilidad de la muestra consulte el cpitulo 13.5).
Evite ciclos repetidos de congelacin-descongelacin. Antes del ensayo, la muestra congelada debe
alcanzar lentamente la temperatura ambiente y ser mezclada suavemente.

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7. Material Requirido Pero No Suministrado

- Pipetas graduadas de 5 mL y 10 mL
- Micropipetas monocanales de 5 L a 1000 L con puntas desechables
- Micropipetas multicanales de 50 L a 300 L con puntas desechables
- Depsito para micropipetas multicanales
- Vasos de precipitados, matraz, probeta, necesarios para la preparacin de reactivos
- Frasco lavador, sistema automatizado o semi-automatizado de lavado de placas de microtitulacin
- Fotmetro para placas de microtitulacin capaz de leer absorbancias a 450 nm
(opcional: 620 nm longitud de onda de referencia)
- Agua bidestilada o deionizada en un recipiente de vidrio
- Programa estadstico informtico para llevar a cabo un anlisis de regresin

8. Precauciones de Uso
- Todos los productos qumicos deben considerarse potencialmente peligrosos. Por lo tanto,
recomendamos que este producto sea manipulado nicamente por aquellas personas que hayan sido
entrenadas en tcnicas de laboratorio y que sea usado de acuerdo con los principios de buenas
prcticas de laboratorio. Se debe llevar ropa de proteccin apropiada como puedan ser las batas de
laboratorio, gafas de seguridad y guantes. Se debe trabajar con cuidado para evitar cualquier contacto
con piel y ojos. En el caso de que tenga lugar un contacto con piel u ojos, proceder de forma inmediata
a lavar la parte afectada con abundante agua. Vase la(s) hoja(s) de seguridad y/o declaraciones de
seguridad para recomendaciones especficas.
- Los reactivos estn destinados para un uso en diagnstico in vitro y no se deben usar en
procedimientos teraputicos.
- No mezclar o sustituir los reactivos por los equivalentes de otros lotes u otras fuentes.
- No usar reactivos caducados.
- No exponer los reactivos del kit a una luz intensa durante su almacenamiento o incubacin.
- No pipetear con la boca.
- No se recomienda comer o fumar en las zonas donde se manipulen muestras o reactivos.
- Evitar el contacto de los reactivos del kit o de las muestras con piel o mucosas.
- Se recomienda el uso de guantes desechables de goma o ltex durante la manipulacin de las
muestras y reactivos.
- Evitar el contacto de la solucin de substrato con agentes oxidantes y metales.
- Evitar salpicaduras y la generacin de aerosoles.
- Con el propsito de evitar una contaminacin microbiolgica o contaminaciones cruzadas de reactivos y
muestras que puedan invalidar el test se recomienda el uso de pipetas y/o puntas de pipetas de un solo
uso.
- Usar recipientes limpios y especficos de reactivos para la dispensacin de reactivos de sustrato.
- La exposicin a los cidos inactiva el conjugado.
- Se debe usar agua destilada o desionizada en la preparacin de los reactivos.
- La solucin de substrato debe de estar a temperatura ambiente antes de su uso.
- Descontaminar y disponer las muestras y todos los materiales potencialmente contaminados como si
pudieran contener agentes infecciosos. El mtodo preferente de descontaminacin es un autoclavado
durante un mnimo de 1 hora a 121.5 C.
- Los residuos lquidos que no contengan cido y los residuos neutralizados pueden ser mezclados con
hipoclorito sdico en volmenes tales que la mezcla final contenga 1.0 % de hipoclorito sdico. Dejar
actuar durante 30 minutos para una efectiva descontaminacin. Los residuos lquidos que contengan
cido deben ser neutralizados previamente a la adicin de hipoclorito sdico.

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9. Preparacin de los Reactivos

Las Solucines de Buffer Concentradas deben de alcanzar la temperatura ambiente y ser diludas antes
de iniciar el procedimiento del ensayo. Si en las Solucines de Buffer Concentradas se han formado
cristales, caliente suavemente hasta su completa disolucin.

9.1. Solucin Buffer de Lavado (1x)

Vierta todo el contenido (50 mL) de la Solucin Buffer de Lavado Concentrada (20x) en un matraz
aforado de 1000 mL limpio. Enrase en matraz con agua destilada o desionizada. Mezcle suavemente para
evitar la formacin de espuma.
Transfiera la solucin a un frasco de lavado limpio y consrvela a una temperatura entre 2 C y 25 C. La
Solucin Buffer de Lavado (1x) permanece estable durante 30 das
En funcin de la cantidad que vaya a necesitar, prepare la Solucin Buffer de Lavado (1x) de acuerdo a la
siguiente tabla:
Nmero de Tiras Solucin Buffer de Lavado Concentrada (20x) (mL) Agua Destilada (mL)
1-6 25 475
1 - 12 50 950

9.2. Solucin Buffer de Ensayo (1x)

Vierta todo el contenido (5 mL) de la Solucin Buffer de Ensayo Concentrada (20x) en un matraz limpio
aforado de 100 mL. Enrase en matraz con agua destilada o desionizada aun volumen final de 100 mL.
Mezcle suavemente para evitar la formacin de espuma.
Conserve la solucin a una temperatura de entre 2 C y 8 C. La Solucin Buffer de Ensayo permanece
estable durante 30 das.
En funcin de la cantidad que vaya a necesitar, prepare la Solucin Buffer de Ensayo (1x) de acuerdo a la
siguiente tabla:
Nmero de Tiras Solucin Buffer de Ensayo Concentrada (20x) (mL) Agua Destilada (mL)
1-6 2.5 47.5
1 - 12 5.0 95.0

9.3. Preparacin de Conjugado de Biotina

Utilice el Conjugado de Biotina antes de transcurridos 30 minutos desde su dilucin.
Justo antes de utilizar el Conjugado de Biotina, se debe diluirlo en una proporcin de 1:100 con la
Solucin Buffer de Ensayo (1x) en un tubo de ensayo de plstico limpio.
En funcin de la cantidad que vaya a necesitar, prepare el Conjugado de Biotina de acuerdo a la siguiente
tabla:
Nmero de Tiras Conjugado de Biotina (mL) Solucin Buffer de Ensayo (1x) (mL)
1-6 0.03 2.97
1 - 12 0.06 5.94

9.4. Estreptavidina-HRP
Utilice la Estreptavidina-HRP antes de transcurridos 30 minutos desde su dilucin.
Justo antes de utilizar la solucin concentrada de Estreptavidina-HRP, se debe diluirlo en una proporcin
de 1:100 con la Solucin Buffer de Ensayo (1x) en un tubo de ensayo de plstico limpio.
En funcin de la cantidad que vaya a necesitar, prepare la Estreptavidina-HRP de acuerdo a la siguiente
tabla:
Nmero de Tiras Estreptavidina-HRP (mL) Solucin Buffer de Ensayo (1x) (mL)
16 0.06 5.94
1 - 12 0.12 11.88

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9.5. Estndar TNF- Humano

Reconstituir el Estndar TNF- humano aadiendo agua destilada.
El volumen de reconstitucin est indicado en la etiqueta del vial del estndar. Girar o mezclar
cuidadosamente para garantizar una solubilizacin completa y homognea (concentracin del estndar
reconstituido = 3000 pg/mL). Permitir que el estndar reconstituido se asiente durante 10-30 minutos.
Mezclar bien previamente a realizar las diluciones.
Tras su uso los restos del estndar no pueden ser almacenados y deben ser descartados.
Las diluciones estndares pueden ser preparadas directamente en la placa multipocillo (vase 10.c) o
alternativamente en tubos (vase 9.5.1).

9.5.1. Dilucin Estndar Externa

Rotular 7 tubos, uno para cada curva estndar.

S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7.

Acto seguido, preparar diluciones seriadas 1:2 para la curva estndar como se indica a continuacin:
Pipetear 225 L de Diluyente de Muestras a todos los tubos.
Pipetear 225 L de estndar reconstituido (concentracin del estndar = 3000 pg/mL) en el primer tubo,
etiquetado como S1, y mezclar (concentracin del estndar 1 = 1500 pg/mL).
Pipetear 225 L de esta dilucin en el segundo tubo, etiquetado como S2, y mezclar completamente antes
de la siguiente transferencia. Repetir la serie de diluciones 5 veces ms de manera que se obtengan los
diferentes puntos de la curva estndar (vase figura 6).

El Diluyente de Muestras sirve como blanco.

Figura 6
Transferir 225 L

S1 S2 S3 S4 - S7

TNF- Humano Diluyente de Muestras Descartar

Estndar Reconstituido 225 L 225 L

9.6. Controles
Solubilizar aadiendo 500 L de agua destilada al controles liofilizados. Permitir que il controles liofilizados
se asiente durante 10-30 minutos. Mezclar bien previamente a realizar las diluciones. Vortear
concienzudamente para asegurar una solubilizacin homognea y completa. A partir de aqu, tratar il
controles de la misma forma que las muestras. El rango del control viene indicado en el certificado de
calidad y en la etiqueta del vial. Almacenar il controles reconstituidos y alicuotado a -20 C. Evitar ciclos
repetidos de congelacin y descongelacin.

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10. Protocolo de Ensayo

a. Determine el nmero de tiras necesarias para analizar el nmero deseado de muestras y
adems aada las tiras para blancos y estndares (de color). Cada muestra, estndar, blanco y la
muestra de control opcional deben ser analizadas por duplicado. Retire del soporte las tiras
sobrantes y consrvelas, junto con el desecante suministrado en una bolsa metalizada y
cerrada hermticamente, a una temperatura de 2-8 C.

b. Lave las tiras 2 veces con aproximadamente 400 L de Solucin Buffer de Lavado por cada
pocillo, aspirando completamente el contenido de los pocillos entre cada lavado. Permitir que la
Solucin Buffer de Lavado permanezca en los pocillos durante 10-15 segundos antes de su
aspiracin. Evite rayar la superficie de los pocillos.
Tras el ltimo lavado, golpee suavemente las tiras contra un papel absorbente o una toallita de
papel para eliminar el exceso de tampn de lavado. Utilice las tiras inmediatamente despus de
lavadas o bien colquelas boca abajo sobre un papel absorbente hmedo durante como mximo
15 minutos. No deje secar los pocillos.

c. Dilucin Estndar en la placa de microtitracin

(Alternativamente, la dilucin estndar puede ser preparada en tubos vase 9.5.1)
Aadir 100 L de Diluyente de Muestras en duplicado a todos los pocillos estndar.
Pipetear 100 L de estndar preparado (vase Preparacin del Estndar 9.5,
concentracin = 3000 pg/mL) por duplicado en los pocillos A1 y A2 (vase Tabla 1). Mezclar el
contenido de los pocillos A1 y A2 por repetidas aspiraciones y expulsiones del contenido con la
pipeta (concentracin del estndar 1, S1 = 1500 pg/mL), y transferir 100 L a los pocillos B1 y B2,
respectivamente. (vase Figura 7). Cuidar de no rascar la superficie interior de los micropocillos con
la punta de la pipeta. Continuar este procedimiento 5 veces, formando dos filas de diluciones
estndar del TNF- humano ordenadas desde 1500.0 a 23 pg/mL. Descartar 100 L de los
contenidos de los ltimos micropocillos (G1, G2) usados.

Figura 7

Transferir 100 L

S1 S2 S3 S4 - S7

TNF- Humano Diluyente de Muestras Descartar

Estndar Reconstituido 100 L 100 L

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En caso de una dilucin estndar externa (vase 9.5.1), pipetear 100 L de estas diluciones estndares
(S1-S7) en los pocillos estndares correspondientes de acuerdo con la Tabla 1.

Tabla 1
Tabla describiendo un ejemplo de la disposicin de los blancos, estndares y muestras en las tiras
de los micropocillos
1 2 3 4
Estndar 1 Estndar 1
A Muestra 1 Muestra 1
(1500 pg/mL) (1500 pg/mL)
Estndar 2 Estndar 2
B Muestra 2 Muestra 2
(750 pg/mL) (750 pg/mL)
Estndar 3 Estndar 3
C Muestra 3 Muestra 3
(375 pg/mL) (375 pg/mL)
Estndar 4 Estndar 4
D Muestra 4 Muestra 4
(188 pg/mL) (188 pg/mL)
Estndar 5 Estndar 5
E Muestra 5 Muestra 5
(94 pg/mL) (94 pg/mL)
Estndar 6 Estndar 6
F Muestra 6 Muestra 6
(47 pg/mL) (47 pg/mL)
Estndar 7 Estndar 7
G Muestra 7 Muestra 7
(23 pg/mL) (23 pg/mL)

H Blanco Blanco Muestra 8 Muestra 8

d. Aadir 100 L de Diluyente de Muestras en duplicado a los pocillos del blanco.

e. Aadir 50 L de cada Diluyente de Muestras a los pocillos con la muestra.
f. Aadir 50 L de cada muestra en duplicado a los pocillos designados.
g. Prepare el Conjugado de Biotina (vase la preparacin del Conjugado de Biotina 9.3)
h. Aada 50 L el Conjugado de Biotina a todos los pocillos.
i. Cubra la placa con una tapa e incbela a temperatura ambiente (18-25 C) durante 2 horas en un
agitador mecnico a 400 rpm, si es posible.
j. Prepare Estreptavidina-HRP (vase la preparacin de estreptavidina-HRP 9.4).
k. Retire la tapa y vace los pocillos. Lavar los micropocillos de las tiras 6 veces de acuerdo al
punto b del protocolo del test. Proseguir inmediatamente despus al prximo paso.
l. Aada 100 L de Estreptavidina-HRP diluida a todos los pocillos, incluidos los del blanco.
m. Cubra la placa con una tapa e incbela a temperatura ambiente (18-25 C) durante 1 hora en un
agitador mecnico a 400 rpm, si es posible.
n. Retire la tapa y vace los pocillos. Lavar los micropocillos de las tiras 6 veces de acuerdo al
punto b del protocolo del test. Proseguir inmediatamente despus al prximo paso.
o. Pipetee 100 L de Solucin de Substrato TMB y virtalos en todos los pocillos.
p. Incube las tiras de microtitracin a temperatura ambiente (18-25 C) durante aproximadamente
10 minutos. Evite la exposicin directa a la luz intensa.
Deben monitorizarse los valores DO de la placa para detener la reaccin del substrato
(vase el siguiente punto de este protocolo) antes de que deje de ser posible registrar
correctamente los pocillos positivos.
La determinacin del tiempo adecuado para el desarrollo del color, debe realizarse de
forma individual para cada ensayo.

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Se recomienda aadir la solucin de parada cuando el estndar ms alto presente un color azul
oscuro. Alternativamente el desarrollo de color puede ser monitorizado con un lector de placas de
ELISA a 620 nm. La reaccin del substrato debera ser parada cuando el Estndar 1 alcance una
DO entre 0.9 y 0.95.
q. Detenga la reaccin enzimtica pipeteando rpidamente 100 L de la Solucin de Parada en cada
pocillo, incluidos los del blanco. Es importante dispensar la Solucin de Parada de forma rpida y
uniforme en todos los pocillos para inactivar totalmente la enzima. Los resultados deben leerse
inmediatamente despus de aadir la solucin de parada o, como mximo, en el plazo de 1 hora si
las tiras se conservan a una temperatura entre 2-8 C en un lugar oscuro.

r. Lea la absorbancia de cada pocillo en un espectrofotmetro utilizando 450 nm como longitud de

onda principal (opcionalmente 620 nm como longitud de onda de referencia; los valores
comprendidos entre 610 nm y 650 nm son aceptables). Utilizar los pocillos de blanco para medir el
blanco del lector de placas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Determine la
absorbancia de las muestras y de los estandares.

Nota: En caso de incubar sin agitar, los valores de D.O. pueden ser inferiores a los indicados ms
abajo. De todas formas los resultados siguen siendo vlidos.

11. CALCULO DE RESULTADOS

- Calcular los valores de absorbancia media para cada conjunto de duplicados de los estndares y
muestras. Los duplicados deben estar dentro del 20 por ciento del valor medio.
- Construir una curva estndar mediante la representacin de la absorbancia media obtenido para cada
estndar frente a la concentracin de TNF- humano con el valor de absorbancia en el eje-y y la
concentracin en el eje-x. Se logra un buen ajuste con 5 Parameter Logistics.
- Para determinar la concentracin de la TNF- humano circulante para cada muestra, primero encontrar
el valor de absorbancia media en la ordenada y extender una lnea horizontal a la curva estndar. En el
punto de interseccin, extender una lnea vertical al eje de abscisas y leer la concentracin del TNF-
humano.
- Si se han seguido las instrucciones de este protocolo, se han diluido 1:2 las muestras (50 L de
muestra + 50 L de Diluyente de Muestras), la concentracin leda a partir de la curva estndar se
debe multiplicar por el factor de dilucin (2x).
- Clculo de las muestras con una concentracin superior al estndar 1, puede dar lugar a
concentraciones incorrectas, bajas en TNF- humano. Estas muestras requieren ms predilucin
externa segn los valores esperados de TNF- humano con el Diluyente de Muestras para
cuantificar con precisin la concentracin real de TNF- humano.
- Se recomienda que cada centro de pruebas establece una muestra de control con concentraciones
conocidas de TNF- humano y se ejecuta este control adicional con cada ensayo. Si los valores
obtenidos no estn dentro del intervalo esperado del control, los resultados del anlisis pueden ser no
vlidos.
- En la figura 8 se muestra una representativa curva estndar. Esta curva no se puede utilizar para
obtener resultados de las pruebas. Cada laboratorio debe preparar una curva estndar por cada grupo
de tiras ensayadas.

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Figura 8
Representativa curva estndar para el ELISA TNF- humano. Se diluy el TNF- humano en serie de 2
etapas en la Diluyente de Muestras. No use esta curva estndar para obtener resultados de las pruebas. Se
debe ejecutar una curva estndar para cada grupo de tiras ensayadas.

Tabla 2
Datos tpicos del ELISA TNF- humano
Longitud de onda: 450 nm
Longitud de onda de referencia: 620 nm

Concentracin
D.O. D.O. C.V.
Estndar TNF- humano
(450 nm) Media (%)
(pg/mL)
1 1500 2.312 2.295 0.7
2.278
2 750 1.304 1.309 0.4
1.314
3 375 0.768 0.744 3.3
0.720
4 188 0.424 0.420 0.8
0.417
5 94 0.291 0.284 2.7
0.276
6 47 0.190 0.180 5.5
0.170
7 23 0.147 0.146 1.0
0.145
Blanco 0 0.090 0.091 1.4
0.092

Los valores de DO de la curva estndar pueden variar segn las condiciones de la realizacin del ensayo
(por ejemplo empleados del laboratorio, tcnica de pipeteo, tcnica de lavado o efectos de la temperatura).
Por otra parte el almacenamiento del equipo puede afectar la actividad enzimtica y por tanto la intensidad
de color. Los valores medidos siguen siendo vlidas.

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12. LMITES

- Dado que las condiciones exactas pueden variar de un ensayo a otro ensayo, se debe crear una curva
estndar para cada prueba.
- La contaminacin de las muestras o los reactivos por bacterias o hongos, o una contaminacin cruzada
entre los reactivos puede dar resultados errneos.
- Se debe utilizar preferiblemente puntas de pipeta desechables, matraz de vidrio o frascos de vidrio. Los
frascos de vidrio reutilizables deben ser lavados antes de su uso y todos los productos de limpieza ser
eliminados por un enjuague minucioso.
- Un lavado incorrecto o inadecuado durante cada paso del procedimiento de ensayo puede conducir a
resultados errneos ya sea falsos positivos o falsos negativos. Vaciar los pocillos completamente antes
de pipetear la Solucin de Lavado fresca. Pipetear la Solucin Buffer de Lavado en los pocillos como se
especifica para cada ciclo de lavado y no deje que los pocillos estn no cubiertos durante mucho tiempo
o que se secan.
- Por la aplicacin de radioinmunoterapia, el nmero de pacientes con los anticuerpos humanos IgG
antiratn (HAMA) ha aumentado significativamente. HAMA puede interferir en ensayos que utilicen
anticuerpos monoclonales murinos, y dar lugar a resultados tantos falsos positivos como falsos
negativos. Muestras de suero que contienen anticuerpos contra inmunoglobulinas murinas pueden
todava ser ensayadas en ensayos de este tipo si se aaden inmunoglobulinas murinas (suero, lquido
asctico o anticuerpos monoclonales no especficos) a la muestra.

13. Pruebas Funcionales

13.1. Sensibilidad
El lmite de deteccin de TNF- humano definido como la concentracin del analito resultando en una
absorcin significativamente ms alta que la del medio de dilucin (media ms dos desviaciones estndar),
se determin de ser 5.0 pg/mL (media de 6 ensayos independientes).

13.2. Recuperacin

13.2.1. Intra-ensayo
La recuperacin del intra-ensayo se evalu en tres experimentos independientes. Cada ensayo se llev a
cabo con 6 repeticiones de 8 muestras de suero que contienen diferentes concentraciones de TNF-
humano. Se llevaron a cabo dos curvas de estndar en cada placa. Los datos a continuacin muestran la
concentracin media de TNF- humano y el coeficiente de variacin para cada muestra (ver Tabla 3).
El calculado coeficiente de variacin intra-ensayo total fue del 7.7 %.

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Tabla 3
La concentracin media de TNF- humano y el coeficiente de variacin para cada muestra
Concentracin Media Coefficiente de
Muestra Experimento
TNF- humano (pg/mL) Variacin (%)
1 1 5328 6.6
2 4990 9.4
3 5474 3.4
2 1 4818 6.4
2 4149 9.9
3 4558 11.3
3 1 3523 12.2
2 2967 5.3
3 3478 5.7
4 1 2236 5.1
2 2207 2.8
3 2381 5.9
5 1 1528 6.7
2 1379 11.6
3 1310 8.4
6 1 889 2.0
2 805 9.0
3 827 7.4
7 1 607 14.9
2 492 8.2
3 507 7.3
8 1 216 6.3
2 286 10.7
3 267 8.0

13.2.2. Inter-ensayo
La recuperacin inter-ensayo dentro de un laboratorio se evalu en tres experimentos independientes.
Cada ensayo se llev a cabo con 6 repeticiones de 8 muestras de suero que contienen diferentes
concentraciones de TNF- humano. Dos curvas de calibracin se realizaron en cada placa. Los datos a
continuacin muestran la concentracin media de TNF- humano y el coeficiente de variacin calculado en
18 determinaciones de cada muestra (ver Tabla 4). El coeficiente de variacin total calculado de inter-
ensayo fue del 8.1 %

Tabla 4
La concentracin media de TNF- humano y el coeficiente de variacin para cada muestra
Concentracin Media de Coefficiente de
Muestra
TNF- humano (pg/mL) Variacin (%)
1 5264 4.7
2 4508 7.5
3 3323 9.3
4 2275 4.1
5 1405 7.9
6 840 5.2
7 535 11.7
8 256 14.0

13.3. Recuperacin despus del Enriquecimiento

La recuperacin del enriquecimiento fue evaluada enriqueciendo cuatro niveles de TNF- humano en
muestras combinadas de suero normal. Las recuperaciones se determinaron en tres experimentos
independientes con 6 repeticiones cada uno. El suero no enriquecido sirv como blanco en estos
experimentos. La recuperacin vari entre 76 % a 115 % con una recuperacin total media de 90 %.
Las recuperaciones dependen del suero utilizado.
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13.4. Dilucin en Paralelo

Se analizaron 4 muestras de suero con diferentes concentraciones de TNF- humano mediante 2
diluciones en serie con 4 repeticiones cada uno.
La recuperacin vari entre 97.1 % a 128.6 %, con una recuperacin total de 112.7 % (ver Tabla 5).

Tabla 5
Concentracin Concentracin Recuperacin de
Muestra Dilucin Expectada de TNF- Observada TNF- Concentracin
humano (pg/mL) humano (pg/mL) Expectada (%)
1:2 - 4937 -
1:4 2469 2996 121.4
1
1:8 1498 1781 118.9
1:16 890 975 109.5
1:2 - 4590 -
1:4 2295 2925 127.5
2
1:8 1463 1582 108.2
1:16 791 1017 128.6
1:2 - 5986 -
1:4 2993 3442 115.0
3
1:8 1721 1751 101.8
1:16 876 969 110.6
1:2 - 5550 -
1:4 2775 3119 112.4
4
1:8 1560 1514 97.1
1:16 757 766 101.2
Las recuperaciones dependen del suero utilizado.

13.5. Estabilidad de Muestras

13.5.1. Estabilidad Congelacin - Descongelacin

Alcuotas de las muestras de suero (enriquecidas o no enriquecidas) fueron almacenadas a -20 C y
posteriormente descongeladas hasta 5 veces, y se determin las concentraciones del TNF- humano. Se
detect una disminucin significativa de la inmunoreactividad de TNF- humano. Por consiguiente, las
muestras deben almacenarse en partes iguales a -20 C y descongelarse solo una vez.

13.5.2. Estabilidad de Almacenamiento

Alcuotas de las muestras de suero (enriquecidas o no enriquecidas) fueron almacenadas a -20 C, 2-8 C,
temperatura ambiente (TA) y a 37 C, y la concentracin de TNF- humano fue determinada despus de
las 24 horas. No se detect una prdida significativa de la inmunoreactividad del TNF- humano durante el
almacenamiento a -20 C,y a 2-8 C.
Una prdida significativa de la inmunoreactividad de la TNF- humano fue detectado durante el
almacenamiento a temperatura ambiente (TA) y a 37 C despus de las 24 h.

13.6. Especificidad
El ensayo no solo detecta TNF- humano natural sino tambin TNF- humano recombinante. La
interferencia de factores circulantes del sistema inmune fue evaluada por enriquecer estas protenas a
concentraciones fisiolgicamente relevantes en un suero positivo de TNF- humano. No se detectaron
interferencias, especficamente no con TNF-R (60 kDa y 80 kDa).

13.7. Valores Esperados

Se ensayaron grupos de 40 muestras de suero provenientes de donantes seleccionados al azar,
aparentemente sanos (hombres y mujeres) para TNF- humano. No se encontr concentraciones
detectables de TNF- humano en los donantes sanos. Concentraciones elevados de TNF- humano
dependen del tipo de trastorno inmunolgico.

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14. INFORMACIN DE PEDIDOS

Para los pedidos pngase en contacto con:

Vase la ltima pgina.

Para preguntas tcnicas comunquese con:

e-mail: IBL@IBL-International.com
www.IBL-International.com

15. Resumen: Preparacin de Reactivos

15.1. Solucin Buffer de Lavado (1x)

Aadir 50 mL de la Solucin Buffer de Lavado Concentrado (20x) a 950 mL de agua destilada.

Nmero de Solucin Buffer de Lavado Agua Destilada

Tiras Concentrada (mL) (mL)
1-6 25 475
1-12 50 950

15.2. Solucin Buffer de Ensayo (1x)

Aadir 5 mL Solucin Buffer de Ensayo Concentrada (20x) a 95 mL de agua destilada.

Nmero de Solucin Buffer de Ensayo Agua Destilada

Tiras Concentrada (mL) (mL)
1-6 2.5 47.5
1-12 5.0 95.0

15.3. Conjugado de Biotina

Hacer una dilucin 1:100 del Conjugado de Biotina en la Solucin Buffer de Ensayo (1x):

Nmero de Tiras Conjugado de Biotina (mL) Solucin Buffer de Ensayo (1x) (mL)
1-6 0.03 2.97
1-12 0.06 5.94

15.4. Estreptavidina-HRP
Hacer una dilucin 1:100 del Estreptavidina-HRP en la Solucin Buffer de Ensayo (1x):

Nmero de Tiras Conjugado de Biotina (mL) Solucin Buffer de Ensayo (1x) (mL)
1-6 0.06 5.94
1-12 0.12 11.88

15.5. Estndar TNF- Humano

Reconstituir el estndar liofilizado TNF- humano con agua destilada.
(El volumen de reconstitucin se indica en la etiqueta del frasco estndar.)

15.6. Controles
Aadir 500 L de agua destilada a los controles liofilizados.

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16. Resumen de Protocolo de Ensayo

1. Determinar el nmero requirido de tiras de la placa de microtitulacin.

2. Lavar las tiras de la placa de microtitulacin dos veces con Solucin Buffer de Lavado.

3. Dilucin estndar en la placa de microtitracin: Aadir 100 L de Diluyente de Muestras,

por duplicado, a todos los pocillos estndar. Pipetear 100 L de estndar preparado en los primeros
pocillos y crear diluciones estndar mediante la transferencia de 100 L de pocillo a pocillo.
Deseche 100 L de los ltimos pocillos.
Alternativamente dilucin estndar externa en tubos (ver 9.5.1): Pipetear 100 L de estas diluciones
estndares en las tiras de los micropocillos.
4. Aadir 100 L de Diluyente de Muestras, por duplicado, a los pocillos blancos.

5. Aadir 50 L de Diluyente de Muestras a los pocillos de muestra.

6. Aadir 50 L de muestras por duplicado a los pocillos respectivos.

7. Preparar el Conjugado de Biotina.

8. Aadir 50 L de Conjugado de Biotina a todos los pocillos.

9. Cubrir las tiras e incubar 2 horas a temperatura ambiente (18-25 C).

10. Preparar Estreptavidina-HRP.

11. Vaciar y lavar los pocillos 6 veces con Solucin Buffer de Lavado.

12. Aadir 100 L de la Estreptavidina-HRP diluida a todos los pocillos.

13. Cubrir las tiras e incubar 1 hora a temperatura ambiente (18-25 C).

14. Vaciar y lavar los pocillos 6 veces con Solucin Buffer de Lavado.

15. Aadir 100 L de Solucin Substrato TMB a todos los pocillos.

16. Incubar las tiras para approximadamente 10 minutos a temperatura ambiante (18-25 C).

17. Aadir 100 L de Solucin de Parada a todos los pocillos.

18. Ajustar el fotmetro y medir la absorbancia a 450 nm.

Nota: Si han seguido las instrucciones en este protocolo las muestras han sido diluidas 1:2
(50 L de muestra + 50 L de Diluyente de Muestras), la concentracin leda de la curva estndar
debe ser multiplicada por el factor de dilucin (x 2).

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17. REFERENCIAS SOBRE EL PRODUCTO

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blockade: an inflammatory issue. Ernst.Schering.Res Found.Workshop 2006; 161-186
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18:343-349.

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 Symbols / Symbole / Symbles / Smbolos / Smbolos /

REF Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N. Cat.: / N.Cat.: / -.:

LOT Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.: / Lotto n.: / -:
Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser : / Usado por: / Usar at: / Da utilizzare entro: /
:
No. of Tests: / Kitgre: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N. de Testes: / Quantit dei tests: /
:
CONC Concentrate / Konzentrat / Concentr / Concentrar / Concentrado / Concentrato /
LYO Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilis / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato /
In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Mdical pour Diagnostics In
IVD Vitro. / Dispositivo Mdico para Diagnstico In Vitro. / Equipamento Mdico de Diagnstico In
Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / In-Vitro .
Evaluation kit. / Nur fr Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour valuation. / Juego de Reactivos
para Evaluaci. / Kit de avaliao. / Kit di evaluazione. / .
Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. /
Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instrues antes de usar. / Leggere le istruzioni
prima delluso. / .
Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schtzen. /
Garder labri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Mantngase alejado del calor o la
luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. /
.
Store at: / Lagern bei: / Stocker : / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: /
:
Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / :
Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaucin! / Cuidado! / Attenzione! / !
Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED.
Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben.
Voir MATERIEL FOURNI pour les symbles des composants du kit.
Smbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS.
Para smbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS.
Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT.
.

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