Introducing Proteomics from concepts to sample

separation ,

mass espectrometry and data analysis .

1- INTRODUCTION

1.1 Quais so as tarefas na protemica?

1.1.1 - O proteoma

Em genmica, um dos principais objetivos estabelecer a composio do genoma ( i.e. A

localizao e seqncia de todos os genes em espcies), incluindo informaes sobre comumente
ver polimorfismos e mutaes. Muitas vezes, esta informao comparada entre diferentes
espcies e populaes locais. Na genmica funcional, os cientistas principalmente pretendem
analisar a expresso de genes, e protemica mesmo considerado por alguns como parte da
genmica funcional . Na protemica, pretendemos analisar todo o proteoma em um nico
experimento ou em um conjunto de experimentos. Vamos olhar em breve o que se entende por
anlise de palavras.

Realizar qualquer tipo de anlise protemica uma tarefa bastante ambiciosa, j que em
sua definio mais abrangente o proteoma consiste em todas as protenas expressas por uma
determinada espcie. O nmero dessas protenas est relacionado ao nmero de genes em um
organismo, mas essa relao no direta e h muito mais para o proteoma do que naquele.

Esta definio abrangente do proteoma tambm explicaria o fato de que nem um nico
indivduo de uma espcie expressar todas as protenas possveis dessa espcie, uma vez que as
protenas podem existir em muitas isoformas diferentes, com variaes e mutaes, diferenciando
indivduos.

Um exemplo intrigante so os anticorpos, mais especificamente as suas regies de ligao

ao antgeno, que existem em milhes de sequncias diferentes, cada uma criada durante o tempo
de vida dos indivduos, sem que a sua sequncia seja previsvel por um gene .Os anticorpos
tambm so um bom exemplo da parte substancial desempenhada por influncias externas, que
definem o proteoma ; Por exemplo, a mistura de anticorpos presente em nossos corpos
estritamente dependente de quais antgenos ns encontramos durante nossas vidas.

Mas claro que toda uma srie de fatores externos mais bvios influenciam nosso
proteoma, mas no o genoma ( figura 1.1) . temperatura , nutrientes , O2/CO2 , hormnios ,
estresse , condies de cultura , idade , drogas , metablitos , protena extracelular e sinalizao .

Alm disso, o proteoma tambm contm todas as protenas possveis expressas em todos
os estdios de desenvolvimento de uma determinada espcie ; Exemplos bvios so protenas
diferentes no ciclo de vida de um parasita da malria, ou a sucesso de espcies que se ligam ao
oxignio durante o desenvolvimento humano, da hemoglobina fetal hemoglobina adulta (Figura
1.2).
 Em cima de todas estas consideraes, existem possveis modificaes na expresso de
uma protena que no so codificadas pela sequncia do seu gene sozinho; Por exemplo, as
protenas so traduzidas a partir de RNAs mensageiros, e estes mRNA podem sofrer splicer para
formar diferentes ARNm finais.

Splicing difundido e regulada durante o desenvolvimento de cada indivduo, por

exemplo, durante a maturao de tipos de clulas especficas. Alteraes no splicing diferencial
podem causar e afetar vrias doenas, como o cncer ou a doena de Alzheimer (Figura 1.3).

Como se tudo isso fosse suficiente variabilidade dentro do proteoma, a maioria das
protenas mostra alguma forma de modificao ps-traduo (PTM). Estas modificaes podem
ser sinais de envelhecimento da protena (desamidao ou oxidao das antigas protenas
celulares) ou podem ser adicionadas de uma forma regulada enzimticamente aps a
transformao das protenas e so fundamentais para a sua funo .

Por exemplo, muitas protenas secretadas no organismo multicelular so glicosiladas.

No caso de hormnios humanos tais como a eritropoietina, isto lhes permite ser funcionais
durante perodos de tempo mais longos. Em outros casos as protenas so modificadas apenas
temporariamente e reversivelmente, por exemplo por fosforilao ou metilao.

Isto constitui um mecanismo muito importante de regulao funcional, por exemplo

durante a transduo de sinal, como veremos mais adiante em detalhes.

Em resumo , existem modificaes relevantes para protenas que no podem ser preditas
pela seqncia de seus genes. Estas modificaes esto resumidas na figura 1.4

As protenas so reguladas por modificaes ps-traducionais. Os

genes e o splicing definem a sequncia primria de protenas.
A sequncia primria contm motivos que permitem diferentes PTMs.

Qual deles realmente encontrado em uma protena em um determinado

momento em um tecido especfico no pode ser previsto.

Muitas vezes uma combinao de PTMs necessria para protenas

ativas. PTMs pode alterar a estrutura 3D de protenas.
Eles tambm alteram parmetros como o peso molecular aparente eo
ponto isolelectric em separaes de protenas baseadas em gel.

PTMs comuns : fosforilao , glicosilao , acetilao , dehydroalanina ( convero de cistena

) , ligaes dissulfeto ( oxidao) , metilao , sulfonao , sumolylation , ubiquitinao ,
fernesilao , desminao .

Alm disso, importante lembrar que o proteoma no estritamente definido pelo

genoma. Enquanto que a maior parte das protenas possveis podem ser preditas pelo genoma
(exceto anticorpos, por exemplo), seu padro de expresso, PTMs e localizao da protena no
so estritamente previsveis a partir do genoma. Todos esses fatores definem um proteoma e
cada protena nele. O genoma a base do 'fentipo' de cada protena, mas as regulaes e
influncias intrnsecas tambm tm uma forte influncia (Figura 1.5).

Protenas tm um fentipo . Semelhante a organismos inteiros, protenas, pode ser

considerado como tendo traos observveis que so derivados por fatores genticos, bem como
influncias do ambiente que experimentam durante a sua vida.
1.1.2 Uma definio de trabalho do proteoma

Por todas as razes acima, a maioria dos pesquisadores usa uma definio mais prtica da
palavra 'proteoma'; Eles o usam para as protenas expressas em um determinado organismo,
tecido / rgo (ou clula mais provvel em cultura), sob uma determinada condio definida.

Estes "proteomas" so ento comparados com outra condio, por exemplo duas estirpes
de um microrganismo, ou clulas em cultura derivadas de um indivduo saudvel ou doente. Esta
chamada abordagem diferencial protemica tem mais do que uma descrio do proteoma em
mente. Seu objetivo descobrir quais protenas esto envolvidas em funes especficas.

Isto , naturalmente, dificultado pelo nmero de protenas presentes (algumas mudanas

podem ocorrer como meras coincidncias) e por muitos parmetros que influenciam a
funcionalidade de protenas, expresses, modificaes, localizaes e interaes.

Enquanto protemica diferencial parece um caminho prudente para ir, temos de ter em
mente que os mtodos escolhidos para a anlise protemica tambm ir determinar os
resultados; Por exemplo, se usarmos uma abordagem baseada em gel, as protenas de membrana
so quase completamente excludas da anlise.

Alm disso, a maioria das anlises tem um certo nvel de corte para as protenas de baixa
abundncia. Isto significa que as protenas abaixo de (digamos) 10000 cpias expressas por clula
no so facilmente mensurveis, porque as abordagens geralmente no so suficientemente
sensveis .

Mesmo dentro desta definio limitada de protemica ainda enfrentamos tarefas

substanciais, como o proteoma definido no s pelo estado das protenas nele (expresso e
modificaes) mas tambm pela sua localizao subcelular e pela sua associao a complexos
protena-protena de composies em constante mutao.

Por exemplo, faz uma grande diferena funcional para a atividade se um fator de
transcrio estiver dentro ou fora do ncleo e um estudo protemico que falhar em analisar a
localizao subcelular do fator de transcrio ir perder grandes mudanas na atividade deste
fator de transcrio (Figura 1.7) -
Importncia da localizao na protemica.

A clula no painel esquerdo contm a mesma quantidade de

protenas vermelhas que a clula cancergena direita.

Entretanto, algumas das protenas esto no ncleo, onde

podem ativar a transcrio e causar cncer.

Se a localizao su-celular no fosse analisada, uma

abordagem protemica quantitativa perderia esta importante
diferena

Uma quinase que precisa estar em um complexo multiproteico para ser ativa estar inativa
quando for unicamente ligada a partes desse complexo, uma diferena importante que ser
perdida se analisarmos apenas a presena de uma protena, mas no os parceiros de interao. O
mesmo vlido para quinases que mudam de complexo e assim regulam a sua especificidade
alvo.

1.1.3 As tarefas em protemica

A maioria dos estudos protemicos tem como objetivo correlacionar certas funes com a
expresso ou modificao de protenas especficas; apenas alguns pretendem descrever
proteomas completos ou compar-los entre espcies diferentes. Para uma correlao funcional
precisamos analisar as caractersticas proticas mais importantes de relevncia funcional.

J mencionamos a anlise de protenas em estudos protemicos - o que isso significa?

As anlises de protemica podem ser resumidas em termos de objetivos especficos :

1. Deteco e quantificao do nvel de protena

2. Deteco e quantificao de modificaes de protenas

3. deteco e quantificao da localizao de protenas subcelulares

4. deteco e quantificao de interaes de protenas.

Historicamente, a expresso protica foi o primeiro parmetro analisado pela protemica.

Enquanto que isso envolve uma certa forma de quantificao (presente / no presente significa
geralmente pelo menos uma diferena de trs a dez vezes no nvel de expresso), muito mais
difcil quantificar protenas em uma escala protemica e muitos dos ltimos desenvolvimentos
tecnolgicos se concentram neste aspecto (Ver captulos 2-5)

Uma vez que a abundncia de protenas pode variar de presumivelmente uma nica
protena para mais de um milho de protenas por clula, as quantificaes tm de cobrir um
intervalo dinmico de mais de 6 ordens de magnitude em clulas e at 10 ordens de magnitude
no plasma.

PTMs so muito importantes para a funo das protenas, e a protemica a nica

abordagem para analis-los em uma escala global. No entanto, as abordagens atuais
(fosfoprotemica) no so capazes de analisar todas as PTMs possveis, e este continua sendo um
tema quente no desenvolvimento de novas tecnologias.

Antes do aparecimento da tecnologia de imagem de clula de vida, o fraccionamento de

clulas foi o nico mtodo para analisar a localizao sub-celular de protenas. Sendo
relativamente crua e propensa a erros devido a longos tempos de manipulao, os estudos de
fraccionamento so muito bem sucedidos na definio da funo da protena. Isto verdade
especialmente quando no s organelas mas tambm estruturas funcionais, tais como
ribossomas ou eixos podem ser inteligentemente isolados.
 A deteco de interaes de protenas certamente o mais desafiador de alvos
protemicos, mas tambm um muito gratificante. Em estudos individuais o objetivo identificar
muitas vezes todos os parceiros que interagem de uma nica protena, e vrios estudos juntos
podem ser identificar, por exemplo, todas as interaes com um nico mdulo de sinalizao.

As interaes em uma escala verdadeiramente protemica foram analisadas apenas em

alguns estudos excepcionais e os resultados no so de forma alguma completos, dada a
natureza temporal e frgil das interaes protena-protena, os diferentes resultados alcanados
com diferentes mtodos e sua complexidade.

No covalentes e, portanto, mais difceis de analisar so a localizao e interaes de

protenas -Embora nenhuma das tarefas acima seja facilmente alcanada, considerando o nmero
de cisalhamento das protenas envolvidas, as quantidades mnimas da amostra normalmente
disponveis e a resoluo temporal que pode ser necessria.Os parmetros protemicos podem
mudar de segundos ou minutos para horas, dias e perodos de tempo ainda mais longos.

1.2 Desafios na protemica

1.2.1 Cada protena um indivduo

Os nucleotdeos so constituidos por quatro bases diferentes cada, e a estrutura do ADN

normalmente muito uniforme. Mesmo que o RNA forme estruturas mais complexas, temos
muitos tampes diferentes nos quais podemos solubilizar todos os nucletidos conhecidos. No
existe tal coisa na protemica.

No h tampo (e provavelmente nunca haver) que possa solubilizar todas as protenas

de uma clula ou organismo (figura 1.6)

As protenas so feitas de 20 aminocidos, o que permite at mesmo um peptdeo ter 18

aminocidos de comprimento para adquirir sequncias mais diferentes do que h estrelas na
galxia ou cem vezes mais seqncias diferentes do que h gros de areia em nosso planeta!

O comprimento mdio das protenas de cerca de 450 aminocidos. A complexidade que

pode ser alcanada por essa protena est alm da imaginao. Mais ao ponto, enquanto quase
todas as seqncias de DNA ter propriedades bioqumicas bastante semelhantes a qualquer
outra seqncia de comprimento similar, com protenas a situao totalmente diferente.

Algumas protenas se ligam aos materiais utilizados para sua extrao e assim se perdem
nas anlises, outras aparecero predominantes em uma anlise tpica de espectrometria de
massa (MS) porque contm quantidades e distribuies timas de arginina e lisina.

Se as protenas so muito hidrofbicas, eles nem sequer se dissolvem sem a ajuda de

detergentes. Algumas protenas apresentam comportamento aberrante com corante; Ou so
manchados facilmente ou muito mal.

Este comportamento torna as quantificaes absolutas e mesmo comparaes relativas de

abundncia de protenas muito difceis. As protenas podem exibir caractersticas altamente
dinmicas, suas abundncias podem mudar drasticamente em poucos minutos, seja por rpida
sntese ou degradao.

Algumas protenas so mais susceptveis degradao pela protelise dependente ou

independente da ubiquitina especfica do que os outros.
 Estes processos, por sua vez, podem ser desencadeados durante processos celulares tais
como diferenciao ou apoptose (morte de chamada activa). H mais de 360 modificaes
qumicas conhecidas de protenas. (Veja a lista 'Delta Mass' no site da Associao de Recursos
Biomoleculares, abrf.org).

Estes incluem PTMs naturais, tais como fosforilao e acetilao, bem como artefactos tais
como oxidao ou desamidao, podem ocorrer naturalmente dentro das clulas, mas tambm
como artefactos durante a preparao da protena. Evidentemente, as modificaes totalmente
artificiais ocorrem exclusivamente durante o isolamento de protenas, tal como a adio de cido
acrlico.

1.2.2 O jogo de nmeros

Esta variedade explica como organismos relativamente complexos conseguem

responder sobre uma pequena quantidade relativa de genes. As formas menos complexas de vida
so encontradas entre os vrus;

Num exemplo tpico, uma dzia de genes codificam protenas de cerca de 40 por meios
de processamento de RNA alternativo e protelise controlada. Em cima disso, estas protenas so
processadas alternativamente (por glicolilao) para regular a sua funo em diferentes fases do
ciclo de vida viral.

Nestas formas de vida relativamente simples o proteoma muito mais complexo do que
o genoma sugeriria, e quanto mais complexa for a forma de vida, mais esta lacuna se alarga .

Bactrias tm cerca de 3000-4500 genes. Em um exemplo tpico (se houver algum

exemplo "tpico" destes organismos fascinantes!) Como Escherichia coli existem 4290 protena
codificando genes mais cerca de 90 produzindo apenas RNA. Splicing de mRNA rara; PTMs esto
presentes em uma variedade de formas, mas ocorrem raramente.

Na levedura (Sacharomyces cerevisiae) detectamos cerca de 6000 genes e estes so

moderadamente modificados. Splicing um evento regular, assim como a glicosilao diferencial,
fosforilao, metilao e uma srie de outras PTMs, resultando em um nmero muito maior de
isoformas proticas do que a adio pura de genes nucleares e mitocondriais sugeriria. Em
organismos multicelulares como os insetos (a mosca da fruta, Drosplhila malanogaster) ou
vermes (a lombriga, Caenorhabditis elegans) encontramos cerca de 13400 e 19000 genes,
respectivamente.

Todos os mecanismos populares conhecidos para aumentar o nmero de protenas de um

gene so observados. Finalmente, vamos dar uma olhada nas formas de vida mais envolvidas,
como desejamos ver a ns mesmos.

Apenas alguns anos atrs, antes da concluso do projeto do genoma humano fase 1, foi
amplamente aceito que assumimos entre 20000 e 40000 genes para a nossa espcie, e a maioria
dos cientistas concorda com uma cifra de cerca de 25000. Ficamos imaginando como
conseguimos ser muito mais complexos do que os vermes com nmeros ligeiramente
aumentados de genes. A resposta encontra-se dentro da crescente complexidade no caminho do
genoma ao proteoma (ver tabela 1.1) .

Assumindo que temos cerca de 30000 genes, um nico indivduo ter cerca de 200000
formas diferenciadas de mRNA e aproximadamente o mesmo nmero de protenas, identificadas
por seqncia idntica, ao longo do curso de seu desenvolvimento. Adicionando todos os
polimorfismos comuns encontrados ou presumidos (alelos diferentes ou polimorfismos de
nucleotdeo nico) que encontramos no nvel de DNA, poderamos falar bem de duas vezes o
nmero de 400000 protenas.

Se inclumos os PTMs, os nmeros aumentam ainda mais. Parece uma estimativa

conservadora que, em mdia, existem cerca de cinco isoformas modificadas ps-tradionalmente
por protena, levando a cerca de 2 milhes de protenas diferentes que se poderia considerar
analisar em um experimento protemico abrangente! H, evidentemente, nenhum mtodo mo
para fazer tal experimento no presente!

Obviamente, nem todas as protenas possveis codificadas pelo genoma sero expressas
em todos os momentos numa dada amostra prtica. seguro supor que uma linha de clulas de
mamfero exprime cerca de 10000-15000 genes num dado momento, ou ligeiramente menos de
metade do proteoma da espcie.

Os tecidos so constitudos por vrias clulas (mais clulas sanguneas, artrias, linfonodos,
etc.) e tm uma complexidade maior. Assim poderamos encontrar os produtos de talvez 15000-
20000 genes em uma dada amostra de tecido, ou cerca de metade do proteoma. Outro problema
em nmeros surge do intervalo dinmico em que as protenas so encontradas.

As protenas podem ser expressas a partir de uma protena rara por clula at vrios
milhes de protenas por clula, enquanto que geralmente h apenas um ou dois genes por
clula.

E, claro, a inveno vencedora de prmio nobel da reao em cadeia de polimerase permite

a amplificao de uma nica molcula de ADN ou ARN para qualquer quantidade necessria para
anlises repetitivas; No h tal coisa para protenas. Os pesquisadores enfrentam o desafio de
analisar um pequeno nmero de protenas (uma por clula?) Na presena de muito abundantes
(10 milhes de cpias por clula, e ghaemmaghami 2003), e obviamente difcil quantificar
quaisquer medidas com resultados que variam mais de sete ordens de Magnitude .

A maneira mais sensvel para analisar protenas desconhecidas o uso de espectrmetros

de massa, que outra razo pela qual eles so to populares na protemica. A maioria das
abordagens protemicas pode medir peptdeos at o baixo nvel de femtomolo, mais avanos e
abordagens complexas podem atingir nveis de attomole e protenas bem caracterizadas podem
ser detectadas at o nvel zeptomole.

1.2.3 onde as protenas esto?

Para alm de outros parmetros, a localizao de cada protena mais importante para
a sua funo.

Bons exemplos so fatores de transcrio, que podem estar em uma conformao inativa no
citoplasma e tm de se translocar para o ncleo para serem ativados. Ento para definir um
proteoma funcionalmente precisamos saber exatamente onde protenas so ... Muito exatamente.

Uma protena que est dentro ou fora de uma organela faz uma diferena de cerca de
20 nm em posio, por exemplo! A distribuio espacial tambm regulada em curtas escalas de
tempo; Como um exemplo tpico podemos pensar em receptores de fator de crescimento
acumulando em poucos minutos de estimulao em vesculas degradantes (Factor de crescimento
epidrmico. Aguilar and Wendland 2005 ).

Esses diferentes locais no podem ser abordados igualmente bem ; , por exemplo,
difcil comparar a distribuio de protenas em clulas com polaridade diferente (apical e distal
em clulas epiteliais).

As protenas podem estar localizadas no somente dentro ou fora de uma organela (o

ncleo - figura 1.7), mas tambm dentro da membrana (s) ou em outras estruturas subcelulares
(ribossomos ou componentes esquelticos).

A maioria das organelas e muitas estruturas subcelulares podem ser isoladas at uma
pureza bastante elevada para analisar as protenas contidas nelas.

Entretanto, quanto maior a pureza, maior e mais complicado o procedimento de

isolamento (geralmente envolvendo centrifugao diferencial ), e mais tempo existe para que as
amostras adquiram alteraes artefactuais, como mostra o exemplo do trabalho em nosso
laboratrio :

Rotulamos as clulas radioativamente para investigar fosforilaes e um procedimento

de fraccionamento celular de duas horas permite que cerca de 90% do marcador radioativo seja
removido (por fosfatases) quando comparado com uma lise direta de clulas inteiras em tampo
de amostra de ureia de concentrao elevada.

Outros possveis artefatos incluem protelise ou deglicosilao . Juntos, eles podem

resultar em dissociao de protenas de sua posio "correta". Mesmo sem isso, muitas vezes
difcil julgar se uma protena est especificamente associada a uma organela, ou se ela apenas
"fura" no especificamente para a organela, como resultado da lise celular e frequentemente
mediada por associaes artificiais com outras, talvez desnaturadas, protenas ou cidos
nucleicos.

Por outro lado, as protenas, que esto na clula viva, (chamemos isso in vivo para
nossos propsitos) associadas a certas organelas, podem se perder durante o processo de
isolamento.

As protenas podem ser pequenas protenas que "escapam" atravs de dano artefactual
nas membranas ou poros nas organelas; Por exemplo, protenas abaixo de 45kDa podem difundir
livremente dentro e fora do ncleo, alm de qualquer mecanismo especfico para import-las,
export-las ou mant-las.

Outra espcie de protenas que podem se perder so protenas ligeiramente associadas

na parte externa das organelas (em oposio s protenas transmembranares ou protenas
internas) .Eles so mantidos no lugar por delicadas interaes protena-protena, que sero
discutidas no prximo captulo .

Estudos protemicos em estruturas subcelulares tm sido muito bem sucedidos no

mapeamento de sua composio e funo e eles foram enormemente ajudados pelo
aparecimento de mtodos protemicos livres de gel, como a eletroforese em fluxo livre e
especialmente a tecnologia de identificao de protenas multidimensionais, conhecida como
MudPIT (Tambm chamada protemica de espingarda, ver captulo 3).

1.2.4 Protenas sempre sair com seus companheiros

 Nenhuma protena pode exercer sua funo sozinha - sempre tem que haver uma
interao com outra protena. As protenas estruturais so freqentemente encontradas em
complexos enormes e composio so uma caracterstica funcional importante. Como exemplo,
basta pensar em tubulina nos microtbulos - pode ser encontrada em microtbulos longos,
fragmentos curtos e tambm em combinao com outras protenas, muitas vezes regulando seus
parmetros de associao / dissociao.

As enzimas so frequentemente activadas e / ou mantidas no lugar pela sua associao

com outras protenas. Eles muitas vezes ainda tm de ser montados em estreita associao com
outras protenas (chaperones), a fim de dobrar em uma forma funcional, e que est sujeito a
regulamentos intrincados.

Por exemplo, uma classe especfica das chamadas protenas de choque trmico
(protenas que geralmente estabilizam a dobragem correta da protena) tem de ser associada com
algumas kinases frgeis para mant-las activas e a regulao desta associao sinalizadora e
dependente do ciclo celular. Pode ser to especfico que o bloqueio da funo da protena de
choque trmico mata as clulas por inativao das kinases.

Outras interaes tpicas so enzimas e seus substratos; muitas vezes mesmo a

preferncia substrato ou especificidade regulada por interaes protena (Jun . ligao por
kinases reguladas por sinais extracelulares).

Um exemplo muito bom disso a protena KSR1 dentro do mdulo MAP kinase :
Utilizando as mesmas kinases com protenas adaptadoras diferentes, diferentes substratos ficam
fosforilados. impossvel analisar todas essas interaes a uma escala protemica, mas vrios
estudos protemicos adicionaram impressionantemente nossa compreenso dos parceiros
interativos e funes de protenas nicas (figura 8) ou de complexos de protenas completos
(complexos ribossomos ou de transcrio) .

No entanto, os resultados de estudos de interao so muito complexos, e pode ser difcil

compreender a sua importncia. Dependendo dos mtodos utilizados, pode ser difcil
compreender se, por exemplo, uma protena apresenta uma interao fraca mas especfica ou
uma interao forte mas inespecfica (que no ocorre em clulas vivas) e tem de ser cuidadoso
comparando e combinando dados De diferentes estudos, porque eles poderiam ter sido derivados
usando diferentes tecnologias.

1.3 Protemica em relao outras-micas e Biologia de Sistemas

No momento, h um nmero cada vez maior de novos -omics que vm a existir,

ao lado da genmica clssica (figura 1.9) .Os principais so a transcriptmica,
fosfoprotemica, glicomica e metabolmica.
 Claramente a genmica um pr-requisito para a protemica. A espectrometria
de massa o mtodo analtico de escolha na protemica, pois rpido, barato e preciso.

No entanto, ningum realmente identifica uma protena ou uma modificao por

MS, como sempre afirmado; Na maioria das vezes o espectrometrista de massa produz
dados que so altamente susceptveis de corresponder aos dados obtidos por computador
a partir de dados genmicos.

Por outro lado, bases de dados genmicas podem ser corrigidas por dados
derivados de estudos protemicos (a partir de espectrometros de massa).

Dados protemicos podem descobrir falhas na base de dados genmica e fornecer

provas de que um gene inferido (e o produto gentico!) Realmente existe.

Indo para baixo a hierarquia da informao, transcriptomics, analisa a transcrio

do DNA em (principalmente) mRNA . Transcriptomics deriva a maior parte de seu
interesse a partir do pressuposto de que alteraes nos nveis de transcrio so
refletidas ao nvel funcional, isto , ao nvel das protenas. Muitos estudos mostraram que,
em mdia, isso no estritamente verdadeiro, como mostrado na figura 1.10.

Normalmente, se um mRNA equilbrio muda, isso ser refletido em algum tipo de

alterao no nvel de protena; Tem de ser controlada, no entanto, devido a controles ao
nvel da estabilidade do mRNA, do splicing e do controle da traduo.

Naturalmente, s porque h mais de uma protena, que no significa

necessariamente que mais ativo, de modo que estudos transcriptmicos devem ser
realmente apoiado por evidncia protemica .

Correlao entre os nveis de mRNA e protena. A quantidade de mRNA e protenas por clula
de levedura so comparadas para cerca de 80 genes.

Apenas protenas relativamente abundantes podem ser utilizadas para esta medio, uma vez
que dados fiveis para a quantidade absoluta de protena so mais difceis de obter para
protenas de baixa abundncia.

Em mdia, h 4000 molculas de protena presentes por molcula de mRNA. O coeficiente de

correlao 0,76.Embora esta seja uma boa tendncia, a variao entre mRNA e quantidade de
protena , em mdia, 10 vezes.

As setas cinzentas (pretas) mostram que para quantidades idnticas de protena (ARNm) o nvel
de ARNm (nvel de protena) pode variar cerca de 100 vezes (Futcher et al., 1999)

Assim, no possvel prever de forma fivel a quantidade de protena com base nas anlises de
mRNA.

Relacionamentos semelhantes entre o ARNm e o nvel de protena podem ser observados para a
relao mRNA / protena de um gene, quando comparados entre diferentes tecidos em
organismos superiores.

prudente supor que as variaes so ainda maiores para mRNAs ou protenas raros.Adaptado

Combinando ambas as tecnologias, tambm possvel, em muitos casos, fazer

backup de dados protemicos e encontrar o mecanismo que levou s mudanas nos
nveis de protena, por exemplo. H tambm outras razes pelas quais a combinao de
protemica e trancriptmica benfica;
 praticamente impossvel medir todas as protenas em estudos protemicos,
como normalmente o menos abundante so perdidos ou mal caracterizados. Uma vez que
a transcriptmica pode ser muito sensvel, mas perde em vrios nveis de regulao,
combinando tecnologias tem a vantagem de aumentar os nveis de cobertura das
anlises.

Phosphoproteomics e glycomics so campos especiais em protemica, eles

merecem seus nomes (como outros mais especializados -omics), uma vez que
impossvel com as tecnologias protemicas padro para alcanar qualquer cobertura
razovel para a fosforilao ou glycosilation de protenas.

Se estimarmos que em uma abordagem protemica tpica usando uma linha celular
cultivada podemos analisar cerca de 30-50% de todas as diferentes espcies proticas
(cobrindo talvez mais de 95% da quantidade total de protenas), uma estimativa
razovel que ns seriamos capazes de analisar talvez cerca de uma dzia de protenas ou
peptdeos fosforilados.

Usando as melhores abordagens atuais ainda no seramos capazes de detectar

mais de cerca de 2000 peptdeos fosforilados ou protenas, e ainda no seriamos capazes
de analisar mais do que talvez 200 de forma quantitativa (quais residuos em que razo
so fosforilados em qualquer dado Tempo )

Se comearmos com uma estimativa de 10000 diferentes protenas expressas em

um determinado tipo de clula em uma experincia tpica, um olhar para a tabela 1.2
mostra que seria de esperar 50000 diferentes fosfo-isoformas destas protenas;

Em outras palavras, nossa cobertura na deteco de fosfo-isoformas de 4% e

muito menor na anlise quantitativa de fosfo-protenas. Certamente a anlise de PTMs
um campo em que ainda muito mais desenvolvimento necessrio!

Metabolomics muito diferente do -omics discutido at agora. quase impossvel

vincular metabolitos a genes isolados diretamente; Eles no codificam para metablitos,
muitos genes diferentes esto envolvidos na regulao de cada metablito, e muitos
metablitos so derivados de fontes externas, como outros organismos. Metabolomics
tem sido usado com muito sucesso para monitorar doenas em recm-nascidos e para
descrever o estado de microrganismos.

Se voc olhar para ele a partir de uma perspectiva clnica, triagem, dos
metabolitos uma maneira muito eficiente para triagem de genes disfuncionais e
protenas. Em mdia, mais de 100 genes e seus produtos influenciam um metablito.

Em um estudo tpico, cerca de 500 metablitos so controlados - excluindo as

redundncias, o suficiente para que 50000 protenas sejam controladas ! Dada a
complexidade da metabolmica, cada combinao de concentrao de metablitos pode
ser derivada de diferentes cenrios na regulao de nvel, por isso difcil descobrir
exatamente quais enzimas disfuncionais podem ser responsveis por uma dada patologia
metablica.
 Este um bom momento para dar uma olhada no campo relativamente novo campo
de biologia de sistemas. Uma maneira de descrever a biologia de sistemas dizer que
o campo de pesquisa que coleta toda a informao disponvel em um sistema (digamos,
uma clula ou organismo) para descobrir como todo o sistema (envolvendo cada via de
sinalizao, cada caminho executivo, cada Metabolito) funciona e controlado.

Como nenhum circuito regulador totalmente separado do resto (na verdade a

maioria parece intensamente interconectada) no podemos olhar para um nico caminho;
Temos de ter um olhar para todo o sistema, da o termo "biologia de sistemas" .

Um aspecto importante da biologia de sistemas o objetivo de simular um sistema

completo no computador (in silico). Para isso, uma enorme quantidade de dados precisa
ser conhecida;

Todas as enzimas e protenas envolvidas, todas as concentraes de todos os

metabolitos e reguladores, todas as propores de sntese, desagregao e meia-vida
para todos os componentes, todas as constantes e distribuies, para citar o mais
importante.

Se um sistema pode ser modelado, podemos tentar desequilibr-lo.

Se o sistema reage como a aproximao in silico, poderamos apenas ter uma

compreenso correta do sistema.

Para alguns sistemas resultados impressionantes foram alcanados, desde imitaes

completas do metabolismo bacteriano at explicaes de como a via de sinalizao em
organismos superiores regulam a diferenciao e crescem (von Kriegsheim 2009).

Somente se pudermos entender clulas e organismos dessa forma seremos

capazes de compreender e curar cncer ou doenas metablicas ou infeces virais.
Portanto, uma maneira, a protemica deve estar fornecendo uma grande quantidade de
dados para a biologia de sistemas, de modo que possamos entender relaes funcionais
numa escala verdadeiramente sistmica (figura 1.9).

1.4 Algumas aplicaes gerais da protemica

Antes do termo "protemica" ter sido cunhado algumas de suas tecnologias

tpicas j estavam em uso isoladamente - por exemplo, a comparao de diferentes
espcimes de milho para sua identificao e controle de varibilidade.

Para distinguir diferentes variantes suficiente gerar uma boa separao de

algumas protenas marcadoras; Usando electroforese em gel bidimensional, pode-se
escolher entre cerca de 600-2000 protenas "manchas" (figura 1.11) Para este tipo de
anlise no mesmo necessrio saber por que as protenas migraram em diferentes
'spots'

Os spots podem surgir de diferentes protenas que esto sendo expressas, ou de

pequenas variaes de sequncia das mesmas protenas (homlogas) ou de diferentes
PTMs em protenas com a mesma sequncia.
 Protemica tambm pode ser usado para a comparao de espcies para analisar as
relaes evolutivas.

Os seres humanos e os chimpanzs so ditos ser 98.7% idnticos no nvel

genomic; Quando voc olha para um chimpanz voc certamente sentiria (ou espero) que
as diferenas so um pouco maiores do que 1,3%. Os estudos genmicos so muito
poderosos para estabelecer relaes evolutivas entre diferentes linhagens, espcies ou
at unidades evolutivas mais altas, como reinos.

No entanto, a nvel genmico a evoluo de diferenas reguladoras, tais como

splicing ou a regulao do gene no muito boa. Usando protemica, ou mesmo
protemica de rgos especficos, este nvel de evoluo pode ser analisado.

O estudo protemico de protenas cerebrais de humanos e chimpanzs mostrou que

cerca de 40% das protenas cerebrais apresentavam diferenas quantitativas ou qualitativas
(figura 1.12) .Este resultado est muito mais de acordo com nossas expectativas ao comparar
humanos e chimpanzs.

Os exemplos anteriores nos mostraram a principal aplicao da protemica, a chamada

abordagem diferencial protemica.

Na protemica diferencial no se interessa tanto em analisar todas as protenas

encontradas; Em vez disso, so comparados dois conjuntos de protenas, provenientes de
amostras semelhantes mas distintas. A protemica diferencial envolve a triagem ou anlise
quantitativa / qualitiva de tantas protenas quanto possvel.

Contudo, apenas uma parte dessas protenas ser posteriormente analisada em qualquer
profundidade, por exemplo, para identificar o gene, analisar PTMs, estabelecer a pureza de
sementes ou distinguir patolgicos de bactrias inofensivas (Figura 1.13) Em outras palavras,
identificar um marcador biolgico para um patgeno.

Entretanto, a maioria dos estudos protemicos de diferentes reas so projetados no apenas

para detectar protenas diferenciais, mas tambm para identific-las ou suas modificaes
diferenciais, combinando dados espectromtricos de massa com previses de bancos de dados.

As aplicaes tpicas para a protemica de diferentes espcies so a comparao de

fluidos corporais ou clulas ou tecidos de estados saudveis e doentes. As doenas variam de
hidrocefalia a distrbios cardiovasculares, distrbios genticos, demncia (Alzheimer) e diversos
tipos de cncer.

Quando se trata de analisar cnceres, protemica diferencial tambm uma

ferramenta importante para a classificao do cncer. O tecido de origem, o grau de
desdiferenciao e o nvel de propagao em todo o corpo so utilizados para classificao
clssica de cncer.

Isso s vezes ajudado por uma anlise gentica limitada (teste de anormalidades
cromossmicas, como perdas ou translocao de grandes regies dos cromossomos) ou a
expresso de certos antgenos (protenas especficas ou glicosilao) conhecidos por serem
tumores ou tumores especficos.
 Alguns canceres foram analisados por anlise genmica ou transcriptmica, e isso
proporcionou uma melhor compreenso do seu desenvolvimento dentro do corpo. O mesmo vale
para as classificaes protemicas;

Em vez de ter uma dzia de parmetros como no caso das classificaes padro, a
protemica analisa milhares de potenciais marcadores tumorais.

Isso tambm permite que as ocorrncias de certas alteraes sejam agrupadas

(agrupadas), quando as mudanas nas protenas individuais no esto sendo muito teis. Estas
novas e melhores classificaes so importantes para escolher diferentes tratamentos protenciais
e prever o seu resultado.

Relacionado protemica diferencial o campo da descoberta de biomarcadores. O

maior aumento nas aplicaes protemicas a anlise de biomarcadores potenciais usando
mtodos protemicos.

No momento da redao, milhares de estudos foram realizados para detectar

biomarcadores para diversas condies, variando de vrios tipos de cncer, resistncia
quimioterapia, doenas cardacas, funo renal e funo do sistema imunolgico (Fig. 1.14)

muito significativo que, embora a maioria dos estudos seja bastante promissora,
poucos biomarcadores avaliados ainda emergiram. Por outro lado, isso parece refletir a falta de
maturidade dos mtodos protemmicos, a falta de padronizao em estudos com tamanhos de
amostra estatisticamente significativos.

Por outro lado, essa falta de resultados imediatos reflete a complexidade da tarefa; No
sabemos o suficiente sobre as interaes em organismos complexos para entender a enorme
quantidade de variabilidade que encontramos.

o objetivo deste livro contribuir para a apreciao dessa complexidade do lado

protemico da anlise, as amostras biolgicas tambm trazem sua prpria complexidade.

Outros campos aos quais a protemica diferencial aplicada com grande sucesso incluem
o estudo dos eventos de sinalizao e a elucidao de outros processos celulares como a
replicao do DNA, o controle transcricional, a traduo, a diferenciao e o ciclo celular.

Uma caracterstica importante da protemica neste cenrio que pode analisar a

composio de estruturas sub-celulares com elevada resoluo espacial e temporal. Ao
correlacionar as mudanas na composio das estruturas durante os processos biolgicos,
possvel obter um conhecimento detalhado das funes das protenas envolvidas.

A protemica usada regularmente para analisar a reao de organismos e clulas a um

ambiente de mudana, por exemplo, crescimento sob diferentes condies de cultura e diferentes
fontes de alimento ou para a anlise da resposta ao estresse.

O estresse analisados podem ser muito diferentes na natureza (temperatura, nutrientes,

oxignio, estresse osmtico, toxinas), algumas das quais so muito interessantes (durante os
transplantes ou, mais geralmente, para a sobrevivncia das operaes).

Usando abordagens semelhantes, protemica diferencial tambm tem sido colocada a

bom uso em estudos phamacological, assim um novo termo, "farmacoproteomics", foi cunhado.
Os principais desafios aqui so identificar os modos de ao dos medicamentos,
identificar novas drogas alvos e avaliar possveis toxicidades, efeitos colaterais e
resistncias.

Uma doena que tem sido abordada por diferentes estudos protemicos a diabetes.
Diabetes afeta cerca de 200 milhes de pessoas do mundo selvagem.

causada em 90% dos casos pela diminuio da produo de insulina pancretica ou

resistncia insulina nos tecidos alvo (msculo, tecido adiposo e fgado), onde a insulina
normalmente induz uma maior absoro de glicose no sangue, levando a hiperglicemia.

Foram publicados diferentes mapas de referncia de gis 2D (provenientes de tecidos

alvo e produtores de insulina), com o objetivo de ajudar a compreender os efeitos dos frmacos
antidiabticos e dos seus efeitos secundrios.

Protemica diferencial tambm muito til na comparao de diferentes estirpes de

microrganismos; Ele oferece mais nveis de complexidade em cima da gentica em que
homologias e diferenas podem ser analisadas.

Estes nveis de complexidade incluem a expresso real de genes semelhantes ou

idnticos e seu padro de PTM. Isso muito til quando se trata de decidir quo prximas so as
estirpes de microrganismos entre si e de onde derivam as diferenas.

Verificou-se que a ionizao por dessoro com laser (SELDI), uma tecnologia baseada em
MS MALDI, utilizando uma matriz de diferentes superfcies absorventes para preparao de
amostras, uma ferramenta rpida para discriminar diferentes estirpes bacterianas (Barzaghi,
2006)

Diferentes estirpes bacterianas tambm podem ser analisadas utilizando protemica, por
exemplo, para encontrar marcadores que se correlacionam com diferentes patologias, como
exemplo em estudos de protemica de Helicobacter pylori, que causa lceras (Mini 2006).

Em uma abordagem semelhante, a protemica diferencial tambm pode ser usada em

estudos evolutivos, comparar diferentes espcies e deduzir seu desenvolvimento e
relacionamentos (Dworzanski 2006) ou mesmo analisar mais compreensivelmente como os
proteomas envolvidos em diferentes phyla para melhorar nosso entendimento da evoluo a
longo prazo.

A Protemica tambm pode ser usada em algumas atividades comerciais muito avanadas,
por exemplo, para a melhoria do bio-processamento (wang 2003) e, portanto, a rpida otimizao
da produo e processamento de biomateriais por micro-organismos.

Exemplos para todas estas aplicaes, juntamente com uma classificao aproximada, so
apresentados no quadro 1.2.