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ISSN 1516-7453

Outubro/2014

Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria


Embrapa Gado de Leite
Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento

Documentos 175

Biotcnicas da Reproduo em
Bovinos
Minicursos ministrados durante o 3 Simpsio
Biotcnicas da Reproduo em Bovinos no
Laboratrio de Reproduo Animal do Campo
Experimental Santa Mnica

Clara Slade Oliveira


Raquel Varella Sarapio
Carolina Capobiango Romano Quinto

Embrapa Gado de Leite


Juiz de Fora, MG
2014
Exemplares desta publicao podem ser adquiridos na:
Embrapa Gado de Leite
Rua Eugnio do Nascimento, 610 Dom Bosco
36038-330 Juiz de Fora MG
Fone: (32)3311-7400
Fax: (32)3311-7424
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www.embrapa.br/fale-conosco/sac

Comite de Publicao da Embrapa Gado de Leite


Presidente
Marcelo Henrique Otenio
Secretrio
Ins Maria Rodrigues
Membros
Alexander Machado Auad, Denis Teixeira da Rocha, Fernando Csar Ferraz Lopes,
Francisco Jos da Silva Ledo, Frank Angelo Tomita Bruneli, Jackson Silva e Oliveira,
Lenidas Paixo Passos, Letcia Caldas Mendona, Nvea Maria Vicentini, Prsio Sandir
DOliveira e Rosangela Zoccal

Superviso editorial Clara Slade Oliveira


Editorao eletrnica Carlos Alberto Medeiros de Moura
Normalizao bibliogrfica Ins Maria Rodrigues
Arte da capa Adriana Barros Guimares
Fotos Clara Slade Oliveira

1a edio
1a impresso (2014): 40 exemplares

Todos os direitos reservados


A reproduo no autorizada desta publicao, no todo ou em parte, constitui violao dos
direitos autorais (Lei no 9.610).

Dados Internacionais de Catalogao na publicao (CIP)


Embrapa Gado de Leite

Oliveira, Clara Slade.


Biotcnicas da reproduo em bovinos: minicursos ministrados durante o 3 Simpsio
Biotcnicas da Reproduo em Bovinos no Laboratrio de Reproduo Animal do
Campo Experimental Santa Mnica / Clara Slade Oliveira, Raquel Varela Serapio e
Carolina Capobiango Romano Quinto. Juiz de Fora: Embrapa Gado de Leite, 2014.
54 p. (Embrapa Gado de Leite. Documentos, 175).

ISSN 1516-7453
1. Superovulao. 2. Estimulao ovariana hormonal. 3. Embries bovinos colheita,
seleo, classificao. 4. Protocolo de superovulao. 5. Aspirao de folculos ovarianos
guiada por ultrassonografia. 6. Produo in vitro de embries - PIVE. 7. Maturao de
ocitos. 8. Fertilizao in vitro. 9. Cultivo in vitro. 10. Criopreservao. 11. Vitrificao. I.
Serapio, Raquel Varela. II. Quinto, Carolina Capobiango Romano. III. Ttulo. IV. Srie.
CDD 636-08926
Embrapa 2014
Autores

Clara Slade Oliveira


Mdica Veterinria, Doutora em Cincias Ve-
terinrias, Analista da Embrapa Gado de Leite,
Valena - RJ

Raquel Varella Serapio


Mdica Veterinria, Doutora em Biotecnologia e Me-
lhoramento Animal, Pesquisadora da PESAGRO-RIO,
Valena - RJ

Carolina Capobiango Romano Quinto


Farmacutica e Bioqumica, Mestre em Gentica e
Biotecnologia, Analista da Embrapa Gado de Leite,
Juiz de Fora - MG
Apresentao

As biotcnicas da reproduo animal so ferramentas singulares para o


avano tecnolgico da pecuria nacional, pois possibilitam a expanso
e seleo do material gentico adequado para o melhoramento animal.
Graas a um esforo contnuo, o Brasil se tornou um grande utilizador
e multiplicador destas tecnologias, o que coloca o pas na condio de
maior produtor de embries bovinos por fertilizao in vitro do mundo.

A difuso e o aprimoramento destas biotcnicas so desafios importan-


tes para os profissionais da rea, para que elas possam alcanar fra-
es cada vez mais representativas da pecuria nacional, e se tornem
ferramentas disponveis para todos os produtores.

O presente documento Biotcnicas da Reproduo em Bovinos, em sua


primeira edio, busca reforar o compromisso da difuso destas tecno-
logias. Nas pginas a seguir, os principais aspectos tericos e prticos
das biotcnicas mais utilizadas no Brasil so abordados, buscando in-
troduzir ao leitor a essncia de cada uma delas. A demonstrao prtica
das atividades, realizada nos minicursos do III Simpsio TecLeite de
Biotcnicas da Reproduo em Bovinos, realizada no Campo Experimen-
tal Santa Mnica em setembro do corrente ano, somada ao contedo
do presente documento, enriquece a leitura e traz ao participante viso
complementar destas importantes ferramentas.

Paulo do Carmo Martins


Chefe-geral
Embrapa Gado de Leite
Sumrio

uperovulao e Colheita de Embries............................................. 9


S
Dinmica folicular................................................................... 10
Superovulao........................................................................ 10
Seleo das doadoras.............................................................. 11
Seleo das receptoras............................................................ 11
Protocolo de Superovulao..................................................... 11
Seleo e classificao dos embries recuperados....................... 14
Desenvolvimento embrionrio em bovinos.................................. 15
Material utilizado para realizao da superovulao de embries.... 18
Literatura Complementar.............................................................. 18
Referncias................................................................................ 19
Aspirao Folicular em Bovinos..................................................... 21
Acessrios necessrios para o procedimento.............................. 22
Escolha das doadoras.............................................................. 23
Sincronizao de onda folicular................................................. 24
Procedimento......................................................................... 25
Literatura Complementar.............................................................. 27
Referncias................................................................................ 27
Produo In Vitro de Embries (PIVE) Bovinos................................. 31
Obteno de ocitos............................................................... 31
Maturao in vitro (MIV).......................................................... 32
Fecundao in vitro (FIV)......................................................... 36
Cultivo in vitro (CIV)................................................................ 40
Classificao dos embries....................................................... 42
Criopreservao de embries.................................................... 44
Importncia...................................................................................44
Tcnica........................................................................................44
Procedimento de vitrificao..................................................... 46
Reaquecimento dos blastocistos............................................... 46
Literatura Complementar.................................................... 47
Referncias................................................................................ 47
Superovulao e Colheita
de Embries (SOV-TE)

A tcnica de superovulao e colheita de embries consiste em re-


colher embries de uma fmea doadora, que sero transferidos para
uma fmea receptora com a finalidade de completarem o perodo de
gestao. Representa uma biotecnologia mundialmente difundida, e
um importante instrumento para o melhoramento gentico de reba-
nhos, acelerando e conferindo maior preciso no processo de sele-
o animal (BARUSELLI et al., 2006).

A fmea bovina monoovulatria, portanto apenas um ocito deve


ser liberado de um folculo durante seu ciclo estral. O princpio da
tcnica de superovulao envolve o conceito de induzir a ovula-
o de vrios folculos, e a liberao de vrios ocitos, e permitir a
fertilizao e o desenvolvimento destas estruturas at o estdio de
blastocisto. Assim, so coletados vrios embries de uma fmea
superovulada, o que permite a disseminao de sua gentica de for-
ma mais abrangente do que no caso da inseminao artificial, onde
apenas um embrio formado. Este resultado alcanado atravs
da aplicao de hormnios, que impedem o fenmeno de dominncia
folicular, observado nas vacas (B et al., 2006).
10 Biotcnicas da Reproduo em Bovinos

Dinmica folicular
Durante a onda de crescimento folicular, trs fases esto presentes. O
recrutamento corresponde ao incio do crescimento de vrios folculos,
desencadeado pelo hormnio folculo estimulante (FSH). A segunda
fase corresponde seleo e dominncia: um folculo cresce mais do
que os outros, e se torna dominante. A presena de um folculo maior
inibe o crescimento dos demais folculos. O crescimento folicular nesta
fase depende do FSH e de pulsos basais de LH. O folculo dominante
produz alta concentrao de estrgeno (17b estradiol). A terceira fase
a ovulao, que desencadeada pelo pico de LH liberado pela hipfise.
A ovulao somente ocorre se, no momento em que o folculo dominan-
te produz alta concentrao de estrgeno, no existam nveis elevados
de progesterona. Ou seja, caso um corpo lteo funcional esteja presen-
te, no haver liberao de pico de LH nem a ovulao. Os folculos da
onda que no ovularem (incluindo os folculos dominantes), entraro em
atresia processo de degenerao das estruturas. Portanto, normal-
mente apenas um folculo ovula por ciclo estral, liberando um ocito. O
ciclo estral da vaca compreende 2 a 3 ondas de crescimento folicular,
porm somente uma terminada na ausncia de nveis elevados de
progesterona (GINTHER et al., 1989; AERTS e BOLS, 2010).

Superovulao
Os protocolos de superovulao visam promover o crescimento e ovu-
lao de todos os folculos recrutados. Para tanto, a onda folicular
sincronizada, e altas doses de FSH so administradas aos animais antes
que se estabelea a dominncia. Assim, os efeitos inibitrios do folculo
dominante sobre o crescimento dos demais folculos so bloqueados,
e os efeitos deletrios da atresia sobre a qualidade dos ocitos ovula-
dos so evitados. Portanto, o hormnio folculo estimulante em altas
concentraes promove o crescimento simultneo de vrios folculos
com caractersticas fisiolgicas semelhantes daqueles selecionados para
ovularem. A divergncia folicular impedida, e os folculos tercirios
que seriam fadados a atresia se tornam folculos ovulatrios (CARVA-
LHO et al., 2008).
11 Biotcnicas da Reproduo em Bovinos

Seleo das doadoras


As fmeas selecionadas para participar de programas de superovulao
devem ser geneticamente superiores, e apresentar adequado estado
nutricional. Ao contrrio do que ocorre na produo in vitro de embri-
es, na qual todo o processo de embriognese ocorre no laboratrio, no
procedimento de SOV o sistema reprodutivo da doadora utilizado para
produzir os embries. Portanto, a mesma deve apresentar ciclos estrais
regulares. Ao exame reprodutivo, importante descartar animais apre-
sentando defeitos anatmicos, tais como desvio de cervix, distrbios
reprodutivos, incluindo patologias de etiologia gentica que podem
ser transmitidas aos descendentes e adquiridas, como aderncias
uterinas, de tuba, ovrio, mucometra, entre outras. Estas condies im-
pedem a coleta, o desenvolvimento e transporte adequado dos gametas
e embries, inviabilizando o procedimento (BARUSELLI et al., 2006).

Seleo das receptoras


A seleo das receptoras um ponto crtico. A aquisio das fmeas
custosa e delicada, e o ideal a utilizao de animais do prprio reba-
nho para evitar problemas infecciosos (SCANAVEZ et al., 2013). Aqui
no Campo Experimental Santa Mnica (CESM), as receptoras utilizadas
so novilhas pesando mais de 350 kg, com porte adequado raa da
doadora do embrio a ser transferido, e com condies reprodutivas
adequadas. O animal deve ter apresentado pelo menos dois cios regula-
res, no demonstrar distrbios de pelve e nutricionais, e ter condies
uterinas adequadas, sem assimetria e sinais de endometrite. A escolha
das receptoras crucial para o sucesso do programa de TE, pois qual-
quer distrbio pode causar reabsoro embrionria, abortamento, e at
mesmo distocias no momento do parto.

Protocolo de Superovulao
O Protocolo apresentado foi adaptado para animais mestios Gir-Holan-
ds, e utilizado com sucesso nas condies do CESM.

Diluio do FSH O protocolo hormonal utilizado foi delineado para


animais mestios. A quantidade de FSH administrada pode variar de
12 Biotcnicas da Reproduo em Bovinos

acordo com caractersticas raciais e tambm individuais. A dose ideal


deve ser ajustada de acordo com a resposta de cada doadora.

1. Diluir o contedo liofilizado de FSH (1.000 UI) em 21 mL de so-


luo fisiolgica. Em seguida, dividir o contedo em 03 frascos
contendo 7 mL cada.
2. Acrescentar 13 ml de soluo fisiolgica em cada frasco, de modo
a completar para um volume final de 20 mL.
3. Preparar duas seringas dos seguintes volumes: 4 mL, 3 mL, 2 mL e
1 mL duas de cada, correspondendo ao volume final de 20 mL.
4. Identificar as seringas com os dias para aplicao de cada uma
(opcional) exemplo: 6 manh, 6 tarde, sbado manh, sba-
do tarde, domingo manh, domingo tarde, 2 manh, 2 tarde -, e
completar cada seringa para 5 mL com soluo fisiolgica. (Este
procedimento evita possveis perdas na aplicao de volumes
pequenos, mas as seringas podero ser confundidas caso no haja
identificao adequada).

Sincronizao da onda folicular (d0) - Este procedimento visa zerar as


ondas foliculares existentes e iniciar uma nova onda. Na presena de
progesterona, o benzoato de estradiol induz a atresia de todos os folcu-
los ovarianos, e uma nova onda folicular emergir em 4 dias.

Para este fim, inserir o dispositivo de progesterona (implante auricular


ou vaginal) e aplicar 2 mg de benzoato de estradiol.

Aplicao de FSH para driblar o fenmeno de seleo e dominncia


(d5 a d8) Suplementar o FSH a partir do quinto dia do protocolo, em
doses decrescentes conforme especificado abaixo:
- dia 5: 66 UI (seringa de 4 mL) pela manh e tarde;
- dia 6: 50 UI foram aplicadas (seringa de 3 mL) pela manh e pela
tarde;
- dia 7: 33 UI foram aplicadas (seringa de 2 mL) pela manh e pela
tarde;
- dia 8: 16 UI foram aplicadas (seringa de 1 mL) pela manha e pela
tarde.
13 Biotcnicas da Reproduo em Bovinos

Lise do corpo lteo, fonte endgena de progesterona (d7) Na tarde do


stimo dia do protocolo, aplicar nas doadoras via intramuscular 225 mg
(3 mL) de d-clorprostenol, anlogo da PGF2, para promover a lise do
CL.

Induo de ovulao dos folculos crescidos (d9) e inseminao (d9


e 10) Ao final do tratamento com FSH, os folculos j estaro cres-
cidos e dever ser aplicado um indutor de ovulao, por exemplo, um
medicamento anlogo ao GnRH (buserelina), na quantidade de 0,02
mg (5 mL) no nono dia. A inseminao artificial deve ser realizada 12 h
aps (dia 9 do protocolo tarde), e se possvel repetida no dcimo dia
do protocolo pela manh.

Procedimento de colheita dos embries A colheita dos embries


realizada no stimo dia aps a segunda inseminao artificial. Neste pe-
rodo, os embries esto flutuando no lmen da ponta dos cornos uteri-
nos, e se apresentam normalmente em fase de mrula ou blastocisto.

Com o animal contido no tronco, realizada higienizao da regio


perineal do mesmo. Em seguida, a doadora anestesiada por injeo
epidural baixa de 0,06 g de cloridrato de lidocana (3 mL).

O expansor de crvix pode auxiliar o procedimento em animais de cer-


vix estreita, como normalmente o caso de novilhas. Este instrumento
passado no interior da crvix.

A sonda de Foley estril deve ser inserida via intracervical com o auxlio
de um mandril, e posicionada no corpo uterino. O balo deve ser inflado
com ar, at fixar a sonda no local desejado. O mandril retirado, e uma
sonda um Y acoplada sonda de Foley, compondo o sistema fechado
de colheita de embries (Figura 1). Em suas outras extremidades, so
fixados o frasco de DPBS, e o copo coletor de embries.

O sistema contm uma trava em cada extremidade, para controle da


entrada e sada do lquido instilado, formando uma presso negativa
que facilita a retirada do contedo, por sifonagem.
14 Biotcnicas da Reproduo em Bovinos

A soluo utilizada, Dulbecco Phosphate Buffered Saline (DPBS)


uma soluo salina tamponada, com osmolaridade e pH fisiolgico, de
forma a manter as caractersticas do embrio. Tambm contm antibi-
tico, reduzindo as possveis contaminaes.

O copo coletor apresenta um filtro que permite a reteno apenas dos


embries, desprezando o restante do contedo recuperado. Instila-se o
contedo at encher os cornos, fecha-se a trava da sada do DPBS, e
a sada para o copo coletor aberta, recolhendo o lquido instilado. A
operao repetida vrias vezes, at lavar o tero com cerca de 1 L,
quando o balo desinflado e retirada a sonda do animal. A sonda
pode ser fixada no corpo do tero, lavando o tero de uma s vez, ou
na base de cada corno uterino, e a lavagem realizada em um corno
por vez.

Seleo e classificao dos embries recuperados


1. Deixar todo o lquido retido no sistema escorrer ao copo coletor.
2. Retira-se o copo, e com auxlio de seringa agulhada, o filtro lava-
do com DPBS, e transfere-se o contedo para uma placa de Petri
15 Biotcnicas da Reproduo em Bovinos

(placa de rastreamento). Com uma caneta de retroprojetor, marcar


a placa para facilitar a procura.
3. Em outra placa de Petri, distribuir dez gotas de soluo de manuten-
o de embries. No microscpio estereoscpico, selecionar as estru-
turas recuperadas presentes na placa de rastreamento, e com auxilio
de uma micropipeta transferir os embries para a primeira gota de
meio. Os embries devem ser lavados em todas as gotas do meio
para diminuir a possibilidade de contaminao, de acordo com as
recomendaes da Sociedade Internacional de Transferncia de Em-
bries (International Embryo Transfer Society- IETS). Os embries
so classificados por sua morfologia em mrula, blastocisto inicial e
blastocisto, que so normalmente as estruturas encontradas quando
a coleta feita no 7o dia aps a IA, alm de estruturas degeneradas.
4. Os embries produzidos no CESM pela tcnica de superovulao
so destinados criopreservao, e sero transferidos futuramen-
te para receptoras, no 7 dia aps cio. O resumo esquemtico do
protocolo apresentado encontra-se na Figura 2.

Desenvolvimento embrionrio em bovinos


Embrio um organismo nos primeiros estdios de desenvolvimento,
que no apresenta ainda caractersticas anatmicas que permitam a
16 Biotcnicas da Reproduo em Bovinos

identificao de sua espcie um embrio de bovino semelhante a


um embrio de camundongo, por exemplo.

Feto um organismo que j se apresenta potencialmente formado,


caracterizado anatomicamente por sua espcie, mas ainda depende das
condies uterinas para sobrevivncia.

A embriognese em mamferos se inicia com a fecundao do ocito e


formao do zigoto (Figura 3). A singamia o processo de fuso entre
o proncleo feminino e masculino, aps a fertilizao do ocito pelo
espermatozide (WATSON & BARCROFT, 2001).

Clivagens Por um perodo varivel entre espcies, o zigoto sofre su-


cessivas clivagens ciclos de divises mitticas. As clulas dos embri-
es so denominadas blastmeros. As clulas do zigoto e dos embries
de 2, 4 e 8 clulas so totipotentes podem dar origem a indivduos
completos e aos componentes fetais da placenta (SENGER, 2003).

Morulao A formao da mrula ocorre no estdio de 16 a 32 clu-


las, e corresponde ao aparecimento de junes tipo GAP nas clulas in-
ternas, que permitem a comunicao entre elas alm de fazer com que
17 Biotcnicas da Reproduo em Bovinos

as mesmas permaneam fortemente unidas. As clulas externas desen-


volvem as junes tight entre as clulas, fazendo com que as mesmas
apresentem forte comunicao. Se torna difcil a distino dos blast-
meros nestas estruturas, e sua contagem, por sua compactao. Assim,
o sdio bombeado para espaos intercelulares e por osmose a gua se
acumula nestes locais, formando a blastocele (STANTON et al, 2003).

Blastulao - Neste estdio, formado o primeiro grupo de clulas que


contribuir para a formao de um novo indivduo, denominado massa
celular interna - a poro embrionria dos blastocistos. Esta diferencia-
o ocorre quando o acmulo de lquido e a blastocele (cavidade em-
brionria) so estabelecidos. Este grupo de clulas permanece protegido
da exposio ao lquido, e se mantm pluripotente. As clulas externas
do embrio se diferenciam em clulas trofoblsticas um grupo de
clulas que dar origem poro embrionria da placenta. Aps a ex-
panso dos blastocistos, ocorre a segregao da massa celular interna
em clulas que constituiro o endoderma primitivo (que mais tarde dar
origem ao saco vitelino), e em clulas pluripotentes, do epiblasto (que
daro origem ao indivduo). A partir do estdio de blastocisto, clulas
trofoblsticas no contribuem mais para a formao das linhagens deri-
vadas da massa celular interna (SENGER, 2003).

Ecloso Aps o desenvolvimento do blastocisto, preciso que haja


a ecloso do mesmo para que seja possvel sua implantao. Primeira-
mente, o blastocisto precisa aumentar o nmero de clulas e acumular
lquido suficiente na blastocele, para que exera presso adequada so-
bre a zona pelcida. As clulas trofoblsticas ento iniciam a produo
de enzimas proteolticas que promovero o enfraquecimento da zona
pelcida, que facilmente rompida quando ocorre o aumento da pres-
so. Nos ltimos estdios do processo, o blastocisto intercala pulsos
de contrao e relaxamento, e estes pulsos de presso gerados cau-
sam a ruptura final da zona pelcida. Assim, o embrio adquire contato
direto entre as clulas trofoblsticas do embrio e as clulas uterinas da
fmea gestante, dando inicio ao processo de implantao embrionria
(WATSON et al., 2004).
18 Biotcnicas da Reproduo em Bovinos

Para Classificao de Embries e Vitrificao de Embries, acessar o


captulo de Produo in vitro de Embries.

Material utilizado para a realizao da superovulao e


colheita de embries
- Estereomicroscpio (70 X)
- Sondas uterinas de Foley (tamanhos 18, 20, 22)
- Mandril para fixao da sonda
- Sistema coletor (equipo) em Y
- Filtros com copo coletor para coleta de embries
- Seringas descartveis de 20 ml
- Seringas descartveis de 50 mL
- Agulha 19G
- Placas de Petri 100 x 20 mm
- Placas de Petri 40 x 10 mm
- Micropipetador 5-20 uL
- Palheta de 0,25 mL
- DMPBS
- Soluo Holding
- Ponteiras descartveis

Literatura Complementar
GONALVES, P. B. D.; FIGUEIREDO, J. R.; FREITAS, V. J. F. Biotcni-
cas Aplicadas Reproduo Animal. So Paulo: Varela, 2002. 340 p.

HAFEZ, E. S. E.; HAFEZ, B. Reproduction in Farm Animals. 7. ed.


Maryland: Lippincott Williams & Wilkins, 2000. 528 p.

PALMA, G. A. Biotecnologia de la Reproduccin. Local: Argentina.


Ediciones Instituto Nacional de Tecnologia Agropecuaria (INTA),
2001. p. 149-197.

SENGER, P. L. Pathways to Pregnancy and Parturition. 2. ed. Local:


Moscow, Indiana. Current Conceptions, Inc., 2003. p. 284-296.
19 Biotcnicas da Reproduo em Bovinos

Referncias
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with emphasis on the bovine species. Part II: antral development, exo-
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BARUSELLI, P. S.; DE S FILHO, M. F.; MARTINS, C. M.; NASSER, L.


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and embryo transfer in Bos indicus cattle. Theriogenology, v. 65, p. 77-
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B, G. A.; BARUSELLI, P. S.; CHESTA, P. M; MARTINS, C. M. The ti-


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Theriogenology, v. 65, p. 89-101, 2006.

CARVALHO, J. B. P.; CARVALHO, N. A. T.; REIS, E. L.; NICHI, M.;


SOUZA, A. H.; BARUSELLI, P. S. Effect of early luteolysis in progestero-
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GINTHER, O. J.; KNOPF, L.; KASTELIC, J. P. Temporal associations


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SCANAVEZ, A. L.; CAMPOS, C. C.; SANTOS, R. M. Taxa de prenhez e


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tion of blastocyst formation Animal Reproduction Science, v. 82-83, p.
583-592, 2004.
Aspirao Folicular Guiada
por Ultrassonografia

A utilizao das tcnicas da reproduo assistida considerada a base


da produo pecuria mundial, tornando-se cada vez mais importante
para enfrentar parte dos desafios que surgiro nas prximas dcadas.
Devido a isso, a utilizao da tcnica de aspirao folicular associada
produo in vitro de embries (OPU-PIV), possibilitar aumentar o
nmero de nascimentos por fmea de alto valor gentico, melhorando
o ganho gentico anual de 2% proporcionado pela inseminao artificial
para aproximadamente 2,5% (VISHWANATH, 2003).

A aspirao folicular transvaginal orientada por ultra-sonografia ou OPU


(Ovum Pick Up) a tcnica de eleio para a obteno de ocitos de
doadoras vivas, em bovinos, destinados produo in vitro de embries
(PIV). Esta biotecnologia encontra-se difundida por vrios pases, mas
o Brasil alcanou uma posio de destaque frente ao nmero surpre-
endente de embries produzidos por esta tcnica no pas (STROUD e
CALLESEN, 2012).

Entre os fatores que podem influenciar os programas OPU-PIV pos-


svel considerar fatores mecnicos tais como: aparelho de ultrassom
(GALLI et al., 2001), domnio da tcnica de aspirao pelo operador
(SCOTT et al., 1994), presso da bomba de vcuo (HASHIMOTO et
al., 1999), tipo de agulha utilizada (BOLS et al., 2004) e frequncia
22 Biotcnicas da Reproduo em Bovinos

de aspirao (MERTON et al., 2003). E entre os fatores biolgicos


possvel destacar: raa (DE ARMAS et al., 1994), idade (MERTON et
al., 2003), estado reprodutivo (BUNGARTZ et al., 1995), fase do ciclo
estral (MACHATKOV et al., 1996), status nutricional (OLIVEIRA
et al., 2002), estresse trmico (TORRES-JNIOR et al., 2008), alm
da variabilidade de resposta dos animais e dos sistemas de cultivo in
vitro empregados (LONERGAN e FAIR, 2008). A influncia destes fa-
tores pode diminuir a competncia dos ocitos para o desenvolvimen-
to in vitro, afetando a produo e qualidade dos embries, causando
perdas de material gentico e perdas econmicas nos programas OPU-
-PIV (BLONDIN e SIRARD, 1995).

Acessrios necessrios para o procedimento


So importantes porque afetam consideravelmente a quantidade e quali-
dade dos complexos cumulus-ocitos (CCOs) recuperados, e consequen-
temente a viabilidade destes para a produo in vitro dos embries.

Agulhas para aspirao folicular Inicialmente, a aspirao era rea-


lizada com agulhas longas, produzidas especialmente para aspirao
folicular. Estas agulhas apresentavam alto custo e rapidamente perdiam
o corte mas, apesar disso, eram usadas para vrios animais visando
minimizar o custo do procedimento, a despeito das extensas leses que
causavam nos ovrios das doadoras. Hoje, comum a utilizao de
agulhas descartveis, de 18 e 19 G, para o procedimento. Elas podem
ser substitudas com maior frequncia, diminuindo os danos aos ovrios
das doadoras (BOLS et al., 2004).

Presso negativa do sistema, gerada por bomba de vcuo A presso


do sistema afeta a recuperao e a qualidade dos CCOs. Altas presses
danificam os ocitos, provocando perda das clulas do cumulus e rup-
tura da zona pelcida. Por outro lado, presses muito baixas dificultam
a recuperao e facilitam tanto a aderncia das estruturas no circuito
como a formao de cogulos. A presso ideal deve ser ajustada a cada
sistema e bombas de vcuo que permitam a estabilidade da presso
ajustada, sem permitir variaes, so preferveis. Normalmente, esta
presso ideal est entre 60 e 100 mm de mercrio. Como existem dife-
23 Biotcnicas da Reproduo em Bovinos

rentes modelos de bombas de vcuo no mercado que podem apresentar


diferentes calibragens na presso do vcuo, a maneira mais adequada
para ajustar a presso negativa do aparelho mensurar em volume de
lquido aspirado por minuto. Neste caso recomenda-se presso entre 10
e 20 mL de liquido aspirado por minuto (HASHIMOTO et al., 1999).

Transdutor Diversos transdutores esto disponveis no mercado, com


diferentes especificaes e finalidades. O profissional deve considerar
se o equipamento ser de uso exclusivo ou no para puno, e procurar
a resoluo que consiga trabalhar de forma adequada. Normalmente,
so utilizados para puno transdutores de 7.5 MHz, porm outras
alternativas esto disponveis (GALLI et al., 2001).

Rolha, tubos Falcon, circuito Deve-se levar em considerao a possi-


bilidade de reutilizao do material aps esterilizao, uma vez que nem
todos os materiais so adequados para este fim. Muitas opes esto
disponveis no mercado, cabendo ao profissional selecionar com critrio
materiais com custo e beneficio interessantes.

Escolha das doadoras


Alguns animais apresentam, naturalmente, uma tendncia para recru-
tamento de um maior nmero de folculos e, por isso, tormam-se mais
atrativos para serem escolhidos como doadoras de ocitos. Para a maio-
ria dos objetivos, as doadoras devem apresentar composio gentica
privilegiada. Patologias adquiridas, como aderncias de tuba, tero, entre
outras no impossibilitam a puno folicular. Da mesma forma, animais
gestantes, ou com patologias uterinas como mucometra, tambm podem
ser aspirados desde que seja possvel manusear os ovrios, e que eles
estejam em boa condio de ciclicidade (SENEDA et al., 2001).

O uso de animais com cistos ovarianos e outras patologias que oca-


sionem desbalano hormonal como doadoras no aconselhvel, pois
reflexos negativos sobre a qualidade dos gametas so observados.

Animais pr-pberes fornecem ocitos com reduzida competncia ao


desenvolvimento. H relatos de que animais senis tambm tendem a
24 Biotcnicas da Reproduo em Bovinos

apresentar ocitos de qualidade inferior, assim como animais subnutri-


dos em condies de estresse.

Fmeas de raas europeias tendem a apresentar nmeros inferiores de


ocitos recuperados em relao a fmeas zebunas. Isso ocorre porque
existe um maior nmero de folculos recrutados na onda folicular de
animais zebunos.

Grande parte do sucesso e difuso da tcnica de produo in vitro de


embries no Brasil se deve a esta caracterstica, observada em animais
Nelore, por exemplo (PONTES et al., 2011).

Sincronizao de onda folicular


Devido aos fenmenos de seleo e dominncia que ocorrem durante
as ondas de crescimento folicular das fmeas bovinas, o momento
do ciclo estral em que se faz a aspirao folicular pode interferir na
quantidade e na qualidade dos CCOs recuperados. A presena de um
folculo dominante inibe o crescimento dos demais folculos, e os ga-
metas iniciam degenerao. Por isso, para aumentar a competncia ao
desenvolvimento dos CCOs recuperados, recomenda-se a sincroniza-
o da onda de crescimento folicular das doadoras de ocitos. Assim,
os ocitos so recuperados no incio da onda folicular, evitando os
efeitos prejudiciais do folculo dominante (PFEIFER et al., 2009).

Alm disso, o tamanho uniforme dos folculos possibilita melhores


taxas de recuperao. O dimetro dos folculos recomendado para
recuperao de 2 a 8 mm. Folculos muito grandes correspondem a
taxas de recuperao inferiores s obtidas em folculos menores (VAS-
SENA et al., 2003).

A sincronizao da emergncia de uma nova onda folicular pode ser


realizada de diferentes maneiras. O FSH e o eCG estimulam o cresci-
mento de folculos adicionais, sendo indicados para doadoras de o-
citos. O benzoato de estradiol na presena de altas concentraes de
progesterona promove o incio de uma nova onda, quatro dias aps a
25 Biotcnicas da Reproduo em Bovinos

aplicao. Por isso, muitos tcnicos utilizam este protocolo 5 a 7 dias


antes da aspirao folicular. A aplicao de anlogos da prostaglandi-
na F2 promove a lise do corpo lteo, que por ser muito vascularizado
dificulta o procedimento de aspirao.

Outra forma interessante de provocar a emergncia de uma nova onda


folicular a aspirao do folculo dominante 72 horas antes da OPU.

Procedimento
A fmea doadora de ocitos devidamente contida no tronco, e sua
higienizao realizada, lavando com gua e sabo a regio perineal e
a cauda. Com agulha descartvel 19 G, realizada anestesia epidural
no espao sacrococcgeo, com 40 mg a 80 mg (2 a 4 mL) de cloridrato
de lidocana, que varia com o tamanho e temperamento do animal.

Com a mo esquerda enluvada no reto do animal, introduzimos o trans-


dutor setorial adaptado para a puno na vagina e, em seguida, a guia
apresentando uma agulha descartvel em sua extremidade, acoplada
ao transdutor. Localizamos os ovrios e os tracionamos, um de cada
vez, para a superfcie de contato do transdutor, que toca a parede do
saco vaginal. A imagem gerada no monitor corresponde ao ovrio e
suas estruturas, sendo os folculos apresentados de forma anecica
(preto), pela presena de lquido, e o parnquima de forma ecognica
(cinza claro) (Figura 4).

Durante a sesso de aspirao, os folculos so contados para que seja


calculada a taxa de recuperao. Com auxlio de linha demarcada no
monitor, o ovrio posicionado e a agulha introduzida no interior de
cada folculo a ser aspirado. A partir da guia de puno, segue um cir-
cuito fechado, que desemboca em tubo Falcon com DPBS, heparina (10
UI/mL) e soro fetal bovino. No tubo Falcon ligada uma mangueira de
silicone, que acaba em bomba de vcuo (Figura 5). Esta bomba, quando
acionada, promove a suco do lquido folicular para o tubo Falcon, e
regulada para aproximadamente 90 mm Hg.
26 Biotcnicas da Reproduo em Bovinos
27 Biotcnicas da Reproduo em Bovinos

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Produo In Vitro de
Embries (PIVE) Bovinos

A PIVE uma tcnica de reproduo assistida que consiste na prepara-


o e co-cultivo de gametas em ambiente laboratorial para gerao do
zigoto, e seu cultivo at o estdio de desenvolvimento embrionrio de-
sejado. A PIVE est relacionada a uma srie de procedimentos integra-
dos, que vo desde o manejo reprodutivo das doadoras e receptoras,
puno folicular guiada por ultrassom, procedimentos no laboratrio at
a transferncia dos embries. Portanto, trata-se de um processo que
demanda planejamento e equipe especializada (RIZOS, 2008).

As principais aplicaes desta biotcnica envolvem:


1. reproduo assistida de animais (fmeas) de alto valor gentico por-
tadores de patologias reprodutivas adquiridas (FABER et al., 2003);
2. melhoramento gentico animal (aumento da intensidade de seleo
e reduo do intervalo entre geraes) (VARAGO et al., 2008);
3. pesquisa dos processos envolvidos na fecundao de gametas e
no desenvolvimento embrionrio inicial (AHUMADA et al., 2013);
4. possibilidade de formao de um banco de germoplasma para
conservao de espcies (HASLER, 2014).

Obteno de ocitos
Podem ser obtidos de doadoras vivas, atravs da aspirao folicular,
ou, a partir da puno de ovrios de fmeas abatidas em abatedouros.
32 Biotcnicas da Reproduo em Bovinos

Aspirao folicular in vivo: Obteno de ocitos a partir de animais


vivos. No passado, era realizada por laparotomia, dificultando o
procedimento pelas complicaes ps-cirrgicas (incluindo aderncias
ovarianas), tempo e custo relacionados (CALLESEN et al., 1987).
Com o advento da tcnica de puno folicular guiada por ultrassono-
grafia na dcada de 80, o processo se tornou menos invasivo, pos-
sibilitando otimizao da tcnica com relao ao nmero de animais
puncionados e freqncia de sesses realizadas no mesmo animal.
Aspirao folicular a partir de ovrios coletados em abatedouro:
Imediatamente aps o abate, os ovrios so coletados e transpor-
tados ao laboratrio, onde folculos entre 2 a 8 mm so aspirados
com auxlio de agulha acoplada a seringa ou bomba de vcuo. Este
mtodo utilizado, principalmente, para experimentos cientficos e
controle de qualidade dos sistemas de PIVE em laboratrios (AHU-
MADA et al., 2013).
Slicing: Utilizado para maximizao da recuperao de ocitos,
normalmente a partir de ovrios de fmeas de alto valor gentico
que vem a bito. Nesta tcnica, a camada cortical do ovrio sec-
cionada em pequenos fragmentos para liberao dos ocitos (HAS-
LER, 1998).

Maturao in vitro (MIV)


A maturao dos ocitos envolve uma srie de transformaes nuclea-
res, citoplasmticas e moleculares que tornam o gameta feminino apto
a ser fecundado (SMITZ et al., 2004). A maturao nuclear (Figura 6)
ocorre sem influncia das clulas do cumulus e caracterizada pela
ruptura da vescula germinativa, que compreende os processos de con-
densao da cromatina e dissoluo da membrana nuclear (ANGUITA
et al., 2007). Concomitantemente maturao nuclear, o citoplasma
tambm sofre alteraes na modulao da sntese de protenas e reor-
ganizao de organelas citoplasmticas, como reduo do tamanho do
Complexo de Golgi, aumento gradativo de lipdeos, compactao do
nuclolo e alinhamento dos grnulos corticais prximos membrana
do ocito. Estes ltimos possuem grande importncia na preveno
da polispermia (FERREIRA et al., 2009).
33 Biotcnicas da Reproduo em Bovinos

Todos esses eventos moleculares e bioqumicos que ocorrem no


ocito at atingir a maturao devem ser estritamente controlados
para que um gameta feminino vivel esteja disponvel para fertili-
zao e desenvolvimento embrionrio subsequente (WRENZYCKI &

Figura 6. Etapas da maturao nuclear.

STINSHOFF, 2013). Sendo assim, a etapa de maturao que ocorre


em um perodo de 22 a 24 horas tem recebido a ateno de pesqui-
sadores que visam melhorar os resultados da produo in vitro de
embries (PARRISH, 2014).

Durante o crescimento do ocito h um aumento da taxa de mitose


das clulas da granulosa, contidas no folculo, que iro diferenciar-
-se em clulas do cumulus (FAIR, 2003). Estas clulas esto ligadas
aos ocitos pelas junes tipo gap, atuando na transferncia de ons,
metablitos e aminocidos que regulam o crescimento e maturao
do ocito (FAIR, 2003; KRISHER, 2004). As clulas do cumulus tam-
bm modulam a atividade transcricional do ocito e facilitam a pene-
trao espermtica durante a fecundao (DE LA FUENTE e EPPIG,
2001). Por outro lado, os ocitos secretam fatores que induzem a
34 Biotcnicas da Reproduo em Bovinos

proliferao e expanso dessas clulas (CHAND et al., 2006). Em


ocitos imaturos, as clulas do cumulus esto compactas e durante
a maturao iniciam a secreo de cido hialurnico o que causa a
mucificao e separao das clulas, ocasionando a sua expanso
(FULOP et al., 2003).

O meio de maturao apresenta gonadotrofinas (FSH e LH) que si-


mulam o ambiente folicular pr-ovulao, para influenciar a expanso
de clulas do cumulus e a maturao nuclear, atravs da ativao de
AMPc e outros mensageiros intracelulares (revisado por LI & ALBER-
TINI, 2013).

A atmosfera gasosa geralmente utilizada em sistemas de MIV de 5%


de CO2 e 20% de O2, com umidade saturada. O CO2 utilizado para
controlar o potencial de hidrognio (pH) dos meios tamponados com bi-
carbonato (BAVISTER, 1995). Por outro lado, a tenso de O2 no fluido
folicular e na tuba uterina menor (1,5 a 8,5%) quando comparado ao
ar atmosfrico (20%) (BAVISTER, 1995). Portanto, alguns sistemas de
PIVE j utilizam mistura de gases contendo 5% CO2, 5% O2 e 90% N2.

Meios utlizados:
PBS + Soro Fetal Bovino (SFB)
MEIO DE LAVAGEM (TCM199 com sais de Hanks, tampo HEPES,
antibitico penicilina e estreptomicina- e soro fetal bovino)
MEIO DE MATURAO (TCM199 com sais de Earle suplementado
com l-glutamina, antibitico penicilina e estreptomicina-, bicarbo-
nato de sdio, piruvato de sdio, hormnios FSH, LH e estradiol- e
soro fetal bovino).

Procedimentos:
I Preparao da placa de maturao
Em uma placa de Petri fazer gotas de 100 l de meio de maturao
e recobr-las com leo mineral.
necessrio que a placa de maturao permanea na estufa in-
cubadora por pelo menos duas horas antes da transferncia dos
ocitos para mesma, para a estabilizao do meio.
35 Biotcnicas da Reproduo em Bovinos

II - Rastreamento de ocitos
O fluido folicular ser submetido lavagem e filtrao, com auxlio
de filtro apropriado, capaz de reter os ocitos.
O material retido no filtro ser transferido para placa de Petri estril
e descartvel, onde sero rastreados os ocitos.
A manipulao das estruturas desta etapa em diante ser realizada
com auxlio do estereomicroscpio, no interior da capela com fluxo
laminar.
As estruturas encontradas sero transferidas para outra placa con-
tendo duas gotas de meio de lavagem, onde permanecero para que
em seguida sejam selecionados de acordo com a qualidade.
III - Seleo
A seleo baseada em caractersticas do cumulus e do citoplasma
do ocito como descrito na Tabela 1 e Figura 7.
Sero selecionados ocitos classificados como grau I, II e III.
IV - Maturao in vitro
Os ocitos selecionados sero lavados em gota de meio de matu-
rao e em seguida transferidos para gotas de 100 l de meio de
maturao contidas em placa de Petri recobertas com leo mineral,
previamente estabilizadas.
A maturao dos ocitos ser realizada em gotas de por um perodo
de 22 a 24 horas, em estufa incubadora com temperatura de 39,5
C, 5% de CO2 em ar atmosfrico e 95% de umidade.

Tabela 1. Critrios adotados no CESM para a classificao morfolgica dos ocitos recuperados.
Qualidade Descrio
Grau I Ocitos com mais de trs camadas de clulas compactas do cumulus, e
citoplasma regular.
Grau II Ocitos com uma a trs camadas de clulas do cumulus, citoplasma regular ou
apresentando granulaes finas.
Grau III Ocitos apresentando menos de trs camadas do cumulus ou parcialmente
desnudos, citoplasma irregular.
Grau IV Desnudos (ocitos sem clulas do cumulus) ou em degenerao (com cumulus
expandido e citoplasma heterogneo apresentando granulaes severas).
36 Biotcnicas da Reproduo em Bovinos

Figura 7. Complexos cumulus-ocito bovinos. Ocitos grau I (a,b,c,e), grau II (d,f), grau III (g) e grau IV (h,i).

Fecundao in vitro (FIV)


A fecundao in vitro ocorre atravs da incubao de ocitos madu-
ros com espermatozides capacitados, em meio de fecundao. Nes-
te momento, ocorre a combinao do material gentico dos gametas
e a formao do zigoto. Para adquirir competncia para fecundao,
o espermatozide precisa sofrer capacitao. Este processo ocorre
pela remoo de fatores decapacitantes presentes no fluido seminal.
In vivo, o processo acontece durante a passagem do espermatozide
pelo trato genital feminino, e envolve a desestabilizao da membra-
na plasmtica e hiperativao espermtica. In vitro, o processo de
37 Biotcnicas da Reproduo em Bovinos

capacitao desencadeado por glicosaminoglicanas (como a hepa-


rina), que so adicionadas nos meios de fecundao. Ao entrar em
contato com o ocito, na presena de clcio extracelular, o esper-
matozide capacitado se liga a receptores presentes na zona pelci-
da (ZP3) e sofre a reao acrossmica, determinada pela fuso das
membranas plasmtica e acrossomal. Assim, o contedo acrossmi-
co liberado, e somado motilidade progressiva espermtica, auxilia
a penetrao do espermatozide e ligao aos receptores ZP2. Aps
penetrar o espao perivitelino, a membrana plasmtica do esperma-
tozide se funde membrana vitelina, havendo liberao de clcio
no interior do ocito. Este influxo de clcio promove a liberao do
contedo dos grnulos corticais e reao zonal, que determina o
enrijecimento da zona pelcida e bloqueio poliespermia (VARAGO
et al., 2008).

Na maioria dos laboratrios, utiliza-se smen congelado para o pro-


cesso de fecundao in vitro em bovinos. No entanto, aps o des-
congelamento, necessrio selecionar os espermatozides vivos e
capazes de fecundar. Esta seleo realizada, na maioria das vezes,
pela separao em gradiente de Percoll, embora outros sistemas
possam ser utilizados como o swim-up ou o lavado espermtico.
O percoll composto por partculas de slica coloidal coberto com
polivinilpirrolidona, preparado em diferentes concentraes para for-
mar um gradiente descontnuo de duas ou trs fases (90, 45 e 30%)
para separao espermtica (GONSALVES et al., 2002).

Meios utlizados:
SPTL
PERCOLL
FERT-TALP

Procedimentos:
I - Preparao da placa de fecundao
- Em uma placa de Petri preparar gotas de 10 l de meio de fecunda-
o, recobr-las com leo mineral e equilibrar em estufa incubadora por
duas horas, antes do incio do perodo de fecundao.
38 Biotcnicas da Reproduo em Bovinos

II Preparao do Smen
II. I - Swim-up
Adicionar 1 mL de SPTL em um tubo de fundo cnico de 15 mL,
tampar, sem vedar, a rosca dos tubos e manter em estufa incuba-
dora para estabilizar o meio.
Descongelar a palheta de smen em banho-maria a 37 C por 30
segundos. Em seguida, verter o contedo da palheta cuidadosamen-
te no fundo do tubo contendo SPTL e mant-lo apoiado dentro de
um bcker em posio inclinada. Lembrar de retirar uma pequena
amostra de smen para analisar a motilidade e vigor do smen an-
tes da incubao em estufa.
Manter o tubo Falcon com o smen por 1 hora em estufa incubado-
ra nas mesmas condies da maturao.
Aps 1 hora, remover o sobrenadante e transfer-lo para um novo
tubo Falcon previamente aquecido.
Remover uma segunda amostra de smen para analisar motilidade e
vigor.
Centrifugar o tubo Falcon com o smen por 8 minutos a 1.200
RPM em centrifuga sorolgica.
Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet com meio FERT-
-TALP (previamente equilibrado na em incubadora) para um volume
final de 100 l.
Deixar o tubo na incubadora enquanto se processa a contagem
espermtica.
II. II - Mini Percoll
Preparar um tubo cnico com capacidade de 1,5 ml com gradien-
te de Percoll, pela adio de 250 l de Percoll 90% e, sobre esta
camada, depositar 250 l de gradiente Percoll 45%, vagarosa-
mente, de maneira que as duas camadas no se misturem.
Equilibrar a temperatura e atmosfera do gradiente de Percoll em
incubadora por aproximadamente 1h antes do uso.
Aps o descongelamento do smen, o contedo da palheta deve
ser depositado sobre as camadas de Percoll previamente aqueci-
das (no deixar o smen se misturar com as camadas de Percoll).
Centrifugar o tubo em uma microcentrfuga a 8.000 RPM, por 7
minutos.
39 Biotcnicas da Reproduo em Bovinos

Remover o sobrenadante, ressuspender o pellet com 1 mL de meio


FERT e centrifugar novamente por 5 min, utilizando a fora de
3.200 RPM.
Remover 60 l do pellet formado e transferir para outro eppendorf.
Transferir 5 l para eppendorf contendo 50 l de meio FERT para
anlise de motilidade progressiva.
II. III Contagem espermtica e ajuste da concentrao do smen (co-
locar em forma de tpicos como os itens anteriores)
Diluir 5 l da amostra do smen em 250 l de gua e homogeneizar
bem.
Contar os espermatozides em 5 retculos da cmara de Neubauer
para se determinar o volume de meio FERT-TALP a ser adicionado.
Ajustar a concentrao a ser utilizada na gota de fecundao por
meio do seguinte clculo:
n de sptz contados x (motilidade/1.000) x 50 L (volume sedimento)
= volume final (em L)
O volume (em L) de meio FIV-gotas a ser adicionado, no microtubo
contendo smen e heparina (ou FIV-gotas), a diferena entre o
volume final e o volume sedimento (50 L).
volume final 50 L (volume sedimento) = volume (L) de meio FIV -
gotas a ser adicionado
Adicionar 4 L (ou 8 L se o smen foi processado com TL-Smen)
desta mistura em cada microgota da placa de FIV, o que dar uma
concentrao de 100x103 espermatozide por microgota de FIV,
que corresponder a 5x103 espermatozides por ocito.

Obs: verificar, sob lupa, se a microgota contm mesmo os espermato-


zides.

* Deduo da frmula utilizada para ajuste de concentrao esper-


mtica

[ ] de sptz/mm3 viveis = n x 2.500 x motilidade (%)


40 Biotcnicas da Reproduo em Bovinos

[ ] inicial x V inicial = [ ] final x V final

n x 25 x 102 x motilidade/100 x 50 L = 25 x 103 x V final

V final = n x motilidade/1.000 x 50 L

Obs: [ ] final = 25 x 106 sptz/mL = 25 x 103 sptz/mm3

III Fecundao in vitro


Aps ajuste da concentrao espermtica transferir, no mximo 20
ocitos por gota, adicionar volume espermtico e completar com
FERT para volume final de 50 a 100 L, de acordo com o protocolo
adotado no laboratrio (ex para 50 L: gota de 10 L + 20 L de
smen + 10 L de FERT com ocitos = 50 L FERT).
Antes de transferir os ocitos para gota de fecundao, lavar, ao
menos duas vezes, em meio FERT previamente equilibrado e aque-
cido.
Incubar os ocitos juntamente com os espermatozides por um
perodo de 18 a 22 h, nas mesmas condies de atmosfera, tempe-
ratura e umidade adotadas para a maturao in vitro.

Cultivo in vitro (CIV)


O perodo de desenvolvimento embrionrio pre-implantao marcado
por importantes eventos, como clivagem, ativao do genoma em-
brionrio, compactao dos blastmeros, diferenciao do trofoblasto
e embrioblasto, formao e expanso da blastocele e rompimento da
zona pelcida (LONERGAN et al., 1999). Esses fenmenos podem ser
afetados de muitas formas no cultivo in vitro, sendo o ponto crtico
do desenvolvimento a ativao do genoma embrionrio, que se d por
volta do estdio de 8-16 clulas (MEMILI & FIRST, 2000).

A qualidade dos embries produzidos in vitro inferior a dos embries


produzidos in vivo. Embries derivados de PIVE geralmente apresentam
41 Biotcnicas da Reproduo em Bovinos

colorao mais escura em seu citoplasma e menor densidade, devido ao


seu alto contedo lipdico (FAIR et al., 2001). Estes embries apre-
sentam tambm uma zona pelcida mais frgil, uma alta incidncia de
anormalidades cromossomais (SLIMANE et al., 2000), falta de compac-
tao da massa celular, formao prematura de blastocele, alterao
na razo de massa celular interna em relao s clulas trofoblsticas,
alteraes na expresso gnica e metabolismo celular (LONERGAN et
al., 2006).

Meios utilizados:
SOF suplementado com SFB, BSA, aminocidos, piruvato, lactato e
glutamina

Procedimentos:
I Preparao da placa de cultivo
Em uma placa de petri preparar gotas de 100 L de meio de cultivo
(SOF), recobr-las com leo mineral e manter em estufa incubadora
por pelo menos duas horas antes do incio do cultivo.
II - Desnudamento Parcial de ocitos
Fazer o desnudamento parcial das estruturas contidas na gota de
fecundao com o auxlio de uma pipeta de 100 L, de forma a
manter algumas clulas aderidas aos ocitos para que a partir des-
tas se forme a monocamada.
III Cultivo in vitro
Retirar os possveis zigotos parcialmente desnudos das gotas de
fecundao e lavar por no mnimo duas vezes em meio SOF, previa-
mente estabilizado.
Transferir de 15 a 20 estruturas para gotas de meio de cultivo.
IV - Avaliao da taxa de clivagem
Em um perodo de 48 aps o incio do cultivo, ser realizada a troca
de 50% do volume de cada gota onde se encontram os embries.
Para tal, ser necessria a estabilizao do meio SOF por pelo me-
nos duas horas de antecedncia.
Aps a troca do meio, ser realizada a avaliao de quantas estru-
turas se dividiram e o nmero de clulas presente em cada uma.
42 Biotcnicas da Reproduo em Bovinos

V - Avaliao da taxa de blastocisto


No stimo dia aps o incio do cultivo, ser realizada a avaliao
da formao de blastocistos (inicial, expandido, eclodido), e qual a
proporo de cada estdio no qual se encontram (Figura 8).

Figura 8. Blastocistos produzidos in vitro no dia 7 (I e II) e 9 (III e IV) aps a fecundao. Nas figuras I e II, esto presentes
blastocistos e blastocistos expandidos, e nas figuras III e IV, blastocistos eclodidos.

Classificao dos embries


A classificao morfolgica uma ferramenta indispensvel para a se-
leo dos embries aptos transferncia e criopreservao. Estruturas
que se apresentam viveis, aptas ao desenvolvimento ps implantacio-
nal e com maior tolerncia congelao normalmente correspondem
a estruturas com boa aparncia morfolgica. A descrio dos critrios
sugeridos pela IETS encontra-se disposta na Tabela 2.
43 Biotcnicas da Reproduo em Bovinos

Tabela 2. Classificao embrionria quanto qualidade.


Cdigo Classificao Descrio
Massa embrionria simtrica e esfrica, com blastmeros uniformes
Excelente ou em tamanho, cor e densi dade. Estdio de desenvolvimento adequado.
1
bom Ao menos 85% do material celul ar vivel, poucas clulas extrusas.
Zona pelcida lisa.
Irregularidades moderadas na forma ou tamanho da massa
2 Regular embrionria, ou na cor e densidade das clulas individuais. A o menos
50% do material celular vivel.
Irregularidades maiores na forma da massa embrionria ou no
3 Pobre tamanho, cor e densidade das clulas individuais. Ao menos 25% do
material celular vivel.
Morto ou Embries no viveis, ou com dese nvolvimento parado e/ou muito
4
degenerado atrasado.
Fonte: Adaptado do Manual da International Embryo Transfer Society, 3 edio, traduzida para o portugus em 1999.

Outras maneiras de se detectar a qualidade dos embries produzidos


a quantificao da morte celular programada (apoptose), a contagem do
nmero de clulas dos embries, alm da expresso de genes importan-
tes para o desenvolvimento. Porm, estas tcnicas no so possveis
em embries vivos, servindo mais como indicadoras da qualidade do
processo de produo de embries. Assim, servem como controle de
qualidade do processo, mas inutilizam os embries analisados, que no
podem ser transferidos. Imagens da contagem de clulas e quantifica-
o de clulas mortas esto dispostas na Figura 9.

Figura 9. Blastocisto corado com HOECHST 33342 para contagem do nmero total de clulas (esquerda). direita, o mesmo
embrio, com as clulas em processo de morte programada (apoptose) coradas pelo ensaio TUNEL.
44 Biotcnicas da Reproduo em Bovinos

Criopreservao de embries
Importncia
A criopreservao de embries uma biotcnica que torna possvel o
controle racional das atividades da biologia da reproduo. A parada
do desenvolvimento embrionrio no estdio de blastocisto permite a
programao de diversas etapas subsequentes, otimizando o destino
destes embries. Dentre os aspectos de controle, o manejo de recep-
toras seria o mais evidente. Em qualquer programa de transferncia de
embries, ou temos um nmero pequeno de receptoras ou o excesso
delas, por ser muito improvvel a estimativa precisa do nmero de blas-
tocistos que ser produzido (KHURANA & NIEMANN, 2000).

Outro ponto crtico na PIVE o transporte e a comercializao destes


embries. Congelados, podem ser trabalhados de forma semelhante
a doses de smen. A venda da gentica se tornaria muito mais fcil e
prtica, com benefcios que se estenderiam desde a sanidade dos re-
banhos, por no haver a necessidade de introduo de animais recep-
tores, at ganhos genticos extremos, pela completa substituio do
material gentico em apenas uma gerao.

Tcnica
O conceito de criopreservao envolve o armazenamento de tecidos
biolgicos vivos a baixas temperaturas. A criopreservao um proce-
dimento amplamente utilizado para conservao de linhagens celulares,
espermatozides e fragmentos de tecidos (SANTIN, et al., 2009).

Embries bovinos so estruturas com apenas cerca de 90 clulas, e envol-


tas por uma forte membrana denominada zona pelcida, o que torna o pro-
cesso de criopreservao bastante complexo pois a perda ou injria destas
clulas pode ser irreparvel, principalmente se atingir algum tipo celular
especfico, como a massa celular interna ou trofectoderma. Por isso, neste
caso, o potencial de sobrevivncia das clulas um aspecto essencial
caracterstica denominada criotolerncia (SHAW et al., 2000).

A primeira tcnica proposta para criopreservao de embries com su-


cesso foi a congelao lenta. O princpio da congelao lenta promo-
45 Biotcnicas da Reproduo em Bovinos

ver o congelamento do meio externo ao embrio, promovendo desidra-


tao gradual do blastocisto at que o mesmo atinja a temperatura de
vitrificao da matriz intracelular. Para tanto, os blastocistos so expos-
tos a baixas concentraes de crioprotetores (molculas que protegem
os embries, reduzindo o ponto de solidificao do meio), e a tempera-
tura reduzida a -5 a -7 C para equilbrio. Em seguida, as palhetas so-
frem o seeding para iniciar a congelao extracelular e a temperatura
diminuda gradualmente atravs de uma curva de -0.3 a -0.5 C/minuto,
at atingir temperaturas da ordem de -30 a -65 C, quando as palhetas
so imersas em nitrognio lquido (VAJTA & NAGY, 2006).

Apesar de funcionar muito bem para embries produzidos in vivo


(provenientes de colheita de vacas superovuladas), com taxas de
aproximadamente 41,5% de prenhez, em embries produzidos in vitro
(provenientes da fecundao in vitro) os ndices so insatisfatrios.
Neste contexto, a tcnica de vitrificao reemergiu como uma alternati-
va interessante para a criopreservao de embries produzidos in vitro
(LIEBERMANN et al., 2002).

O princpio da congelao rpida promover a desidratao do embrio


utilizando solues osmticas, e ento, induzir a diminuio drstica da
temperatura embrionria, transpondo a etapa de cristalizao. So mui-
to importantes trs aspectos neste processo: a taxa de resfriamento, a
viscosidade do meio de vitrificao, que deve ser alta para diminuir as
chances de cristalizao, e o volume, que deve ser o menor possvel
para permitir melhor transferncia de calor (VAJTA, 2000).

Diversos protocolos utilizando o princpio de congelao rpida para


promover vitrificao foram desenvolvidos. As diferenas encontradas
nas taxas de sobrevivncia aps a vitrificao entre diferentes autores
e protocolos refletem o estdio, origem, a qualidade e a razo volume/
superfcie dos embries que influencia a penetrao de crioprotetores
(VAJTA & NAGY, 2006).

O procedimento open pulled straw (OPS), proposto por Vajta, permite


que se alcance taxas muito altas de resfriamento e aquecimento (at
46 Biotcnicas da Reproduo em Bovinos

20,000 graus C/min), e pequeno contato com os crioprotetores concentra-


dos (menos de 30s). A tcnica permite que se evite a injria causada pela
formao de cristais e toxicidade/ danos osmticos (VAJTA et al, 1999).

As pesquisas relacionadas criopreservao de embries bovinos


utilizam a porcentagem de ecloso para avaliar a recuperao destas
estruturas aps as etapas de congelamento ou vitrificao. Nesse con-
texto, as condies de cultivo in vitro so responsveis pelas altera-
es que diminuem a viabilidade do embrio tanto antes como aps a
criopreservao. Sendo assim, o estudo dos componentes do meio de
cultivo , visando melhorar o resultado de ecloso aps criopreservao
essencial para o aprimoramento desta tcnica e para complementar
os resultados da PIVE (VAJTA & NAGY, 2006).

Procedimento de vitrificao
1. O procedimento aqui especificado baseado na tcnica desenvolvi-
da por Vajta et al. (1999), com pequenas modificaes. Descreve-
remos o uso de palhetas esticadas e abertas (Open Pulled Straws
OPS) para envase dos embries.
2. Selecionar blastocistos e blastocistos expandidos no stimo dia de
desenvolvimento (D7).
3. Lavar os embries em meio base (SOF suplementado com 20% de
SFB), aquecido a 37 C.
4. Transferir os embries para meio base acrescido de 7,5% etilenoGli-
col e 7,5% de DMSO por 3 minutos.
5. Transferir os embries para meio base acrescido de 16,5% EG
e 16,5% DMSO. Deixar os embries por tempo mximo de 40
segundos.
6. Envasar os embries, individualmente, em OPS, em um volume
mximo de 2 l da soluo, e, submerg-los, imediatamente, em
nitrognio lquido, onde sero armazenados.

Reaquecimento dos blastocistos


Para o reaquecimento, trs solues sero utilizadas: meio SOF su-
plementado com 20% de SFB adicionado de 1,0 M/ 0,5 M/ e 0 M de
sacarose.
47 Biotcnicas da Reproduo em Bovinos

1. Imergir a OPS em meio com 1 M de sacarose a 37 C por 1 min.


2. Transferir os embries para soluo com 0,5 M de sacarose por 5 min.
3. Em seguida, transferir os embries para meio livre de sacarose (0
M) por 10 min. A ltima etapa consiste no envase dos embries em
palhetas para serem transferidos para receptoras.

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