3- CINTICA ENZIMTICA

Estudia las velocidades de las reacciones y la forma en que stas cambian en respuesta a
modificaciones experimentales.
Las enzimas aumentan la velocidad de las reacciones, sin modificar su constante de
equilibrio.
 La velocidad de una reaccin qumica puede
determinarse midiendo la aparicin del
producto (P) o la desaparicin de los
reactivos (R) a lo largo del tiempo.

k -d[A ] d[B]
A B v= = = k [S]
dt dt

k-constante de reaccin: depende de la probabilidad de que

las molculas se encuentren y de que la reaccin sea exitosa.
Las reacciones enzimticas siguen
los principios generales de la
cintica de las reacciones Pendiente de la recta en el
qumicas, pero adems muestran inicio de la reaccin
un rasgo caracterstico: Vo = Velocidad inicial
la SATURACIN POR (moles P formados/tiempo)
SUSTRATO
Desaparicin de 10% S

Segn transcurre la reaccin, la velocidad

de acumulacin de producto disminuye
porque se consume el sustrato de la
reaccin. Para evitarlo se representa la
velocidad inicial de la reaccin (V0=igual a
la pendiente de la curva de avance a tiempo
cero) frente a la concentracin de sustrato.
La velocidad de una reaccin catalizada por una enzima depende de:
* Cantidad de enzima
* La concentracin de molculas de sustrato (Cintica de Michaelis-
Menten)
* El pH
* La temperatura
* La presencia de inhibidores
 Velocidad de la reaccin (VO)
* Cantidad de enzima
La V0 es proporcional a la concentracin de enzima, al
menos en un determinado rango de concentraciones.

Concentracin de enzima [E]

* La concentracin de molculas de sustrato (Teora de Michaelis-Menten)

Considerando la [E] constante y variable la cantidad de sustrato, la relacin entre la velocidad
y la [S] es una hiprbole.

Etapa lineal-Baja [S]- velocidad proporcional a [S]

Etapa curvilnea-descenso de la respuesta al

aumento de [S]. Velocidad dependiente de la
velocidad de transformacin qumica de ES a EP y
separacin de E-P
La velocidad no vara al aumentar la [S]. La
velocidad sera la mxima
EFECTO DE SATURACIN DEL ENZIMA POR EL SUSTRATO
 (1) La concentracin total de enzima es la suma de la
unida al sustrato y la libre.

(2) Las reacciones catalizadas enzimticamente ocurren

en dos etapas: rpida formacin del complejo ES, lenta
catlisis del complejo.

(3) La etapa limitante (4) Bajo condiciones de

de la reaccin es la saturacin, toda la enzima
Leonor Michaelis descomposicin del interviene en la formacin Maud Menten
(1875-1949) (1879-1960)
complejo ES. del complejo ES.

(5) Cuando toda la enzima se encuentra en (6) El complejo ES se encuentra en estado

forma de complejo ES, la velocidad de la estacionario: velocidad de formacin del
reaccin es la mxima posible (Vmx). complejo ES igual a la velocidad de desaparicin.

CINTICA DE MICHAELIS MENTEN

En 1913 Michaelis y Mentel propusieron una ecuacin de velocidad para
explicar el comportamiento cintico de las enzimas y asumiendo ciertos
supuestos:
 (2) Las reacciones catalizadas enzimticamente ocurren en dos etapas

k1 k2 k1, k-1 y k2 son la constantes cinticas individuales

E+S ES E+P
v1= k1 [E] [S]
k-1
v-1= k-1 [ES]
Unin del Etapa cataltica, v2=k2 [ES]
sustrato lenta o
Etapa rpida limitante Constante cataltica

(6) Hiptesis del estado estacionario: la velocidad de formacin del

complejo enzima-sustrato (v1) es comparable a la de su disociacin (v-1+ v2).

v1=v-1+v2 La velocidad con que se forma ES es k1[E][S] = k-1[ES] + k2[ES]

igual a la velocidad con que se destruye. k1[E][S] = (k-1 + k2)[ES]

[ E ][ S ]
(k 1 k 2) [ E ][ S ] (k 1 k 2)
k1
[ ES ] km
[ ES ] k1
constante de
Michaelis Menten
[ E ][ S ] (k 1 k 2) [ E ][ S ]
km Km[ES] = [S][E]
[ ES ] k1 [ ES ]

(1) [ET] = [E] + [ES] [E] = [ET] - [ES] Km[ES] = [ET][S]-[ES][S]

[ET] [S]
Sacando factor comn [ES]: [ES](Km + [S]) = [ET][S] [ES] = ---------------
Km + [S]
(3) Como la etapa limitante de la reaccin es la descomposicin del complejo ES.
k2[ET] [S]
v = k2[ES] v = ---------------
Km + [S]

(4) En condiciones de saturacin [ES]=[ET] v = k2[ET]

(5) Se define Vmax=k2[ET]

Ecuacin de Michaelis-Menten
 Vmx
Velocidad cuando todos los centros
activos estn ocupados con S.

KM

Km = [S] cuando
V0=1/2 Vmx
Concentracin de
sustrato a la cual la
velocidad de la
reaccin es Vmax
 Velocidad cuando todos los centros activos estn ocupados con S.
Vmx
Ciertas transformaciones matemticas permiten obtener un valor numrico de Vmax a
partir de los datos experimentales.

Constante de Michaelis Menten-Km

Constante cataltica-Kcat

Eficiencia cataltica-kcat/km
1 Km: concentracin de sustrato a la cual la velocidad de la reaccin es Vmax
V max V max [ S ] ; 1 [S ]

2 Km [ S ] 2 Km [ S ]

Km [S ] 2 [S ] KM es una medida de la concentracin

Km [S ] de sustrato necesaria para que se
produzca una catlisis eficaz.

2 Km: ndice de afinidad de la enzima por el sustrato

(k - 1 k2) Km
k -1 k1 k2
Km Si K2<<< K-1 E+S ES E+P
k1 k1
k-1

Km Baja alta afinidad K-1< K1 -Gran estabilidad del complejo ES

-Gran afinidad del E por el S
Km alta poca afinidad K-1> K1
El valor de Km vara considerablemente de una enzima a otra y para una misma enzima difiere
segn los distintos sustratos.
Experimentalmente se ha visto que el valor de Km de una enzima est prximo a la [S]
habitual para esa enzima en el ambiente celular.

Enzima Sustrato Km (mM)

Catalasa H2O2 25
Hexoquinasa ATP 0.4
D-Glucosa 0.05
D-Fructosa 1.5
Quimotripsina Gliciltirosinilglicina 108
N-Benzoiltirosinamida 2.5
-Galactosidasa D-Lactosa 4.0
Treonina deshidratasa L-Treonina 5.0

Pequeas variaciones en la [S] pueden suponer grandes cambios en la velocidad de toda una
ruta metablica.
Nmero de recambio del enzima: nmero de Vmax=k2[ET] Vmax=kcat[ET]
molculas de sustrato convertidas en producto por
unidad de tiempo por una molcula de enzima V max
cuando sta est totalmente saturada de sustrato. Kcat
[ ET ]
Constituye una medida directa de la produccin cataltica de producto en condiciones
ptimas (enzima saturada). Cuanto mayor es Kcat, la enzima es ms eficaz en la etapa de
transformacin del sustrato en producto.

Enzima Sustrato Kcat (s-1)

Catalasa H2O2 4 x 107

Acetilcolinesterasa Acetilcolina 1.4 x 104
-Lactamasa Bencilpenicilina 2 x 103
Fumarasa Fumarato 8 x 102
RecA (ATPasa) ATP 4 x 10-1
La proporcin entre las constantes cinticas Kcat
proporciona una medida directa de la EFICIENCIA
eficacia y la especificidad de la enzima. kM

Enzima Sustrato Kcat (s-1) Km (M) Kcat/Km (M-1s-1)

Acetilcolinesterasa Acetilcolina 1.4 x 104 9 x 10-5 1.6 x 108

Catalasa H 2 O2 4 x 107 1.1 4 x 107

Fumarasa Fumarato 8 x 102 5 x 10-6 1.6 x 108
Malato 9 x 102 2.5 x 10-5 3.6 x 107
-Lactamasa Bencilpenicilina 2.0 x 103 2 x 10-5 1 x 108
Triosa-fosfato isomerasa Gliceraldehido-3-fosfato 4.3 x 103 4.7 x 10-4 2.4 x 108

El hecho de que la enzima sea ms eficaz en la

etapa de transformacin del sustrato en
producto (mayor Kcat), no implica que sea ms
eficiente; ya que la afinidad de la enzima por
el sustrato puede ser menor (Km mayor).
Unidad de enzima (UI): Cantidad de enzima necesaria para transformar
1mol de sustrato por min.

Katal (Kat): cantidad de enzima para transformar un mol sustrato por segundo
1Kat = 6x107 UI
Como esta unidad es muy grande, se utilizan frecuentemente los submltiplos
como el microkatal (kat, 10-6 kat) o el nanokatal (nkat, 10-9 kat)

La actividad especfica es el nmero de unidades de enzima por miligramo de

protena (U/mg prot) o por mililitro de disolucin (U/ml).
NO TODAS LAS ENZIMAS SIGUEN UNA CINTICA MICHAELIANA
(ver enzimas alostricas)
La velocidad de una reaccin catalizada por una enzima depende de:

* Cantidad de enzima
* La concentracin de molculas de sustrato (Cintica de
Michaelis-Menten)
* El pH
* La temperatura
* La presencia de inhibidores
2. Sobre la transformacin
cataltica del substrato
pH
3. Sobre la estructura de la
protena enzimtica
1. Sobre la fijacin del substrato al
centro activo:
-Grupos disociables de la enzima
- Grupos disociables del sustrato

pH ptimo: pH en el cual la conformacin de la enzima es la ms adecuada para

su actividad cataltica.
 Succinato y centro activo de Succinato Deshidrogenasa
NH NH NH
Arg
C C C
-
+
H3N NH +
H3N NH H2N NH
COO COOH COO-
CH2 CH CH2 CH CH2 CH
CH2 CH2 CH2
-
COO COOH COO-
+
H 3N Lys +
H3N H2N

CH CH CH

pH 7 pH 2 pH 13

pH ptimo
La velocidad de una reaccin catalizada por una enzima depende de:

* Cantidad de enzima
* La concentracin de molculas de sustrato (Cintica de
Michaelis-Menten)
* El pH
* La temperatura
* La presencia de inhibidores
 2. Desnaturalizacin
1. Aceleracin Temperatura trmica de la protena

La temperatura a la cual la actividad cataltica

Por un lado, la temperatura
aumenta la velocidad de reaccin
(un aumento de 10 en la T
duplica la velocidad de reaccin)
es mxima se llama temperatura ptima.
Por otro lado, la temperatura desnaturaliza la protena,
que pierde su actividad

DT
La velocidad de una reaccin catalizada por una enzima depende de:

* Cantidad de enzima
* La concentracin de molculas de sustrato (Cintica de
Michaelis-Menten)
* El pH
* La temperatura
* La presencia de inhibidores
 Los INHIBIDORES son pequeas molculas qumicas o iones que pueden
ralentizar o inhibir una reaccin enzimtica.

REVERSIBLES IRREVERSIBLES
Unin no covalente de un inhibidor a la Unin covalente del inhibidor al
enzima enzima
Competitiva
No competitiva Elementos naturales, toxinas
(Acompetitiva-multisustrato) especficas, venenos, iones, frmacos

E+I EI E+I E

ES + I ESI
Los inhibidores reversibles competitivos tienen un
parecido estructural con el sustrato, lo que
permite que se unan con facilidad al centro activo,
pero a diferencia del sustrato este inhibidor no
experimenta una reaccin cataltica. La molcula del inhibidor se une al
Este tipo de inhibicin se puede eliminar a centro activo, excluyendo al sustrato.
elevadas concentraciones de sustrato.

Durante el tiempo en el que el inhibidor est unido al enzima, se evita la catlisis.

COMPITE CON EL SUSTRATO

La inhibicin reversible puede ser descrita cuantitativamente en trminos de la unin
del inhibidor a la enzima y al complejo enzima-sustrato, y sus efectos en las
constantes cinticas de la enzima.

No cambia Vmax
Si [S] -no hay
competicin
Aumenta Km

Se necesita ms sustrato para alcanzar la mitad de la Vmax, por lo que Km

aparentemente aumenta.
Gran parte de la farmacoterapia moderna est basada en la inhibicin enzimtica, y
en gran medida en la de tipo competitivo, por su elevada utilidad biolgica y
teraputica.

Quimioteraputicos: metotrexato

El metotrexato es un inhibidor competitivo

de la enzima dihidrofolato reductasa que se
emplea en la sntesis de nucletidos. Este
mtodo se emplea en el tratamiento del
cncer.
 Agentes antibacterianos: Sulfamidas Estatinas

Compiten con el p-amino-benzoico en la unin Inhiben HMG-CoA reductasa (3-hidroxi-3-

con la enzima dihidropteroato sintasa que metilglutaril-coenzima A reductasa), enzima

interviene en la sntesis de DNA de bacterias. limitante sntesis de colesterol.

Etanol

cido flico Ante intoxicacin con metanol, la enzima

alcohol deshidrogenasa forma formaldehido,
muy daino. El etanol, sustrato preferente de
cido p-aminobenzoico la enzima, compite con el metanol por su
unin al enzima.

Sulfonilamida
El inhibidor se une a un sitio distinto del centro activo, no compite con el
sustrato.

Se fija indistintamente a la enzima libre E

y al complejo enzima-sustrato ES; ni el complejo EI,
ni el complejo ESI son productivos.

La presencia del inhibidor no impide al

sustrato unirse (y viceversa) (Km no variar).

NO EXISTE COMPETENCIA CON EL SUSTRATO

El inhibidor reduce la velocidad de reaccin. La inhibicin no revierte al
incrementar la [S] (porque as no se evita la unin del inhibidor no competitivo).

Disminuye Vmax
No cambia Km

Sin inhibidor

Velocidad (Vo)
El inhibidor no tiene por qu tener
parecido estructural con el
sustrato, sino que tiene afinidad
por un segundo lugar de unin al
enzima. [Sustrato]
En su mayora, se combinan de forma covalente con las enzimas y las inactivan de
manera irreversible.
poseer semejanza estructural con el sustrato (TPCK)

Los inhibidores pueden poseer semejanza estructural con el estado de transicin

=anlogos del estado de transicin

Activarse tras procesamiento enzimtico: inhibidor

suicida (cido clavulnico).

Casi todos los inhibidores enzimticos irreversibles son sustancias txicas

(naturales o sintticas).
La penicilina se une covalentemente y de manera irreversible a la enzima
transpeptidasa, que estabiliza la membrana bacteriana.

Gases neurotxicos como el gas sarn o el gas mostaza que inhiben a la

acetilcolinesterasa presente en la hendidura sinptica, causando parlisis.

La Aspirina es un inhibidor irreversible de la Prostaglandina Sintasa

(Cicloxigenasa) o COX, que convierte al acido araquidnico en Prostaglandina
H2. Por lo tanto, la aspirina impide la formacin de prostaglandina H2 y
derivados; de ah sus efectos antiinflamatorios y anticoagulantes.

Cianuro: Reaccin con el hierro del complejo citocromo oxidasa de la

cadena de transporte de electrones, induciendo hipoxia celular.
 (AET)
- El inhibidor no es estrictamente anlogo del substrato, sino del Estado de
Transicin de la reaccin.
- La afinidad de las enzimas por los AET es enorme (nM o pM), con lo que la
fijacin es tan fuerte que puede considerarse irreversible.

Ejemplo: Captopril como AET de la enzima ECA, tratamiento de la hipertensin

Enzima convertidora
Angiotensingeno Angiotensina I Angiotensina II
Renina de Angiotensina, ECA

R
CH COO- Contribuye al
- HN
CH COO aumento de la
N C O presin arterial
C O R' C H
H3C C H NH
H C HO C
H
-
O C Estado de transicin de la
-
S AET
Zn2+ ECA
 (Inhibidores activados enzimticamente)
Se trata de molculas que se unen al centro activo de manera especfica, igual que
el sustrato o los inhibidores competitivos.

La accin cataltica de la enzima

convierte al inhibidor I en una
especie altamente reactiva I*

El inhibidor se fija a la enzima igual I* modifica covalentemente a la enzima,

que el sustrato o un inhibidor inactivndola de forma definitiva al igual
competitivo convencional que un inhibidor irreversible.

1 2 3
E+I EI EI* E + I*

Tienen por tanto (a) la especificidad del inhibidor competitivo y (b) la potencia de
los inhibidores irreversibles.
Sistema de la b-lactamasa bacteriana
Los microorganismos resistentes a los antibiticos b-lactmicos (penicilinas, sus
derivados semisintticos y cefalosporinas), lo son por producir una enzima, la b-
lactamasa, que inactiva a los antibiticos b-lactmicos.
Muy a menudo los preparados de penicilinas o penicilinas semisintticas se formulan
aadiendo un inhibidor suicida de la b-lactamasa, el cido clavulnico

O CH2OH O
C b-Lactamasa O CH2OH
C
N H C
O O- HN H
-
COO
COO-
c.clavulnico
Esta molcula
O reacciona con la
O CH2OH serina activa de la
C
CH CH2 O
C b-lactamasa,
HN H produciendo su
Ser
COO- inactivacin
Las monoamina oxidasas (MAO) del sistema nervioso son enzimas esenciales para la
inactivacin de los neurotransmisores monoaminrgicos (serotonina, dopamina,
adrenalina y noradrenalina).
Los inhibidores suicidas de las MAOs se utilizan en el tratamiento de la depresin y la
enfermedad de Parkinson.