INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS

BIOLGICAS
FISIOLOGA Y BIOQUMICA MICROBIANA
LABORATORIO

PRCTICA 3:
 DETERMINACIN DE ACTIVIDAD DE SUCCINATO
DESHIDROGENASA DE Escherichia coli

Alumnos:
Acua Vzquez Elia Gabriela
Ortiz Lpez Miguel ngel
Ramrez Hernndez Perla Isabel

Grupo: 6QV2
Equipo 2 Seccin 1

ASPECTOS VALOR CALIFICACIN

Hiptesis 1%
Objetivos 1%
Anlisis de 1%
resultados
finales
Discusin de 4%
resultados
Conclusiones 2%
Bibliografa 1%
HIPTESIS

Si la glucosa representa una mejor fuente de carbono para

Escherichia coli que succinato, su crecimiento se ver favorecido
en presencia de la misma.
Si hay un aumento en la velocidad de sntesis de la enzima
succinato deshidrogenasa en presencia de succinato, entonces
dicha es inducible por l.
Si la glucosa reprime la sntesis de la enzima succinato
deshidrogenasa, sta generar una disminucin en la velocidad de
sntesis de la misma.
 Si se aplica el mtodo de Ells, entonces Escherichia coli generar
una cadena transportadora de electrones artificial lo que nos
permitir medir la actividad de la succinato deshidrogenasa puesto
que sta enzima participa tanto en el ciclo de Krebs como en la
cadena de transporte de Escherichia coli.

OBJETIVO

Analizar los resultados obtenidos con base al crecimiento y la actividad

enzimtica de la succinato deshidrogenasa tras someterla a diferentes
condiciones de cultivo, para conocer cal es su papel fisiolgico en
Escherichia coli.

OBJETIVOS ESPECFICOS

Evaluar el efecto qu tiene la fuente de carbono en la actividad de

la succinato deshidrogenasa
Evaluar el efecto de la fuente de carbono en el crecimiento de
Escherichia coli.
Inducir una cadena artificial de electrones para E. coli y as poder
determinar la actividad enzimtica de succinato deshidrogenasa.
Determinar qu fuente de carbono (succinato o glucosa) genera
una mayor actividad enzimtica en succinato deshidrogenasa.

RESULTADOS

Tabla 1 Efecto de la fuente de carbono en el crecimiento de

Escherichia coli.
 Crecimiento (absorbancia a 600
Cultivos previos
Matraces con medio nm)
en:
base Inicia de
Final
l absorbancias
0.72
1 Succinato 0.149 0.578
7
Succinato
1.08
2 Glucosa 0.148 0.939
7
0.72
3 Succinato 0.313 0.416
9
Glucosa
0.81
4 Glucosa 0.327 0.489
6
ANLISIS: La presente tabla nos muestra las absorbancias tanto
iniciales como finales a 600nm obtenidas a partir de los diferentes
tratamientos, con base en ellas se determin el de absorbancia lo cual
nos indica el crecimiento total para cada ensayo: succinato-succinato,
succinato-glucosa, glucosa-succinato y glucosa-glucosa. Es importante
mencionar que tal procedimiento no se realiz, sin embargo, los datos
fueron proporcionados por los profesores.
Para obtener el de absorbencia se emple la siguiente formula:
Abs 600nm= A 600nm final - A600nminicial
Ejemplo de obtencin de Abs 600nm en matraz No 1
Abs600nm= 0.727-0.149= 0.578
Tabla 2. Efecto de la fuente de carbono en la actividad de
succinato deshidrogenasa.
Tiempo Porcentaje de transmitancia a 600nm de las suspensiones
(segundo celulares crecidas en las fuentes de carbono
s) 1.Succinato- 2. succinato- 3. glucosa- 4. glucosa-
succinato glucosa succinato glucosa
%T %T %T %T %T
%T %T %T
0 4.1 0 3.1 0 3.5 0 4.3 0
30 6.9 2.8 3.9 0.8 4.3 0.8 4.7 0.4
60 11.7 7.6 4.7 1.6 6.9 3.4 5.0 0.7
90 16.7 12.6 5.5 2.4 9.8 6.3 5.5 1.2
25.8 21.7 6.1 3.0 15 11. 5.9 1.6
120 5
36.7 32.6 6.7 3.6 21.8 18. 6.0 1.7
150 3
47.8 43.7 7.5 4.4 31 27. 6.0 1.7
180 5
210 55.5 51.4 7.6 4.5 41.9 38. 6.0 1.7
 4
240 58.6 54.5 7.8 4.7 51.5 48 6.3 2
59.9 55.8 8.0 4.9 57.1 53. 6.5 2.2
270 6
60 55.9 8.1 5.0 59.6 56. 6.6 2.3
300 1

ANLISIS: En la tabla numero dos podemos observar el porcentaje de

transmitancia obtenido en cada uno de los tratamientos realizados, a
partir de estos datos fue posible obtener la diferencia del % de
transmitancia para cada cultivo, lo cual se determin cada 60 segundos
durante 10 minutos.
Formula
%T=Ttx-Tt0
Ejemplo a segundo 0 y 30 en tratamiento succinato-succinato
%T a 0 segundos= 4.1-4.1= 0
%T a 30 segundos= 6.9-4.1= 2.8

1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
Absorbancia a 600 nm
0.2
0

Figura 1 Grfica del efecto de la fuente de carbono en el

crecimiento de Escherichia coli.
ANLISIS: En la figura nmero 1 podemos observar el efecto que tiene
la fuente de carbono adicionada sobre el crecimiento de Escherichia coli.
 60

50

%T succinato-succinato
40
Linear (%T succinato-
succinato )
%T glucosa-succinato
30
%T Linear (%T glucosa-
succinato )
%T glucosa-glucosa
20
Linear (%T glucosa-glucosa)
%T succinato-glucosa
10 Linear (%T succinato-
glucosa)

0
0 1 2 3 4 5 6

tiempo (minutos)

Figura 2: Grfica del efecto de la fuente de carbono en la

actividad de succinato deshidrogenasa.
ANLISIS: En la Figura 2 se muestra la actividad enzimtica de
succinato deshidrogenasa para casa una de las condiciones de cultivo
(diferentes fuentes de carbono) por el mtodo de Ells.
DISCUSIN
La

succinato deshidrogenasa cataliza la deshidrogenacin esteroespecfica

de succinato a fumarato. 1

Fig. 3 Deshidrogenacin de succinato a fumarato, catalizada por

la succinato deshidrogenasa. Fuente: Voet Donald. 2009.
Fundamentos de bioqumica: la vida a nivel molecular. 2 Ed.
Mdica Panamericana. Buenos aires Argentina. Pg. 530.
La succinato deshidrogenasa contiene un grupo prosttico FAD que se
une en forma covalente a la enzima por medio de un residuo His (en la
mayora de otras enzimas que contienen FAD, el FAD se sostiene
fuertemente pero no en forma covalente). En general el FAD funciona
para oxidar bioqumicamente alcanos (como succinato) a alquenos
(como fumarato), mientras que NAD+ participa en la oxidacin ms
exergnica de alcoholes a aldehdos o cetonas. La deshidrogenacin de
succinato produce FADH2, que debe reoxidarse antes que la succinato
deshidrogenasa pueda emprender otro ciclo cataltico. La reoxidacin de
FADH2 se produce cuando sus electrones pasan a la cadena
transportadora de electrones mitocrondrial.

Ahora bien, a partir de la importancia en la participacin de dicha

enzima en el ciclo de los cidos tricarboxlicos as como en la cadena de
transporte de electrones, nuestro objetivo en la prctica era medir la
actividad enzimtica de esta en Escherichia coli, as como el efecto de la
fuente carbono en el crecimiento del microorganismo y en la sntesis de
dicha enzima.
Se evalu el efecto de la fuente de carbono en el crecimiento de
Escherichia coli, realizando cuatro ensayos; en el primero y segundo
ensayo se utiliz un cultivo previo de Escherichia coli en un medio
sinttico de Succinato, y se emple como fuente de carbono adicional
Succinato 0.5% y Glucosa 1.0%, respectivamente (SS y SG). En el tercer
y cuarto ensayo el cultivo previo empleado fue en Glucosa, y la fuente
de carbono adicionada fue succinato 0.5% y Glucosa 1.0%
respectivamente (GS, GG). Para discutir cada uno de los ensayos,
describimos el efecto en cada matraz:

En el Matraz 1 (Succinato-Succinato) se observa un aumento en la

absorbancia final, sin embargo el crecimiento es el menor de todos los
ensayos (Fig. 19, esto se debe a que el mecanismo para que E. coli
incorpore succinato a su metabolismo requiere una fase de adaptacin
de mayor tiempo, ya que como se observ el cultivo s presento
crecimiento en succinato pero de manera ms lenta en comparacin con
las clulas crecidas en glucosa.
En el Matraz 2 (Succinato - Glucosa) Se observa que el crecimiento se
vio incrementado al cambiar las clulas pre incubadas en succinato por
otra fuente de carbono como glucosa (Fig. 1), ya que su absorbancia
final sin duda representa un aumento por encima de la inicial ya que su
de absorbancias es el ms alto (Tabla 1). Esto se debe a que
Escherichia coli prefiere utilizar como fuente de carbono la Glucosa, la
cual interviene en la induccin del opern Lac, favoreciendo una
represin por catabolito cuando se encuentra presente 2. Adems la
glucosa como sustrato utiliza dos vas centrales en condiciones
aerobias, la glicolisis y el ciclo de Krebs, lo cual genera un mayor poder
reductor que se ver reflejado en mayor sntesis de ATP, mientras que el
succinato es un sustrato que se va a incorporar en el ciclo de los cidos
tricarboxlicos, pero produciendo menor poder reductor.
Por otro lado en el matraz 3 donde cambiamos la fuente de carbono
inicial (glucosa) por el succinato como fuente adicional, observamos que
el crecimiento se vio afectado, obtenindose el menor de
absorbancia, debido a que la clula se ve forzada a cambiar de
maquinaria enzimtica, obteniendo menor poder reductor.
En cambio en el matraz 4 (Glucosa-Glucosa) otro de los matraces donde
no se vari la fuente de carbono se observa una baja diferencia entre las
absorbancias, ya que el crecimiento se mantiene de forma constante a
travs del tiempo y es el mayor obtenido gracias a lo mencionado
anteriormente, ya que el papel de la glucosa en las diferentes vas
favorece una mayor produccin de ATP, poder reductor, y sin duda una
mejor fuente de carbono para Escherichia coli.
De acuerdo a estos ensayos podemos entender un poco ms los
experimentos realizados y publicados por el Dr. Ruiz Herrera en su
artculo Regulation of Succinate Dehydrogenase in Escherichia coli,
donde evalu tambin el efecto de la fuente de carbono en la actividad
respiratoria y la actividad de la succinato deshidrogenasa. Haciendo
referencia a los resultados de dicho artculo, en l se observa el mismo
comportamiento con respecto al crecimiento de Escherichia coli, en el
cual el succinato no resulto tan buena fuente de carbono como la
glucosa.
Por otro lado Ruiz Herrera adems estudi el transporte del succinato en
este microorganismo donde concluy que ste no se vea afectado por
gravemente con las condiciones de crecimiento sin embargo ste se
vea favorecido en presencia de succinato en el medio ya que este
induca; es decir incrementaba la velocidad de sntesis de la succinato
deshidrogenasa puesto que el opern lactosa era activado y con ello la
permeasa favoreca el transporte, en cambio en los cultivos crecidos en
glucosa, la sntesis de succinato deshidrogenasa se vea reprimida esto
debido a que como mencionamos anteriormente mientras discutamos el
efecto en el matraz 2, si bien la glucosa es utilizada como fuente de
carbono antes que otros azcares por Escherichia coli, sta interfiere en
la induccin del opern lactosa, generando el fenmeno de represin por
catabolito, pues ocurre durante el catabolismo de la glucosa. La
represin por catabolito ocurre cuando la glucosa desactiva a la adenilil
ciclasa y hace descender la concenctracin de AMP cclico (cAMP)
intracelular. El cAMP se une a la protena activadora del catabolito (CAP),
una protena alostrica que, combinada con el cAMP, es capaz de unirse
al sitio regulador CAP del promotor lactosa y de otros operones. El
complejo CAP- cAMP ejerce un control positivo sobre la transcripcin de
estos operones. Su unin al sitio CAP de la doble hlice del DNA induce
una curva cerrada en el DNA en el lugar de la unin. Esta curva del DNA
y la interaccin entre el complejo CAP- cAMP y la RNA polimerasa de E.
coli activan la iniciacin de la transcri`pcin en el promotor. En cambio si
el sitio CAP no est ocupado, la RNA polimerasa se une con ms
dificultad al promotor y la transcripcin del opern es mucho menos
eficiente. Por lo tanto, cuando la glucosa se halla presente en el medio,
el nivel de cAMP desciende, no se forma el complejo CAP- cAMP y no se
da la influencia positiva sobre la RNA polimerasa. 2 Al reprimir el opern
lactosa se reprime la permeasa y el transporte de succinato (inductor de
la sntesis de succinato deshidrogenasa).
 Fig. 4. Control de lacP por cAMP. Represin por catabolito en
presencia de Glucosa Fuente: M. Devlin, Thomas, Bioqumica; 4
a Ed. Reverte: Barcelona, 2006. Pg. 337.

En lo experimentos realizados en el laboratorio para evaluar el efecto de

la fuente de carbono en la actividad de succinato deshidrogenasa
pudimos comprobar dicho comportamiento. Para determinar la actividad
de la succinato deshidrogenasa utilizamos el mtodo de Ells, donde la
reaccin Succinato Fumarato se midi mediante la reduccin de un
aceptor de electrones artificial, el colorante 2,6- diclorofenol indofenol,
se aadieron 0.25 ml de este colorante a una celda de
espectrofotmetro, se adicionaron 0.6 ml de KCN para bloquear la
trayectoria normal de electrones a travs del sistema de transporte de
electrones mitocondrial, se adicionaron tambin a la celda 2.25 ml de
regulador de fosfatos para mantener el pH ptimo de la enzima, 1.0 ml
de Succinato de sodio como sustrato que la enzima deba oxidar, 0.4 ml
de metosulfato de fenazina, compuesto que actu como acarreador para
garantizar que los electrones fueran captados por el aceptor artificial de
electrones, y por ltimo se aadieron 0.5 ml de suspensin celular, de
Escherichia coli, microorganismo que llev a cabo esta cadena artificial
de transporte de electrones. Finalmente lemos el % Transmitancia 600
nm, tras la reduccin del colorante de un color azul a incoloro.
Como se puede observar en los resultados obtenidos (Fig. 2) de acuerdo
a los ensayos realizados con condiciones distintas, los que presentaron
una mayor actividad enzimtica fueron Succinato- Succinato (SS) y
Glucosa-Succinato (GS), esto debido a que el succinato favorece la
induccin de la sntesis de la succinato deshidrogenasa; como se haba
visto en los estudios realizados por Ruiz Herrera 3. En el primer caso
(SS), al no existir presencia de Glucosa, se obtuvo la mayor actividad de
la enzima succinato deshidrogenasa ya que esta es inducida gracias a
que la nica fuente de carbono presente en el medio es el succinato; en
cambio, en el segundo caso (GS), si bien los microorganismos fueron
cultivados primariamente en Glucosa, se les aadi posteriormente
como fuente adicional el succinato lo que sin duda favoreci
grandemente la sntesis de la enzima al actuar ste ltimo como su
inductor.

Por ltimo los ensayos Succinato-Glucosa (SG) y Glucosa-Glucosa (GG)

obtuvieron el menor grado de actividad enzimtica. Como analizamos
anteriormente la Glucosa acta como un represor de la sntesis de la
succinato deshidrogenasa, ya que interfiere en la induccin del opern
Lactosa y en la permeasa, reprimiendo el transporte de succinato y con
ello la sntesis de la enzima. En el ensayo SG se observa una ligera
mayor actividad que en GG; a causa de que en este ensayo el succinato
si estuvo presente como inductor de la enzima, sin embargo al cambiar
la maquinaria enzimtica aadiendo glucosa posteriormente su sntesis
fue reprimida. y en el ensayo GG al no haber entrado en contacto el
microorganismo con el succinato como era de esperarse la actividad es
prcticamente nula.

CONCLUSIONES

La Glucosa es utilizada como una mejor fuente de carbono

favoreciendo el crecimiento de Escherichia coli en mayor grado
que el succinato.
El succinato en el medio acta como un inductor, ya que aumenta
la velocidad de la sntesis de la succinato deshidrogenasa lo que
se ve reflejado en la determinacin de la misma.
La glucosa, interfiere en la induccin del opern lactosa y la
permeasa reprimiendo el transporte del succinato, lo que la hace
un represor disminuyendo la sntesis de la succinato
deshidrogenasa al estar presente en el medio.
BIBLIOGRAFA
1. Voet Donald. 2009. Fundamentos de bioqumica: la vida a nivel
molecular. 2 Ed. Mdica Panamericana. Buenos aires Argentina.
Pg. 530.
2. M. Devlin, Thomas, Bioqumica; 4 a Ed. Reverte: Barcelona, 2006.
Pg. 331-337.
3. J. Ruiz Herrera y L. G. Garca. Marzo 1972. Regulation of
succinate dehydrogenase in escherichia coli . Departamento de
microbiologa, Escuela nacional de ciencias biolgicas, instituto
politcnico nacional, Mxico 17, D. F.