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Colombia Mdica Vol.

39 N 2 (Supl 2), 2008 (Abril-Junio)

Evaluacin del efecto genotxico del Antracol WP 70 en


cultivos de linfocitos humanos*

CARLOS HERNN BARRERA, BIOL1, LIZ CAROLINA PARDO, BIOL2, GERMN DAVID CORTINA, PHD3

RESUMEN

Introduccin: El Antracol WP 70 es un plaguicida de uso comn en la agricultura para mitigar fitopatologas asociadas
con hongos. Dado su gran espectro de aplicacin e incorrecta manipulacin, no se encontraron estudios de genotoxicidad,
realizados en humanos, acerca de este compuesto.
Objetivo: Evaluar, a partir de la prueba de aberraciones cromosmicas estructurales (ACE), el efecto genotxico del
Antracol WP 70 en cultivos de linfocitos humanos de sangre perifrica.
Materiales y mtodos: Se establecieron con rplica, cultivos de linfocitos humanos en medio RPMI 1640 complementado,
e incubaron a 37 C. Estos cultivos se trataron con agua destilada estril (control), concentracin alta del plaguicida (2.5 mg/
ml), media (1.25 mg/ml) y baja (0.02 mg/ml), durante un perodo de 48 horas. Se evaluaron las clulas en metafase, se registraron
las ACE observadas y se analizaron los datos para calcular los respectivos valores estadsticos.
Resultados: El mayor nmero de aberraciones cromosmicas se encontr en las clulas tratadas con la concentracin media
y el menor fue para el grupo control. Sin embargo, no se encontraron diferencias estadsticamente significativas a un nivel
de confianza de 95% entre la frecuencia de aberraciones cromosmicas en relacin con el grupo control (p = 0.63). Los
porcentajes entre aberraciones de tipo cromatdico y cromosmico encontradas fueron 77.3 y 22.7%. De la misma manera, no
se encontraron diferencias estadsticamente significativas.
Conclusin: No se informa dao genotxico, medido a travs de la prueba ACE in vitro del Antracol WP 70 en cultivos
de linfocitos humanos. Se recomienda continuar con estudios de toxicologa gentica y citogentica en Boyac para resolver
dudas acerca de los efectos mutagnicos, carcinognicos y teratognicos de los diferentes compuestos fsicos, qumicos y
biolgicos en los seres vivos.

Palabras clave: Genotoxicidad; Linfocitos; Aberraciones cromosmicas.

Antracol WP 70 genotoxicity in human lymphocyte cultures

SUMMARY

Introduction: Antracol WP 70 is a pesticide of common use in farming activities to mitigate pathologies in plants associated
to mushrooms. In spite of its great application spectrum and incorrect manipulation, there were no genotoxicity studies found,
carried out on human beings regarding this compound.
Aim: To evaluate, by means of structural chromosomal aberration test (SCA), the genotoxicity effect of Antracol WP 70
in human lymphocyte cultures of peripheral blood.
Materials and methods: Human lymphocyte cultures were established in RPMI 1640 supplemented Medium and incubated
at 37 C. The cultures were treated with sterile distilled water (control), high concentration of the pesticide (2.5 mg/ml), half
(1.25 mg/ml) and low (0.02 mg/ml), during a 48 hours period. The metaphase cells were evaluated and the SCA observed were
registered and analyzed to estimate the respective statistical values.

* El presente trabajo de investigacin fue financiado por la Direccin de Investigaciones (DIN) y la Escuela de Ciencias
Biolgicas de la Universidad Pedaggica y Tecnolgica de Colombia, Tunja, Colombia.
1. Investigador, Direccin de Investigaciones (DIN), Escuela de Ciencias Biolgicas, Facultad de Ciencias Bsicas,
Universidad Pedaggica y Tecnolgica de Colombia, Tunja, Colombia. e-mail: cahebaro@yahoo.com
2. Investigadora, Universidad Pedaggica y Tecnolgica de Colombia, Facultad de Ciencias Bsicas, Universidad Pedag-
gica y Tecnolgica de Colombia, Tunja, Colombia e-mail: lizcapar@yahoo.com.mx
3. Docente Asociado, Universidad Pedaggica y Tecnolgica de Colombia, Facultad de Ciencias Bsicas, Universidad
Pedaggica y Tecnolgica de Colombia, Tunja, Colombia (QEPD).
Recibido para publicacin mayo 30, 2007 Aceptado para publicacin abril 18, 2008

2008 Corporacin Editora Mdica del Valle 29


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Results: The biggest number of SCA was found in cells protozoos del gnero Colpidium toxicidad leve13. No
tried with the half concentration and the lowest one was for obstante, en otros estudios no se encontraron efectos
the group control. However, there were no statistically adversos en los sistemas biolgicos experimentales
significant differences found at a confidence interval of 95% usados, medidos a partir del porcentaje de micro-
in the SCA frequency in relation with the group control (p =
ncleos14, y las anormalidades en los espermatozoides3,
0.63). The percentages of chromatid and chromosome
aberrations were 77.3 and 22.7%, respectively. There were no
evaluado en ratones.
statistically significant differences found. De acuerdo con la literatura consultada, no se encon-
Conclusion: Damage genototoxic, measured through the traron informes sobre poderes genotxicos en los seres
SCA test in vitro of the Antracol WP 70 in human lymphocyte humanos para este compuesto; por tanto, con el presen-
cultures, is not reported. To continue with genetic toxicology te estudio, se evalu el efecto genotxico del fungicida
and cytogenetic studies in Boyac Department (State) to Antracol WP 70 en cultivos de linfocitos de sangre peri-
solve doubts about the mutagenic, carcinogenic and frica mediante la prueba de aberraciones cromosmicas
teratogenics effects of the different physical, chemical and estructurales, a partir de tincin regular homognea.
biological compounds in the living beings is recommended.

Keywords: Genotoxicity; Lymphocyte;


MATERIALES Y MTODOS
Chromosome aberrations.
Obtencin del producto. El fungicida Antracol WP
El Antracol WP70 es un fungicida orgnico utilizado 70 se obtuvo de la casa productora Bayer CropScience
a nivel mundial, cuya accin se ejerce especficamente S. A., en unidad de presentacin comercial, que contie-
para el control de hongos causantes de enfermedades ne ingrediente activo (Propineb) a un grado de pureza de
como antracnosis (Colletotrichum gloeosporioides), 70%.
cenicilla (Oidium sp.), mancha prpura (Alternaria Seleccin de donantes. Se aplicaron encuestas
porri), mildeo (Peronospora sp.), podredumbre para obtener informacin personal y familiar, estado de
(Botrytis sp.), gota (Phytoptora infestans) y tizn salud, hbitos de consumo (tabaquismo, alcoholismo y
(Alternaria solani) en cultivos agrcolas de arroz, caf, psicoactividad), ocupacin previa, actual y alterna de los
cacao, papa, cebolla, y plantas ornamentales, entre posibles donantes. Se seleccionaron 5 mujeres y 5
otros1. hombres entre 18 y 25 aos de edad, sin problemas de
Este plaguicida es un compuesto organosulfurado salud conocidos, sin exposicin directa a compuestos
incluido en los fungicidas ditiocarbamatos2,3, que se mutagnicos, carcinognicos y teratognicos, sin con-
clasifica en la categora toxicolgica III4, correspon- sumo de cigarrillo, ni sustancias psicoactivas y alcohol.
diente a compuestos de toxicidad media5. De acuerdo Obtencin de las muestras. Se tomaron, por pun-
con las caractersticas toxicolgicas, la dosis letal 50 cin venosa del antebrazo, con jeringa heparinizada, 5
(DL50) en ratas (toxicidad aguda) suministrado va oral ml de sangre perifrica total por donante. Este procedi-
y cutnea es de 5,000 mg/kg, y la dosis de toxicidad miento lo hizo personal especializado y con tcnicas de
crnica en rata por ingestin es de 50 mg/kg6. asepsia admitidas mdicamente.
Los registros disponibles acerca de los efectos ad- Prueba de genotoxicidad. Inmediatamente des-
versos encontrados en sistemas biolgicos experimen- pus de tomada la muestra de sangre, se establecieron
tales informan: para ratas, disminucin en el tamao de con rplica 4 cultivos de linfocitos por donante. Se
los fetos al nacer y efectos histopatolgicos7, malforma- depositaron directamente 0.5 ml de sangre perifrica
ciones y defectos craneofaciales8, efectos sobre funcio- total por individuo en 5 ml de medio RPMI 1640 (Sigma),
nes musculares y sobre el citoesqueleto de clulas suplementado con 20% de suero fetal bovino estril
neuronales, astrocitos y clulas musculares9, lesiones inactivado (Microgen), 1% de L-glutamina (Sigma) y
preneoplsicas y neoplsicas en tiroides, rin y vejiga 1% de penicilina/estreptomicina (Sigma). Los cultivos
urinaria10, disminucin en el peso corporal e incremento se estimularon con 100 l de fitohemaglutinna (Eurobio)
en la queratinizacin e hiperplasia en clulas epidrmi- y se incubaron a 37 C. A las 24 horas, los cultivos
cas11. Para Drosophila melanogaster se informan controles se sometieron 100 l de agua destilada estril
alteraciones morfolgicas en patas y alas12, y para y los cultivos experimentales se trataron con 100 l de

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las concentraciones 2.5 (alta), 1.25 (media) y 0.02 mg/


ml (baja) del fungicida por 48 horas. Estas concentra-
ciones correspondieron a las finales en el medio de
cultivo. Preliminarmente se aplic la tcnica de ndice
mittico para seleccionar las concentraciones alta, me-
dia y baja que disminuyeron las clulas en mitosis en
75%, 50% y 25%, respectivamente en relacin con el
control. Para el anlisis de aberraciones cromosmicas,
se utiliz la tcnica de doble ciego para eliminar la
tendencia subjetiva de correlacionar los resultados en-
tre las concentraciones y los controles. Se realizaron los
respectivos extendidos celulares y se observaron por
cultivo entre 100-200 clulas en metafase con un rango
entre 44 y 47 cromosomas. Se registraron en cuadros
nicamente las ACE observadas a partir de coloracin
regular homognea (Giemsa). No se efectuaron evalua-
ciones posteriores a las 48 horas de tratamiento, para
evaluar in vitro los daos genticos no reparados por los
mecanismos de control celular y reparacin de ADN,
inducidos por el fungicida. Se tomaron microfotografas
Foto 1. Metafase de linfocito de sangre de algunas metafases observadas con y sin aberracio-
perifrica. Aumento 1000X nes cromosmicas.

Cuadro 1
Porcentaje y nmero de aberraciones cromosmicas observadas para el grupo control
y para las concentraciones alta, media y baja

Individuo Control Concentracin


Alta Media Baja
N aberraciones N aberraciones N aberraciones N aberraciones
Crt Crm % Crt Crm % Crt Crm % Crt Crm %
1 5 0 2.5 6 1 4.1 7 3 5.8 1 0 1
2 0 0 0 0 1 0.6 0 0 0 0 0 0
3 0 0 0 1 1 1 2 0 1 3 1 2
4 2 0 1 1 0 0,5 0 2 1 1 1 1
5 0 3 1.5 0 0 0 4 0 2 1 1 1
6 1 0 0.5 1 1 1.14 2 0 1.33 1 0 0.5
7 2 0 1 4 1 2.5 1 0 0.5 0 0 0
8 0 0 0 2 0 1 1 0 0.5 1 1 1
9 0 0 0 1 0 1 3 0 1.5 2 0 1
10 1 0 0.5 0 0 0 0 0 0 1 0 0.5
Total 11 3 16 5 20 5 11 4
Medianas 17.0 22.4 22.9 19.7

Crt: Quiebre cromatdico Crm: Quiebre cromosmico


39 gl 0.05% X2 c = 15.17 > X2 t = 24.4
p = 0.634572

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A B
Foto 2. A. Aberracin de tipo cromosmico (QCm). B. Aberracin de tipo cromatdico (Qcr).
Aumento 1000X

Anlisis estadstico: Los datos se procesaron con el DISCUSIN


programa estadstico StatGraphics Plus para Windows
y DOS. Se aplicaron las pruebas de X2, ANOVA, El Antracol WP 70 no indujo aumento estadstica-
prueba de Kruskal Wallis y prueba t de Student para mente significativo en el porcentaje de aberraciones
evaluar las diferencias estadsticamente significativas cromosmicas a concentraciones de 2.5, 1.25 y 0.02 mg
entre aberraciones cromosmicas en las concentracio- de Antracol/ml de agua, en relacin con el grupo control.
nes evaluadas en relacin con el grupo control. El promedio en el porcentaje de aberraciones cromos-
Consideraciones ticas. Se realiz una reunin con micas espontneas por individuo para los cultivos con-
los individuos seleccionados para informarles los objeti- troles del presente estudio fue 0.07% y estuvo por
vos, procedimientos metodolgicos, resultados espera- debajo de lo informado por otros autores16,17. Asimismo,
dos, requerimientos y riesgos de participacin en el los resultados encontrados estuvieron entre el rango de
estudio. Las personas, que aceptaron voluntariamente 0-2% que se plantea para aberraciones cromosmicas
ser parte del estudio, firmaron un consentimiento infor- espontneas en cultivos de linfocitos humanos de sangre
mado. Lo anterior se realiz con base en la Resolucin perifrica18.
N 08430 de 1993 del Ministerio de Proteccin Social15. Las alteraciones cromosmicas son el resultado de
fallas en los mecanismos de control celular y de repara-
RESULTADOS cin en el ADN. Estas alteraciones se pueden expresar
en el sucesivo ciclo celular19, 20. Por ello, en este estudio
Se encontraron 75 aberraciones cromosmicas en se considera el tiempo de exposicin un factor importan-
7,486 clulas en metafase analizadas (Foto 1). De estas, 14 te en la induccin de aberraciones cromosmicas. Si
(18.6%) corresponden al grupo control, y 21 (28%), 25 estas alteraciones se mantienen a nivel in vivo, es
(33.3%) y 15 (20%) a las concentraciones alta, media y posible que en un individuo expuesto ocupacionalmente,
baja, respectivamente (Cuadro 1). No se encontraron puedan llegar a incidir en las clulas somticas o
diferencias estadsticamente significativas entre el grupo germinales, y de esta manera, desencadenar enferme-
control y las concentraciones alta, media y baja, en rela- dades genticas y ser transmitidas a la descenden-
cin con el porcentaje de aberraciones cromosmicas. De cia21,22.
100% de las aberraciones encontradas, 23% corresponden De la totalidad de aberraciones, 17 (23%) corres-
a alteraciones de tipo cromosmico (Foto 2A) y 77% son ponden a cromosmicas y 58 (77%) a cromatdicas. En
de tipo cromatdico (Foto 2B). No se encontraron diferen- las aberraciones cromosmicas estructurales observa-
cias estadsticamente significativas entre quiebres de das en este estudio, se encontr una frecuencia mayor
tipo cromatdico y cromosmico. Tampoco hubo figuras del quiebre cromatdico con respecto al cromosmico.
multirradiadas, cromosomas en anillo o cromosomas Estos resultados fueron similares a los obtenidos en
dicntricos, u otro tipo de aberracin. otras investigaciones23-25, donde informan mayor fre-

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cuencia de aberraciones de tipo cromatdico, originadas metablica de los individuos y tambin por la herencia de
por sustancias qumicas. variacin polimrfica20.
El anlisis estadstico para el porcentaje de aberra- De acuerdo con lo anterior, el tiempo de exposicin
ciones cromosmicas demostr que no se encontraron y los mtodos de aplicacin del Antracol WP 70 deben
diferencias estadsticamente significativas entre el gru- tener una correcta manipulacin, porque aunque a las
po control y las concentraciones alta, media y baja. Sin concentraciones evaluadas aparentemente inofensivas
embargo, la concentracin media (1.25 mg/ml) registr del Antracol WP 70 y los niveles de exposicin que se
el porcentaje ms alto de aberraciones cromosmicas informan en el presente estudio, no implica que a
observadas correspondiente a 33%, seguido por las mayores concentraciones o mayor tiempo de exposi-
concentraciones alta y baja, con respecto al grupo con- cin, no pueda afectar el material gentico y convertirse
trol. La prueba t Student mostr diferencias estadstica- en un cancergeno potencial, debido al uso indiscrimina-
mente significativas para la concentracin baja (0.02 do y frecuente por los trabajadores agrcolas. Este
mg/ml) con respecto al porcentaje de quiebres hecho amerita ampliar el anlisis toxico, citotxico y
cromatdicos en relacin con los cromosmicos. Es especialmente genotxico de este agente qumico en
necesario considerar que los quiebres cromosmicos diferentes sistemas biolgicos experimentales.
presentan ms riesgo gentico, porque las dos cromtides
estn comprometidas en el dao. Esto indica, que la AGRADECIMIENTOS
totalidad de sus descendientes presentarn esta aberra-
cin, por la reparacin incorrecta, mientras que en el Los autores expresan sus agradecimientos a la
quiebre cromatdico, 50% de su descendencia conserva Escuela de Ciencias Biolgicas y a la Direccin de
el material gentico sin la presencia de la alteracin Investigaciones DIN de la Universidad Pedaggica y
cromosmica Los resultados obtenidos corresponden Tecnolgica de Colombia, Tunja, Colombia. A Luz
nicamente a aberraciones cromosmicas estructura- Stella Hoyos Giraldo y Nancy Guerrero de la Unidad de
les. Este hecho amerita un estudio complementario del Toxicologa Gentica y Citogentica de la Universidad
efecto genotxico del Antracol WP 70 con base en del Cauca, Popayn, Colombia.
aneuploidas, pues la exposicin a varios compuestos
puede causar un incremento en la frecuencia de REFERENCIAS
aneuploidas en los linfocitos de los individuos26; adems
del papel que stas desempean en los procesos 1. Bayer Cropscience. Antracol. An old warhorse thats still
carcinognicos27,28. going strong. Courier Agrochem. 2000; 2: 15-7.
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Los efectos genotxicos encontrados no se deben dithiocarbamate fungicide propineb and its main metabolite
extraporlar en trminos poblacionales o individuales, propylenethiourea in airborne samples. Chemosphere. 2007;
sino a nivel celular e in vitro. Debido a que a nivel in 68: 2104-10.
vivo, el efecto genotxico del Antracol WP 70 puede ser 3. Quinto I, De Marinis E. Evaluation of Propineb, a dithio-
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cativamente la susceptibilidad y, por tanto, la repuesta
accumulation and histological effects of organometallic
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