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INSTRUCCIONES PARA LA PRESENTACION DE MONOGRAFIAS DE

BIOLOGIA MOLECULAR 2017

PRIMERA UNIDAD
SE LES RECUERDA QUE LA PRESENTE MONOGRAFIA ES PARA LA NOTA DE
INVESTIGACIN FORMATIVA QUE CORRESPONDE AL 10% DE
CALIFICACIN DEL CURSO

Tema: BASES MOLECULARES DE LA DIABETES MELLITUS


Puntaje mximo: 10 puntos
Entrega: El trabajo se entregar 23 de marzo (Despus de la fecha indicada el
trabajo se calificara sobre 3 puntos)
Instrucciones El trabajo debe incluir estrictamente:
1.- Hoja de calificacin estndar*
2.- Cartula: Debe incluir: Nombre del curso, Apellidos y nombre, N de grupo de
seminario, Tema, ao
3.- Introduccin: Motivacin para la realizacin del trabajo, experiencias,
inquietudes, dificultades, breve sinopsis. (1 hoja)
4.- Objetivos: Deber plantearse un objetivo general y mnimo 3 objetivos
especficos para el presente trabajo
5.- Cuerpo del trabajo: (Mnimo 7 hojas, mximo 20). Se realizara un anlisis
acadmico directo y claro sobre los siguientes artculos:
1.Time of onset of non-insulin-dependent diabetes mellitus and genetic
variation in the 3-adrenergicreceptor gene
2. Familial Hyperglycemia Due to Mutations in Glucokinase--Definition of
a Subtype of Diabetes Mellitus
3.A subtype of diabetes mellitus associated with a mutation of
mitochondrial DNA

La orientacin son las siguientes preguntas:


1.- Cules son los factores de riesgo para la NIDDM?
2.- Explicar y fundamentar el aumento del estress oxidativo en la DM
3.- Cules son los factores de riesgo para la NIDDM?
4.- Qu relacin tiene las mutaciones del gen del receptor B3 adrenrgico
con la obesidad y la NIDDM y sus implicancias?. Fundamentar.
1
5.- Qu mtodos utilizara para evaluar lasmutaciones del gen del receptor
B3 adrenrgico?. Fundamentar
6.- Cmo interpreta los resultados de los mismos?
7.- Qu variacin de NIDDM se da en pacientes con edades inferiores a los
25 aos y cules son sus causas?
8.- Cmo explicar el polimorfismo en el gen de la glucoquinasa y NIDDM?
9.- Qu estudios moleculares se realizan para explicar la hiperglicemia en
pacientes con mutaciones en el gen de glucoquinasa?
10.- Qu relacin tiene la Fosforilacin oxidativa de la mitocondria y la
secrecin de insulina por el pncreas?
11.- Cmo explicar el subtipo de la Diabetes Mellitus asociada con la
mutacin A G del DNA mitocondrial?
12.- Qu mtodos utilizara para evaluar la mutacin A G del DNA
mitocondrial?. Fundamentar
13.- Cmo interpreta los resultados de los mismos?

6.- Conclusiones: Despus de haber realizado el estudio y resumen del tema, qu


es lo que considera usted (originalidad) como importante y esencial en
relacin a los objetivos planteados. (Mximo 10 conclusiones numerados).
7.- Preguntas: Elabore 10 preguntas tipo opcin mltiple, sealando su respectiva
respuesta, en funcin al resumen y conclusiones desarrolladas
8.- Bibliografa consultada segn el siguiente orden:
- AUTOR o REVISTA, TITULO DEL ARTICULO O DEL Libro, Ciudad, Pas, Ao
- WWW. Nombre de la Pgina. Autor. Ttulo del Artculo, Pas, Ao
9.- Anexos: Incluir las Pagina. WWW. Consultadas (pueden presentarse en CD o
impresas).
(*)IMPORTANTE
En cada respuesta debe figurar con exactitud la bibliografa que sustenta lo
escrito. El trabajo debe ser realizado en hoja A-4 letra Arial, tamao 12, Espacio 1
1/5.

1. Es probable que las formas comunes de DMNID son complejas y

2
heterogneas, y que resultan cuando un grupo de genes mutantes,
cada uno contribuyendo de una manera pequea y sutil, interactan
entre s y con el medio ambiente, el envejecimiento y las influencias
de comportamiento para dar lugar a la expresin de la enfermedad. 2-4

La obesidad es un factor de riesgo conocido para el desarrollo de la


DMNID 5,6 y, como DMNID, tiene determinantes genticos claros

2.

4. Hemos identificado una mutacin en el 3 gen del receptor


adrenrgico que, aunque no en s mismo asociadas con NIDDM, se
asocia con la aparicin de NIDDM en una edad anterior entre los
indios Pima homocigotos para la mutacin. Este hallazgo sugiere que
la mutacin no es un determinante importante de la DMNID en estos
temas, sino que acta para acelerar el curso de la enfermedad

5. Anlisis de los polimorfismos de cadena sencilla conformacionales


de la 3 adrenrgicos-gen del receptor.

Anlisis de la secuencia dideoxi.

Deteccin del receptor mutado por hibridacin con oligonucletidos


especfico a alelo

6. Anlisis de los polimorfismos de cadena sencilla conformacionales


de la 3 adrenrgicos-gen del receptor
Se prepar ADN genmico a partir de leucocitos o lneas celulares
inmortalizadas por mtodos establecidos. El ADN genmico se
amplific mediante la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)
como se describe en otro lugar. 28 diez pares de cebadores se
utilizaron para generar 10 la superposicin de los productos de PCR
que abarca toda la regin codificante, la regin no traducida 5' , las
uniones de corte y empalme exn-intrn, y 521 pares de bases (pb)
de la regin reguladora de la 3 -adrenergic- gen receptor 17,20,29 (y
3
los datos depositados en el Servicio Nacional de Publicaciones
auxiliares, NAPS). Para el anlisis de polimorfismos conformacionales
de cadena sencilla, los productos de PCR fueron radiomarcados
mediante la adicin de [- 32 P] trifosfato de desoxicitidina a la mezcla
de reaccin. Productos de PCR desnaturalizados se cargaron en un
gel de poliacrilamida (MDE, AT Biochemicals, Malvern, Pa.), Y se
someti a electroforesis a 4 a 6 W durante 18 a 20 horas bajo cuatro
condiciones de gel: con y sin 10 por ciento de glicerol a 4 C y a 25
C. 30 El gel se sec al vaco, y se realiz la autorradiografa.
Anlisis de la secuencia dideoxi
Variantes detectadas por anlisis de polimorfismos conformacionales
de cadena sencilla se sometieron a dirigir el anlisis de secuencia
didesoxi con PCR asimtrica 28 y Sequenase Versin 2.0 kits (United
States Biochemicals, Cleveland). Los cambios en bases fueron
confirmados por la secuencia de las cadenas opuestas y por digestin
con enzimas de restriccin.
Deteccin del receptor mutado por hibridacin con oligonucletidos
especfico a alelo

Un fragmento de 367 pb de la 3 gen del receptor adrenrgico que


abarca el sitio de mutacin se amplific por PCR con cebadores
5'TTCCTTCTTTCCCTACCGCCC3' y
5'GCAGCCAGTGGCGCCCAACGG3' . Los productos de PCR se
transfirieron por duplicado a membranas de nylon. La hibridacin se
llev a cabo con 32 oligonucletidos P-radiomarcado correspondiente
a cualquiera de la secuencia normal de la 3 gen del receptor
adrenrgico (5'CATCGCCTGGACTCCGA3' ; la sonda para Trp64) o la
secuencia de la Trp64Arg 3 gen adrenrgico-receptor (5
'CATCGCCCGGACTCCGA3'; la sonda para Arg64). 31 A
continuacin, las membranas se lavaron dos veces en 2 fosfato de
sodio-EDTA-cloruro de sodio (SSPE) (1 x SSPE es cloruro sdico 150
mM, fosfato de sodio 10 mM, y EDTA 1,25 mM; pH 7,4) y 0,05 por
ciento de sulfato dodecil de sodio a se llev a cabo a 60 C (la sonda
Trp64) o 62 C (la sonda Arg64) durante 15 minutos, y
autorradiografa.

7. Recientes estudios genticos de familias con diabetes de inicio en


la madurez de los jvenes, una forma de DMNID se caracteriza por
una edad de inicio de menos de 25 aos y la herencia autosmica

4
dominante, se han localizado los genes de susceptibilidad a la
diabetes a los cromosomas 7 y 20 2-4 . Aunque la identidad del gen
en el cromosoma 20 no se conoce, las mutaciones en el gen de la
glucoquinasa en el cromosoma 7 se han identificado y ha demostrado
ser la causa de la diabetes

8. La enzima glucoquinasa glicoltica se expresa slo en las clulas


hepticas y pancreticas beta y tiene un papel clave en la regulacin
de la homeostasis de la glucosa. En los hepatocitos, la fosforilacin de
la glucosa por la glucoquinasa facilita la captacin y el metabolismo de
la glucosa mediante el mantenimiento de un gradiente para el
transporte de glucosa en estas clulas. En las clulas beta del
pncreas, la glucoquinasa aparece para compensar parte del
mecanismo sensible a la glucosa y de estar involucrados en la
regulacin de la secrecin de insulina

9. El ADN se prepar a partir de linfocitos de sangre perifrica 14 . Los


genotipos de los sujetos fueron establecidos con el uso de la reaccin
en cadena de la polimerasa (PCR) para detectar los dos
polimorfismos de ADN descritos anteriormente en el gen de la
glucoquinasa, 3 , as como una tercera recientemente identificado
polimorfismo de ADN de cinco alelo (GCK3) localizado
aproximadamente 4,3 kb aguas arriba del exn 1a. GCK3 se detect
con los cebadores 5'GGTTATGTAGCATCAGGATG3' y
5'TCTCTCTGTCTCTGTGAGTC3' ; el producto de PCR fue de 280
pares de bases (pb). Los haplotipos AluVpA / PstI en el gen de la
adenosina desaminasa, un marcador para el gen diabetes-
susceptibilidad en el cromosoma 20, se determinaron como se ha
descrito previamente

10. Genes mitocondriales son agentes causales plausibles tanto de


IDDM y NIDDM, ya que se ha sugerido que la fosforilacin oxidativa
en la mitocondria tiene un papel crucial en la secrecin de insulina por
las clulas beta pancreticas en respuesta a la glucosa y otros

5
nutrientes 10 . ADN mitocondrial normal es una molcula circular de
16.569 pares de bases (pb) que contiene 37 genes que codifican 22
tipos de ARN de transferencia (ARNt), 2 tipos de ARN ribosomal, y 13
enzimas implicadas en la fosforilacin oxidativa

11. Recientemente, varios informes de casos 12-15 sugiri que las


mutaciones en el ADN mitocondrial, especialmente uno que implica la
sustitucin de guanina por adenina (A-a-G) en la posicin 3.243 de la
leucina tRNA, 13-15 puede causar diabetes y sordera. Esta mutacin
se produce en el sitio de unin de ADN mitocondrial para un factor de
protena que promueve la terminacin de la transcripcin en el lmite
entre los ARN ribosmico 16S y los genes tRNA Leu (UUR). Esta
mutacin parece interferir no slo con la sntesis de tRNA Leu (UUR),
sino tambin con la unin del factor de terminacin de la transcripcin,
de ese modo causando defectos en la sntesis de las protenas
mitocondriales.

12. Los estudios moleculares


Se prepar ADN a partir de leucocitos de sangre perifrica. Los
fragmentos de ADN mitocondrial posicin 3243 que abarca se
amplificaron con la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). El
cebador directo fue 5'AGGACAAGAGAAATAAGGCC3' , que abarca
las posiciones 3130 a 3149, y el cebador inverso fue
5'CACGTTGGGGCCTTTGCGTA3' , que abarca las posiciones 3423 a
travs de 3404 17 . Los resultantes fragmentos de 294 pb del ADN
mitocondrial (3130 a travs de 3423) fueron digeridos con una
endonucleasa de restriccin, ApaI, y se analizaron por gel de agarosa
(0,8 por ciento) de electroforesis. Los productos de PCR fueron
secuenciados directamente o bien 18 o subclonaron en un vector de
plsmido y luego se secuenciaron.
La insulina capacidad secretora y Estudios Euglycemic-Clamp

Capacidad insulina secretora se evalu mediante mediciones de la


insulina en plasma o concentraciones de pptido C durante una
prueba oral de tolerancia a la glucosa de 75 g o despus de la
administracin intravenosa de glucagn (1 mg) o por medidas de
6
pptido C en una muestra de orina de 24 horas. Absorcin perifrica
de la glucosa (principalmente por el msculo esqueltico) se midi en
un paciente con IDDM y un paciente con NIDDM, ambos de los cuales
tena la mutacin, durante un estudio de clamp euglucmico
hiperinsulinmico- 19 .

13. Se identificaron una mutacin A a G en la posicin 3243 de ARNt


de leucina mitocondrial en 16 de los pacientes de los grupos 1 a 5
( Figura 1 FIGURA 1Identificacin de una mutacin de A a G en la posicin

3243 de mitocondrial Leucina tRNA. ). La Figura 1A muestra


las secuencias de la posicin 3243 que abarca en el ADN mitocondrial
normal y mutante de un paciente (Asunto II-2 en la Familia 2). Esto
significa que el paciente es heteroplsmico para la mutacin. Esta
transicin A-a-G cre un sitio de reconocimiento para la endonucleasa
de restriccin ApaI (GAGCCC a GGGCCC). La digestin de ADN
mitocondrial con ApaI revel que los sujetos afectados son
heteroplasmic para la mutacin ( Figura 1B ). Esta mutacin no se
encontr en 200 sujetos normales sin antecedentes familiares de
diabetes. En el grupo 1, 3 de los 55 pacientes (6 por ciento) tenan
esta mutacin; en el grupo 2, 0 de 85 pacientes; en el grupo 3, 2 de
100 pacientes (2 por ciento); en el grupo 4, 3 de 5 pacientes (60 por
ciento); y en el grupo 5, 8 de 39 pacientes (21 por ciento). Se
identificaron 16 sujetos adicionales con diabetes y la mutacin en
nuestro estudio de 42 familiares de los pacientes de los grupos 1, 2, 3
y 4, y 20 sujetos adicionales con diabetes y la mutacin en nuestro
estudio de 127 familiares de los pacientes del grupo 5. de este modo,
se identificaron 52 pacientes con diabetes mellitus en 22 familias no
relacionadas que tenan la mutacin

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