Teora 6: PCR

La reaccin de la polimerasa es un gran avance que por el ao 1973 Kary Mullis ideo dicha
estrategia para obtener una gran cantidad de numero de copias de un fragmento de un gen, un
fragmento en particular, a partir de una nica copia de la unidad de DNA. La idea principal es la
amplificacin de un fragmento o de un gen.

Componentes de la PCR
DNA molde: DNA que se desea amplificar. Puede ser un gen, para lo cual se necesita como
molde DNA genmico; puede ser DNA copia, para lo cual, lo primero que hay que hacer es
una retrotranscripcin a partir de un mRNA; tambin puede ser un genoma completo para
aislar un promotor.
Desoxinucleotidos trifosfatos (dNTP): son los sustratos de la DNA polimerasa, que se
utilizan para copiar la cadena molde. Se utiliza una mezcla equimolar de los 4 dNTPs.
Primers (oligonucletidos): son aquellas secuencias de DNA que determinan la regin que
se desea amplificar. Deben ser de secuencia perfectamente homologa o no, para que permita
flanquear la zona que se desea amplificar, posicionarse y a partir de ellos la DNA polimerasa
se va a pegar y va a empezar a extender.
Mg2+: agregado como sulfato de magnesio o cloruro de magnesio. Lo que importa es el catin
Mg2+ que es cofactor para que la enzima pueda extender, pueda leer y pueda polimerizar.
Buffer de reaccin: le da a la enzima las condiciones apropiadas para que funcione
correctamente.
DNA polimerasa o mezcla de DNA polimerasas.
Termociclador: inicialmente las PCR se hacan en baos a distintas temperaturas y una
persona iba cambiando el tubo de reaccin, pasndolo, durante un tiempo determinado, por
las distintas temperaturas de los baos. La idea del funcionamiento del termociclador hacer
cambios de temperatura en trmino de segundos; la mayora de los termocicladores se basan
en un efecto llamado efecto Peltier: calientan o enfran una placa por encima de la cual se
colocan los tubos de reaccin y, por inversin de corriente, rpidamente puede subir o bajar la
temperatura. Algunos termocicladores poseen en la tapa la opcin de introducir un
calentamiento a 103C, evitando la evaporacin del buffer de reaccin sin la necesidad de
agregar la gota de aceite mineral para aislar. Todos los tubos o las placas que se colocan en el
termociclador deben tener la misma temperatura en todas las condiciones; debe haber
homogeneidad.

DNA polimerasas
Fundamentalmente, lo que se emplea en la reacciones de PCR es la capacidad de polimerizar o
de sintetizar una nueva hebra en sentido 53. Incorpora solo un nucletido a la vez.
Una propiedad que tienen las DNA polimerasas, adems de poder polimerizar, naturalmente tienen
una actividad exonucleasa 35; va revisando todo el tiempo los nucletidos que fue incorporando,
va mirando hacia atrs y, si hubo una mala incorporacin, al nucletido mal incorporado lo elimina y
lo reemplaza.
Otra actividad que tienen estas enzimas, no todas, es una actividad exonucleasa 53, va
removiendo nucletidos desde el extremo 5 y de esta manera puede resintetizar e incorporar
nucletidos marcados.

1
 Las DNA polimerasas, no todas, poseen estas tres actividades: polimerasa 53, exonucleasa
35 y exonucleasa 53.

Ejemplo de polimerasas:
Enzima Actividad Actividad Tasa de Procesivida
exonucleasa 35 exonucleasa 53 polimerizacin1 d2
E.coli DNA polimerasa Baja Presente Intermedia Baja
Fragmento Klenow Baja Ausente Intermedia Baja
Transcriptasa reversa Ausente Ausente Lenta Intermedia
T4 DNA polimerasa Alta Ausente Intermedia Baja
T7 DNA pol nativa Alta Ausente Rpida Alta
T7 DNA pol modif. Baja Ausente Rpida Alta
Qumicamente
T7 DNA pol modif. Ausente Ausente Rpida Alta
Genticamente
Taq DNA polimerasa Ausente Presente Rpida Alta

Que las enzimas tengan actividad exonucleasa 35 baja o ausente hace que sean susceptibles a
cometer muchos errores. La Taq polimerasa, al tener esta propiedad, es utilizada en mutagnesis,
introduce mutaciones en la secuencia de DNA ya que no puede corregir los nucletidos mal
incorporados.
Existen enzimas que cometen menos errores que la taq y tienen una probabilidad 100 veces
menor de cometer un error.
Las reacciones de PCR cuentan con una etapa de desnaturalizacin a 94C, donde el molde de
doble cadena de DNA se abre, luego se hibridan los primers y finalmente se sintetiza la cadena
complementaria. Si la enzima no es resistente, las incubaciones a 94C la desnaturalizaran.
Entonces, las polimerasas utilizadas para PCR son polimerasas termoestables que han sido
aisladas de microorganismos que crecan en ambientes extremofilos o termfilos.
En las reacciones de PCR tambin se pueden emplear mezclas de polimerasas para compensar la
desventaja de una (muy procesiva) con la ventaja de la otra (con correccin de errores).

Parmetros que definen a las DNA polimerasas

Fidelidad: no deben introducir errores; tiene que ver con la actividad 35 exonucleasa. Se
comprob que la presencia de cationes divalentes distintos al Mg 2+ o concentraciones de Mg2+
muy elevadas favorecen a que la enzima cometa ms errores. Las reacciones de PCR se
utilizan tambin para detectar la presencia de un alelo Wilde type o un alelo mutante en un
microorganismo; una taq polimerasa que tenga alta fidelidad nicamente va a polimerizar
cuando hay perfecta complementariedad entre las bases del extremo 3 del primer, si en esta
ultima interaccin de nucletidos no hay complementariedad, la taq no se adhiere y no se
extiende. (ver mutagnesis)
Procesividad: (ver nota al pie 2)
Termoactiva: debe poder actuar a altas temperaturas. Cuanto mas alta sea la temperatura de
la reaccin en total de PCR, se tiene una menor probabilidad de que ocurran polimerizaciones
inespecficas; es decir, la posibilidad de que el primer se hibride a regiones inespecficas es
1
Cun rpido puede llegar de un extremo al otro. Una enzima muy lenta no es til en una reaccin
de PCR ya que hay que darle mucho tiempo de extensin para poder amplificar un fragmento
determinado.
2
Parmetro muy importante que define a las polimerasas y tiene que ver con cuantos nucletidos
puede incorporar la polimerasa antes de despegarse del molde. Depende de las caractersticas
de la enzima.
2
 menor a altas temperaturas de reaccin. Cuando se hacen reacciones de PCR se trata de
trabajar en condiciones lo mas astringentes posibles, o sea, a la mayor temperatura posible
para que no ocurran hibridizaciones inespecficas de los primers con el molde.
Termoestables: debe ser capaz de soportar por un tiempo prolongado las altas temperaturas.
Debe tener una vida media alta cuando las temperaturas son elevadas.

Diferencias entre taq polimerasa y Pfu polimerasa

Caractersticas Taq polimerasa Pfu polimerasa
Temperatura optima 75-80C 75-80C
2hs (70-94C)
95% de actividad
Vida media (termoestabilidad) 45-96min (95C)
luego de 1 hora a 95C
9min (97,5C)
3x10-4-3x10-6 errores por 2x10-6 errores por
Fidelidad
nucletido polimerizado nucletido polimerizado
Exonucleasa 53 presente Exonucleasa 53 ausente
Actividades
Exonucleasa 35 ausente Exonucleasa 35 presente
Para tener alta fidelidad de
Mutagnesis
secuencia
Aplicaciones Amplificacin de
Para fragmentos ricos en
fragmentos largos
GC

Ejemplo: la Real Pfu polimerasa se utiliza para Real Time PCR y posee, esta enzima, un
anticuerpo que esta bloqueando el sitio activo; este anticuerpo slo se desprende a 94C y, por ello,
se pueden armar las reacciones a temperatura ambiente y se evita la polimerizacin de la enzima en
cualquier lado por pegado inespecfico de primers.

A modo de resumen: si se tiene que elegir una polimerasa en particular, se debe saber, en primer
lugar, para que se la necesita. Si se van a detectar mutaciones en individuos o poblaciones, se
necesita una enzima muy fiel. Si se van a amplificar fragmentos para luego expresar protenas,
tambin se requiere una enzima muy fiel. Si se va a hacer un chequeo de rutina, se necesita una
enzima que sea muy rpida, pero si comete errores, no genere problemas despus.

Pasos de la PCR
Un ciclo de PCR consta de 3 pasos:
Desnaturalizacin: ocurre a 94C, para separar el molde de DNA y obtenerlo como simple
cadena. El tiempo de desnaturalizacin va a depender de la complejidad del molde, un molde
de DNA genmico requiere mas tiempo ya que es rico en contenido de G-C y tiene un tamao
muy grande. Si el molde es DNA genmico se sugiere que, en primer lugar, se someta a
desnaturalizacin durante 3 minutos y posteriormente agregar la enzima y continuar con el
ciclado. Por lo general, el tiempo de desnaturalizacin 1 minuto.
Annealing o hibridacin de primers: la temperatura de annealing depende de la secuencia
del primer a utilizar.
Tanneling = Tmelting - 5C
Tmelting = 4(G + C) + 2(A + T)

Se bajan 5C a la temperatura de Melting para asegurase de obtener el apareamiento de

bases. Se debe trabajar a una temperatura donde se favorezca la formacin de la doble cadena.
Si, por ejemplo, se tiene un primer A con una T a de 48C, un primer B con una Ta de 52C y un
primer C con una Ta de 62C; con stos se quiere obtener un producto que es A-B y otro producto
3
 A-C a partir del mismo molde; la temperatura annealing a la cual se debe fijar el ciclado para
asegurarse de que todos los productos se formen deber ser la mas baja ya que, si se trabaja a
la temperatura mas alta, los primers con T a menor no se hibridaran al molde. Por ello, cuando se
deben disear primers, lo ideal es que los primers que se utilicen tengan la misma Ta o muy
cercana entre ellos.
Tiempo de annealing 45 segundos-1 minuto.
Extensin: siempre se extiende a 72C. El tiempo de extensin depende de la enzima que se
esta utilizando, por lo general se utiliza la Taq polimerasa, la cual incorpora 1000pb.min -1. A
partir de ello, dependiendo del fragmento que se esta amplificando, se calcula el tiempo de
extensin.

Caractersticas de la reaccin de PCR

Una caracterstica de la reaccin de PCR es que es una reaccin de amplificacin exponencial; es
decir,

Donde n es el nmero de ciclos. Por lo general el numero de ciclos es 30, porque se estima que
despus de 30 ciclos ya se consumieron todos los reactivos y la enzima se encuentra inactiva, por lo
que no vale la pena seguir sometiendo al molde y al producto a mas ciclados porque no va a
aumentar el rendimiento del producto.

Los productos de PCR se chequean en un gel de agarosa con un marcador de peso

molecular. Se chequea por un lado, que no haya inespecificidades, es decir, que haya una
nica banda, y, por otro lado, que sea del tamao correcto.

Si se grafica la cantidad de molculas de DNA por el numero de ciclos, se obtiene una

grafica como la siguiente

4
 Cantidad de DNA
Esta grafica indica, por un lado, que no vale la pena seguir por ms de 35 ciclos ya que se
encuentra en un plat y esto es debido al consumo de reactivos y la efectividad de la enzima; por otro
lado, indica que no se puede hacer una reaccin con un numero de ciclos menor a 30 ya que la
cantidad de producto es muy baja. Esto es en condiciones tericas.
0 5 10 15 20 25 30 35
Posibles problemas de una PCR Numero de ciclos
Producto no detectable
Bajo rendimiento del producto deseado
Contaminaciones: como el fundamento de la PCR es amplificar, mnimas contaminaciones
generan grandes problemas. Por ello, siempre hay que hacer controles negativos, ya sea de
reactivos, en el cual se colocan slo los reactivos que se utilizaron, o tambin control negativo
de DNA para ver si los primers no se unen a otra parte del DNA y estn dando productos
inespecficos.
Falsos positivos: se pueden llegar a determinar por una corrida en un gel por la presencia de
otras bandas a alturas no esperadas.

Parmetros
En lo que respecta al ciclado las variaciones se pueden dar en los siguientes parmetros:
Temperatura y tiempo de desnaturalizacin: depende del molde.
Temperatura y tiempo de annealing:
Tiempo de extensin:
La temperatura de extensin no es una variable ya que se usa a 72C.

En cuanto a los reactivos, ya sea por exceso o defecto,

Concentraciones de enzima: un exceso de enzima no es bueno ya que puede dar lugar a
polimerizaciones inespecficas
Concentraciones de dNTPs: una disminucin de reactivos puede dar lugar a la formacin de
producto indeseado.
Concentracin de Mg2+: un exceso o defecto del catin da lugar a mayor cantidad de errores
producidos por la polimerasa.
Composicin y concentracin de primers: cuando se disean los primers es fundamental que no
haya apareamiento entre ellos, ya que puede dar producto inespecfico. Adems, un exceso de
primer puede favorecer al apareamiento inespecfico primer-DNA.

Diseo de primers
Tamao: entre 18-28 nucletidos; se debe tener en cuenta, adems, el contenido de G+C y por
ende la Ta.
5
 Cantidad de G+C: 50-60%, aunque hay excepciones. adems, debe ser similar al contenido de
G+C del DNA molde para que al aumentar la temperatura de anneling se disminuya la
inespecifidad.
Temperatura de Melting: balanceada entre ambos oligonucletidos, para evitar que uno se
hibride bien y el otro inespecficamente.
Hibridizacin especifica con el molde: que se hibride slo en la regin que se desea y no en
varias.
Distancia entre primers: separados por una distancia capaz de ser recorrida por la Taq (menor a
3Kpb). Por un lado, que no estn muy cerca para que no se solapen y, por otro lado, que no
estn lejos y la enzima no llegue hasta el otro extremo porque no se va a obtener producto.
Secuencia del primer: evitar la formacin de primer-dimer, es decir, la hibridizacion entre
primers.
Presencia de mistmatches: deben estar ubicados hacia 5, ya que la enzima necesita una
perfecta hibridizacion 3 para unirse. (ver mutagnesis)
Para introducir sitios de restriccin: por ejemplo para amplificarlo y luego clonarlo en un
vector. Se disea el primer perfectamente complementario cuya longitud depender de la
secuencia, por delante de la regin que se quiere amplificar se incorpora el sitio de restriccin e
inmediatamente despus del sitio de restriccin, se incorporan 3 bases que deben ser G o C.
Entonces,

El nmero de nucletidos de la regin que hibrida con el molde debe ser entre 18 y 20 tal
que su Ta no se eleve demasiado al momento de contar los nucletidos que se adicionaron y
tampoco debe ser menor a 18 ya que puedo no hibridizar en ninguna regin del molde. La
secuencia que hibrida al molde debe ser al menos 2 veces mayor en nmero de nucletido que
la secuencia que no hibrida, para que se estabilice la unin primer-molde.
Para el calculo de la Ta, se debe tener en cuenta que la parte que se adiciona no hibrida al
molde, por lo que, si se considera esta regin en el calculo de la temperatura, se obtendr un
valor alto que no permitir la hibridizacion del primer al molde. Siempre que se quiera agregar
sitios de restriccin, se utiliza para los primeros 10 ciclos la T a solo de la secuencia que hibride
al molde (sin el sitio de restriccin). En los prximos ciclos, la polimerasa leer el sitio de
restriccin como parte molde y lo que se puede hacer, para aumentar la especificidad de la
reaccin y evitar la formacin de productos inespecficos, es aumentar la T a a la temperatura
correspondiente al primer completo, es decir, sumndole el sitio de restriccin y las G o C
agregadas. Si esta ltima temperatura es mayor a la temperatura de extensin se procede de
dos maneras, o bien se fija a 72C y se aumenta el tiempo (siendo este tiempo el de annealing
y extensin) o bien se sube la temperatura pero no tanto, por ejemplo a 65C.

Aplicaciones de la PCR
Aislamiento de genes: una forma de hacer screening de bibliotecas es mediante sondas
especficas o tambin se puede hacer diseando primers especficos y buscando dentro de la
biblioteca el fragmento de inters mediante PCR.
Secuenciacin: la tcnica de secuenciacin, si bien no es un PCR convencional, utiliza la Taq
polimerasa para secuenciar.
Clonado:
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 RT-PCR: se utiliza generalmente para medir los niveles de mensajeros
PCR inversa: la idea es poder amplificar y conocer secuencias que estn flanqueando una
regin conocida.
Caminata cromosomal: permite amplificar regiones del genoma que estn cercanas a regin
del genoma conocida.
RACE-PCR: es una tcnica que permite mediante PCR poder completar una secuencia de
cDNA. Permite ir hacia ambos lados del cDNA se secuencia desconocida para poder obtenerlo
completo.
Differential display: basada en la RT-PCR. Permite detectar genes que se expresan en una
muestra y no en otra.
PCR cuantitativa en tiempo real.

Nested-PCR
Es una PCR de PCR. Se tiene, por ejemplo, un DNA genmico y se quiere amplificar una
secuencia de inters. Se utiliza un par de primers que se cree que son especficos, pero este par de
primers puede hibridizar en otras zonas que puede contener la secuencia target o puede hibridar
inespecficamente en otra regin por lo cual, en una reaccin de PCR, se van a tener dos productos
de los cuales no se sabe cual es el correcto. Para saber cual es el producto buscado, se realiza una
segunda PCR utilizando los productos anteriores como molde, utilizando un par de primer que
hibriden por adentro de la secuencia deseada.
Es muy poco probable que el nuevo par de primers hibride sobre el fragmento indeseado.

Esta tcnica es utilizada cuando se tiene poca informacin de la ubicacin de la secuencia target.
(La secuencia target no se conoce).

Clonado
Se toma el ejemplo el clonado de un fragmento que codifica para una protena.
Por un lado se amplifica el fragmento, se lo purifica y, posteriormente, se lo digiere con las
protenas adecuadas. Por otro lado, se corta el vector en el sitio mltiple de clonado, se purifica el
vector. Se juntan vector e inserto, se liga y se transforma. Para esto se necesita taq polimerasa,
7
enzimas de restriccin y ligasa. En este caso, se le agregaron sitios de restriccin al inserto mediante
PCR.
Tambin hay primers que no agregan sitios de restriccin pero la polimerasa, no todas, incorpora
en el extremo 3 del fragmento 3 o 4 A. entonces, se puede usar esta propiedad que poseen algunas
polimerasas y cortar al vector con enzimas que genere extremos romos y agregar a ste algunas T y
as generar una regin que pueda hibridizar con el fragmento que tiene A.
Existen vectores comerciales para evitar hacer lo mencionado anteriormente. Uno de ellos es un
sistema llamado pGEM-T que lo que tiene es, adems de un sitio de multipleclonado muy grande,
tiene los promotores de la T7 RNA polimerasa, de la SP6 terminal polimerasa; tiene el gen LacZ
introducido, con el cual se puede diferenciar colonias blancas de azules, y adems tiene, al costado
del sitio de mltiple clonado, las colitas de T agregadas. El vector viene listo para usar, el vector esta
abierto con las colitas de T.

Otro vector comercial es uno que no necesita de ligasa, tiene las colitas de T y adems,
pegado al vector, tiene una topoisomerasa. Entonces, se coloca el vector y el inserto y se
transforma sin ligar. No se sabe como ocurre la ligacin. El vector, al igual que el anterior, esta
abierto.

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 Construccin de molculas quimera
Las molculas quimeras son aquellas molculas formadas por fragmentos de dos molculas
diferentes. Esto consiste en:
Se quiere obtener una protena de fusin, por ejemplo, se desea fusionar una protena target a
una protena fluorescente. Una secuencia se encuentra en gen 1 y la otra secuencia en gen2.
En primer lugar, se disea un primer exterior para gen1 cuyo extremo 3 sea homologo al
extremo 5 de gen2 y viceversa. Se realizan las reacciones de PCR por separado y el resultado final
son dos molculas de DNA con regiones homologas entre si; tienen una regin de
complementariedad que puede ser de hasta 20 nucletidos.
Posteriormente, se mezclan los productos, se calienta para que deshibriden las cadenas de DNA y
se deja enfriar lentamente. Los extremos complementarios se hibridan y luego se agrega Klenow para
extender las cadenas. Finalmente, por PCR, utilizando primers de los extremos, se amplifica la
quimera.

3 5
5 3

PCR (x2 se amplifica primero uno y luego el

otro)
3 5 3 5
5 3 5 3

Juntar los dos productos y

deshibridar
3 5 3 5

5 3 5 3

Hibridizacion

3 5
5 3
+
5 3
3 5

Extensin con Klenow

3 5
5 3

Amplificacin por PCR

RACE-PCR (Rapid Amplification of cDNA Ends)

Es una tcnica que permite amplificar extremos de DNA copia. Hay dos tipos de RACE
1. 5 RACE-PCR: se desea obtener el extremo 5 faltante de un cDNA obtenido, por
ejemplo, de una biblioteca; slo se conoce la secuencia del extremo 3 de dicho cDNA. Se
disea un primer sobre la regin conocida, un primer interno. Entonces, por una reaccin
de retrotrascripcin utilizando una transcriptasa reversa, se obtiene RNA mensajero. La RT,
por lo tanto, va a extender hasta el extremo 5 desconocido. A partir del mRNA se va a
9
 obtener un cDNA del cual solo se conoce el extremo 3 y no se conoce la secuencia del
extremo 5.
Como no se conoce la secuencia del extremo 5 del cDNA, se procede a una reaccin con
una terminal transferasa, la cual permite incorporar nucletidos sin necesidad de un molde,
con dATP solamente, con el objetivo de incluir al cDNA una colita de poliA.
La PCR, entonces, se realiza utilizando el primer de secuencia conocida y un oligo de
T, un primer compuesto slo de T que se va a aparear a la cola de poliA. As, se
amplificar un fragmento de secuencia desconocida.
Tambin, se puede agregar un adaptador que va a permitir luego digerir con una enzima
de restriccin y clonarlo en un vector.

2. 3 RACE-PCR: no se conoce la secuencia del extremo 3 del cDNA, pero lo que si se sabe
es que en el mRNA se tiene naturalmente una cola de poliA. Por ello, se puede empezar
haciendo una PCR con un primer conformado slo por T, un oligo de T. en esta primera
reaccin, se amplifica el cDNA completo. Tambin se tiene alguna informacin sobre la
secuencia del extremo 5 del cDNA.
Se realiza una segunda PCR con el primer poliT y un primer interno de secuencia conocida
y, as, amplificar toda la regin 3 del cDNA.

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 PCR inversa
Se conoce una secuencia, pero no se conoce la secuencia que esta por afuera de la
secuencia conocida.
En primer lugar, se corta el fragmento con enzimas de restriccin, que no corten tan
frecuentemente y luego se liga el DNA digerido. Entonces, se obtienen molculas circulares.
Posteriormente, se digiere la molcula circular con una enzima que corte dentro del fragmento de
secuencia conocida. Se obtiene, as, un fragmento linear con extremos de secuencia conocida.
La reaccin de PCR se realiza utilizando primers que hibriden en la secuencia conocida. De esta
manera, se amplifica un fragmento de secuencia desconocida. Por secuenciacin se obtendr la
secuencia de dicho fragmento.

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 Real Time PCR
Entre las estrategias que existen para cuantificar los niveles de transcriptos son northern blot,
ribonuclease protection assay (RPA), in situ hibridizacion y PCR.
En la PCR, como se utiliza para cuantificar niveles de mRNA, lo que se utiliza como molde es
mRNA, por lo cual se requiere un paso previo de retrotranscripcin para pasar de mRNA a cDNA y
despus realizar la PCR sobre este cDNA.
Los tipos de PCR para cuantificar mRNA son la PCR convencional y la Real Time PCR o PCR
cuantitativa.
La retrotranscriptasa tiene una actividad polimerasa 53 y es una polimerasa RNA dependiente.
Tambin posee actividad exonucleasa 53 y exonucleasa 35. Esta enzima, adems, posee
actividad RNAsaH.
Se tiene el mensajero en sentido 3-5; se puede utilizar un primer poliT que hibride sobre la colita
de poliA o un primer especifico de secuencia nica del gen de
inters. Con los primer poliT se va a obtener cDNA de todos
los transcriptos que hay en la muestra, no as con los primers
Cantidad de DNA

especficos con los cuales se obtendrn solo los transcriptos

de inters. Tambin se pueden utilizar primers randoms N6
que son primers de secuencia al azar que hibridan en
cualquier parte del mRNA. Entonces, hay 3 maneras distintas
de hacer la retrotranscripcin. Generalmente, se hace cDNA
de todos los transcriptos.
Para cuantificar se puede hacer una RT seguida de una
PCR semicuantitativa, es decir, cuantificando los niveles en
una regin especifica de la curva, es decir, en la zona lineal
Curva log
de la curva logartmica. Lo que se hace es largar la reaccin y

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0 5 10 15 20 25 30 35
Numero de ciclos
al ciclo n25 cortar, tomar una muestra y seguir ciclando. Finalmente, sembrar en un gel las muestras
de los diferentes ciclos.
La Real Time PCR reemplaza la metodologa antes descripta. Este tipo de PCR permite observar
en un monitor de computadora lo que esta sucediendo ciclo a ciclo, cmo se est produciendo la
amplificacin ciclo a ciclo en el tubo de PCR.
Se utiliza un ciclador convencional y adems se utilizan colorantes fluorescentes mas todos los
componentes necesarios para realizar la reaccin de PCR. Lo que detecta el ciclador es la
fluorescencia que emite el tubo en cada ciclo de amplificacin. De acuerdo a la fluorescencia emitida,
se va construyendo una grafica.
Lo que se utiliza generalmente para la fluorescencia es el Cyber Green, el cual es un colorante
fluorescente, similar al bromuro de etidio, que se intercala en las bases cuando el DNA esta doble
cadena, es decir, el cyber green fluorece cuando el DNA esta doble cadena. El ciclador detecta la
fluorescencia cuando finaliza el paso de extensin. Se supone que los niveles de fluorescencia tienen
una relacin directa con la cantidad de DNA doble cadena existente.
Otro parmetro que tiene en cuenta la PCR es cuando se tienen varias muestras, es decir, el
ciclador va detectando lo que va pasando en cada momento en cada tubo y lo grafica con colores
diferentes. El programa del ciclador traza una lnea horizontal ms o menos a la mitad de la zona de
linealidad. Esta lnea es una lnea umbral. El Ct es el punto de la curva en el cual la amplificacin
cruza el valor umbral.
Como se puede observar, no es lo mismo realizar una PCR Real Time, donde el numero de ciclo
en el cual se da el Ct es distinto para cada muestra, que realizar una PCR convencional en la cual
solo se observa la cantidad de DNA a tiempo final. En el caso de la figura, si se realiza una PCR
convencional, a tiempo final, se concluye que los niveles de transcriptos son los mismos, pero si se
realiza una Real Time y se observa el valor umbral, se obtienen distintos niveles de mensajeros. El
programa del ciclador relaciona al Ct con los niveles de expresin de los genes. Lo que se encuentra
por debajo del valor umbral es background.

Par comprobar si el producto amplificado es especfico se utilizan las curvas de Melting. Cuando
termina la reaccin de PCR, el programa del ciclador permite conocer la identidad de su producto.
Cuando finaliza la reaccin, el ciclador empieza a elevar la temperatura y va tomando la fluorescencia
cada 2C y grafica una curva d2Fluorescencia/dT2 vs. T. esta grafica se denomina cura de Melting. Si
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los productos son los mismos, las curvas deben tener el mismo pico; esto tiene que ver con la
secuencia especifica del producto.

Para cuantificar una muestra de DNA, lo primero que hay que tener en cuenta es que se coloque la
misma cantidad de muestra en todos los tubos de reaccin. Para ello, se recurre a genes standars,
que son genes que estn en alta concentracin y nunca varan su expresin, son genes constitutivos.
Se analiza la muestra con el gen de inters y se analiza la muestra con el gen estndar. En teora, los
niveles de expresin del gen estndar en todas las muestras deben ser el mismo, mientras que la
muestra incgnita puede variar o no. Por ejemplo, para plantas, se utilizan genes ribosomales. Los
genes standars son muestras control. Por lo general, los genes standars tienen alto niveles de
expresin
Para cuantificar, se aplica un mtodo denominado Ct. se tiene, entonces, por un lado el gen
estndar o de referencia y por el otro el gen incgnita. Si se quiere analizar, por ejemplo, los niveles
de expresin de un gen en un tejido normal y uno en un tejido patolgico. Entonces, se evala el C t
para el gen de tejido normal y el Ct del gen estndar y calcula un Ct que corresponde a la diferencia
entre el Ct del gen target con el gen estndar. Un Ct negativo indica mayor nivel de expresin.
Tambin se calcula el Ct entre el gen de tejido patolgico y el del estndar. Finalmente, se hace el
clculo de Ct haciendo simplemente la diferencia entre los Ct.

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