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HPLC

PRINCIPE
Vient du terme anglais High Performance LiquidChromatography communement appelee HPLC L'HPLC n'est pas une
nouvelle technique, elle repose sur la mme base que la chromatographie conventionnelle dite basse pression.
Les performances, en termes de slectivit et de rsolution, se sont trouvees grandement ameliorees par la
miniaturisation et lutilisation de phases stationnaires trs labores.

Ces phases S constitues de :


particules spheriques O 2 a 5 m
Materiauxmonolithiques poreux
Perte de charge >>>
Il faut donc exercer sur la phase mobile une forte pression pour obtenir un debit convenable

L' HPLC est l'aboutissement des progrs de l'instrumentation et de la technologie en ce sens qu'elle s'utilise avec :
Des pressions de pompage leves
Des colonnes de microparticules qui minimisent le temps des cintiques d'absorption et de dsorption des
molcules, tout en augmentant le debit de la phase mobile
Le systeme comprend differents modules generalement pilotes par microprocesseurs et informatises

Ces modules sont relies entre eux par lintermediaire de canalisations de trs faible diamtre interne (0,1 mm) pour
assurer la circulation de la phase mobile. Elles peuvent etre :
En acier inoxydable
PEEKR (ou polyether-etherketone), un
polymere souple et colore qui resiste aux
solvants usuels, meme sous des pressions
elevees (350 bars)
Le systeme comprend differents modules generalement pilotes par microprocesseurs et informatises

1-Pompe
Toute installation de CLHP comporte au moins une pompe pour forcer le passage de la phase mobile a
travers la colonne dont le remplissage est tres compact :
Pression importante au niveau de linjecteur. Celle-ci peut atteindre 40 000 kPa (400 bars)
P depend du dbit & viscosit de m
P depend de la nature de la s
Concues pour maintenir un dbit non puls et stable, meme si la composition de la phase mobile varie
Ces pompes debitmetriques comportent generalement deux pistons en serie fonctionnant en opposition pour eviter les interruptions de
debit dues au remplissage du cylindre

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m
m : La presence de gaz ambiants (N2, O2, CO2...), dissous en quantite non negligeable, peut perturber les sparations
par :
modification de la compressibilite des eluants
formation de bulles
O2 la duree de vie des colonnes et est genant pour les detecteurs electrochimiques ou
photometriques UV

Dgazage des solvants par :


Ultrasons (15 mn)
Barbotage dhelium
En ligne : Diffusion en les faisant passer dans un long tube de petit diametre en polymere permeable
aux gaz

2- PhaseMobile
Les solutions tampons doivent etre filtrees a travers une membrane 45 m

m: Doit etre claire et homogene sans particules ou impurets :


m: Toujours utiliser un filtre de succion :
Pour eviter que des particules atteignent la pompe, les crepines regulierement nettoyees par les ultrasons dans
lisopropanol ou par une solution HNO3 1N
Les solutions tampons ne doivent pas etre laisses dans le systme pour eviter la cristallisation :
Effet sur la pompe : pistons et joints endommages
Effet sur la colonne : cree des vides dans la colonne
Effet sur la tubulure : corrosion des tubulures en acier
Possibilite de developpement bacterien en particulier les tampons phosphate favorables au developpement bacterien et
fongique

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Ne pas passer directement des solutions tampons aux solvants organiques aqueux (Methanol,
acetonitrile...)
m: Utiliser des solvants grade HPLC et non pas grade analytique:
Parmi les solvants grade HPLC il subsiste parfois des differences de qualite entre les differents fournisseurs

m: Preparation des melange en isocratique :


Les solvants doivent etre mesures separement avant detre melanges
Exemple : Pour preparer 1 L dunmelange Eau/Methanol (50:50)
Mesurer exactement 500 ml deau et les transferer dans une bouteille
Mesurer exactement 500 ml de methanol et les transferer
dans la meme bouteille
Melanger et passer aux ultrasons pendant 15 min

Choix de la PhaseMobile
Le choix de la m et les modifications de cette phase au cours de lanalyse sont importants :
Ils interviennent directement dans le processus de
separation chromatographique

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Les facteurs dterminants du choix sont au nombre de 6 :

1. Le pouvoir dlution (PE)


Depend de la polarit globale du solvant (Psolv)
Depend de la polarit de la s
Depend de la nature des constituants de lchantillon
Lindice de polarite de Snyder (P) etabli sur des mesures de
solubilite de la substance etablie dans 3 solvants :
Dioxane (accepteur de proton a faiblemoment dipolaire)
Nitromethane (accepteur de proton a moment dipolaire eleve)
Ethanol (donneur de proton a moment dipolaire eleve)

= Mlanges _ Polarits intermediaries

Choix de la Phase Mobile


1. Le pouvoir dlution (PE)

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Lintrt de la chromatographie en phase inverse plus utilis que celle en
mode normal car les solvants polaires (H2O, CH3OH...) sont beaucoup moins
couteux, moins toxiques et moins sensibles aux impurets que les polaires (CH 3CN...)

Choix de la PhaseMobile / Polarit


Exemple : Choix de tm en chromatographie sur phase inverse

Elution du cholestrol
Utilises a des [C] proches de 100% CH3OH (p=5.1) a un plus fort pouvoir delution que CH3CN
(P=5.8) .
Pour les mlanges la rgle a ses limites :

Elution de la cafine
En melange avec leau en faibles proportions, on obtient meme T r pour un % plus faible de CH3CN que CH3OH

2-La temprature dbullition (Teb) :

Au degazage : le solvant chauffe et sevapore modifiant ainsi la composition de la phase


mobile

3. La viscosit :
Une augmentation de la viscosite diminue les coefficients de diffusion et de transfert de
masse :
Diminution du nombre de plateaux theoriques.
La pression en tete de colonne augmente proportionnellement a la
viscosite de la phase mobile

4. Compatibilit avec le dtecteur :


Pas dabsorption aux longueurs donde de travail (detection par absorption),
Indice de refraction de la phase mobile different de celui des solutes (detecteur refractometres)

5. Inflammabilit
6. Toxicit

Choix de la PhaseMobile

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1- Mode Isocratique :

_ Pour les separations simples, un seul solvant peut suffire pour une analyse complete.
_ Mais souvent le solvant est constitue dun melange de solvants (2 a 4 solvants).
Optimisation de la m :

Comment trouver la composition idale?


1. Isocratique :
Optimisation de la m :
La meilleure facon pour definir les proportions consiste a tracer un triangle quilatral
pour les melanges ternaires ou un
ttradre rgulier pour les melanges quaternaires

La composition dun melange quelconque est alors representee par un point a linterieur
du triangle ou du tetraedre

Exemple : Optimiser le melange H2O/CH3OH / CH3CN / THF


7 experiences suffisent a determiner la composition optimum.
On commence par ajuster les proportions CH3CN/H2O pour obtenir la meilleure separation pendant
le temps danalyse
souhaite et quon appelle 100%A qui va correspondre a 1 des sommets du triangle
Exemple : Optimiser le melange H2O/CH3OH / CH3CN / THF
Ensuite on utilise la table suivante pour estimer la composition CH3OH/H2O et THF/ H2O qui donnent le meme
temps danalyse qui
constitueront respectivement les deux autres sommets du triangle ( 100%M et 100%T)

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Exemple : Optimiser le melange H2O/CH3OH / CH3CN / THF
Ces 3 proportions des sommets avec les 3 melanges 50/50 et le melange 1/3 1/3 1/3 constituent les 7
experiences a realiser

Inconvnients de lisocratique :
Grande diversite de polarite des analytes
Temps delution long
Mauvaise sensibilite pour les composes tres retenus car les
pics sont larges
Possibilite de retention irreversibles conduisant a des
Contaminations
Exemple : Optimiser le melange H2O/CH3OH / CH3CN / THF
Levaluation des chromatogrammes obtenus en utilisant les 7 phases mobiles permet de determiner
celles qui produisent la
meilleure separation ou didentifier la region du triangle qui permet une separation
Exemple : Pour une duree danalyse de 6 mn, separation sur C18 du melange :
Acide benzoque
Acide trphtalique
Acide p-aminobenzoque
Acide p-hydroxybenzoiqu

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Inconvnients de lisocratique :
Grande diversite de polarite des analytes
Temps delution long
Mauvaise sensibilite pour les composes tres retenus car les
pics sont larges
Possibilite de retention irreversibles conduisant a des
Contaminations
2. Mode GRADIENT
Correspond a un changement de la composition de la phase mobile au cours de lanalyse
Utilit?
Le mode gradient est utilise pour sparer des mlanges complexes qui ne peuvent pas letre en
isocratique
Particulirement efficace pour les constituants de polarits trs diffrentes

Principe :
la composition initiale est choisie pour sparer les composs les plus rapidement lues
la force dlution est augmente pour luer les composs avec une slectivit optimum
la composition finale est choisie pour luer lensemble des composes dignes dinteret
il est possible daugmenter la force luante pour liminer les composes trs retenus pouvant
conduire a des contaminations

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Avantages :
Permet daugmenter la rsolution
Rduire le temps danalyse
Augmenter la sensibilit

Injecteur
Linjection dun volume prcis de lchantillon en tte de colonne doit se faire en un temps bref
afin de perturber le moins possible
le rgime de circulation de la phase mobile qui doit tre stable de la colonne au dtecteur
vanne haute pression a plusieurs voies, manuelle ou motorise dans le cas des injecteurs
automatiques, place juste avant la colonne

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2- Les colonnes

On retrouve tous les systemes de chromatographie basse pression grace a des colonnes
contenant des supports equivalents pour une
utilisation HPLC :

Exclusion
Partage
Echangeurs d'ions
Affinite

1. La theorie cinetique
Equation de van Deemter (1956) :

On peut considrer dans le cas dune volution dune petite quantit de compose
que ltalement du pic au fur et a mesure de sa progression dans la
colonne de chromatographie est du a trois origines indpendantes:

A. Diffusion turbulente due a lexistence de chemins multiples dus au remplissage


Variation des trajectoires de diffusion due a :

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B. La diffusion longitudinale ou dispersion des molecules par diffusion

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Lequation de VAN DEEMTER relie les differentes causes delargissement des pics a la vitesse
de la phase mobile et a la hauteur equivalente a un plateau theorique (efficacite):

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Colonnes
La colonne se prsente comme un tube, le plus souvent en acier, dont la longueur et le
diamtre prsentent des diffrences selon les modles

Les colonnes standard dont le diametre interne (DI) est denviron 4,5 mm et la
longueur de 10 cm
Les colonnes standard sont de plus en plus supplantees par des colonnes de plus faible
diametre
Narrow-bore : DI 2-4 mm
Micro-bore : DI 1-2 mm
Capillaires remplies : DI 0,1-1 mm

Ces modeles sont apparus suite a levolution des phases stationnaires


customisees et pour simplifier les problemes
de couplage avec la spectrometrie de masse

Choix des colonnes :

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Une colonne courte permettra daller plus vite
Une colonne etroite se traduira par une economie de phase mobile :
pour une colonne standard, le debit est de lordre de 1 mL/min, alors quil tombe a
quelques L/min pour une colonne micro-bore

_ ncessite des pompes et des detecteurs adaptes quelques gouttes suffisant pour
luer tous les composes

Pre-Colonnes

La colonne est souvent precedee dune pre-colonne, dite colonne de garde ayant les
caracteristiques suivantes:

Courte : 0,4 a 1 cm
Remplie de la meme phase stationnaire
Augmente la duree de vie de la colonne principale en preservant ses performances
Les colonnes peuvent etre thermostatees aux temperatures
souhaitees :
Influence sur les TR et la duree de lanalyse

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Les phases monolithiques offrent une alternative intressante a
la fois parce que la perte de charge est beaucoup plus faible et
que les performances ne sont pas altres par des dbits levs

Le mcanisme daction du gel de silice repose sur le phnomne


dadsorption qui consiste en laccumulation dun compose a linterface
entre deux phases (tm et ts) Dautres thories expliquent le phnomne de
sparation des constituants par un simple ralentissement (sans
immobilisation) au niveau de linterface tm / ts qui diffre pour chaque
analyte

Dans les cas les plus simples, il y a formation dune monocouche, mais
souvent il se cre aussi une attraction entre les molcules dj adsorbes et
celles qui sont restes en solution

_Non-symetrie des pics delution

Dautres theories expliquent le phenomene de separation des constituants


par un simple ralentissement (sans immobilisation) au niveau de linterface
tm / ts qui differe pour chaque analyte

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3. Les silices greffes
Bien quayant une capacite dadsorption elevee, le gel de silice non greffe
nest plus utilise tel quel en chromatographie analytique car etant
hydrophile :
Pour diminuer sa polarite jugee excessive dans de nombreux cas
on le rend essentiellement hydrophobe

Ses caractristiques voluent au cours du temps, entrainant un manque de


reproductibilit des sparations
Les modifications classiques mettent a profit la ractivit des fonctions
silanols prsentes en surface pour fixer des molcules organiques par des
liaisons covalentes

Ces phases greffees, dont la polarite peut etre ajustee avec precision, sont a
lorigine de la chromatographie de partage a
polarite de phase inversee, utilisee dans quasiment toutes les separations
Deux types de phases :
Phases monomeriques (1015 m depaisseur) : Obtenues en faisant
reagir des reactifs sililes tels que le chlorodimethylsilane
en presence dune base sur les fonctions silanols de surface

Phases polymeriques (25 m ou plus en epaisseur) : di- ou trichlorosilane en presence de vapeur


deau qui provoque une
polymerisation en solution du reactif avant depot et greffage sur la silice

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On obtient ainsi une couche polymerique reticulee / On vite les silanols libre
3-Les dtecteurs
Plusieurs types de detecteurs peuvent etre employes en CLHP. Le detecteur doit reunir un certain
nombre de qualites TECTEURS
Selectivite _Ex. : refractometrie

_Un detecteur non selectif est base sur une propriete fondamentale des molecules
_Un detecteur Selectif mesure une reponse due a une propriete
de la molecule de solute

_Ex. : UV absorbance
Plusieurs types de detecteurs peuvent etre employes en CLHP. Le detecteur doit reunir un certain
nombre de qualites :HPLC - DTECTEURS
Specificite _Ex. : Spectrometrie de masse

Plusieurs types de detecteurs peuvent etre employes en CLHP. Le detecteur doit


reunir un certain nombre de qualites :
HPLC - DTECTEURS
Etre sensible et avoir peu de bruit de fond

Limite de dtection et de quantification


Limite de dtection = la plus petite quantit danalyte qui peut tre dtecte (3 fois le bruit de fond)
Limite de quantification = la plus petite concentration danalyte, dans une certaine matrice, qui peut
tre mesure (10 fois le bruit de fond)
Plusieurs types de dtecteurs peuvent tre employs en CLHP. Le dtecteur doit runir un
certain nombre de qualits :

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HPLC - DTECTEURS
Donner pour chaque compose dtecte une rponse proportionnelle a sa concentration
instantane

_ Domaine de linearite
Plusieurs types de dtecteurs peuvent tre employs en CLHP. Le dtecteur doit runir un certain nombre de qualits :
HPLC - DTECTEURS
Etre stable dans le temps

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Les modes de detection les plus courants reposent sur les proprietes optiques des
composes :LC -ECTEURS
Absorption
Fluorescence
Indice de refraction

1. Detecteurs spectrophotometriques

Ces dtecteurs sont les plus couramment utilises en HPLC car ils sont :
2. HPLC - DTECTEURS
Peu sensibles aux fluctuations de debit et de temperature
Un grand nombre de solvants ont une bonne transparence dans lUV
On mesure en permanence labsorbance de la phase mobile en sortie de la colonne a une ou
plusieurs longueurs donde. Le signal donne par ces detecteurs est proportionnel a la
concentration du solute dans leffluent de la colonne chromatographique

Spectre uv-visible

Un spectre UV (ou visible) rend compte de l'absorption de radiationsUV (ou visibles) par une
molecule
A chaque rayonnement de longueur donde est associee une energie E
Passage dun electron d'une orbitale d'energie E1 a une orbitale d'energie E2 plus elevee

On dit quon passe a un etat excite

Ainsi pour la difference d'energie E = E2 - E1 correspond une longueur d'onde


donnee par la relation :

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Cette detection est basee sur l'absorption d'une lumiere monochromatique. Elle suit la loi
de Beer-LamberL
Loi qui traduit la relation entre labsorbance, la concentration et la longueur de solution traversee par la lumiere dans la
cuve de mesure

A: Absorbance (ou D.O.)


C : Concentration de lechantillon (mol.l -1)
l : Longueur de la solution traverses (cm)
: Coefficient dextinction molaire ou coefficient dabsorption ou absortivitemolaire
(mol-1.cm-1.l)
Les valeurs experimentales de vont de 0 a 106 M-1.cm-1
Le spectre UV-Vis decrit la variation de labsorbance (A) en fonction de la longueur donde

A chaque correspond un / Un compose est caracterise par son max et son max

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Nature et notation des principales transitions electroniques

Definitions
On distingue 4 types de bandes d'absorption dans les spectres UV desmolecules
organiques.
Elles sont caracterisees par la longueur d'onde de leur maximum d'absorption (
max ) et par l'intensite de ce maximum
Bandes R
max > 190 nm, faible Abs.Mol. (10 < < 100 L.mol-1.cm-1)
Elles sont dues a une transition lectronique n*.
Lorsqu'un htroatome, porteur de doublet(s) non-apparie(s) n, fait partie d'un systme insatur ou est conjugue avec un
tel systme,
une transition de faible nergie peut se produire :
passage d'un lectron n non liant dans une orbitale anti-liante *

Nature et notation des principales transitions electroniques

Bandes K (Konjugierte)
max > 190 nm (> 400 nm pour systemes tres conjugues)
Forte Abs. Mol. (1 000 < < 10 000 L.mol-1.cm-1)
Elles sont dues a une transition electronique *
Elles apparaissent dans les spectres de molecules possedant un systeme de doubles liaisons conjuguees

Bandes B (Benzenoides)

max < 1 000 M-1.cm-1


Egalement dues a une transition electronique *
Elles apparaissent dans les spectres de molecules aromatiques ou heteroatomiques

Bandes E (Ethyleniques)

Les max varient entre 2000 et 14 000 M-1.cm-1


Egalement dues a une transition electronique *
Apparaissent dans les spectres de molecules aromatiques substituees par des groupements auxochromes

Exemples de chromophores

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Remarque

Sil nya pas de perturbation amenee par la presence dun heteroatome ou dune
conjugaison
Tous les composes qui presentent le meme chromophore absorbent pratiquement a la meme

Lorsque plusieurs chromophores sont separes les uns des autres par au moins 2
liaisons
Ils se comportent comme des chromophores isoles

Par contre, lorsque 2 chromophores sont conjugues


Ils se comportent comme un nouveau systeme et les spectres
UV-Vis se trouvent totalement transformes

Leffet bathochrome rencontre avec lallongement dunsysteme conjugue


saccompagne dune forte augmentation du coefficient

Effet hyperchrome

Les detecteurs monochromatiques :


HPLC - DTECTEURS
1. Dtecteurs spectrophotometriques
Ce type de detecteur est le modele de base, il se compose dune source au deuterium ou a
vapeur de mercure, dun monochromateur pour isoler
une bande passante (10 nm) ou une raie dune cellule de circulation et dun detecteur
optique

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La sensibilite est dautant plus grande que l est grand, mais il faut dans le meme temps que le
volume soit aussi faible que possible pour ne pas
affecter lefficacite du systme chromatographique.
HPLC - DTECTEURS
Les cellules ont en general un volume de quelques microlitres (5 a 10 L) et ont un trajet
optique de lordre de 1 cm

Les detecteurs polychromatiques :


HPLC - DTECTEURS
On peut les classer en 3 categories :

Les detecteurs qui permettent de changer de longueur donde au cours de


lanalyse

Les dtecteurs qui permettent denregistrer labsorbance a plusieurs longueurs donde simultanment

Chromatogramme dun melange de pesticides a plusieurs longueurs dondes

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Les dtecteurs qui peuvent capter en une fraction de seconde tout un domaine de longueurs donde
sans interrompre la
circulation dans la colonne

_La cellule de mesure est eclairee par une source polychromatique dans le proche UV/Vis
_La lumiere transmise par lechantillon est dispersee par un reseau a reflexion sur un detecteur
constitue par une rangee de diodes

Les spectrophotometres a barrette de diodes permettent lenregistrement


tridimensionnel absorbance-temps-

Avec les DAD on dispose a tout moment du spectre UV-Visible de la phasemobile eluee
_Permet lidentification de solutes inconnus par comparaison des spectres UV des solutes avec ceux des
composes purs stockes en bibliotheque

Detecteurs spectrophotometriques
Avantages :
Selectif : choix de la longueur donde
DAD : mesurer a plusieurs (purete dun pic)
Peu sensible a TC et debit
Peut etre utilise en mode gradient
Non destructive
Inconvenients :
Lanalyte doit etre chromophore
Facteur de reponse : different pour chaque compose
DAD : emploi plus difficile

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Limite par le cut-off de la phase mobile

2- Detecteurs spectrofluorimetriques
Ce mode de detection exploite les proprietes quont certaines molecules en solution dabsorber des
radiations dans lultraviolet
(passage a un etat excite) et de reemettre une fraction de la lumiere absorbee donc a une
longueur donde superieure, lautre fraction etant convertie en energie interne

Il existe 3 types dappareillage :


Les spectrofluorimetres munis dun monochromateur a lexcitation et t dun filtre a
lemission
Les spectrofluorimetres munis de monochromateurs a lexcitation et lemission,
Les spectrofluorimetres programmables en longueur donde dans le temps

_Permet doptimiser la sensibilite et la selectivite, Exp :


Il existe 3 types dappareillage :
Les spectrofluorimetres munis dun monochromateur a lexcitation
et dun filtre a lemission
Les spectrofluorimetres munis de monochromateurs a lexcitation et
a lemission,
Les spectrofluorimetres programmables en longueur donde dans le
temps
_Permet doptimiser la sensibilite et la selectivite
Exemple :
Melange de seize hydrocarbures polyaromatiques (HAP) avec programmation des longueurs
donde a lemission et a lexcitation

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Avantages :
Selectivite elevee
Sensibilite elevee

Inconvenients :
Reserve aux substances fluorescentes
Nest lineaire quaux faibles concentrations

3- Detecteurs refractometriques
Mesure de maniere continue la difference d'indice de refraction entre une phase mobile (eluant +
substance) et l'eluant circulant
respectivement dans la cellule de reference et la cellule de mesure

Avantages :
Quasi-universel, sauf dans le cas rare ou lindice de refraction de la phase eluante est
identique a celui du solute
Inconvenients :
Beaucoupmoins sensible que lUV
Sensible aux variations de temperature et de pression en raisonde la variation de lindice
de refraction en fonction de la densite des solvants

_ Refractometre thermostate (0,001C)

_ Colonnes doivent etre thermostatees (0,1C)

Pics negatifs et positives

Reglage de la ligne de base a mi-hauteur du graphe

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4- Detecteurs Polarimetriques
Principe
Mesure l'activite optique de substances possedant un ou des centres
d'asymetrie. Les nouveaux appareils equipes de laser
permettent de detecter des rotations optiques de l'ordre du microdegre

5- Detecteurs conductimetriques
Principe
Repose sur la mesure, en sortie de colonne, de la conductance de la phase mobile riche en
compose ionique, il est donc :
HPLC - DTECTEURS
_Limite a la detection des especes ionisees
Particulierement utilise en chromatographie ionique
La difficulte dans cette analyse est de reconnaitre dans le signal global la part de
conduction due aux ions ou substances ioniques faiblement chargees appartenant a
lechantillon de celle de lelectrolyte contenu dans la phase mobile
La reponse du detecteur est proportionnelle a la difference de conductivites ioniques des
anions de lechantillon etde leluant
Une bonne detection implique que :
La difference entre la conductivite ionique de lespece avec celle du solvant soit aussi
grande que possible en valeur absolue.
La conductance de leluant soit tres stable :

_Thermoregulation de lensemble du systme

La conductance de leluant soit tres faible pour permettre une forte amplification du signal
au passage du solute
Ameliorations techniques
on dispose, entre la colonne et la cellule de detection, un dispositif de neutralisation
par lequel on elimine les ions de leluant (suppressed ion chromatography),
generalement par reaction acide-base :
_Si le conducteur ionique du solvant est acide, on ajoute une base et vice versa OU
On utilise comme ion eluant un ion organique volumineux donc peumobile et par
consequent de faible conductivite ionique

6- Detecteurs par spectrometrie de masse

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Permet de detecter, d'identifier et de quantifier des molecules dinteret par mesure
de leur masse, et de les fragmenter pour caracteriser leur structure chimique.
_Principe :
Separation en phase gazeuse de molecules chargees (ions) en fonction de leur
rapportmasse/charge (m)

. Informations apportees par le spectrometre de masse


1- La masse molculaire dun compos
2- La masse des fragments de ce compos
3-Une mesure de la quantit

Ex: spectre en ionisation par impact electronique du cholestane

1- La valeur m/z du pic moleculaire permet de calculer la masse moleculaire


2- Les pics de fragmentation permettent de reconstituer une partie de la
structure
3- Lintensite des pics permet de faire de lanalyse quantitative

HPLC DTECTEURS

La masse moleculaire est deduite de la valeur m/z du pic moleculaire dans le spectre.
Celui-ci correspond a un ion qui
contient TOUS les atomes de la molecule etudiee , sans quil y ait eu rupture dune
liaison.

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La molecule a ete ionisee grace a la perte ou au gain dune charge electrique
_ La masse moleculaire correspond donc a la composition elementaire (formule brute) de
lion moleculaire.
Lexistence disotopes se traduit par la presence de plusieurs
picsmoleculaires
_ On observe, non pas UN pic moleculaire, mais UN GROUPE de pics moleculaires
(un massif moleculaire ou cluster
moleculaire )
La presence disotopes complique donc la definition, et la mesure du pic moleculaire .

Ces gouttelettes se deplacent dans un courant d'azote (ou He) a travers un orifice de la contre-
electrode, processus qui contribu a l'evaporation du solvant present dans les gouttelettes

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Spectrometrie de Masse :
Les ions formes par ce type d'ionisation possedent un rapport m/z eleve, ce qui permet de faire l'analyse de molecules de
masse
molaire elevee comme les proteins

Ionisation par ionisation chimique a pression atmospherique


Leffluent de la colonne est evapore dans le vaporiseur. Il s combine avec le gaz nebuliseur pour
transferer les composes vers
lelectrode a decharge couronne faite dune aiguille et dune chambre de nebulisation servant de
contre-electrode. Une difference de potentiel important (entre }3 et }6 kV) est exercee sur cette
electrode corona
Decharge couronne (decharge electrique lumineuse) de ~2-3 A

Ionisation par ionisation chimique a pression atmospherique


_ Les ions radicalaires du plasma participent ensuite a des reactions chimiques qui donnent lieu a
lionisation des molecules danalyte

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Les analyseurs Quadripolaires
constitue de quatre electrodes metalliques paralleles raccordees electriquement deux a deux (2
chargees + et 2 chargees -)
Les ions emanant de la source sont soumis a une tension continue (U) et une tension alternative (V).
Le trajet des ions dans le quadripole est oscillant. Si lamplitude des oscillations est trop grande, les
ions sont collectes par les barres du quadripole et ils ne seront pas detectes
On regle U et V de sorte que seul un ion de rapport m/z choisi puisse se frayer un chemin jusquau
detecteur (trajectoire stable)

Deux modes de dtection:


- Full scan : Balayage dune gamme de masse _ On observe la totalite des ions formes dans cette
gamme.
- SIM ou SIR (Single Ion Monitoring ou Recording) : Le quadripole fonctionne en filtre de masse regle
pour ne laisser passer que les
ions dun rapport m/z donne. _ + selective et + sensible que full scan_Analyse quantitative
Avantages
- Simple & peu couteux
- Peu encombrant
- Analyse ciblee (SIM)
Inconvenients
- Resolution relativement faible
- Limite en gamme de masses

Les Piges Ioniques ou Trappes a ions

Cet analyseur est compose de 3 electrodes : 1 annulaire , et 2 dits chapeau . Cet


analyseur a la capacite de faire une analyse
tridimensionnelle en variant les tensions en radiofrequence, et les tensions continues entre les
electrodes
_ Les ions decrivent initialement des mouvements oscillatoires stables au centre de la
trappe

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_ les ions vont avoir une trajectoire destabilisee et vont etre ejectes de la trappe en fonction de
leur m/z croissant
Application dune rampe de Radiofrequences au niveau de lelectrode annulaire

Ledetecteur sert a mesurer le nombre delectrons et a amplifier le signal pour


obtenir une bonne sensibilite

_ Le plus frequemment utilise est un multiplicateur delectrons tubes en


verre dopes au Pb ou Cu/Be : dynodes

_Dynodes type amplification discontinue (10 25 dynodes)

_Dynodes type amplification continue

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7. Le tandem de masse MS/MS
Les analyseurs peuvent etre couples et agir de facon sequentielle. On parle alors de spectrometrie de
masse a plusieurs dimensions :
Un premier analyseur selectionne les ions avec un certain m/z On purifie donc un ion present
dans un melange dion qui peut etre tres complexe.
Lion purifie est alors fragmente dans une chambre de collision.
Un deuxieme analyseur mesure alors les m/z des fragments. Cest de la MS-MS (spectrometrie de
masse en tandem)

Les detecteurs de masse multiples

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Certain appareils permettent de faire de la MS10
_ Le tandem de masse ou le multiple masse constituent de puissants outils de
determination de structure

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