UNIVERSIDAD NACIONAL

MAYOR DE SAN MARCOS

Facultad de Farmacia y Bioqumica

Ao de la Escuela Acadmico Profesional de Farmacia y
consolidacin del mar de Grau
CTEDRA DE QUMICA ANALTICA INSTRUMENTAL

PROYECTO DE INVESTIGACIN

IDENTIFICACIN DE ANTOCIANINAS EN MASHUA NEGRA (Tropaeolum

tuberosum Ruiz & Pavn) POR HPLC -DAD

DOCENTES :
Dr. Mario Carhuapoma Yance
Dra. Norma Anglica Carlos Casas
GRUPO:
N4
DA:
Mircoles 2:00 am a 6:00 pm

INTEGRANTES:
Avalos Champa Angie
Cayo Llufire, Carmen Luca

2016

NDICE
 pg.
Introduccin 3
Objetivos 4

I. Marco terico
La mashua negra
1.1 Clasificacin taxonmica 5
1.2 Descripcin botnica 5
1.3 Hbitat y distribucin 6
1.4 Usos 6

Las antocianinas

1.5 Estructura qumica de las antocianinas 7

1.6 Distribucin y contenido de antocianinas en los alimentos 8
1.7 Propiedades funcionales de las antocianinas 8
1.8 Actividad antioxidante 8
1.9 Estabilidad de las antocianinas 8

II. Materiales y mtodos 9

II.1Materia prima
2.2 Reactivos, materiales y equipos
2.3 Identificacin de antocianinas por HPLC DAD

III. Resultados
IV. Discusiones
V. Conclusiones
VI. Referencias bibliogrficas
VII. Anexos

INTRODUCCIN

La mashua Tropaeolum tuberosum conocida como isao, au; es una planta

andina de la familia de las Tropaeolaceae. Esta planta ha sido cultivada desde la poca
prehispnica por sus bellas flores ornamentales, pero principalmente por sus tubrculos
comestibles (Ramallo, 2004)
La mashua Tropaeolum tuberosum Ruiz & Pavn) es un tubrculo cultivado en las
zonas agro ecolgicas de Suni y Puna baja en el Per y Bolivia y crece entre 2400
y 4300 m. altitud. La mashua es empleada con fines alimentarios y por la medicina
folklrica, se presentan reportes de su uso en el tratamiento de lceras en la piel,
dolencias renales y hepticas (Grau, 2003)

La mashua no es consumida ni comercializada a gran escala, debido a su sabor amargo

y a sus supuestos efectos adversos para la reproduccin humana. Es comnmente
conocido como anafrodisaco para las personas del sexo masculino. (Ramallo, 2004).

Desde el punto de vista agronmico es muy rstico ya que en la zona andina se cultiva
en suelos pobres, sin uso de fertilizantes ni pesticidas, y aun en estas condiciones, sus
rendimientos superan a los de la papa. Adems, de ser tolerante a las heladas, tambin
tiene capacidad fungicida, nematocida e insecticida, debido a los glucosinolatos y sus
derivados los isotiocianatos (Ortega et al., 2006) presentes en toda la planta.

Existen muchos reportes experimentales de propiedades medicinales del au que son

resultado de la presencia de glucosinolatos y sus derivados principalmente de
pmethoxybenzylisothiocyanate (Johns et al., 1982), y de Bencil-isotiocianato, siendo
este ltimo un agente anticancergeno, que acta eficazmente contra una amplia gama
de clulas tumorales (Hasegawa et al., 1992; Pintao et al., 1995).

Estudios realizados refieren que Tropaeolum tuberosum contiene altas

cantidades de glucosinolatos y es rica en isotiocianatos; estos ltimos
poseen la capacidad de inhibir la proliferacin de clulas cancerosas de la
prstata, colon y piel en humanos . Por ello, basados tanto en la prctica
popular como en estudios previos, Tropaeolum tuberosum podra tener
efecto en la proliferacin celular presente en la HPB.

As mismo, el au comparado con la papa, el olluco, y la oca presenta una mayor

capacidad antioxidante, con alto contenido de antocianinas y carotenoides (Campos et
al., 2006). Atributos que hacen del au un cultivo con un gran potencial, y que podran
ser utilizados en la mejora para la resistencia a plagas, la industria farmacutica y en la
nutricin.

Recientemente se est tomando mayor atencin al estudio de la actividad antioxidante,

la cual cobra protagonismo al reducir o evitar el estrs oxidativo producido por los
radicales libres, responsables de la destruccin de las macromolculas en las clulas,
asociadas al envejecimiento prematuro y aparicin de patologas como cncer,
inflamacin y padecimientos inmunitarios que involucran al rin, hgado, pncreas,
sistema nervioso y alteraciones en el sistema cardiovascular (Costa, 2008) .

Este estudio tiene como prioridad identificar las antocianinas presentes en el extracto
alcohlico de mashua negra mediante el uso del equipo HPLC. Para determinar la
presencia e importancia de las antocianinas en la mashua negra; se busc informacin
en artculos cientficos publicados en la base de datos como Revista Scielo, Science
Direct, Tesis revisadas en la Universidad Agraria La Molina; en dichas publicaciones
se evidencia los estudios que avalan las propiedades mencionadas y la composicin de
las antocianinas.

OBJETIVOS:

Identificar la composicin de antocianinas presentes en el tubrculo de

mashua negra Tropaeolum tuberosum , en el extracto alcohlico
mediante la tcnica de Cromatografa Lquida de Alta Performance
acoplada al detector de arreglo de diodos ( HPLC- DAD)
Correlacionar la actividad antioxidante con las antocianinas.

I. MARCO TERICO

LA MASHUA NEGRA (Tropaeolum tuberosum Ruiz & Pavn)

1.1 Clasificacin taxonmica:

REINO: Plantae
 DIVISIN: Magnoliophyta
CLASE: Magnoliopsida
ORDEN: Brassicales
FAMILIA: Tropaeolaceae
GNERO: Tropaeolum
ESPECIE: T. Tuberosum Ruiz & Pavn

1.2 Descripcin botnica: Es una planta herbcea de tallos cilndricos y hbitos

rastreros como el mastuerzo, tiene crecimiento erecto cuando es tierna y de tallos
postrados con follaje compacto cuando madura. Las hojas son alternas, de 3 5
lbulos, con nervaduras pronunciadas. Las flores son solitarias de diferentes colores que
van desde anaranjadas o rojizas, el nmero de estambres es variable, puede ser de 8
13. El tiempo de duracin de la flor abierta vara de 9 a 15 das. El periodo vegetativo es
de 220 245 das. Es tolerante a bajas temperaturas y al ataque de insectos y plagas.
Adems es muy rstico, por ello puede cultivarse en suelos pobres, sin uso de
fertilizantes y pesticidas y an en estas condiciones su rendimiento puede duplicar al de
la papa. Requiere de suelos sueltos, de pH ligeramente cido entre 5 -6, aunque tambin
se desarrolla entre pH 5,3 7,5. El fruto es esquizocarpo, el cual produce abundante
semilla botnica. Los tubrculos son parecidos a los de la oca pero se les diferencia
porque tienen forma cnica alargada, de yemas profundas, son de color variado: gris,
blanco, amarillo, rojizo, morado y negro, generalmente con jaspes oscuros, rayas o
pintas cortas, moradas o prpuras.

Fig.
1
 Fig. Fig.
2 3

1.3 Hbitat y distribucin: Arbizu y Tapia (1994) afirman respecto a este cultivo que
es originario de los andes centrales y por ser un cultivo de sierra alta se le encuentra en
Ecuador, Per y Bolivia. Tienen una mayor adaptacin entre 3500- 3800 msnm
(Betalleluz , 2006)

1.4 Usos : Por las caractersticas del sabor de sus tubrculos, la mashua no es
consumida en estado fresco, es por ello, que se cuecen generalmente en estofados,
tambin se hornea o se fe con huevos y cebollas. Cerca de la Paz, se empapan con miel
y se comen como dulce. En Nueva Zelanda, donde ha sido recientemente introducida, se
cuecen en sopas y estofados, los cuales adquieren un sabor agradable y delicado.

En la medicina folklrica la mashua es considerado como un agente inhibidor sexual,

tambin es usado para tratar problemas hepticos y renales (IDNRC, 1989)

Fig.
4
http://pt.slideshare.net/Agroipex/programa-mercados-para-la-mashua-negra-2016
LAS ANTOCIANINAS

1.5 Estructura qumica de las antocianinas

Los compuestos fenlicos abarcan un gran grupo de sustancias orgnicas, siendo los
flavonoides un grupo importante el cual incluye las antocianinas, uno de los pigmentos
ms ampliamente distribuidos en el reino vegetal. Las antocianinas son responsables de
un amplio abanico de colores de las plantas, que incluyen el azul, prpura, violeta,
magenta, rojo y naranja (Fennema,2000).

Las antocianinas se consideran flavonoides porque tienen el tpico esqueleto carbonado

C6C3C6, stas difieren en el nmero de grupos hidroxilo y / o metoxilo presentes, tipos
nmeros y los sitios de unin de los azcares a la molcula y las clases y nmeros de
cidos alifticos o aromticos que estn unidos a los azcares de la molcula.
Cuando se hidroliza una antocianina la fraccin no azcar de una antocianina se conoce
como antocianidina, la cual contiene dobles enlaces conjugados responsables de la
absorcin de la luz alrededor de 500 nm causando que los pigmentos aparezcan rojos al
ojo humano (Markakis, 1982, Rein, 2005)

ANTOCIANIDINAS

Fig.
5
https://www.google.com.pe/search?
q=antocianidinas&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=0ahUKEwis39KsgLnQAhVB6yYKHdyvClAQ_AUICCgB
&biw=1137&bih=708&dpr=0.9#imgrc=3czFupnYD1qP9M%3A

Las antocianinas presentes en la naturaleza contienen diversas antocianidinas, alrededor

de 22 diferentes son conocidas pero nicamente seis de ellas son los ms importantes
en los alimentos (Francis, 1989) y estas son: pelargonidina, cianidina, peonidina,
delfinina, malvidina y petunidina de las cuales la cianidina es la ms comn
(Harbone, 1998)

1.6 Distribucin y contenido de antocianinas en los alimentos

Las antocianinas son pigmentos solubles en agua y se localizan en las vacuolas de la
clula vegetal, se encuentra en diferentes rganos de la planta, principalmente en flores
y frutos pero tambin en hojas, tallos y rganos de almacn.

1.7 Propiedades funcionales de las antocianinas

Anticarcinognico, antiinflamatorio, antihepatxico, antibacterial, antialergnico,
antitrombtico, reductor del riesgo de enfermedades coronarias, reductor de ataques y
mejorador del comportamiento cognitivo (Worlstad,2004)

1.8 Actividad antioxidante

La actividad antioxidante en las frutas y vegetales procede en su mayora de las
vitaminas C,E, - caroteno y de los compuestos de naturaleza fenlica. Se ha
evidenciado que stos ltimos son ms efectivos que las propias vitaminas
antioxidantes. La actividad antioxidante de la mashua es atribuida principalmente a los
compuestos fenlicos. Por lo sealado es necesario identificar a los polifenoles de la
mashua, a fin de establecer el potencial antioxidante que los mismos otorgan a la
mashua (Costa N, 2008)

Investigaciones realizadas por Chirinos en el ao 2006 en diferentes genotipos de

mashua sealan que contiene importantes concentraciones de compuestos fenlicos;
antocianinas, flavanoides y una actividad antioxidante hidroflica similar o superior a la
del arndano, fresa, pasa, grosella, frambuesa, manzana, entre otras frutas.

La capacidad antioxidante, las cuales cobran protagonismo al reducir o evitar el estrs

oxidativo producido por los radicales libres, responsables de la destruccin de las
macromolculas en las clulas, asociadas al envejecimiento prematuro y aparicin de
patologas como cncer, inflamacin y padecimientos inmunitarios que involucran al
rin, hgado, pncreas, sistema nervioso y alteraciones en el sistema cardiovascular
(Costa, 2008) .

1.9 Estabilidad de las antocianinas

Los pigmentos de antocianinas son relativamente inestables y la mayor estabilidad se
presenta en condiciones cidas. La degradacin de antocianinas se produce no slo
durante la extraccin del tejido vegetal, sino tambin durante el procesamiento y
almacenamiento de los alimentos que las contienen, esto limita su efectiva aplicacin
como colorantes. El tono del pigmento y su estabilidad se ven influenciados por los
sustituyentes en el aglicn.

Los principales factores de la degradacin de las antocianinas son: su conformacin

qumica, el pH, la temperatura, la concentracin de oxgeno y la luz. (Betalleluz, 2006)
 II. MATERIALES Y MTODOS
2.1 Materia prima
Se utiliz tubrculos de mashua negra cultivado en el departamento de Ayacucho. La
muestra fue lavada y posteriormente se obtuvo un extracto etanlico de 70 con HCl al
1%
2.2 Reactivos, materiales y equipos
2.2.1 Reactivos:
Etanol de 70
HCl 1%
2.2.2 Materiales:
Fiola de 100 mL
Tubo probeta de 10 mL
Pipeta de 10 mL
Micropipeta
Frasco mbar
2.2.3 Equipo:
HPLC-DAD

2.3 Identificacin de antocianinas por HPLC DAD

Metodologa
2.3.1 Extraccin de las antocianinas
Se obtuvo a partir del extracto etanlico de 70 con HCl al 1%
2.3.2 Purificacin del extracto de mashua
Los extractos de antocianinas deben pasar por la etapa de purificacin haciendo uso de
la tcnica cromatogrfica de interaccin hidrofbica recomendada por (Durst y
Worlstad, 2001), para la cual se emplea las columnas sep-pack C-18, las que en primer
lugar deben ser acondicionadas con metanol seguido de agua acidulada (HCl 0,01%
v/v), luego se procede aplicar el extracto en la columna. Posteriormente se pasa el agua
acidulada (HCl 0,01% v/v) con la finalidad de arrastrar los compuestos de mayor
carcter hidroflico (cidos, azcares), seguido de etil acetato con la finalidad de
arrastrar otros fenlicos diferentes a la antocianina para finalmente ser estas eluidas con
metanol acidulado (HCl 0,01% v/v). El extracto metanlico obtenido debe ser
concentrado al vaco (rotavapor, 38 40C) hasta casi sequedad y luego resuspendida
en agua acidulada. Este procedimiento es una de las tcnicas ms empleadas para la
identificacin de antocianinas por HPLC- DAD.

2.3.3 Identificacin de las antocianinas por HPLC

Para la identificacin de las principales antocianinas presentes en la mashua se trabaj
con el extracto purificado de mashua, el que fue pasado directamente por el HPLC-
DAD junto
con los
stndares de
antocianinas
de maz
morado
(Zea mays
L. var

subnigroviolaceo)

Las antocianinas se pueden separar por HPLC con columna RP-18, de 25 cm de

longitud y 5 mm de dimetro; el eluente es una mezcla 1:1 de A (H 3PO4 al 1.5% acuoso)
y B (H2O: MeCN:AcOH:H3PO4 107:50:40:3) a un flujo de 0.8 mL/min; a una longitud
de onda de 352 y 530 nm.

III. RESULTADOS

Se obtuvo el cromatograma de la antocianina cianidina 3 glucsido a partir del

extracto purificado de la mashua negra mediante la tcnica HPLC-DAD, comparando
con el estndar de cianidina 3 glucsido del extracto purificado de maz morado.

El espectro obtenido en la regin visible para la cianidina (Metanol-HCl) es a 535 nm

(Harbone, 1958) (Rein,2005)
Fig.
5
IV. DISCUSIONES

La extraccin de antocianinas se puede realizar por maceracin con metanol (MeOH) o

etanol (EtOH) conteniendo 1% de HCl. El metanol es ms ventajoso que el etanol
porque no forma mezclas azeotrpicas con el agua y tiene menor punto de ebullicin
que permite una rpida concentracin (Fernndez, 1995). El HCl mantiene el pH bajo y
produce sales de cloruro con antocianinas. El uso de otros cidos durante la extraccin
puede producir resultados errneos ya que las sales formadas pueden diferir
considerablemente en movilidad cromatogrfica de la correspondiente sal de cloruro.
Las soluciones cidas ms fuertes son perjudiciales. (Fernndez, 1995).

Para la identificacin de las principales antocianinas presentes en la mashua se debe

trabajar con el extracto purificado el cual debe pasarse directamente por el HPLC- DAD
junto con estndares de antocianinas (Betalleluz,2006)

Para tener una mayor informacin de la conformacin de la antocianina, la

identificacin del aglicn y su carcter acilado, el extracto purificado debe ser
hidrolizado bajo condiciones cidas con la finalidad de elucidar el tipo de antocianidina
presente en las antocianinas de la mashua y bajo condiciones alcalinas para saber si las
antocianinas se encontraban ligadas a grupos acilos respectivamente (Durst y Worlstad,
2001)

Por revisin de informacin sobre identificacin de antocianinas se sabe que la

antocianina que se encuentra en mayor cantidad es la cianidina 3 glucsido, el cual
requiere el uso de un estndar. Cada tipo de antocianina deber contar con su estndar.

V. CONCLUSIONES

Se identific la composicin de antocianinas con la tcnica de HPLC-DAD en la

cual se revel en el cromatograma la presencia de la antocianina cianidina 3
glucsido en el extracto purificado de mashua negra comparando con el
estndar de cianidina 3 glucsido del extracto purificado de maz morado.
En el presente estudio se comprob que la cianidina es la antocianina ms
comn en la naturaleza. (Harbone, 1998)
 La mashua negra contiene una gran cantidad de antocianinas que son
compuestos fenlicos relacionadas con la capacidad antioxidante, las cuales
cobran protagonismo al reducir o evitar el estrs oxidativo producido por los
radicales libres, responsables de la destruccin de las macromolculas en las
clulas, asociadas al envejecimiento prematuro y aparicin de patologas como
cncer, inflamacin y padecimientos inmunitarios que involucran al rin,
hgado, pncreas, sistema nervioso y alteraciones en el sistema cardiovascular
(Costa, 2008) .

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

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VII. ANEXOS