INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL.

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS.

DEPARTAMENTO FARMACIA.
TOXICOLOGA GENERAL PARA INGENIERA EN SISTEMAS
AMBIENTALES.

PRCTICA 8. EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD DE LA

ACETILCOLINESTERSA EN ANIMALES TRATADOS CON PLAGUICIDAS
ORGANOFOSFORADOS.

5AV1

EQUIPO 2:

GARCA SANCHEZ LUIS ANTONIO

MRQUEZ SEGOVIA DIANA LAURA

ONETO GOROCICA LEVI

SAN JUAN SOSA DIANA LAURA

SANTIAGO FIGUEROA RUB BETSABEE

Fecha de realizacin:

21/Octubre/2016

Fecha de entrega:

4/Noviembre/2016
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RESUMEN

INTRODUCCIN

Debido a la persistencia de los insecticidas organoclorados fue necesario

desarrollar otros tipos de plaguicidas, tal es el caso de los compuestos
organofosforados (POF). La primera molcula sintetizada de tipo de POF fue el
tetraetilpirofosfato (TEPP) y era muy efectiva como insecticida, pero poco
apropiada para su uso agrcola por su rpida degradacin en el ambiente.

Para ejercer su efecto txico los POF requieren ser metabolizados,a travs de la
fosforilacin de la enzima acetilcolinesterasa que es una enzima esencial con un
alto grado de especificidad en cuanto al sustrato, y que est presente unida a
estructuras celulares en las regiones de las sinapsis colinrgicas. Como parte del
sistema de la acetilcolina, esta enzima tiene la funcin fisiolgica de desdoblar
rpidamente la acetilcolina neurotrasmisora (AC) en colina y cido actico, y, de
esta manera, inactivarla.

Si la enzima se inhibe, se acumula acetilcolina en el espacio sinptico alterando el

funcionamiento normal del impulso nervioso. Esta acumulacin sucede en las
uniones colinrgicas neuroefectoras (efectos muscarnicos), en las uniones
mioneurales del esqueleto y los ganglios autnomos (efectos nicotnico) as como
en el sistema nervioso central. Una vez metabolizados, los oxones reaccionan con
la enzima mediante unin covalente con en el sitio activo de la acetilcolinesterasa,
mientras se libera la fraccin alcohlica. El resultado final es la inhibicin de la
enzima que produce crisis colinrgicas agudas, sndrome intermedio (IMS) y
polineuropatas, finalmente la muerte puede ocurrir por paro respiratorio.

OBJETIVOS
Evaluar la inhibicin de la actividad de la acetilcolinesterasa en el cerebro de
ratones producida por la exposicin aguda a un POF.
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HIPOTESIS
A mayor concentracin del pesticida utilizado, la actividad de la enzima
acetilcolinesterasa ser menor. De la misma manera, a menor concentracin de
pesticida, mayor actividad de la enzima, es decir mayor hidrolizacion de
acetilcolina.

METODOLOGA

Reactivos

1) Buffer Tris pH 7

Disolver en agua destilada 8.1816 g de NaCl; 0.4473 g de KCl; 0.484 g de Trizma

y aforar a 1000 mL (preparar solo 250 mL), ajustar el pH a 7 con solucin de HCl
0.1 N.

2) Cloruro de acetilcolina 10 moles/mL en buffer Tris pH 7

Pesar 0.0455 g de cloruro de acetilcolina, disolver y aforar a 25 mL con Buffer Tris

pH 7

3) Hidroxilamina alcalina 2 M

Disolver 3.475 g de clorhidrato de hidroxilamina y aforar a 25 mL con agua

destilada, despus esta solucin se mezcla con 25 mL de NaOH 3.5 N. La
solucin se prepara al momento de utilizarla.

4) cido clorhdrico 4 N

En un matraz volumtrico de 100 mL agregar 32.62 mL de cido clorhdrico

concentrado y aforar con agua destilada.

5) Cloruro frrico 0.34 M

Pesar 20.585 g de FeCl 3 disolver en HCl 0.1 N y aforar a 250 mL.

6) Hidrxido de sodio 3.5 N

Pesar 14 g de NaOH, disolver en agua destilada y aforar a 100 mL.

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DESARROLLO DE LA PRCTICA

Centrifugar a 9,000
Separar el cerebro de rpm/15 min para
Despus de la los ratones, colocarlo en obtener la fraccin S9
exposicin aguda a mortero, agregar 2.0 ml (sobrenadante) para la
diferentes dosis del de agua desionizada y evaluacin de la
txico. macerar hasta la actividad de la
disgregacin total, acetilcolinesterasa por
el mtodo de Hestrin.

Mtodo de Henstrin.
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Tomar 100 L de la fraccin

Transcurrido ese tiempo se
S9, se agregan 250 L de
aaden 500 L de
buffer de Tris pH 7 y 250 L La absorbancia obtenida se
hidroxilamina alcalina 2 M;
de acetilcolina estndar (10 divide entre los minutos de
250 L de HCl 4 N y 250 L
moles/mL), se agita y se incubacin para obtener
de FeCl 3 0.34 M; se agita y
incuba a temperatura laabsorbancia por minuto
se determina la
ambiente durante 15 a 30
absorbancias a 540 nm.
minutos.

Las lecturas se interpolan Agregar la correspondiente Transcurrido ese tiempo se

contra curva estndar de cantidad de sol. cloruro de adiciona a cada tubo 500 L
acetilcolina para calcular los acetilcolina y buffer. de hidroxilamina alcalina;
micromoles de acetilcolina
Despus de mezclar se 250 L de HCl 4 N y 250 L
hidrolizada usando una
incuba a temperatura de FeCl 3 0.34 M; agitar y
regresin lineal contra curva
ambiente durante 15 a 30 medir las absorbancias a
de calibracin de
minutos. 540 nm
acetilcolina.

Determinacin de protenas por el mtodo de Bradford (1976)

Tomar 10 L de la fraccin S9 y agregar 90 L de solucin buffer de fosfatos.

Agregar 100 L de solucin de Bradford y dejar reposar 10 min, Leer a 595 nm
contra blanco de reactivos. Calcular la concentracin de protenas contra una
curva tipo de albmina.

RESULTADOS

Tabla 1. Concentraciones de la curva tipo de acetilcolinesterasa, con sus

respectivas absorbencias.

Concentraci Absorbencia
n (mg/kg) (nm)
0 0.122
1 0.244
2 0.56
3 0.602
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4 0.776
5 1.095

1.2

1 f(x) = 0.19x + 0.08

R = 0.95
0.8

0.6
Absorbancia (nm)

0.4

0.2

0
0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5

Concentracin (mg/kg)

Figura 1. Curva tipo de las concentraciones de acetilcolinesterasas con

respecto a las absorbencias observadas en el espectrofotmetro.

Obtencin de las concentraciones de acetilcolinesterasas en base a la

curva tipo.

Tabla 2. Absorbancias de las muestras de acetilcolinesterasa de los ratones

muertos.

Equipo Concentracin Testigo Ratn Ratn Ratn Ratn Ratn

(mg/kg) 1 2 3 4 5
1 133.33 0.549 0.722 0.755 0.918 0.646 0.68
2 200 0.623 0.516 0.692 0.624 0.581 0.598
3 300 0.496 1.086 0.75 0.815 0.716 0.838
4 450 0.562 0.6 0.567 0.721 0.663 1.212
5 675 0.537 0.84 0.969 0.739 0.767 0.864
6 1012.5 0.563 0.914 0.737 0.773 0.747
1 1518.75 0.455 0.672 0.618 0.46 0.55 0.637
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2 TESTIGO 0.557 0.472 0.655 0.501 0.515

De acuerdo a la ecuacin de la curva tipo:

y0.1918 x0.08

Dnde: x = concentracin (mg/kg)

y = absorbencia (nm)

Despejando x:

y0.08
x
0.1918

Obteniendo as lo siguiente:

Tabla 3. Concentraciones (MOL) calculadas de acetilcolinesterasa de las

muestras del grupo 5AV1.

Equipo Concentraci Testig Ratn Ratn Ratn Ratn Ratn

n o 1 2 3 4 5
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(mg/kg)
1 133.33 2.4452 3.347 3.5192 4.3691 2.9509 3.1282
2
2 200 2.8310 2.273 3.1908 2.8362 2.6120 2.7007
2
3 300 2.1689 5.245 3.4932 3.8321 3.3159 3.9520
0
4 450 2.5130 2.7111 2.5391 3.3420 3.0396 5.9019
5 675 2.3826 3.962 4.6350 3.4358 3.5818 4.0875
4
6 1012.5 2.5182 4.348 3.4254 3.6131 3.4775
2
1 1518.75 1.9551 3.086 2.8050 1.9812 2.4504 2.9040
5
2 TESTIGO 2.486 2.0437 2.9979 2.1949 2.2679
9

Esto fue realizado durante treinta minutos, as que para obtener los MOL/min se
realiz la conversin, y se obtuvo lo siguiente:

Tabla 4. Concentraciones (MOL/min) calculadas de acetilcolinesterasa de

las muestras del grupo 5AV1.

Equip Concentraci Testigo Ratn Ratn Ratn Ratn Ratn

o n 1 2 3 4 5
(mg/kg)
1 133.33 0.0815 0.1115 0.1173 0.1456 0.0983 0.1042
2 200 0.0943 0.0757 0.1063 0.0945 0.0870 0.0900
3 300 0.0722 0.1748 0.1164 0.1277 0.1105 0.1317
4 450 0.0837 0.0903 0.0846 0.1114 0.1013 0.1967
5 675 0.0794 0.1320 0.1545 0.1145 0.1193 0.1362
6 1012.5 0.0839 0.1449 0.1141 0.1204 0.1159
1 1518.75 0.0651 0.1028 0.0935 0.0660 0.0816 0.0968
2 TESTIGO 0.0828 0.0681 0.0999 0.0731 0.0755

Obtencin de MOL/min/mg protena

Tabla 5. Concentraciones de la curva tipo de protena, con sus respectivas

absorbencias.
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Concentraci Absorbencia
n (mg/kg) (nm)
0 0.154
2 0.223
4 0.265
6 0.289
8 0.323
10 0.329

0.35
f(x) = 0.01x + 0.2
0.3 R = 0.95

0.25

0.2

Absorbencia (nm)
0.15

0.1

0.05

0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Concentracin (mg/kg)
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AMBIENTALES.

Figura 2. Curva tipo de las concentraciones de protena con respecto a las

absorbencias observadas en el espectrofotmetro.

Tabla 6. Absorbancias de las muestras de protena de los ratones muertos.

Equipo Concentracin Ratn Ratn Ratn Ratn Ratn

(mg/kg) 1 2 3 4 5
1 133.33 0.477 0.489 0.422 0.452 0.438
2 200 0.498 0.45 0.543 0.666 2.057
3 300 0.507 0.473 0.416 0.404 0.515
4 450 0.417 0.333 0.428 0.38 0.467
5 675 0.448 0.558 1.137 0.514 0.504
6 1012.5 0.475 0.416 0.52 0.534
1 1518.75 0.419 0.587 0.467 0.515 0.461
2 TESTIGO 0.712 0.605 0.491 0.494 0.49

De acuerdo a la ecuacin de la curva tipo:

y0.0135 x0.2048

Dnde: x = concentracin (mg/kg)

y = absorbencia (nm)

Despejando x:

y0.2048
x
0.0135
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Obteniendo as lo siguiente:

Tabla 7. Concentraciones (g) calculadas de protena de las muestras del

grupo 5AV1.

Equip Concentraci Ratn Ratn Ratn Ratn Ratn

o n 1 2 3 4 5
(mg/kg)
1 133.33 20.162 21.051 16.088 18.311 17.274
9 8 8 1 0
2 200 21.718 18.162 25.051 34.162 137.2
5 9 8 9
3 300 22.385 19.866 15.644 14.755 22.977
1 6 4 5 7
4 450 15.718 9.4962 16.533 12.977 19.422
5 3 7 2
5 675 18.014 26.162 69.051 22.903 22.162
8 9 8 7 9
6 1012.5 20.014 15.644 23.348 24.385
8 4 1 1
1 1518.75 15.866 28.311 19.422 22.977 18.977
6 1 2 7 7
2 TESTIGO 37.570 29.644 21.2 21.422 21.125
3 4 2 9

Y obteniendo los mg protena de la acetilcolina:

Tabla 7. Concentraciones (MOL/min/mg protena) calculadas de acetilcolina

de las muestras del grupo 5AV1.

Equip Concentracin Ratn Ratn Ratn Ratn Ratn

o (mg/kg) 1 2 3 4 5
1 133.33 0.2766 0.278 0.452 0.268 0.301
6 6 5 8
2 200 0.1744 0.292 0.188 0.127 0.032
7 6 4 8
3 300 0.3905 0.293 0.408 0.374 0.286
0 2 5 6
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4 450 0.2874 0.445 0.336 0.390 0.506

6 8 3 4
5 675 0.3665 0.295 0.082 0.260 0.307
2 9 6 3
6 1012.5 0.3620 0.364 0.257 0.237
9 9 6
1 1518.75 0.3242 0.165 0.170 0.177 0.255
1 0 7 0
2 TESTIGO 0.1103 0.114 0.235 0.170 0.178
9 6 7 9

DISCUSIN

La inhibicin de la Acetilcolinesterasa (ACE) ocasiona acumulacin de acetilcolina este

acta como un neurotransmisor en el sistema nervioso autonmico y en las terminaciones
motoras, se puede producir, eventualmente, parlisis de la musculatura estriada y fallo
respiratorio. Pudimos comprobar estos sntomas en los ratones, que antes de morir,
depende de la concentracin de plaguicida, presentaban temblores y convulsiones.

Realizamos la determinacin de la actividad enzimtica, es decir, la cantidad de enzima

que cataliza la conversin de 1 mol de sustrato en un minuto. La actividad especfica es
el nmero de unidades de enzima por miligramo de protena.

Como podemos observar en la Tabla 7 las concentraciones ms altas de acetilcolina

hidrolizada, es decir, de la mayor actividad enzimtica presente se encontraron en el
equipo 4, el cual presentaba valores de entre 0.28 y 0.50 MOL/min/mg protena, con una
concentracin de 450 mg/kg. Como se puede observar la tendencia en los equipos 1, 3,4
y 5, es casi la misma, esto es, la actividad enzimtica no vara demasiado . Mientras que
en el equipo 6 y 1 con concentraciones ms altas, la actividad enzimtica disminuye, esto
es completamente entendible. Como ya sabemos a mayor concentracin de plaguicida,
presenta una actividad menor, esto provoca una acumulacin de acetilcolina.

Aunque cabe destacar que si comparamos con los datos del Testigo, esto no concuerda
muy bien, porque presenta una gran similitud pero incluso con menor magnitud que con
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los datos de la concentracin ms alta y eso no puede ser posible, lo correcto hubiera
sido que estos presentaran concentraciones muy altas, ya que al no tener presencia de
plaguicidas, la enzima no se inhiba y la hidrolizacion de la acetilcolina seria mas efectiva..
Podemos creer que la manera en la que se efectu el experimento mostro fallos al
manipular las muestras y por lo tanto se obtuvieron datos errneos. De la misma manera
pasa con los datos de la concentracin de plaguicida 200 mg/kg que presento la menor
concentracin de actividad enzimtica, siendo esta baja.

CONCLUSIONES

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

1. Enrique Jos Ibarra Fernndez de la Vega, La inhibicin de la actividad

colinestersica sangunea como biomarcador de exposicin a compuestos
organofosforados y carbamatos, Revista Cubana de Salud y Trabajo 2012.