Engenharia Biomolecular e Celular

Purificao de DNA plasmdico por cromatografia de interaco

hidrofbica
Teresa Cardoso, Gustavo Lopes e Liliana Valente
Enviado a 2 de Janeiro de 2008

RESUMO DNA plasmdico que introduzem reagentes orgnicos e compostos

Motivao: Separar o DNA plasmdico de cadeia dupla que se txicos so desadequados. Adicionalmente, ainda necessrio
encontra num lisado de E. coli dos contaminantes do hospedeiro, eliminar componentes celulares do hospedeiro que possam causar
tais como protenas, RNA, entre outros, atravs da cromatografia de respostas imunolgicas e biolgicas (Diogo et al., 2000).
interaco hidrofbica. Pelo traado de um cromatograma foi poss-
vel a anlise contnua do processo de separao dos constituintes 2 MTODOS
do lisado.
Em primeiro lugar, equilibrmos a coluna por gravidade com o
eluente (NH4)2SO4 a 1,5 M.
1 INTRODUO Efectumos, de seguida, duas medies do caudal, das quais
A cromatografia por interaco hidrofbica (HIC) um mtodo fizemos a mdia. Preparmos, entretanto, os eppendorfs para fazer
que se baseia nas propriedades hidrofbicas dos solutos para os as recolhas peridicas.
separar. As reas hidrofbicas das molculas ligam-se aos ligandos Quando o nvel de lquido atingiu o distribuidor de fluxo de
hidrofbicos da coluna (aqui os grupos fenil). Quanto mais hidro- topo, injectmos o lisado e ligmos o cronmetro.
fbico for o constituinte, mais forte ser a ligao coluna. Este Comemos a recolher amostras de 2 em 2 minutos e fizemos as
mtodo ortogonal cromatografia por permuta inica, a qual se suas subsequentes leituras de absorvncia a 260 nm.
baseia nas cargas dos constituintes para os isolar e que, contraria- Ao fim de 6,5 minutos de adicionado o lisado, adicionmos gua
mente HIC, pouco tem que ver com estrutura e forma. coluna e continumos a recolha normalmente. Um outro grupo
As bases deste processo cromatogrfico so em tudo semelhan- seguiu o mesmo procedimento, com a excepo de que introduziu
tes s da cromatografia de fase reversa a grande diferena entre a gua apenas volvidos 15 minutos.
estas duas tcnicas a necessidade de solventes orgnicos para a Com os valores das absorvncias obtidos foi traado um croma-
eluio dos solutos ligados coluna utilizada na cromatografia de tograma.
fase reversa. Estes solutos representam a grande desvantagem des-
ta tcnica, j que podem causar a desnaturao das protenas a 3 RESULTADOS
eluir. Esta desnaturao no problema na cromatografia de inte- O caudal medido na nossa coluna, com 7,3 cm de altura e
raco hidrofbica. 100 m de dimetro, foi de 0,875 ml/min.
No nosso caso especfico, a tcnica usada para separar o DNA As absorvncias medidas executando o procedimento descrito
plasmdico de cadeia dupla no ligante de RNA, DNA plasmdico anteriormente esto representadas na figura 1.
e genmico desnaturado (aps lise alcalina), com grandes pores
de cadeias simples, e lipopolissacridos mais hidrofbicos que os
plasmdeos super enrolados. De facto, a natureza no ligante do
DNA plasmdico deve-se ao facto de estar super enrolado e as
regies hidrofbicas estarem voltadas para o interior da cadeia
dupla, no podendo interagir com os ligandos da coluna. (Diogo et
al., 2000).
Para aumentar as interaces hidrofbicas acrescenta-se sulfato
de amnio, um agente caotrpico. A matriz usada foi de agarose de
fenil. A passagem dos constituintes pode ser controlada pela con-
centrao de sal na coluna ou pela adio de solventes mesma.
A necessidade de desenvolver tcnicas de purificao de plasm-
deos advm da sua utilizao em tcnicas moleculares da medicina
que os usam para efectuar o transporte de genes funcionais tera-
puticos ao ncleo das clulas alvo. necessrio usar processos
que satisfaam simultaneamente critrios de pureza, segurana e
eficcia. Fig. 1. Valores de absorvncias medidas pelo nosso grupo (curva a cinzen-
Por um lado, a eficcia e durao da expresso dos genes nos to claro) e por um outro (curva a cinzento escuro) para as amostras recolhi-
tecidos alvo relativamente baixa e so necessrias grandes quan- das, em funo do tempo.
tidades de plasmdeos. Por outro lado, mtodos de isolamento de

1
T.Cardoso et al.

importante referir que a absorvncia de cada amostra foi te de hidrofobicidade, j que os compostos que se associam mais
medida a 260 nm j que este o comprimento de onda a que os fortemente matriz hidrofbica so mais difceis de eluir.
cidos nucleicos absorvem mais (contrariamente s protenas, que Em relao s nossas medies em particular, verificou-se um
absorvem mais a 280nm). certo desvio no comportamento esperado para os valores das
absorvncias desde a sada do DNA plasmdico de cadeia dupla at
4 DISCUSSO ao inicio da eluio dos outros componentes do lisado. Isto porque,
Com o objectivo de separar o DNA plasmdico de cadeia dupla tal como facilmente se verifica pelos resultados obtidos pelo outro
de todos os outros componentes do lisado, efectuou-se uma croma- grupo, neste intervalo de tempo no seria de esperar que sassem
tografia de interaco hidrofbica. Este tipo de cromatografia til quaisquer compostos da coluna, devendo-se identificar valores de
na purificao de compostos que possuam locais hidrofbicos absorvncia aproximadamente nulos. No entanto, as amostras por
sua superfcie, o que lhes permite estabelecer interaces com os ns recolhidas nesse intervalo de tempo revelaram valores de
ligandos hidrofbicos da matriz utilizada no processo cromatogr- absorvncia entre 0,5 e 1, o que revela que se foram perdendo
fico. Neste caso em particular, como o DNA plasmdico de cadeia alguns componentes da coluna, talvez devido a interaces hidro-
dupla possui todas as suas bases voltadas para o interior da cadeia, fbicas demasiado fracas com alguns compostos.
no vai interagir com a matriz. J as cadeias de RNA e de DNA
genmico de cadeia simples (tambm presentes no lisado) tm as REFERNCIAS
bases expostas, estabelecendo interaces hidrofbicas com os Diogo, M. M. et al. (2001) Purification of a Cystic Fibrosis Plasmid Vector for Gene
Therapy Using Hydrophobic Interaction Chromatography. Biotechnology and
grupos hidrofbicos da matriz. Consequentemente, o DNA plasm-
Bioengineering, 68, 576-583.
dico percorre a coluna enquanto as cadeias de RNA e de DNA
genmico so retidas na mesma.
As referidas diferenas de reteno na coluna esto bem eviden-
tes no cromatograma da Fig. 1, onde se pode identificar um pico
comum para as duas curvas traadas aproximadamente 9 minutos
aps o inicio do processo. Este pico de absorvncia corresponde,
ento, sada do DNA plasmdico de cadeia dupla da coluna, j
que, no sendo retido, o primeiro componente a sair da coluna.
As diferenas aqui identificadas entre os resultados dos 2 grupos
dizem respeito ao valor da absorvncia mxima do pico, que reve-
lou um valor mais elevado para o outro grupo de trabalho. Esta
diferena poder estar relacionada com erros de qualquer um dos
grupos, ou a concentraes de DNA plasmdico de cadeia dupla
mais elevada no lisado do outro grupo. Outras possibilidades
incluem o DNA plasmdico do nosso grupo sair duma forma mais
gradual devido a diferenas na coluna ou no volume (e consequen-
temente presso) de fluido no topo da coluna.
Relativamente ao segundo pico de absorvncia, este identifica-
do mais perto do final do processo cromatogrfico mas, ao contr-
rio do verificado para o pico correspondente sada do DNA
plasmdico de cadeia dupla, verifica-se uma desfasagem entre as
duas curvas (em que cada curva corresponde s medies efectua-
das por 2 grupos diferentes). A identificao deste pico em instan-
tes diferentes para cada um dos casos justificada pela desfasagem
na substituio do Sulfato de Amnia ((NH4)2SO4) por gua.
O sulfato de Amnia utilizado no inicio da actividade tem como
funo a maximizao das interaces hidrofbicas com a matriz,
sendo este efeito anulado pela adio de gua, que vai gerar um
gradiente decrescente da fora inica. Contudo, esta troca no foi
efectuada em simultneo com o outro grupo de trabalho, j que
adicionmos gua passados 6,5 minutos do incio do processo,
enquanto o outro grupo a adicionou passados 15 minutos. Conse-
quentemente, quanto mais cedo forem minimizados os efeitos das
interaces hidrofbicas, mais cedo o RNA e o DNA genmico de
cadeia simples comeam sair da coluna (ver Fig. 1). Em particular,
esperar-se-ia que os picos estivessem desfasados de cerca de 8,5
minutos, o que de facto acontece.
Aps a adio da gua o RNA e o DNA genmico de cadeia
simples, assim como os lipopolissacridos e protenas tambm
existentes no lisado, comeam a sair da coluna por ordem crescen-