MICROPROPAGACIN

MICROPROPAGACIN EN EL LABORATRIO EDUCACIONAL

MARIA ANTONIA MALAJOVICH (Doctora en Ciencias Biolgicas, Gentica, UFRJ)

Coordinadora de Biotecnologa del Instituto de Tecnologia ORT de Rio de Janeiro.
VITOR SOARES MANN (Magister en Educacin, UNIRIO)
Jefe de los laboratorios de Ciencias y Biotecnologa del Instituto de Tecnologia ORT de
Rio de Janeiro.

ORGANIZACIN DEL TEXTO

FUNDAMENTOS BIOLGICOS
POR QU ENSEAR LAS TCNICAS DE MICROPROPAGACIN?
EN EL LABORATORIO DE ENSEANZA
LOS EXPERIMENTOS
Cultivo in vitro de plantas enteras
Cultivo in vitro de rganos aislados
Cultivo in vitro de callos
Cultivo in vitro de clulas aisladas
LOS PROCEDIMIENTOS
LOS OBJETIVOS POSIBLES
PRIMER OBJETIVO: ESTABELECER UN CULTIVO ASPTICO
La obtencin de explantes
Desinfeccin de la superficie del explante
Sembrado e incubacin
SEGUNDO OBJETIVO: REGENERAR UNA PLANTA
Multiplicacin
Preparacin de las plntulas para la transferencia a tierra
Aclimatacin
VALE LA PENA?

BIBLIOGRAFA BSICA

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FUNDAMENTOS BIOLGICOS

La reproduccin asexual es utilizada para obtener una gran cantidad de plantines

a partir de una nica planta. Dependiendo del caso, se aprovechan bulbos
(cebolla), cormos (gladiolos), rizomas (helechos), tubrculos (papas), tallos
(banana), races (batata o boniato, manzana, mora), hojas (begonia, espada de
San Jorge), estacas (vid), etc. Las plantas obtenidas por propagacin asexual o
vegetativa son idnticas a la planta madre e idnticas entre s. En otras palabras,
son clones.
Se denomina totipotencia a la capacidad de una clula de generar rplicas del
organismo del cual deriva. Restringida en animales, esta propiedad caracterstica
de las plantas permite la supervivencia en condiciones ambientales desfavorables
o luego del ataque de herbvoros, plagas y patgenos.
El cultivo in vitro o la micropropagacin se inicia con la extraccin de pequeos
fragmentos de tejido tomados de diversas partes de la planta, tales como hojas,
races, segmentos nodales y gemas axilares, gemas florales y apicales (Figura 1).
Una vez limpios y desinfectados, los explantes son transferidos en condiciones
aspticas a un medio de cultivo adecuado. Subcultivos peridicos de dichos
explantes permiten la amplificacin del material y, ms tarde, su diferenciacin de
modo de generar una planta completa.

Figura 1. Las diversas partes de una planta angiosperma.

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POR QU ENSEAR LAS TCNICAS DE MICROPROPAGACIN?

El cultivo in vitro puede desarrollarse inicialmente en un espacio reducido e

independientemente de factores climticos y estaciones del ao. Se calcula que 10
m2 de estantes son suficientes para el cultivo de 20.000 plantines.
El nmero de individuos que se produce por cultivo in vitro es mucho mayor al
nmero de individuos que podra obtenerse por el mtodo de multiplicacin
tradicional. El cultivo de una gema de eucalipto puede originar en un ao 75
trillones de mudas en vez de las 100 o 200 que se obtienen habitualmente por
estaquillado. Estos resultados son de gran inters para las industrias del papel,
celulosa y maderera.
El cultivo in vitro permite la produccin y distribucin de mudas libres de patgenos
a partir de tejidos meristemticos, que no estn infectados por virus. Un ejemplo
es la produccin de tubrculos de papa libres de virus para la inclusin en
programas de certificacin de papa-semilla.
Tambin permite la produccin de semillas sintticas, que consisten en un
embrioide formado a partir de una masa de tejidos obtenida in vitro, envuelta en
una sustancia gelatinosa con nutrientes y cubierta por un plstico biodegradable.
El conjunto constituye una semilla artificial que se desarrolla normalmente cuando
se siembra en la tierra. Lanzada desde aviones, estas semillas facilitan la
reforestacin en regiones degradadas de difcil acceso.
Las tcnicas de cultivo in vitro de vegetales fueron asimiladas rpidamente por las
empresas e instituciones de investigacin y desarrollo, porque facilitan el
mejoramiento gentico de las variedades comerciales y, tambin, porque
representan una etapa indispensable en la obtencin de una planta transgnica.
Siendo tcnicas de dominio pblico, relativamente simples y de bajo costo,
numerosas empresas las utilizan, en todo el mundo, para garantizar la calidad
gentica y fitosanitaria de las mudas y semillas comercializadas. Esta tecnologa
est ampliamente difundida en Amrica Latina, donde representa el segundo
producto ms comercializado de la biotecnologa agrcola, con una amplia difusin
en la olericultura, en la horti-fruticultura, floricultura y en la propagacin de plantas
ornamentales, as como en la produccin de plantas de inters industrial (caa de
azcar, caf) y de mudas forestales para la industria del papel.

EN EL LABORATORIO DE ENSEANZA

Los complejos protocolos de investigacin en micropropagacin vegetal exigen

reactivos o condiciones de trabajo no habituales en el laboratorio de enseanza,
pero eso no significa que sea imposible desarrollar algunas actividades.
Cules son los requerimientos mnimos? Un espacio de laboratorio limpio, una
olla a presin, numerosos frascos de mayonesa o mermelada con sus respectivas
tapas, algunos reactivos para la preparacin de medios, un microscopio o lupa
binocular, y un lugar con iluminacin directa para la incubacin de los cultivos.

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Un aparato de flujo laminar es bienvenido, pero tambin se puede trabajar dentro

de una caja plstica (50cm x 40cm x 40 cm) previamente desinfectada. Con estos
materiales y sabiendo mantener la asepsia, es posible dar inicio a varios
experimentos simples de cultivo de tejidos vegetales (Figura 1).
Diferentes de las tcnicas de propagacin vegetativa, las tcnicas de cultivo de
tejidos vegetales representan, en el laboratorio de enseanza, un desafo
considerable para el Profesor: baja repetitividad, mucho trabajo de preparacin y
numerosas contaminaciones. La lentitud del crecimiento de los explantes puede
ser decepcionante para quien est acostumbrado a lidiar con resultados
inmediatos. De todos modos, son esas mismas dificultades las que las vuelven
ms interesantes.
Con cierta dedicacin, los experimentos pueden desarrollarse con xito. Gracias a
un movimiento del tipo DIY (Do-it yourself) conducido por personas amantes de
las plantas y la jardinera, hoy en da podemos encontrar en Internet protocolos
simples y videos entusiastas que muestran cmo proceder para el cultivo in vitro
casero de algunas plantas (Kitchen experiments).

Figura 2: El trabajo en el laboratorio de enseanza, la mesada (a la izquierda) y

el flujo laminar (a la derecha).

LOS EXPERIMENTOS

Cultivo in vitro de plantas enteras

Las semillas germinan y se desarrollan en le medio de cultivo hasta el momento

de la transferencia a tierra. Esta tcnica es aplicada comercialmente en la
produccin de orqudeas, pero en el laboratorio de enseanza conviene comenzar
con simientes mayores y que germinen ms rpido.
Tuvimos bastante xito con el cultivo in vitro de embriones de maz. Dentro de
esta modalidad, se trata de separar los embriones del resto de la semilla y
transferirlos al medio de cultivo.

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Cultivo in vitro de rganos aislados

El explante puede ser extrado de un tejido (meristemas) o de un rgano (gemas

o brotes, races, anteras, etc.). La capacidad de regeneracin disminuye con la
edad de la planta y tambin depende del genotipo y de las condiciones
ambientales. Mayor en las plantas herbceas que en las leosas, dicha capacidad
est distribuida en forma desigual dentro de algunas familias de Solanceas,
Crucferas, Geraniceas, Compuestas y Liliceas.
En la literatura correspondiente, la violeta africana (Saintpaulia) figura como una
planta modelo, por ser fcil de cultivar mediante propagacin vegetativa y
adecuada para los estudios morfolgicos. Sin embargo, encontramos que las hojas
son muy difciles de desinfectar y tuvimos mejores resultados con las hojas de los
embriones foliares de Kalanchoe daigremontiana (Bryophyllum). Tambin
obtuvimos resultados satisfactorios con brotes de papa, races de arvejas, gemas
de repollo y flores de coliflor y brcoli.

Cultivo in vitro de callos

Un callo es una masa de clulas indiferenciadas que crece a partir de un explante.

Una vez establecido en un medio de cultivo, el callo puede ser subdividido cada
tres o cuatro semanas y mantenido indefinidamente en un medio nutritivo de igual
composicin. Su transferencia a medios de cultivo con diferentes concentraciones
de hormonas induce la embriognesis y/o la organognesis. En el laboratorio de
enseanza, zanahorias y batatas (boniatos) produjeron callos espectaculares.

Cultivo in vitro de clulas aisladas

Los cultivos de clulas aisladas en medio lquido apuntan a la produccin de

metabolitos secundarios en fermentadores industriales (alcaloides, perfumes,
enzimas, hormonas, etc.). Hasta el momento no realizamos ningn experimento
de este tipo, pero ya obtuvimos protoplastos por digestin enzimtica de la pared
celular.

LOS PROCEDIMIENTOS

Un entrenamiento bsico en tcnicas microbiolgicas evita numerosas

decepciones.
Antes de iniciar cualquier procedimiento es necesario preparar el medio de cultivo
(Gua 96: Micropropagacin- Los medios de cultivo). Adems de medios complejos
existen medios alternativos de formulacin simple y bajo costo (Gua 111:
Micropropagacin- La desinfeccin de los instrumentos).
Se debe desinfectar el lugar de trabajo con alcohol 96. Tambin es recomendable
lavarse bien las manos y los antebrazos con agua y jabn, y finalmente, pasarse
alcohol 70.

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Salvo que se tenga una buena prctica microbiolgica, hay que evitar el flameado
por el mechero de Bunsen (el alcohol es inflamable) sustituyendo la desinfeccin
de los instrumentos por la inmersin en alcohol o agua sanitaria (lavandina, o agua
jano, segn su denominacin en distintos pases).
Antes de iniciar los procedimientos, recogerse el cabello adems de quitarse relojes
o anillos. Una buena organizacin del lugar de trabajo es determinante para el
xito de las actividades.
Durante los procedimientos, usar guantes descartables sobre los cuales
eventualmente se pasar alcohol y una mscara quirrgica y, fundamentalmente
no hablar ni pasar los brazos sobre los explantes o por encima de los frascos
abiertos que contienen medio. Evitar tambin abrir y cerrar las puertas y la
circulacin de personas en el laboratorio.
Todo el material contaminado ser esterilizado y posteriormente, eliminado.

LOS OBJETIVOS POSIBLES

PRIMER OBJETIVO: ESTABLECIMIENTO DE UN CULTIVO ASPTICO

Los pasos necesarios para el establecimiento de un cultivo asptico son los

siguientes:

Obtencin de los explantes

Desinfeccin de la superficie del explante

Lavado en agua destilada estril

Diseccin final y transferencia al medio de cultura

Incubacin

Obtencin de los explantes

Limpiar cuidadosamente con agua y jabn el material elegido (hojas, tallos, races,
etc.) dando preferencia a las partes jvenes y saludables.

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Desinfeccin de la superficie del explante

Sumergir el material retirado de la planta madre en etanol 70, durante uno a dos
minutos, antes de desinfectarlo con un agente qumico como el hipoclorito de sodio
(NaClO con 0,5-1% de principio activo) en solucin, a la que se agregar una gota
de detergente.
La concentracin de la solucin de hipoclorito y el tiempo necesario para la
desinfeccin vara con el tipo de explante. La funcin del detergente es disminuir
la tensin superficial, favoreciendo el contacto entre el explante y el desinfectante.
La agitacin suave y continua durante el proceso cumple la misma funcin.
El hipoclorito de sodio ser eliminado mediante tres lavados con agua destilada
estril (Gua 90: Micropropagacin- La desinfeccin de los explantes). A
continuacin, puede ser necesaria una diseccin en condiciones aspticas para
eliminar las partes daadas de los explantes.

Transferencia al medio de cultivo

El medio de cultivo puede estar distribuido en tubos de ensayo, en placas de Petri

o en frascos de diverso tamao. Transferir los explantes en condiciones aspticas,
semejantes a las utilizadas para el cultivo de microorganismos.
Debido a la composicin del medio, ni la humedad ni la disponibilidad de agua son
factores limitantes. Para garantizar la aireacin del cultivo y una buena
oxigenacin, se sustituyen las tapas de los frascos por PVC.

Figura 3. Sustitucin de las tapas por film de PVC.

Incubacin

En temperatura entre 23C e 28C, con luz durante 12 a 14 horas diarias o en la

oscuridad, dependiendo del explante.

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SEGUNDO OBJETIVO: REGENERAR UNA PLANTA

Una vez dominada la tcnica para el establecimiento de cultivos aspticos, los tres
prximos pasos para regenerar una planta son la multiplicacin de los propgulos,
la preparacin de las plntulas para la transferencia a tierra y la aclimatacin.

Multiplicacin

Al observarse crecimiento y propagacin, dividir el material y transferirlo a un

medio fresco, de modo de obtener numerosos subcultivos. En algunos casos, basta
alterar la composicin del medio para estimular la diferenciacin. Siempre en
condiciones aspticas.

Preparacin de las plntulas para la transferencia a tierra

En condiciones aspticas, transferir las plntulas de los subcultivos a un medio de

enraizamiento donde, adems de desarrollar las races, se fortalecer y comenzar
a fotosintetizar. En algunos casos se elimina el azcar del medio.

Aclimatacin

Cuando el desarrollo de la planta justifica su traspaso a tierra, se elimina el agar

y los restos de azcar por lavado. Se transfiere la planta primero a tierra o a algn
otro sustrato, ms tarde a un ambiente protegido. Protegidas de la iluminacin
solar directa, aumentarn su capacidad fotosinttica adaptndose lentamente a
las condiciones ambientales.

VALE LA PENA?

Por supuesto

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BIBLIOGRAFIA BSICA

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University Press, 1995.
FAO FOOD AND AGRICULTURAL ORGANIZATION / IAEA -INTERNATIONAL ATOMIC
ENERGY AGENCY Low cost options for tissue culture technology in developing countries,
2004. 68653-142828-1-PB.pdf
HOME TISSUE CULTURE GROUP. http://www.hometissueculture.org
KYTE L. E KLEYN J. Plants from test tubes 3th edition. Portland, Timber Press Inc., 2009.
MANTELL S.H., MATTHEWS J.A. E McKEE R.A. Princpios de biotecnologia em plantas.
Ribeiro Preto, Sociedade Brasileira de Gentica, 1994.
PIERIK R.L.M. Cultivo in vitro de las plantas superiores. Madrid, Ediciones Mundi-Prensa,
1990.
RAVEN, et al. Biologia Vegetal. Rio de Janeiro, Editora Guanabara Koogan, 2001.
SMITH R.A. Plant Tissue Culture Studies. Reston, National Association of Biology Teachers,
1997.
TORRES A.C. ET AL. Cultura de Tecidos e Transformao Gentica de Plantas. Vol.1.
Braslia, EMBRAPA-CNPH, 1998.

AGRADECIMIENTOS

A los tcnicos que a lo largo de veinte aos colaboraron en la preparacin y armado

de los experimentos de micropropagacin.

A los profesores y alumnos.

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