BLOQUE: TCNICAS EXPERIMENTALES ENSAYO DE INMUNOABSORCIN LIGADO A ENZIMA (ELISA)

Ensayo de inmunoabsorcin
ligado a enzima (ELISA)
Claire Horlock, Imperial College London, Reino Unido
Traduccin: Jess Gil, Wrzburg, DE (SEI)

El ensayo de inmunoabsorcin ligado a enzima (ELISA)

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es una tcnica muy usada en inmunologa para medir
anticuerpos, antgenos, protenas y glicoprotenas en
muestras biolgicas. Algunos ejemplos incluyen: diagnstico
de infeccin por VIH, test de embarazo, y medicin de
citocinas o receptores solubles en sobrenadantes celulares o
suero. Generalmente se llevan a cabo en placas de 96
pocillos, lo que permite medir mltiples muestras en un nico
experimento. Estas placas deben tener propiedades
especiales (ser absorbentes, como las NUNC) para asegurar
que el anticuerpo o el antgeno se pegan a su superficie.
Cada prueba mide un antgeno especfico, existiendo una
gran variedad de kits disponibles para distintos antgenos.
En la Figura 1 se puede observar un tipo de ELISA, llamado
ELISA sandwich, donde se utilizan dos juegos de
anticuerpos para detectar productos, como citocinas. El
mtodo se lleva a cabo en el orden mostrado. El primer paso
es recubrir la placa ELISA con el anticuerpo de captura; Figura 1. Ensayo ELISA. Lo que se
cualquier anticuerpo en exceso o que no se haya unido se muestra es un ELISA tipo sandwich, con
elimina despus mediante lavado. Este anticuerpo est los pasos de la prueba numerados del 1
diseado para reconocer el antgeno de inters. al 4.
Despus la muestra (ej. orina, suero o sobrenadante
celular) es aadida. Cualquier antgeno que se encuentre en
ella se unir al anticuerpo de captura que recubre la placa.
Las muestras suelen aadirse en duplicado o triplicado (para
permitir anlisis estadstico) y en distintas concentraciones
para garantizar que puedan ser medidos con los niveles de
deteccin de la prueba. De nuevo, cualquier excedente es
eliminado de la placa usando un paso de lavado.
En el ltimo paso, se aade el anticuerpo de deteccin,
que suele estar marcado con una enzima, generalmente
peroxidasa de rbano picante o fosfatasa alcalina. Este Figura 2. Curva standar tpica. Se
anticuerpo se unir a los antgenos que estarn a su vez muestra una curva estandar para un
ELISA que detecta IFN. Para
unidos al anticuerpo de captura. Para terminar, se aade
determinar la concentracin del
una solucin substrato. Las pruebas ELISA suelen ser
antgeno en la muestra, la curva
cromgenas, es decir, se basan en una reaccin que estandar se basa en usar una solucin
convierte el sustrato (ej. TMB o ABTS) en un producto que contiene una concentracin
coloreado que puede medirse utilizando un lector de placas. conocida del antgeno.
Para determinar la concentracin de antgeno en la muestra se requiere producir una curva
estandar, utilizando antgenos en concentracin conocida (mostrado en la Figura 2). La
concentracin del antgeno en la muestra se puede calcular utilizando la densidad ptica (OD).